Summary
Imaging проточной цитометрии предоставляет идеальный подход для выявления морфологических и функциональных изменений клеток на индивидуальном и популяционной уровнях. Нарушается функция endocytic для презентации антигена липидов в подвергшихся воздействию загрязнителей дендритных клетках человека была продемонстрирована с профилирования комбинированных транскриптомики экспрессии генов и морфологических демонстрации оборота белка.
Abstract
Популяционной анализа морфологических и функциональных изменений endocytic белков сложной из-за спроса захвата изображения на одну ячейку анализа уровня и статистические изображений на популяционной уровне. Для преодоления этой трудности, мы использовали визуализации проточной цитометрии и транскриптомики, профилирование (РНК seq) для определения измененных субцеллюлярные локализации Кластер дифференцировки 1d белка (CD1d) связанные с нарушением endocytic ген выражение в человека дендритные клетки (DCs), которые были подвержены общей липофильных воздушных загрязнителей бензо [а] пирена. Colocalization CD1d и endocytic маркер Lamp1 белков из тысячи клеток изображения, снятые с imaging проточной цитометрии было проанализировано, используя идеи и ImageJ-Фиджи программы. Многочисленные сотовой изображения с совместно окрашенных CD1d и Lamp1 белки были визуализирована после стробирования на CD1d+Lamp1+ РС с помощью идей. Расширение CD1d и Lamp1 colocalization на Бат экспозиции далее была продемонстрирована с помощью показатели scatterplots, протестированы с Мандер в коэффициенты для совместного локализованных интенсивности и нанесены на основе доли совместно локализованных участков с помощью ImageJ-Фиджи. Наши данные обеспечивают выгодно инструментальная и bioinformatic подход для измерения colocalization белка на как одного, так и популяционной сотовой уровнях, поддерживая зрением функциональный результат транскриптомики изменения в подвергшихся воздействию загрязнителей человека РСУ.
Introduction
Презентация антигена, как правило, включает внутриклеточных белков людьми, который часто исследовано с помощью морфологических характеристик и фенотипические профилирование антиген представляющих клеток в1,2,3 . Чтобы интегрировать преимущества изображений и методов фенотипа, мы описываем анализа платформа отображения информации на одну ячейку и численности населения продемонстрировать измененный белок colocalization дендритных клеток человека (DCs). В презентации антигена пептидный комплекс гистосовместимости (MHC) сорта молекул привязать короткие пептиды (8-10 остатков) в эндоплазматический ретикулум активировать обычных CD8 клетки+ T, хотя II молекул MHC класса привязки относительно больше пептид (~ 20 остатков) в endocytic отсеках для активации обычных CD4 клеток+ T1,4. В противоположность этому липидов специфичные Т-клетки активируются CD1 белки с антигенами липидов, главным образом в endocytic отсеков5,6. Презентация антигена липидов требует питания липидов метаболитов в липидного метаболизма7,8,9,10 и загрузка функциональных липидов метаболитов CD1 белки в endocytic отсеков5,6. В этом контексте различных клеточных факторов, модулирует презентации антигена липидов, особенно в экологические воздействия липофильных загрязнителей и иммунных, важно определить. В этом исследовании мы использовали транскриптомики анализ, профилирование изображения и клеточных и популяционной изображений анализ человека моноцитарных DCs для определения торговли endocytic белка, способствует презентации антигена липидов в воздействия широкого круга загрязнителей. Конечно это комбинированные платформы может применяться для изучения торговли внутриклеточных белков и colocalization в различных биологических процессах.
