Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

המשלבים Cytometry זרימה הדמיה Transcriptomic פרופיל כדי להעריך שינו CD1d Endocytic סחר

Published: October 29, 2018 doi: 10.3791/57528
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Environmental Health, University of Cincinnati College of Medicine

Summary

הדמיה cytometry זרימה מספקת גישה אידיאלי כדי לזהות את שינוי מורפולוגי ופונקציונליים של תאים ברמות הפרט והן populational. הפונקציה endocytic שיבשו למצגת אנטיגן השומנים ב החשופים מזהם את האדם תאים דנדריטים הודגם עם transcriptomic בשילוב פרופיל של ביטוי גנים, הפגנה מורפולוגי של חלבון סחר בבני אדם.

Abstract

ניתוח populational של שינוי מורפולוגי ופונקציונליים של חלבונים endocytic הם מאתגרים עקב הדרישה של לכידת תמונה-ניתוח תמונה ברמה וסטטיסטיים תא בודד ברמה populational. כדי להתגבר על הקושי הזה, השתמשנו הדמיה cytometry זרימה, transcriptomic פרופיל (RNA-seq) כדי לקבוע שונה לוקליזציה subcellular של האשכול של בידול 1d חלבון (CD1d) הקשורים עם ביטוי גנים endocytic לקוי-אנוש תאים דנדריטים (Dc), אשר נחשפו המשותף lipophilic אוויר מזהם benzo pyrene [א]. Colocalization של CD1d וחלבונים סמן endocytic Lamp1 מתוך אלפי תמונות תא שנתפסו עם הדמיה cytometry זרימה נותחו באמצעות רעיונות ו- ImageJ-פיג'י תוכניות. תמונות הסלולר רבים עם שותף מוכתם חלבונים CD1d ו Lamp1 היו דמיינו לאחר gating על CD1d+Lamp1+ DCs באמצעות רעיונות. Colocalization CD1d ו Lamp1 משופרת על BaP חשיפה נוספת הדגימו באמצעות thresholded scatterplots, נבדק עם המקדמים של Mander עבור עוצמת משותפת לשפות אחרות, המותווה מבוסס על האחוז של אזורי משותף לשפות אחרות באמצעות ImageJ-פיג'י. הנתונים שלנו לספק גישה פלייבקים, bioinformatic יתרון למדוד חלבון colocalization ברמות יחיד והן populational הסלולר, תומך תוצאה מליקוי תפקודי של שינוי transcriptomic של האדם חשוף מזהמים בקרי קבוצת מחשבים.

Introduction

אנטיגן המצגת כוללת בדרך כלל חלבונים תאיים סחר, אשר לעיתים קרובות נחקר באמצעות אפיון מורפולוגי, יצירת פרופילים פנוטיפי של אנטיגן הצגת תאים1,2,3 . כדי לשלב את היתרונות של דימות ופעולות phenotyping, נתאר פלטפורמה ניתוח ההדמיה על תא בודד והן רמות האוכלוסיה להפגין colocalization שינו חלבון בתאים דנדריטים אנושי (Dc). במצגת אנטיגן פפטיד, הגדולות histocompatibility מורכבים (MHC) מחלקה אני מולקולות לאגד פפטיד קצר (8-10 שאריות) ב רשתית תוך-פלזמית כדי להפעיל CD8 קונבנציונלי+ T תאים, בעוד MHC class II מולקולות לאגד ארוך יחסית של פפטיד (שאריות ~ 20) בתאים endocytic להפעלת CD4 קונבנציונלי+ T תאים1,4. לעומת זאת, תאי T ספציפי השומנים מופעלים על ידי CD1 חלבונים עם אנטיגנים השומנים נטען בעיקר בתוך תאי endocytic5,6. מצגת אנטיגן השומנים דורש את האספקה של השומנים המטבוליטים המיוצר השומנים חילוף החומרים7,8,9,10 ו הטעינה של השומנים פונקציונלי מטבוליטים CD1 חלבונים ב- תאים endocytic5,6. בהקשר זה, גורמים שונים הסלולר להתכוונן המצגת אנטיגן השומנים, במיוחד, החשיפה הסביבתית של מזהמים lipophilic, כשל חיסוני, הם קריטיים כדי להיות מוגדר. במחקר זה, השתמשנו transcriptomic ניתוח תמונת פרופיל, תאית populational הדמיה וניתוח של האדם נגזר מונוציט DCs לקביעת חלבון endocytic הסחר תורם למצגת אנטיגן השומנים בחשיפה מזהמים. בהחלט, ניתן להחיל פלטפורמה משולבת זו ללמוד חלבון subcellular סחר, colocalization בתהליכים ביולוגיים שונים.

