Summary

Amministrazione semplice ed efficace e la visualizzazione di microparticelle nell'apparato circolatorio di piccoli pesci mediante l'inserimento di rene

Published: June 17, 2018
doi:

Summary

Questo articolo illustra i principi di un’iniezione rapida, come minimo dilagante di microparticelle fluorescenti in circulatory system di piccoli pesci e la visualizzazione in vivo delle microparticelle in sangue di pesce.

Abstract

La somministrazione sistemica di particelle micro-dimensione in un organismo vivente può essere applicata per la visualizzazione del sistema vascolare, droga e distribuzione del vaccino, l’impianto di cellule transgeniche e piccoli sensori ottici. Tuttavia, microiniezioni endovenosa in piccoli animali, che sono principalmente utilizzati nei laboratori biologici e veterinari, sono molto difficili e richiedono personale qualificato. Qui, dimostriamo un metodo robusto ed efficiente per l’introduzione di microparticelle nell’apparato circolatorio di adulto zebrafish (Danio rerio) tramite l’iniezione nel rene pesce. Per visualizzare le microparticelle introdotte nel sistema vascolare, vi proponiamo una semplice tecnica di imaging videomicroscopia nelle branchie di pesce. In vivo monitoraggio del pH del sangue di zebrafish è stato compiuto usando un fluorescente microincapsulati iniettato sonda, SNARF-1, per dimostrare una delle possibili applicazioni della tecnica descritta. Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata di incapsulamento di pH sensibili colorante e dimostra i principi dell’iniezione rapida e la visualizzazione di microcapsule ottenute per registrazione in vivo del segnale fluorescente. Il metodo proposto di iniezione è caratterizzato da un tasso di mortalità basso (0-20%) e ad alta efficienza (70-90% di successo) ed è facile da Istituto utilizzando attrezzature comunemente disponibili. Tutte le procedure descritte possono essere eseguite su altre specie di piccoli pesci, come i guppies e medaka.

Introduction

La somministrazione di particelle micro-dimensione in un organismo animale è un compito importante in tali zone come droga e vaccino consegna1, sistema vascolare visualizzazione2, cellula transgenica impianto3e l’impianto piccolo sensore ottico 4 , 5. Tuttavia, la procedura di impianto per le particelle di Microscala nel sistema vascolare di piccoli animali da laboratorio è difficile, soprattutto per gli organismi acquatici delicati. Per campioni di ricerca popolari come zebrafish, è consigliabile che queste procedure essere chiarita mediante protocolli dei video.

Microiniezioni intracardiache e capillare richiedono personale qualificato e servizi di microchirurgia unico per la consegna dei microobjects nel sangue di zebrafish. In precedenza, un’ iniezione manuale retro-orbitale3 è stato suggerito come un metodo facile ed efficace per la somministrazione di cellule intere. Tuttavia, nella nostra esperienza, a causa della piccola zona della rete capillare occhio, ci vuole molta pratica per ottenere il risultato desiderato da questa tecnica.

Qui, descriviamo un metodo per l’impianto di microparticelle solide ed efficienti nell’apparato circolatorio di iniezione manuale direttamente nel tessuto del rene di zebrafish adulto, che è ricca di vasi capillari e vasi renali. Questa tecnica si basa sul protocollo dei video per trapianto di cellule in zebrafish rene6, ma sono stati eliminati i passaggi di microsurgical traumatici e che richiede tempo. Il metodo proposto è caratterizzato da bassa mortalità (0-20%) e ad alta efficienza (70-90% di successo) ed è facile da Istituto utilizzando attrezzature comunemente disponibili.

Una parte importante del protocollo proposto è la visualizzazione delle impiantato microparticelle (se sono fluorescenti o colorato) nei capillari gill, che permette di verificare la qualità di iniezione, una valutazione relativa approssimativa del numero di particelle iniettate e la rilevazione del segnale spettrale per misurazioni fisiologiche direttamente dal sangue circolante. Come esempio delle possibili applicazioni della tecnica descritta, dimostriamo il protocollo per in vivo misure di pH del sangue di zebrafish usando una sonda fluorescente microincapsulata, SNARF-1, originariamente suggerito nel Borvinskaya et al. 20175.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali sono stati condotti in conformità con la direttiva europea 2010/63/UE per gli esperimenti sugli animali e sono state approvate da animale soggetti ricerca comitato di Istituto di biologia all’Università statale di Irkutsk. 1. fabbricazione di microcapsule Nota: Microcapsule che trasportano una tintura fluorescente sono preparati utilizzando un assembly di strato dopo strato di carica opposta polielettroliti7<su…