Технически локализация внутриклеточных белков обычно была продемонстрирована с помощью конфокальной микроскопии и статистически проанализированы в ограниченное количество обнаруженных клетки1,2,3,11. Кроме того проточной цитометрии широко применяется для ворот клеточных популяций с совместно окрашенных сигналов нескольких белков на клеточном уровне12; Однако это не хватает подробной визуализации внутриклеточных белков colocalization. Для достижения всеобъемлющего и статистический анализ процент белка colocalization на уровнях как клеточного, так и населения, мы внедряем изображений профилирования и анализ подходов для определения функции белка colocalization с биологического актуальность. В частности, мы используем изображений проточной цитометрии для обнаружения colocalization CD1d и лизосомальных связанные мембранный белок 1 (Lamp1) белки в этом исследовании. Количественный анализ colocalized молекул был ранее трудно выполнить в популяционной масштабе. В этом исследовании мы адаптировали ImageJ-Фиджи программа для изучения процент белка colocalization с большим числом совместно окрашенных клеток на популяционной и индивидуальных клеточном уровнях. В частности мы измерили совместно локализованных участков, интенсивности и популяционной размер позволяет поддержать вывод о значительной степени сохранить CD1d белка в конце endocytic отсеках человека РС в подверженности липофильных загрязнителей бензо [а] пирена (БАП)13 . Этот комбинированный клеточного и населения, анализ изображений предоставляет высокую воспроизводимость, всеобъемлющий и статистически значимые результаты CD1d-Lamp1 colocalization отношение к презентации антигена тормозится липидов.
Транскриптом БАП облученных людей DCs решительно поддержали гипотезу, что endocytic липидного обмена и CD1d endocytic людьми были нарушениями в экспозиции БАП. Чтобы проверить эту гипотезу, мы применили изображений проточной цитометрии профилирование изображения DC населения, которые окрашивали совместно с несколькими белков, включая CD1d, endocytic маркеры и маркеры DC. Наконец, совместно окрашенные клетки были статистически проанализированы продемонстрировать процент от интенсивности и районов CD1d и Lamp1 colocalization.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Человека протоколов в этом исследовании были утверждены институциональных Наблюдательный Совет Университета Цинциннати и все методы были исполнены в соответствии с соответствующих руководящих принципов и правил. Образцы крови здоровых доноров были получены из центра крови Hoxworth в медицинском центре Университета Цинциннати.
1. транскриптомики профилирование воздействию загрязнителей человека моноцитарных DCs
- Общая добыча РНК БАП облученных DCs
- Дифференцировать человека DCs, используя цитокинами ГМ-КСФ и Ил-4 и разоблачить DCs бат за 4 дня13.
- Сортировать БАП облученных DCs, с помощью проточной цитометрии, основанный на поверхности выразили маркеры (линии–HLA-DR+), большинство из которых состоит из обычных DCs (CD11c+CD1c+)13. Как правило, сортировка 10000 РС в питательной среды, содержащие 10% FBS, центрифуга РС в 600 x g и 4 ° C на 6 мин и немедленно удалить супернатант стремление с помощью кончика пипетки 1 мл.
- После супернатант удаляется путем аспирации, Лизируйте клетки Пелле, добавив 0,4 мл буфера Lysis/привязки из РНК изоляции комплект для хранения в-80 ° C до извлечение RNA.
- Используйте комплект изоляции РНК с общей РНК добыча протокол для извлечения всего РНК14. Мера целостности РНК с помощью Bioanalyzer15.
- Транскриптомики анализ отсортированных DCs (рис. 1A)
- Подготовьте библиотеку для РНК seq с использованием библиотеки РНК подготовки комплекта. Короче говоря, фрагмент РНК изолированных поли A (~ 200 bp), обратный транскрибировать фрагменты в 1-й нити cDNA и следить за второй синтез cDNA стренги, помечены dUTP.
- Перевязать cDNA стренги двойной адаптер с стволовых циклической структуры после очистки шарик, конец ремонт и dA хвостов. Акцизный остатков урацила в 2-й нити cDNA и адаптер петля с энзимом пользователя (зависящие от урацила иссечение реагент) чтобы сохранить специфику прядь и открыть адаптер петля для ПЦР.
- Выполните 13 циклов PCR с помощью универсального и индекс специфические праймеры обогатить индексированные библиотеки. Очистить библиотеку и работать на Bioanalyzer ДНК высокой чувствительности чип, чтобы проверить качество библиотека и размер распределения.
- Использовать библиотеки комплекта количественной оценки и системы PCR реального времени в сочетании с библиотека размер информации для расчета библиотека концентрации через метод стандартной кривой.
- Пропорционально бассейн индивидуально индексированных совместимых библиотек и настроить окончательный общая концентрация 15 pM. Выполните библиотека кластера поколения и последовательности библиотеки при настройке одного чтения 1 x 50 bp для создания ~ 25 миллионов чтений на сэмпл.