טכנית, לוקליזציה חלבון subcellular הודגם בדרך כלל באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתח סטטיסטית במספר מוגבל של תאים שזוהו1,2,3,11. יתר על כן, cytometry זרימה בהרחבה הוחלה על שער תא אוכלוסיות עם אותות מוכתם משותפת של מספר חלבונים הסלולר ברמה12; עם זאת, זה חסרה ויזואליזציה מפורטת של חלבון subcellular colocalization. כדי להשיג ניתוחים סטטיסטיים ומקיף של אחוז חלבון colocalization ברמות הסלולר והן באוכלוסייה, אנו משלבים את הדמיה תיעוד וניתוח גישות כדי לקבוע את התכונות של חלבון colocalization עם ביולוגית רלוונטיות. באופן ספציפי, אנו משתמשים מיכשור הדמיה כדי לזהות את colocalization של CD1d ו חלבון ממברנלי lysosomal-הקשורים 1 (Lamp1) חלבונים במחקר זה. ניתוח כמותי של מולקולות colocalized היה בעבר קשה לביצוע בקנה מידה populational. במחקר זה, שינינו את התוכנית ImageJ-פיג'י לבחון את אחוז חלבון colocalization עם מספר גדול של תאים שותף מוכתם ברמה התאית הן populational והן בודדים. באופן ספציפי, מדדנו אזורי משותף לשפות אחרות, העוצמה וגודל populational כדי לתמוך במסקנה כי החלבון CD1d נשמר בעיקר בתאים endocytic מאוחר של בקרי תחום אנושי חשיפה benzo מזהם lipophilic [א] pyrene (BaP)13 . זה המשולבים סלולארי והאוכלוסיה הדמיה ניתוח סיפק תוצאות מאוד לשחזור מקיף, סטטיסטית CD1d-Lamp1 colocalization הרלוונטי למצגת אנטיגן השומנים עכבות.

Transcriptome החשופים BaP בדרור האנושי נתמך בחוזקה את ההשערה כי endocytic מטבולי וסחר CD1d endocytic היו ליקויי BaP בחשיפה. כדי לבדוק השערה זו, אנחנו מוחלים מיכשור הדמיה לפרופיל תמונות מאוכלוסיית DC משותפת היו מוכתמים חלבונים מרובים כולל CD1d endocytic סמנים, סמנים DC. לבסוף, תאים שותף מוכתם נותחו סטטיסטית כדי להדגים את האחוז של עוצמת ותחומי CD1d ו Lamp1 colocalization.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקולים האנושי במחקר זה אושרו על-ידי ועדת הבדיקה המוסדי באוניברסיטת סינסינטי, כל השיטות בוצעו בהתאם ההנחיות הרלוונטיות והתקנות. דגימות דם מתורמים בריאים התקבלו ממרכז דם Hoxworth במרכז הרפואי של אוניברסיטת סינסינטי.