Representative Results

I risultati ottenuti provengono da una delle tre principali categorie del protocollo presentato: la formazione di microparticelle fluorescenti di incapsulamento di un colorante fluorescente (Figura 1), l’iniezione di rene di microcapsule con ulteriore visualizzazione in Gill capillari (Figura 2 e 3) e, infine, la in vivo spettrale registrazione della fluorescenza di SNARF-1 per il monit…

Discussion

Per dimostrare l’iniezione di microparticelle in zebrafish rene, abbiamo usato semipermeabile microcapsule caricati con un colorante indicatore. Così, il protocollo contiene le istruzioni per la fabbricazione di microcapsule usando l’Assemblea strato dopo strato di carica opposta polielettroliti7,8,15,16,17 ,18 (<strong cla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Autori riconoscono notevolmente l’aiuto di Bogdan Osadchiy ed Evgenii Protasov (Università statale di Irkutsk, Russia) in preparazione del protocollo dei video. Questa ricerca è stata sostenuta dalla Fondazione scienza russa (n. 15-14-10008) e dalla Fondazione russa per la ricerca di base (n. 15-29-01003).

Materials

SNARF-1-dextran, 70000 MW Thermo Fisher Scientific D3304 Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler
Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA) SIGMA A9771 Fluorescent probe
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran) SIGMA R9379 Fluorescent probe
Calcium chloride SIGMA C1016 CaCO3 templates formation
Sodium carbonate SIGMA S7795 CaCO3 templates formation
Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH) SIGMA 283215 Cationic polymer
Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS) SIGMA 243051 Anionic polymer
Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG) SuSoS PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules
Sodium chloride SIGMA S8776 To dissolve applied polymers
Water Purification System Millipore SIMSV0000 To prepare deionized water
Magnetic stirrer Stegler For CaCO3 templates formation
Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL Eppendorf Dosing solutions
Eppendorf Research plus pipette, 10 µL Eppendorf Dosing solutions
Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL F.L. Medical 28093 Dosing solutions
Pipette tips, volume range 0.1-10 μL Eppendorf Z640069 Dosing solutions
Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed BioSan For microcapsule centrifugation-washing procedure
Microcentrifuge tubes, 2 mL Eppendorf Z666513 Microcapsule synthesis and storage
Shaker Intelli-mixer RM-1L ELMY Ltd. To reduce microcapsule aggregation
Ultrasonic cleaner To reduce microcapsule aggregation
Head phones  To protect ears from ultrasound
Ethylenediaminetetraacetic acid SIGMA EDS To dissolve the CaCO3 templates
Monosodium phosphate SIGMA S9638 Preparation of pH buffers
Disodium phosphate SIGMA S9390 Preparation of pH buffers
Sodium hydroxide SIGMA S8045 To adjust the pH of the EDTA solution and buffers
Thermostat chamber To dry microcapsules on glass slide
Hemocytometer blood cell count chamber To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules
Fluorescent microscope Mikmed 2 LOMO In vivo visualization of microcapsules in fish blood
Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided) Chroma 79010 Visualization of microcapsules with fluorescent probes
Fiber spectrometer QE Pro Ocean Optics Calibration of microcapsules under microscope
Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m Ocean Optics To connect spectrometer with microscope port
Collimator F280SMA-A Thorlabs To connect spectrometer with microscope port
Glass microscope slide Fisherbrand 12-550-A3 Calibration of microcapsules under microscope
Coverslips, 22 x 22 mm Pearl MS-SLIDCV Calibration of microcapsules under microscope
Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL Blaubrand BR708709 To collect fish blood
Clove oil SIGMA C8392 Fish anesthesia
Lancet No 11 Apexmed international B.V. P00588 To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector
Heparin, 5000 U/mL Calbiochem L6510-BC For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection
Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode Mettler Toledo To determine fish blood pH
Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm Becton, Dickinson and Company For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate
Glass capillaries, 1 x 75 mm Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co 9201075 For injection procedure
Gas torch To solder steel needle to glass capillary
Microinjector IM-9B NARISHIGE For precise dosing of microcapsules suspension
Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene SIGMA P5481 For manipulations with fish under anesthesia
Plastic spoon For manipulations with fish under anesthesia
Damp sponge For manipulations with fish under anesthesia
Dissection scissors Thermo Scientific 31212 To remove the gill cover from the fish head
Pasteur pipette, 3.5 mL BRAND Z331767 To moisten fish gills

References

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Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Karnaukhov, D., Sadovoy, A., Meglinski, I., Timofeyev, M. Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection. J. Vis. Exp. (136), e57491, doi:10.3791/57491 (2018).

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