- Виртуализация
- Загрузите последовательность и индексирование реагентов для SBS и PE реагент стойки, соответственно. Место реагентов в водяной бане Лаборатория класса за 1 ч до тех пор, пока весь лед растаял и реагентов в каждой бутылке/трубе смешиваются должным образом.
- Подготовить ICB смесь, добавив талой красителя и -20 ° C фермента в бутылке и перемешать. Приготовляют раствор NaOH согласно последовательности инструкций. Поместите все реагенты на 4 ° C до готовой к использованию.
- В течение 1 ч. ожидания периода, Включите секвенсор. Ждать для DONOTEJECT диска и подключите компьютер к сетевой диск.
- Запуск программного обеспечения управления программы sequencer.
- Приготовьте 2 Л обслуживания промывочный раствор, содержащий 0,5% 20 анимации и 0,03% воды 300 в лаборатории класса ProClin.
- В SBS реагент стойку добавьте ~ 100 мл обслуживания Вымойте решения для каждой из 8 бутылок и воронки колпачки для бутылок. В стойке реагент PE добавить ~ 12 мл обслуживания промывочного раствора в каждый из десяти 15 мл конические трубы и отбросить шапки.
- Загрузка двух стоек с решением заполнены бутылки/трубы в секвенсор.
- Программное обеспечение управления программы sequencer выберите обслуживания мыть; Следуйте инструкциям на экране для очистки жидкости системы секвенсор, до тех пор, пока процесс завершится.
- Начать новый запуск на вкладке «Последовательность» от программного обеспечения; прямой вывод данных на сетевой диск. Выберете параметры для одного чтения 1 x 50 bp с единого индекса мультиплексированных библиотек.
- При необходимости войдите в хаб последовательности BaseSpace так, что состояние виртуализации может контролироваться удаленно через компьютер или смартфон.
- Загрузить образец листа для демультиплексирования и предоставлять информацию реагент согласно требований программного обеспечения.
- Загрузить SBS и PE реагентов в секвенсор. Премьер системы с ячейкой используется поток (~ 15 мин).
- После завершения создания кластера (~4.5 h), вынуть ячейку потока, слегка спрей поток клеток с водой и протрите сухой, с помощью объектива бумаги. Слегка спрей поток клеток с 95% этиловом спирте и вытрите его насухо. Проверьте против света, чтобы убедиться, что поверхность чистая без мусора или соли остатков.
- После завершения шага премьер, загрузить кластерный потока клеток и начать последовательность. Программное обеспечение последовательности анализа просмотра будет автоматически запущен.
- Мониторинг качества данных последовательности через SAV включая кластера плотность, читает фильтр, кластер перевал фильтр %, % ≥Q30, наследие фаза/профаза %, индексирование КК и т.д. , что это помогает понять качество данных и устранения неполадок.
- Изменить ячейки прокладка потока и выполнять техническое обслуживание мыть после завершения последовательности. Sequencer готова для следующего запуска.
- Bioinformatic анализ
- Выполняйте биоинформатики РНК seq данных анализа13.
2. путь анализ транскриптомики профилей (рис. 1B)
- Станок Bioconductor используйте для сравнения результирующая ген выражение интенсивности графов между БАП подвержены и не подвержены DCs от трех доноров. Затем, определите дифференциально выраженной генов между БАП подвержены и не подвержены DCs, основанный на изменении абсолютной раза (> 2 складки) и ложное обнаружение оценить (ФДР) - скорректированный p- значения (< 0,05).
- Для прогнозирования функциональных групп дифференциально выразил генов, используйте пакет программного обеспечения ToppCluster для поиска измененных генов против нескольких баз данных, включая KEGG и REACTOME и генерировать кластеризации данных. ToppCluster использует гипергеометрических тест для получения функциональных обогащения через анализ списка обогащения гена16.
- Далее входные результаты этих функции кластеров до Cytoscape17,18 версии 3.3.0, широко используемым открытым исходным кодом программного обеспечения платформы для визуализации сложных сетей. Таким образом генов, участвующих в различных кластерах или пути, включая endocytic кластеры и жирового обмена, показаны в сети с цвет Аннотация усредненной раз изменения генов выражение (Рисунок 1B)13.