1. Transcriptomic פרופיל החשופים מזהמים בדרור נגזר מונוציט אנושי

  1. סה כ החילוץ-RNA חשוף BaP בדרור
    1. להבדיל DCs האנושי באמצעות ציטוקינים GM-CSF ו- IL-4, ולחשוף DCs כדי BaP עבור 4 ימים13.
    2. למיין החשופים BaP DCs באמצעות cytometry זרימה בהתבסס על הסימנים ביטוי משטח (השושלת–הלע-DR+), ורובם מורכב DCs קונבנציונאלי (CD11c+CD1c+)13. בדרך כלל, למיין 10,000 DCs לתוך תרבות בינוני המכיל 10% FBS, צנטריפוגה DCs-600 x g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות, להסיר לאלתר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה באמצעות טיפ פיפטה 1 מ"ל.
    3. ברגע תגובת שיקוע יוסר על ידי השאיפה, lyse בגדר תא על-ידי הוספת 0.4 מ של מאגר פירוק/איגוד הערכה בידוד RNA עבור אחסון ב- 80 ° C לפני החילוץ-RNA.
    4. להשתמש בערכה בידוד RNA עם פרוטוקול הכולל של מיצוי RNA כדי לחלץ את ה-RNA הכולל14. למדוד את תקינות RNA באמצעות Bioanalyzer15.
  2. ניתוח Transcriptomic של מיון בקרי קבוצת מחשבים (איור 1 א')
    1. להכין ספריית ה-RNA-seq באמצעות ערכת הכנה ספריית ה-RNA. בקיצור, קטע את הרנ א לבודד poly-A (~ 200 bp), להפוך לתעתק את השברים לחוף הראשון של cDNA ופעל על-ידי הסינתזה cDNA סטרנד השני המסומנת dUTP.
    2. מאתרים ומפסיקים גדיל כפול cDNA למתאם עם מבנה גזע לופ לאחר טיהור חרוז, תיקון סוף ו dA-עוקב. לסלק את שאריות אורציל סטרנד השנייה של הלולאה cDNA ומתאם עם אנזים המשתמש (ריאגנט כריתה ספציפיים אורציל) כדי לשמור על ירידה לפרטים סטרנד ולפתוח הלולאה מתאם עבור ה-PCR.
      1. לבצע 13 מחזורים של ה-PCR באמצעות תחל ואוניברסלי אינדקס ספציפיות כדי להעשיר את ספריית באינדקס. לנקות את הספריה ולהפעיל על שבב רגישות גבוהה של ה-DNA Bioanalyzer לבדוק את איכות ספריה, גודל הפצה.
    3. השתמש ערכת כימות ספריה, מערכת ה-PCR בזמן אמת בשילוב עם מידע על גודל הספרייה לחישוב ספריית הריכוז באמצעות שיטה עיקול רגיל.
    4. באופן פרופורציונלי מאגר ספריות תואם באינדקס בנפרד ולהתאים את הריכוז הסופי 15 pM. לבצע ספריית אשכול הדור, רצף הספרייה בקביעה של קריאה יחיד 1 x 50 bp כדי להפיק ~ 25 מיליון קריאות עבור דגימה.
  3. רצף
    1. לטעון את הרצף ואינדקס ריאגנטים המדפים ריאגנט SBS ו- PE, בהתאמה. מקם את ריאגנטים באמבט מים מעבדה-ציונים עבור 1 h עד כל הקרח נמס, ריאגנטים כל הבקבוק/צינור מעורבבים כראוי.
    2. מכינים את תערובת ICB על-ידי הוספת האנזים צבע ו-20 ° C המופשרים הבקבוק ומערבבים. להכין פתרון NaOH בהתאם להוראות רצף. מקם כל ריאגנטים ב 4 ° C עד מוכן לשימוש.
    3. במהלך האחד עשר זמן המתנה, כוח על הרצפים (sequencer). המתן הכונן DONOTEJECT מופיעים ולחבר את המחשב בכונן רשת.
    4. הפעל את תוכנת שליטה הרצפים (sequencer).
    5. להכין 2 ל' של פתרון תחזוקה שטיפת המכילה 0.5% Tween 20 ל- 0.03% ProClin 300 כיתה מעבדה בתוך המים.
    6. בארון ריאגנט SBS, להוסיף ~ 100 מ"ל של תחזוקה שטיפת פתרון אחד של שמיניית, וכן משפך מזרקי אל הבקבוקים. בארון ריאגנט PE, להוסיף ~ 12 מ ל תחזוקה שטיפת פתרון לכל אחד הצינורות חרוט 10 15 מ"ל, למחוק את הפקקים.
    7. טען השני ארונות עם הפתרון מילוי בקבוקים/צינורות כדי הרצפים (sequencer).
    8. תוכנת שליטה של הרצפים (sequencer), בחרו בכביסה תחזוקה; בצע את ההוראות שעל המסך כדי שתנקה את המערכת נוזל הרצפים (sequencer) עד להשלמת התהליך.
    9. להתחיל לרוץ חדש בכרטיסיה "רצף" מתוך התוכנה; כוונו את נתוני הפלט לכונן רשת. לבחור פרמטרים עבור קריאה יחיד 1 x 50 bp עם ספריות אינדקס אחד מרובב.
    10. באופן אופציונלי, להיכנס לתוך הרכזת רצף BaseSpace כך מצב הרצף ניתן לנטר מרחוק באמצעות מחשב או טלפון חכם.
    11. העלה גיליון לדוגמה עבור demultiplexing, לספק מידע ריאגנט לפי הדרישה תוכנה.
    12. לטעון ריאגנטים SBS ו- PE הרצפים (sequencer). ראש המערכת עם תא זרימה בשימוש (~ 15 דקות).
    13. לאחר השלמת הדור אשכול (h. ~4.5), להוציא את התא זרימה, בקלילות לרסס את התא זרימה עם מים, תנגבי אןתן שימוש בנייר העדשה. בקלילות לרסס את התא זרימה עם 95% אתנול, נגב את זה יבש. בדוק נגד אור כדי לוודא כי השטח נקי ללא פסולת או שאריות של מלח.
    14. לאחר השלמת השלב ראש הממשלה, לטעון את התא זרימה באשכולות ולהתחיל את הרצף. התוכנה מציג ניתוח רצף אוטומטי יופעל.
    15. לפקח על איכות הנתונים רצף דרך סאב כולל צפיפות אשכול, קריאות מסנן, אשכול עוברים סינון %, % ≥Q30, המורשת שלב/prophase %, יצירת האינדקסים QC, וכו שזה עוזר להבין את איכות הנתונים וכיצד לפתור בעיות.
    16. לשנות את האטם תא זרימה ולבצע שטיפה תחזוקה לאחר השלמת הרצף. הרצפים (sequencer) מוכן למיתקפה הבאה.
  4. ניתוח Bioinformatic
    1. לבצע ביואינפורמטיקה RNA-seq נתונים ניתוח13.

2. מסלול ניתוח של פרופילים Transcriptomic (איור 1B)

  1. השתמש edgeR של Bioconductor כדי להשוות בין תוצאות ג'ין ביטוי בעוצמה ספירות בין בקרי התחום החשופים BaP, שאינו חשוף מתורמים שלוש. לאחר מכן, לזהות גנים ביטוי באופן שונה בין DCs החשופים BaP, שאינו חשוף בהתבסס על השינוי המוחלט קיפול (> 2 קיפולים) גילוי שקר לדרג ערכים (פד) - מנוכי עונתיות p-(< 0.05).
  2. כדי לחזות אשכולות פונקציונלי באופן שונה הביע גנים, להשתמש בחבילת תוכנה ToppCluster חפש את הגנים שינו מול מספר מסדי נתונים כולל קג REACTOME ועד להפקת נתוני האשכולות. ToppCluster משתמשת הבדיקה ההיפר-גיאומטרית כדי לקבל העשרה תפקודית באמצעות ניתוח16העשרה רשימת גנים.
  3. בהמשך קלט את התוצאות של אלה אשכולות פונקציה Cytoscape17,18 גרסה 3.3.0, פלטפורמת תוכנה קוד פתוח באופן כללי משמש להמחשת רשתות מורכבות. לפיכך, הגנים המעורבים אשכולות שונים או מסלולים, כולל אשכולות endocytic מטבולי, מוצגים ברשת עם ביאור צבע של השינוי קיפול בממוצע של ג'ין ביטוי (איור 1B)13.