3. томография проточной цитометрии CD1d и Lamp1 Colocalization
- Антитело маркировки БАП облученных DCs
- Разоблачение 0,5 x 106 человека DCs 5.94 мм бат за 4 дня при 37 ° C в 2 мл полной Дульбекко среднего изменения орла. Урожай DCs центрифугированием при 400 g x 10 мин блок дифференцированных DCs путем инкубации клеток с человеческой сыворотки окон и антигуманна Fc рецепторов антител для 10 мин в лед, включая CD16, CD32 и CD64 антител против человека.
- Инкубировать фиолетовый блестящий 421-анти CD1c (L161), фикоэритрин/цианиновые красители 7 (PE/Cy7) - анти - HLA-DR и PE/Cy5-анти CD11c с РС на 20 мин в лед. Таблица 1 показывает этот список антител.
- Исправьте DCs с параформальдегида 4% в PBS и разрушения их с Permeabilization мыть буфера. Выполните внутриклеточных окрашивание с смесь из PE-меченых очищенный антинародным CD1d (51,1) и Alexa Fluor 647-помечены анти Lamp1 (CD107a) (H4A3).
- Imaging цитометрии измерения потока (рис. 2)
- Анализируйте окрашенных образцов с использованием изображений проточный цитометр потока цитометрии суть Цинциннати Детская больница, используя 40 X цель приносить 300 пикселей для ячейки с диаметром около 10 мм. Один пиксель размер составляет примерно 0,5 мм, 0,5 мм объекта.
- Получить 10 000 сотовой изображения в непредвзято согласно инструкции производителя.
4. Анализ потока цитометрии изображений изображений
- Colocalization анализ с использованием программного обеспечения идеи (рис. 2)
- Выполнение компенсации с одной окрашенных по сравнению с не окрашенных образцов, установив интенсивности флуоресценции-окрашенных образцов ниже порогового значения, включая-окрашенных БАП облученных DCs с Бат аутофлюоресценция, как и обычные потока данных цитометрии анализ.
- Ворота, окрашенные клетки для получения подмножества HLA-DR+CD11c+CD1d+Lamp1+ клетки (рисунок 2A) и шоу сотовой изображения в закрытом подмножеств (Рисунок 2Б).
- Сохраните клетки изображения в формате png, основанный на двух технических критериях, визуального присутствия сильных совместно окрашенных сигналов и локализация внутриклеточных белков CD1d и Lamp1, для colocalization анализа с использованием ImageJ-Фиджи (Рисунок 2Б).
- Используйте программное обеспечение ImageJ-Фиджи для выполнения анализа colocalization (рис. 3).
- Подготовка файлов входного изображения путем слияния 100 изображений сохраненные клетки для человека DCs-воздействию и воздействию БАП, соответственно (рис. 3A).
- Анализ CD1d (красный) и Lamp1 (зеленый) colocalization с помощью рассеяния.
- Запустите программу ImageJ-Фиджи. Откройте файл .png с 100 ячеек изображения (рисунок 3B и рис. 4A): «файл | Открыть».
- Разбить изображение с Объединенные красный и зеленый каналы на два изображения с красный или зеленый канал: «изображение | Цвет | Разделить каналы».
- Нарисуйте диаграмму рассеяния, используя команды «анализ | Colocalization | Colocalization порог». Сохраните рассеяния, используя клавишу «PrintScreen» .
- Рассчитать Мандер в colocalization коэффициенты для каждого единого сотовой изображения (n = 100) (рис. 4B)
- Выберите одну ячейку изображение на файл изображения с разделить каналы с помощью «овальный « инструмент выделения.
- Используйте команды «анализ | Colocalization | Colocalization порог». Выберите «Канал 1» из диалогового окна региона интерес (ROI). Храните все параметры вычислений, включая «Мандер используя пороги» для каждой ячейки изображения.
- Повторите этот расчет для всех изображений 100 клеток.
- Сохранение и открытие результатов с помощью таблицы.
- Участок среднего и стандартные ошибки для «Показатели Мандер коэффициентов» (n = 100, 0 означает не colocalization и 1 идеальным colocalization). Используйте t критерия Стьюдента для вычисления значения p для сравнения между группами БАП подвержены и не подвержены (рис. 4В).
- Рассчитать процент показатели пиксель интенсивности совместно локализованные между CD1d и Lamp1 для нескольких ячеек изображения (n = 100) (рис. 4 c).
- Используйте один и тот же протокол анализа в 4.2.3 и Дополнительно выберите параметр результат «% интенсивности выше порога colocalized».
- Выполните этот анализ вместе с Мандер в colocalization коэффициенты.
- Аналогичным образом, земельный участок, среднем и стандартные ошибки для % интенсивности colocalized между CD1d и Lamp1. Используйте t критерия Стьюдента для вычисления значения p для сравнения между группами БАП подвержены и не подвержены (рис. 4 c).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Липофильные загрязнителей БАП изменяет endocytic гена кластеров в DCs моноцитарных человека DCs. человека от каждого донора (n = 3) были инкубировали с Бат и сортируются для обычных РСУ, которые использовались для РНК добыча и транскриптомики анализа как описано далее . После нормализации экспрессии генов измененных генов между группами БАП подвержены и не подвержены были сгруппированы согласно функциональной корреляции дифференциально выраженной генов. Мы ввода списка измененных генов Toppcluster программа16 для анализа соответствующих путей сотовой и проводить статистический тест, с помощью ложных обнаружения ставка (ФДР) коррекция значений p (рис. 1B). Несколько крупных измененный ген кластеры, включая метаболизм липидов и endocytic функции, были определены в Бат облученных DCs. В этом исследовании, мы специально сосредоточились на функциональное испытание endocytic людьми, потому что презентации антигена CD1-опосредованной был сильно зависит от антигена липидов, погрузка в endocytic путь5,19, 20,21.
CD1d endocytic торговли подтверждается с помощью тепловизионных проточной цитометрии. Получив большое количество клеток изображений с помощью тепловизионных проточной цитометрии, мы начали использовать идеи программы для визуализации отдельных клеточных изображений через удобно стробирования клеточных популяций, совместно витражи с несколькими антител (рис. 2A). В частности мы смогли ворота основных DC населения совместно витражи с HLA-DR и CD11c далее Показать DCs с CD1d и Lamp1 одним выражением (рисунок 2A). Совместное окрашенных сигналы можно обогатить через стробирования популяции клеток с двойной пятно CD1d и Lamp1 (рис. 2A). Мы впервые показали-облученных нормальной DCs с минимальным colocalization CD1d и Lamp1 белков, указанием базальный уровень CD1d endocytic торговли и высокий уровень экспрессии поверхностных в физиологических условиях (рис. 2B)5, 19,,2021. Для измерения colocalization CD1d и Lamp1 белков, мы первоначально использовали идеи Показать незначительное увеличение ярких подробно сходство между CD1d и Lamp1 белки с Бат экспозиции13. Яркие детали сходство было рассчитываются на основе коэффициента корреляции Пирсона для тестирования корреляции двух факторов, в то время как CD1d и Lamp1 белки вряд ли сильно перекрываются в физиологическое состояние, указывающее, что CD1d способна временно трафик через конце endocytic отсеков для получения функциональных липидов антигены. Таким образом, это более биологически значимые для проверки ли CD1d белка в экспозиции БАП сохраняет более в конце endocytic отсеках, как отражено увеличение доли перекрытые CD1d и Lamp1 белков, с использованием изображений Фиджи программное обеспечение анализа в ImageJ пакет. Наконец удержания CD1d белка в конце endocytic отсеках может использоваться для функционально подтверждения измененный ген endocytic профили в экспозиции БАП.