3. הדמיה Cytometry זרימה של CD1d ו Lamp1 Colocalization

  1. נוגדן תיוג החשופים BaP בדרור
    1. וחושפים 0.5 x 10 DCs האנושי6 מ"מ 5.94 BaP עבור 4 ימים ב- 37 מעלות צלזיוס ב 2 מיליליטר של Dulbecco מלאה בינוני ששינה רשנה. הקציר בקרי קבוצת מחשבים על ידי צנטריפוגה-400 g x עבור 10 דקות לחסום בקרי התחום הבדיל מאת המקננת תאים עם חוסם בנסיוב אדם, אדם אנטי Fc קולטן נוגדנים במשך 10 דקות בקרח, כולל נוגדנים נגד CD16, CD32 ו- CD64.
    2. דגירה סגול מבריק 421-נגד-CD1c (L161), phycoerythrin/cyanine לצבוע הלע (PE/Cy7) - נגד - 7-ד ר ו PE/Cy5-נגד-CD11c עם בקרי קבוצת מחשבים עבור 20 דקות בקרח. טבלה 1 מציגה רשימה זו של נוגדנים.
    3. לתקן DCs עם 4% paraformaldehyde ב- PBS, permeabilize אותם עם מאגר לשטוף Permeabilization. לבצע ההכתמה תאיים עם תערובת של התווית על-ידי PE מטוהרים נגד האדם CD1d (51.1), התווית על-ידי אלקסה עבור חיל הים 647 אנטי-Lamp1 (CD107a) (H4A3).
  2. הדמיה מדידה cytometry זרימה (איור 2)
    1. לנתח את הדגימות מוכתם באמצעות cytometer הדמיה של זרימה בתוך ליבת cytometry זרימה של בית החולים לילדים בסינסינטי באמצעות מטרה X 40 להניב 300 פיקסלים עבור תא עם בסביבות 10 מ מ קוטר. גודל פיקסל אחד הוא כ- 0.5 מ מ- 0.5 מ מ של האובייקט.
    2. רוכשים 10,000 תמונות סלולארית בצורה בלתי לא משוחדת על פי הוראות היצרן.

4. הדמיה ניתוחים של תמונות Cytometry זרימה

  1. Colocalization ניתוח באמצעות רעיונות תוכנה (איור 2)
    1. לבצע פיצוי יחיד שהוכתמו לעומת דגימות שאינו מוכתם על-ידי הגדרת עוצמת קרינה פלואורסצנטית שאינו מוכתם דוגמאות מתחת לסף, כולל שהוכתמו שאינם חשופים BaP DCs עם autofluorescence BaP, כמו נתונים cytometry זרימה שוטפת ניתוח.
    2. שער צבעונית תאים כדי להשיג את קבוצות משנה של ד ר+CD11c הלע+CD1d+Lamp1+ (איור 2 א) והתאים הצג תמונות הסלולר תת-קבוצות מגודרת (איור 2B).
    3. שמור תמונות תא בתבנית png המבוסס על שני קריטריונים טכניים הכללה, נוכחות חזותית של אותות מוכתם משותפת חזקה ולוקליזציה subcellular של חלבונים CD1d ו Lamp1, עבור הניתוחים colocalization באמצעות ImageJ-פיג'י (איור 2B).
  2. השתמש בתוכנת ImageJ-פיג'י לבצע ניתוח colocalization (איור 3).
    1. להכין את קובצי התמונה קלט על-ידי מיזוג תמונות שנשמרו תא 100 עבור שאינו חשוף ונחשף BaP DCs אנושי, בהתאמה (איור 3 א).
    2. לנתח CD1d (אדום), Lamp1 (ירוק) colocalization משתמש של scatterplot.
      1. הפעל תוכנית ImageJ-פיג'י. פתח את קובץ png עם 100 תמונות תא (3B איור , איור 4A): "קובץ | פתח'.
      2. לפצל את התמונה עם ערוצי אדום וירוק הממוזג שתי תמונות עם ערוץ ירוק או אדום: "תמונה | צבע | לפצל ערוצים".
      3. לצייר את scatterplot באמצעות הפקודות "נתח | Colocalization | סף colocalization". שמור את scatterplot באמצעות המפתח "PrintScreen" .
    3. חישוב מקדמי colocalization של Mander עבור כל תמונה סלולרית יחיד (n = 100) (איור 4B)
      1. בחר תמונה תא בודד על קובץ התמונה עם פצל ערוצים באמצעות "אובל" הכלי בחירה.
      2. השתמש בפקודות "נתח | Colocalization | סף colocalization". בחר "ערוץ 1" תיבת דיאלוג של אזור בעל עניין (ROI). לשמור על כל האופציות חישוב כולל "של Mander באמצעות ספי" עבור כל תמונה התא.
      3. חזור על חישוב זה עבור כל תא 100 תמונות.
      4. לשמור ולפתוח את התוצאות באמצעות גיליון אלקטרוני.
      5. להתוות את הממוצע ואת תקן שגיאות עבור "מקדמי של Mander thresholded" (n = 100, 0 מציין colocalization אין ו- 1 אומר colocalization מושלם). השתמש בשם מבחן t של סטודנט כדי לחשב את ערך p עבור ההשוואה בין הקבוצות החשופים BaP, שאינו חשוף (איור 4B).
    4. לחשב את האחוזים של עוצמת פיקסל thresholded משותפת לשפות אחרות בין CD1d ו Lamp1 לתמונות תאים מרובים (n = 100) (איור 4C).
      1. להשתמש באותו פרוטוקול ניתוח 4.2.3 ובחר בנוסף אפשרות התוצאה "עוצמת % מעל הסף colocalized".
      2. לבצע ניתוח זה יחד עם המקדמים של colocalization של Mander.
      3. בדומה לכך להתוות את הממוצע ואת תקן שגיאות עבור עוצמת % colocalized בין CD1d ו Lamp1. השתמש בשם מבחן t של סטודנט כדי לחשב את ערך p להשוואה בין קבוצות החשופים BaP, שאינו חשוף (איור 4C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Lipophilic מזהמים BaP הפיצולים אשכולות גנים endocytic ב DCs נגזר מונוציט DCs. האדם האנושי של כל תורם (n = 3) היו מודגרות עם BaP וממוינות עבור בקרי התחום קונבנציונאלי, אשר שימשו בהמשך RNA החילוץ transcriptomic וניתוח כמתואר . על הנורמליזציה של ביטוי גנים, גנים שונה בין הקבוצות החשופים BaP, שאינו חשוף היו מקובצים לפי המתאם פונקציונלי של גנים ביטוי באופן שונה. אנחנו קלט את הרשימה ג'ין שינו תוכנית Toppcluster16 עבור הניתוחים של מסלולים סלולר רלוונטיים ולבצע את הבדיקה סטטיסטי באמצעות תיקון שיעור (פד) גילוי שווא של ערכים p (איור 1B). מספר אשכולות גנים שהשתנו העיקריים, כולל מטבולי ופונקציות endocytic, זוהו החשופים BaP DCs. במחקר זה, במיוחד התמקדנו מבחן פונקציונלי endocytic סחר בבני אדם, כי כבר הצגת אנטיגן בתיווך CD1 תלויים במידה רבה אנטיגן השומנים מעמיסים מסלול endocytic5,19, 20,21.