Была измерена совместно локализованных интенсивности и район между CD1d и Lamp1 белков. Для получения воспроизводимых порога и проценты совместного локализованных участков и интенсивности, мы применили ImageJ-Фиджи22, которая также использовалась в ряде других исследований23,24,25. Мы случайно выбрать CD1d+Lamp1+ клеток с сильным Сопредседатель пятно и ясно субцеллюлярные Локализация белков CD1d и Lamp1 как входного изображения (Рисунок 2Б). Отдельных клеточных изображения могут быть объединены в один файл образа для одной последовательного анализа (рис. 3A). В нашем исследовании, мы объединены 100 клеток изображений и открыл ее в программы для анализа, установив «colocalisation порогов» (рис. 3B). Colocalization интенсивности пикселей между двумя каналами (PE-меченых CD1d и AF647-меченых Lamp1) был показан общий с рассеяния, обнаруживая совместно локализованных пикселов из этих 100 ячеек изображения (рис. 4A). В этом участке горизонтальные и вертикальные линии представляют Костес порогов и диагональные линии представляют собой соотношение общей интенсивности пикселей между двумя каналами. Costes порог обеспечивает видимый параметр для удаления слабых точек из двух перекрывающихся каналов. Результате рассеяния показывает увеличение colocalization CD1d и Lamp1 белков в экспозиции БАП. Кроме того мы количественно степень colocalization между CD1d и Lamp1 белки, используя Мандер коэффициенты (рис. 4В). Следовательно коэффициенты Мандер продемонстрировать увеличение colocalization между CD1d и Lamp1 в конце endocytic отсеках БАП облученных DCs, сравнивая с DCs не подвергаются, как статистически поддерживается студента t тесты (рис. 4В). Однако если белок интенсивность гетерогенных между районами colocalized и не colocalized, colocalized интенсивность будет беспрецедентной в colocalized районы. Таким образом это также необходимо для дальнейшего экзамен, colocalization на основе интенсивности (рис. 4 c). В результате, каждый столбец представляет усредненный расчет доли colocalized интенсивности от нескольких клеток изображений (n = 100) между БАП подвержены и не подвержены условия для пары совместно локализованных белков. Студента t тесты показывают также статистической значимости (n = 100, p< 0,001) между БАП подвержены и не подвержены группами с указанных стандартных ошибок. Вообще наши данные показывают, что CD1d, белок был сохранен в конце endosomes в экспозиции БАП, поддерживая это выражение гена БАП изменены далее приводит к нарушение функции endocytic и CD1d людьми.
В целом CD1d-Lamp1 colocalization усиливает под воздействием БАП. Несколько параметров на основе ячеек изображения (рис. 2B), включая scatterplots с перекрытием пиксель света (рис. 4A), увеличило Мандер коэффициенты (рис. 4B) и процент перекрытия интенсивности ( Рисунок 4 c), поддержка CD1d endocytic удержание в экспозиции БАП. Этот анализ colocalization клеточных изображений является точный подход для определения степени colocalization белка и продемонстрировать биологических механизмов функций клеток, например, endocytic функция соответствует нарушается endocytic гена выражение, дополнительный вклад препятствует активации CD1d-ограничено T клетки13.
Рисунок 1 : Возмущений DC transcriptomes в экспозиции БАП (A) схема РНК Seq. Во-первых был проведен анализ контроля качества (КК) для изучения качества всего РНК. С помощью автоматизированной системы и высокое качество всего РНК РНК ввода, поли A был изолирован, который продемонстрировал истощены рРНК в поли А анализе РНК КК. Поли A РНК был затем подвергнут автоматической библиотеки подготовка и индексации через PCR. Далее усиленные библиотека был проанализирован Bioanalyzer для контроля качества с ожидаемой доходности и распределения размеров. После количественной ПЦР, индексированные библиотеки были объединены и кластерного ячейку потока для секвенирования, и качество данных последовательности был в реальном времени мониторинг. Axis представляет собой относительное количество проточной цитометрии пятнать сигналов. (B) измененные гены были сгруппированы в различные функциональные кластеры и кластеры гена, связанные с endocytic функции и липидного обменов, показаны. Красный: CD1d; Зеленый: Lamp1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Анализ клеточных изображений, используя программу идеи. (A) моноцитарных DCs от здоровых доноров были сначала закрытого по HLA-DR + CD11c + клетки и далее воротами на CD1d+Lamp1+ клеток, используя программу идеи. (B) сотовых изображения были взяты из HLA-DR+CD11c+CD1d+Lamp1+ населения для визуализации клеточных изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Анализ клеточных изображений, используя программу Фиджи-ImageJ. Клетки с сильным Сопредседатель пятно белков CD1d и Lamp1 были случайно отобранных для анализа изображений, используя Фиджи-ImageJ, но клетки * с невидимым или слабый пятная для CD1d или Lamp1 белок был исключен как показано на рисунке 2B. (A) эти случайно выбранных сотовых изображения были собраны в один файл образа как входного изображения. (B) colocalization анализ проводился путем установления colocalization порогов для каналов, зеленый и красный. Scatterplots были созданы с расчетом порог. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Colocalization белков CD1d и лампа 1. Используя аналогичный набор данных сообщили в Sharma et al. 13, совместно локализованных пиксель интенсивности между CD1d и Lamp1 белки от РСУ в Бат подвержены и не подвержены условий пересчитываются и показаны с scatterplots (A). Мандер в коэффициенты для CD1d и Lamp1 colocalization были рассчитаны и представлены в среднем от выбранной ячейки изображения (B). Процент совместно локализованных пиксель интенсивности был также рассчитанные (C). Статистическая значимость (n = 100, p < 0,001) был получен с студента t тесты по сравнению с группой, не подвергаются. Стандартные ошибки были указаны. Данные взяты из одной пробы с ячейками от здорового донора. Два независимых анализов были исполнены с аналогичными результатами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Антитела | Флуорофоров или вторичного антитела | Клон |
| HLA-DR | Фикоэритрин/цианиновые 7 (PE/Cy7) | L243 |
| CD11c | Фикоэритрин/цианиновые 5 (PE/Cy5) | 3.9 |
| CD1c | Фиолетовый блестящий 421 | L161 |
| Очищенный антинародным CD1d | PE-анти мышь IgG2b | 51.1 |
| Lamp1 | Alexa Fluor 647 (AF647) | CD107a(H4A3) |
Таблица 1: антитела используются в настоящем исследовании. Из-за общего возбуждения и выбросах волн флуорофоров PE/Cy5 и AF647 частично перекрываются на окрашивание сигналов. Мы используем эти флуорофоров меток поверхности белка (CD11c) и внутриклеточных белков (Lamp1), соответственно, чтобы избежать их дублирования сигнал на субклеточном уровне. Мы также используем оптимального титрования и компенсации для сведения к минимуму перекрытием сигналов между обеими флуорофоров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Функциональные подтверждения пути измененный ген является сложной задачей, из-за широко влияние генов выражения с участием нескольких путей и трудности интеграции индивидуальных и популяционной клеточной деятельности. Мы использовали визуализации проточной цитометрии специально тест CD1d торговлей endocytic отсеков. Imaging проточной цитометрии интегрирует популяционной измерение клеток и индивидуальные демонстрации внутриклеточных colocalization несколько белков. Конфокальная микроскопия ранее предоставил высокое разрешение при измерении colocalization белок, и проточной цитометрии способен обеспечить всеобъемлющую фенотипирование для различных клеточных популяций. Imaging проточной цитометрии сочетает в себе преимущества confocal микроскопии и проточной цитометрии приемлемые изображения разрешением для анализа белка colocalization образом высоким профилем для функциональных подтверждения транскриптомики изменения экологической загрязнителей.
Анализ colocalization несколько белков в масштабе популяционной технически сложные, потому, что (i) подробный анализ нескольких отдельных ячеек являются трудоемкими и относительно предвзятым; (ii) трудно определить оптимальный порог для интерпретации перекрывающиеся Пиксели на основе интенсивности или области положительный пятнать; и (iii) сбалансированных наблюдения индивидуальных и популяционной клеток имеет решающее значение. В этом исследовании мы сосредоточились на биологически значимые наблюдения, статистической значимости теста и визуализации демонстрации совместно локализованных белков. Для достижения этой цели, мы впервые получили тысячи изображений человека РС с использованием изображений проточной цитометрии. Количественный анализ изображений файлов комбинированный яркий подробно сходство с помощью программного обеспечения идеи и статистически проверенные colocalization анализ с помощью Фиджи-ImageJ. ИДЕИ программа позволяет стробирования совместно цветного населения, расчета colocalization двух белков с помощью Пирсон коэффициент корреляции на основе ярких подробно сходство, и случайным выбором совместно окрашенных клеток с субцеллюлярные локализации белки13. Для дальнейшего достижения биологических соответствующих демонстрационных совместно локализованных белков, мы использовали программное обеспечение ImageJ-Фиджи и применяется коэффициент Мандер вычислить процент совместно локализованных участков и перекрываются интенсивности пикселей, чтобы продемонстрировать степень Локализация в CD1d в endocytic пути.