סחר endocytic CD1d הוכח באמצעות הדמיה cytometry זרימה. בעת קבלת מספר גדול של תמונות התא באמצעות מיכשור הדמיה, התחלנו באמצעות התוכנית רעיונות לדמיין תמונות בודדות הסלולר דרך בנוחות gating אוכלוסיות תאים צבעונית במשותף עם מספר נוגדנים (איור 2 א). באופן ספציפי, היינו יכולים לשער האוכלוסייה DC הגדולות צבעונית בשיתוף עם ד ר הלע, CD11c להראות עוד יותר Dc עם ביטוי שיתוף CD1d ו Lamp1 (איור 2 א). אותות ויטראז'ים שיתוף יכול להעשיר דרך gating האוכלוסייה תא עם הכתם כפול של CD1d ו Lamp1 (איור 2 א). הראנו קודם שאינו חשוף נורמלי Dc עם colocalization מינימלית של חלבונים CD1d ו Lamp1, המציין את רמת הבסיס של סחר endocytic CD1d ברמה גבוהה של פני השטח ביטוי בתנאים פיזיולוגיים (איור 2B)5, 19,20,21. כדי למדוד את colocalization של חלבונים CD1d ו Lamp1, בתחילה השתמשנו רעיונות להראות עלייה קלה של פרט בהיר דמיון בין חלבונים CD1d ו Lamp1 עם חשיפה BaP13. הדמיון פירוט בהיר היה מחושב בהתבסס על מקדם המתאם של פירסון לבדיקת הקורלציה של שני הגורמים, בעוד חלבונים CD1d ו Lamp1 היו לא סביר מאוד חפפו במצב פיזיולוגי, המציינת כי CD1d מסוגל transiently תעבורה דרך תאים endocytic מאוחר כדי להשיג השומנים פונקציונלי אנטיגנים. לכן, היא גם משמעותית יותר ביולוגית כדי לבדוק אם החלבון CD1d BaP בחשיפה שומרת יותר בתאים endocytic מאוחרת כפי שהיא משתקפת האחוז מוגבר של חלבונים CD1d ו Lamp1 החופפים באמצעות פיג'י תוכנת הדמיה של ניתוח ב החבילה ImageJ. לבסוף, שמירה של החלבון CD1d בתאים endocytic מאוחר ניתן לאשר באופן פונקציונלי פרופילים ג'ין endocytic שינו BaP בחשיפה.

נמדדה בעוצמה משותפת לשפות אחרות ואזור בין חלבונים CD1d ו Lamp1. כדי לקבל הגדרה הסף לשחזור והאחוזים של אזורי משותף לשפות אחרות ועוצמה, והגשנו בקשה ImageJ-פיג'י22, אשר שימש גם כמה אחרים מחקרים23,24,25. אנו בוחרים באקראי CD1d+Lamp1+ תאים עם הכתם שותף חזק ולוקליזציה ברור subcellular של חלבונים CD1d ו Lamp1 כתמונות קלט (איור 2B). ניתן למזג תמונות בודדות הסלולר לקובץ תמונה בודדת לניתוח עקבית אחת (איור 3 א). במחקר שלנו, אנו למזג תמונות תא 100, פתח אותו בתוכנית כדי לנתח על-ידי הגדרת "ספי colocalisation" (איור 3B). Colocalization בעוצמה פיקסל בין שני ערוצים (התווית על-ידי PE CD1d ו Lamp1 התווית על-ידי AF647) הוצגה הכללי עם scatterplot על ידי גילוי הפיקסלים שותף מקומי מתמונות אלה תא 100 (איור 4A). בחלקה זו, קווים אופקיים ואנכיים. לייצג סף של המלך שלמה, הקווים האלכסוניים מייצגים היחס של העוצמה הכוללת פיקסלים בין שני ערוצים. הסף של בריטס מספק סביבה גלויים עבור הסרת פיקסלים חלש בשני ערוצים חופף. Scatterplot הביא מראה של colocalization מוגבר של חלבונים CD1d ו Lamp1 BaP בחשיפה. יתר על כן, אנו לכמת את מידת colocalization בין חלבונים CD1d ו Lamp1 באמצעות המקדמים של Mander (איור 4B). כתוצאה מכך, המקדמים של Mander מדגימים colocalization מוגברת בין CD1d ו Lamp1 בתאים endocytic מאוחר של בקרי התחום החשופים BaP השוואת עם בקרי תחום שאינו חשוף, כמו סטטיסטית הנתמכים על ידי הסטודנט t-הבדיקות (איור 4B). עם זאת, אם עוצמת חלבון הטרוגניות בין האזורים colocalized ו- colocalized, עוצמת colocalized יהיה ללא תחרות לאזורים colocalized. לכן, יש גם צורך בחינה נוספת colocalization מבוסס על עוצמת (איור 4C). כתוצאה מכך, כל עמודה מייצגת חישוב בממוצע של אחוז בעוצמה colocalized מתמונות תא מרובות (n = 100) בין תנאי החשופים BaP, שאינו חשוף עבור צמד של חלבונים משותפת לשפות אחרות. T-הבדיקות של סטודנט גם מראים מובהקות סטטיסטית (n = 100, p< 0.001) בין קבוצות החשופים BaP, שאינו חשוף עם המצוין תקן שגיאות. בסך הכל, הנתונים שלנו להפגין כי CD1d החלבון נשמר ב endosomes מאוחר-חשיפה BaP, תמיכה זה ביטוי גנים מהונדס BaP נוסף מוביל תפקוד לקוי endocytic ואת CD1d סחר.

לסיכום, CD1d-Lamp1 colocalization משפר עם BaP חשיפה. פרמטרים מרובים המבוסס על תמונות תא (איור 2B), כולל scatterplots בעוצמה פיקסל חופף (איור 4A), משופרת המקדמים של Mander (איור 4B), גדל אחוז בעוצמה חופף ( איור 4C), תומך אגירת endocytic CD1d BaP חשיפה. ניתוח זה colocalization של תמונות הסלולר היא גישה מדויקת כדי לקבוע את מידת colocalization חלבון ומדגימים את המנגנונים הביולוגיים של פונקציות תא, לדוגמה, עקבית עם הגנים endocytic שיבשו endocytic פונקציה ביטוי נוסף לתרום הפעלת עכבות מוגבלת CD1d T תאים13.

Figure 1
איור 1 : למבוכת DC transcriptomes בחשיפה BaP (א) זרימה של RNA-תת סעיף. ראשית, בקרת איכות (QC) ניתוח בוצע כדי לבחון את האיכות של RNA הכולל. באמצעות מערכת אוטומטית, ו RNA סך באיכות גבוהה כפי RNA קלט, poly-A היה מבודד, אשר הפגינו דלה rRNA בניתוח RNA QC poly-A. הרנ א poly-A היה נתון אז ספריה ממוכנת הכנה ויצירת אינדקס באמצעות PCR. בשלב הבא, הספרייה מוגבר נותחה על ידי Bioanalyzer עבור QC עם התשואה הצפויה והפצה גודל. לאחר qPCR כמת, ספריות אינדקס היו איחדו התקבצו אל תא זרימה עבור רצף ואת איכות נתונים רצף היה בזמן אמת פיקוח. הציר מייצג סעיפים היחסי של cytometry זרימה מכתים אותות. (B) Altered הגנים היו מקובצים באשכולות פונקציונליים שונים ומוצגים אשכולות גנים הקשורים מטבוליזם השומנים והפונקציה endocytic. אדום: CD1d; ירוק: Lamp1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : ניתוח של הסלולר תמונות באמצעות התוכנית רעיונות. (א) נגזר מונוציט DCs מ בריאים התורמים היו ראשית מגודרת על הלע-ד ר + CD11c + תאים, CD1d מגודרת על עוד יותר+Lamp1+ תאים באמצעות התוכנית רעיונות. תמונות סלולארית (B) היו מופק הלע-DR+CD11c+CD1d+Lamp1+ האוכלוסייה להמחשת תמונה סלולרית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : ניתוח של הסלולר תמונות באמצעות התוכנית פיג'י-ImageJ. תאים עם הכתם שותף חזק של חלבונים CD1d ו Lamp1 נבחרו באופן אקראי לניתוח תמונה באמצעות פיג'י-ImageJ, אך תאים * עם בלתי נראים או חלש מכתים החלבונים CD1d או Lamp1 הוצאה מהכלל כמו דמות 2B. תמונות (א) אלה שנבחרו באקראי סלולריים התכנסו לתוך קובץ תמונה בודדת כתמונה קלט. (B) colocalization הניתוח בוצע דרך קביעת הסף colocalization עבור ערוצי גם ירוק וגם אדום. Scatterplots נוצרו ןובשחב הסף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : Colocalization של חלבונים CD1d ו מנורה 1. באמצעות ערכת נתונים דומים דיווחו שארמה. et al. 13, עוצמת פיקסל שותף מקומי בין חלבונים CD1d ו Lamp1 מ- DCs-חשופים BaP שאינו חשוף ותנאי מחושבים מחדש, מוצג עם scatterplots (א). של mander עבור colocalization CD1d ו Lamp1 חושבו והקבוע מוצגים עם ממוצע מתמונות התא שנבחר (B). האחוז של עוצמת פיקסל משותפת לשפות אחרות היה גם מחושב (C). מובהקות סטטיסטית (n = 100, p < 0.001) הושג עם t של סטודנט-הבדיקות לעומת הקבוצה שאינו חשוף. תקן שגיאות היו מצוינת. הנתונים הם assay אחד עם תאים מתורם בריא. שני מבחני עצמאית בוצעו עם תוצאות דומות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