Важным шагом для использования программы ImageJ-Фиджи — выполнить одну ячейку, визуализации анализа. Вариация colocalization процент белка из отдельных клеток может контролироваться по сравнению с визуально Объединенные цвета из изображений одной ячейки. Путем усреднения белка colocalization процент от всех 100 клеток, средства и стандартные ошибки могут быть рассчитаны для демонстрации белка colocalization и функциональных корреляции на уровне популяционной. Этот анализ биоинформатики простой и простой без относительно неоднозначные результаты, потому что этот анализ предлагает воспроизводимый порог вычисления с помощью метода Costes производить же привело пороговых значений для наборов данных, же и подобные пороги для аналогичных наборов данных26. Ограничением этой методики является трудоемкой ручной ввод изображений одной ячейки и потенциально субъективный выбор визуально совместно окрашенных клеток с помощью программного обеспечения идеи. В нашем исследовании мы анализируем 100 ячеек изображения от каждой группы и мы ставим воспроизводимого отбора критериев, включая сильные сигналы совместно окрашенных и очистить локализация внутриклеточных белков CD1d и Lamp1. Преодоление этих ограничений требует техническое совершенствование аналитического программного обеспечения для анализа пакета и объективный отбор единичных клеток на основании морфологических особенностей за интенсивность окрашивания, предоставляемый проточной цитометрии. В резюме, комбинированные сотовые и населения визуализации анализа обеспечит высокую воспроизводимость, всеобъемлющего, статистически проверенные и биологически соответствующие результаты процент белка colocalization. Мы считаем, что этот CD1d-Lamp1 colocalization анализ может служить успешным примером высокого профиля клеточного изображений анализов для ответа на более широкие вопросы на функциональные и морфологические изменения клеточных белков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать
Acknowledgments
Авторы благодарят Роберт Giulitto (центр крови Hoxworth) для образцов крови человека и читает доктор Лян Niu для нормализации экспрессии генов. Мы также благодарим Грантовая поддержка от национального института окружающей среды медицинских наук (ES006096), центр экологической генетики (ГОЗ) экспериментального проекта (с.х.), Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний (AI115358) (с.х.), университет Премия Совета исследований Университета Цинциннати (с.х.) и университета из Цинциннати колледж медицины Core Укрепление финансирования (X. Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transcriptomics | Illumina | HiSeq 2500 v4 | Illumina HiSeq system |
| ImagingStream X | Millipore | 100220 | Imaging flow cytometry |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fisher | Total RNA extraction | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent | Total RNA QC analysis | |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher | PCR, enzyme reaction | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England Biolab | PolyA RNA purification | |
| Automated SMARTer Apollo system | Takara | PolyA RNA purification | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolab | Library preparation | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | DNA purification | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) | Thermo Fisher | Library quantification | |
| NEBNext Library Quant Kit | New England Biolab | Library quantification | |
| cBot | Illumina | Library cluster generation | |
| TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot – HS | Illumina | Library cluster generation | |
| HiSeq 1000 | Illumina | Sequencing | |
| TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles) | Illumina | Sequencing | |
| Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | Bio Legend | L243 | |
| Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | Bio Legend | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | Bio Legend | L161 | |
| PE-anti-mouse IgG2b | Bio Legend | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) | Bio Legend | CD107a(H4A3) |
References
- Roche, P. A., Cresswell, P. Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells. Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).
- Huang, S., et al. MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells. The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).
- Nakamura, N., et al. Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling. Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).
- Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P.
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Zajonc, D. M., Kronenberg, M. CD1 mediated T cell recognition of glycolipids. Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).
- Cox, D., et al. Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules. PloS one. 4 (5), e5325 (2009).
- Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments. Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).
- Huang, S., et al. Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).
- de Jong, A., et al. CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens. Nature. 15 (2), 177-185 (2014).
- Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Sharma, M., et al. Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants. Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).
- Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).
- Nachamkin, I., et al. Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene. Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).
- Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems. Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).
- Bauer-Mehren, A. Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape). Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).
- Cline, M. S., et al. Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape. Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).
- Huang, S., Moody, D. B. Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system. Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).
- Huang, S. Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis. Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).
- Moody, D. B., Porcelli, S. A. Intracellular pathways of CD1 antigen presentation. Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9 (7), 676-682 (2012).
- Diard, M., et al. Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype. Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Eliceiri, K. W., et al.
- Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).