נוגדנים Fluorophores או נוגדנים משניים שיבוט
ד ר הלע Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) L243
CD11c Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) 3.9
CD1c סגול מבריק 421 L161
האדם נגד מטוהרים CD1d PE-נגד-עכבר IgG2b 51.1
Lamp1 אלקסה עבור חיל הים 647 (AF647) CD107a(H4A3)

טבלה 1: נוגדנים השתמשו במחקר זה. הודות עירור משותפת של פליטה אורכי הגל, fluorophores PE/Cy5 ו- AF647 חלקית לא-צביעת אותות. אנו משתמשים fluorophores האלה כדי לתייג חלבון פני השטח (CD11c), של חלבונים תאיים (Lamp1) בהתאמה להימנע שלהם חופפים אות ברמה subcellular. אנו משתמשים גם טיטור אופטימלית ופיצויים כדי למזער את האותות החופפים בין שני fluorophores.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אישור פונקציונלי נתיב הגנים שינו הוא מאתגר, בגלל התבטאות גנים מושפעים נרחב המערבות מספר מסלולים ואת הקושי לשלב בודדים ופעילויות הסלולר populational. אנחנו מועסקים מיכשור הדמיה במיוחד במבחן CD1d סחר בתאים endocytic. הדמיה cytometry זרימה משלבת את המדידה populational של תאים ההפגנה בודדים של colocalization subcellular של מספר חלבונים. מיקרוסקופיה קונפוקלית סיפקה בעבר ברזולוציה גבוהה במדידת חלבון colocalization, cytometry זרימה הוא מסוגל לספק phenotyping מקיף עבור אוכלוסיות תאים שונים. הדמיה cytometry זרימה משלב את היתרונות של מיקרוסקופיה קונפוקלית ו cytometry זרימה-רזולוציית התמונה מקובל לנתח את החלבון colocalization באופן פרופיל גבוה לאישור פונקציונלי של שינוי transcriptomic על ידי הסביבה מזהמים.

ניתוחים של colocalization של חלבונים מרובים במידה populational טכנית דורשים, כי (i) מפורט ניתוחים של מספר תאים בודדים הם עתירי עבודה יחסית משוחד; (ii) קשה להגדיר על סף אופטימלית עבור לפרש פיקסלים החופפים בהתאם בעוצמה או שטח של צביעת חיובי; וכן (iii) תצפית מאוזנת של תאים בודדים, populational היא קריטית. במחקר זה, התמקדנו ביצוע אבחנה משמעותית מבחינה ביולוגית, מבחן מובהקות סטטיסטית, בהפגנה הדמיה של חלבונים משותפת לשפות אחרות. כדי להשיג מטרה זו, תחילה השגנו אלפי תמונות של בקרי התחום האנושי באמצעות הדמיה cytometry זרימה. כמותני של הדמיה קבצים בשילוב ניתוח דמיון פירוט בהירים, שימוש בתוכנה רעיונות וניתוח colocalization נבדק סטטיסטית באמצעות פיג'י-ImageJ. התוכנית רעיונות מאפשרת gating האוכלוסייה משותפת מוכתם, חישוב colocalization של שני חלבונים באמצעות דמיון פירוט בהיר המבוסס על מקדם המתאם של פירסון, והמוכתמות באקראי בחירה משותפת תאים עם לוקליזציה subcellular של חלבונים13. להשיג עוד ההפגנה הרלוונטיים הביולוגי של חלבונים משותפת לשפות אחרות, אנחנו עשתה שימוש בתוכנה ImageJ-פיג'י, מוחל המקדם של Mander כדי לחשב את אחוז אזורי משותף לשפות אחרות והוא חופף עוצמת פיקסל כדי להדגים את מידת לוקליזציה CD1d בשביל endocytic.

השלב הקריטי עבור שימוש בתוכנית ImageJ-פיג'י היא לבצע הדמיה ניתוח תא ותא. וריאציה של אחוז חלבון colocalization תאים בודדים ניתן לנטר לעומת צבעים באופן חזותי הממוזג מתמונות תא בודד. על ידי חישוב ממוצע של colocalization חלבון אחוז מכל התאים 100, ניתן לחשב את האמצעים ואת תקן שגיאות כדי להדגים colocalization חלבון ותפקודי מיתאם ברמה populational. ניתוח זה ביואינפורמטיקה הוא פשוט והביאה פשוטה ללא בדבר תוצאות חד משמעיים, כי ניתוח זה מציע חישוב הסף לשחזור בשיטה של בריטס לייצר אותו סף עבור ערכות הנתונים זהה, סף דומה עבור datasets דומה26. המגבלה של טכניקה זו היא קלט ידני מהגידולים של תא בודד תמונות ומבחר שעשויות להיות סובייקטיבית חזותית משותפת מוכתם תאים באמצעות התוכנה רעיונות. במחקר שלנו, אנחנו מנתחים 100 תמונות תא מכל קבוצה, לנו להגדיר את קריטריוני הבחירה לשחזור, כולל אותות מוכתם משותפת חזקה ונקה לוקליזציה subcellular של חלבונים CD1d ו Lamp1. התגברות על מגבלות אלה דורש שיפור טכני של תוכנות אנליטיות כדי לאפשר ניתוח אצווה ומבחר אובייקטיבית של תאים בודדים בהתבסס על תכונות מורפולוגיות מעבר עוצמת מכתימים שסופקו על-ידי cytometry זרימה. לסיכום, המשולבים סלולארי, האוכלוסייה הדמיה ניתוח תספק תוצאות מאוד לשחזור מקיף, נבדק סטטיסטית, רלוונטי מבחינה ביולוגית של אחוז חלבון colocalization. אנו מאמינים שניתוח colocalization CD1d-Lamp1 זה יכול לשמש דוגמה מוצלחת של פרופיל גבוה ניתוחים הדמיה הסלולר לענות על שאלות רחבה יותר על שינוי מורפולוגי פונקציונלי של החלבונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף

Acknowledgments

המחברים, רוברט Giulitto (Hoxworth דם מרכז) תודה דגימות דם אדם וקורא ד ר Niu ליאנג על נירמול של ביטוי גנים. אנו מודים גם מענק תמיכה מ נבחרת המכון למדעי בריאות הסביבה (ES006096), המרכז גנטיקה סביבתיים (CEG) הפרויקט טייס (תרגום), המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (AI115358) (תרגום), אוניברסיטת פרס המועצה למחקר של אוניברסיטת סינסינטי (תרגום), האוניברסיטה של סינסינטי המכללה של רפואה הליבה שיפור המימון (אקס Z.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transcriptomics Illumina HiSeq 2500 v4 Illumina HiSeq system
ImagingStream X Millipore 100220 Imaging flow cytometry
mirVana miRNA Isolation Kit Thermo Fisher Total RNA extraction
Agilent RNA 6000 Pico Kit Agilent Total RNA QC analysis
Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler Thermo Fisher PCR, enzyme reaction
NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module  New England Biolab PolyA RNA purification
Automated SMARTer Apollo system Takara PolyA RNA purification
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina New England Biolab Library preparation
Agencourt AMPure XP magnetic beads Beckman Coulter DNA purification 
2100 Bioanalyzer Agilent Library QC, size distribution analysis
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Library QC, size distribution analysis
QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) Thermo Fisher Library quantification
NEBNext Library Quant Kit New England Biolab Library quantification
cBot Illumina Library cluster generation
TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot – HS Illumina Library cluster generation
HiSeq 1000 Illumina Sequencing
TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles) Illumina Sequencing
Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) Bio Legend L243
Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) Bio Legend 3.9
Brilliant violet 421 Bio Legend L161
PE-anti-mouse IgG2b Bio Legend 51.1
Alexa Fluor 647 (AF647) Bio Legend CD107a(H4A3)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roche, P. A., Cresswell, P. Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells. Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).
  2. Huang, S., et al. MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells. The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).
  3. Nakamura, N., et al. Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling. Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).
  4. Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).
  5. Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
  6. Zajonc, D. M., Kronenberg, M. CD1 mediated T cell recognition of glycolipids. Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).
  7. Cox, D., et al. Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules. PloS one. 4 (5), e5325 (2009).
  8. Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments. Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).
  9. Huang, S., et al. Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).
  10. de Jong, A., et al. CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens. Nature. 15 (2), 177-185 (2014).
  11. Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).
  12. Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
  13. Sharma, M., et al. Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants. Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).
  14. Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).
  15. Nachamkin, I., et al. Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene. Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).
  16. Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems. Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).
  17. Bauer-Mehren, A. Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape). Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).
  18. Cline, M. S., et al. Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape. Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).
  19. Huang, S., Moody, D. B. Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system. Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).
  20. Huang, S. Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis. Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).
  21. Moody, D. B., Porcelli, S. A. Intracellular pathways of CD1 antigen presentation. Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).
  22. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9 (7), 676-682 (2012).
  23. Diard, M., et al. Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype. Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).
  24. Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
  25. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature. 9 (7), 697-710 (2012).
  26. Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).

Tags

אימונולוגיה זיהום בעיה 140 הדמיה Cytometry זרימה ImageJ-פיג'י רעיונות Transcriptomics מסלול ניתוח Cytoscape
המשלבים Cytometry זרימה הדמיה Transcriptomic פרופיל כדי להעריך שינו CD1d Endocytic סחר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sharma, M., Zhang, X., Huang, S.… More

Sharma, M., Zhang, X., Huang, S. Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking. J. Vis. Exp. (140), e57528, doi:10.3791/57528 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter