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Immunology and Infection

एकीकृत इमेजिंग प्रवाह Cytometry और Transcriptomic का मूल्यांकन करने के लिए बदल Endocytic CD1d ्े

Published: October 29, 2018 doi: 10.3791/57528
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Environmental Health, University of Cincinnati College of Medicine

Summary

इमेजिंग फ्लो cytometry व्यक्तिगत और जनसंख्या स्तर पर कोशिकाओं के रूपात्मक और कार्यात्मक परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक आदर्श दृष्टिकोण प्रदान करता है । प्रदूषक-उजागर मानव वृक्ष कोशिकाओं में लिपिड प्रतिजन प्रस्तुति के लिए बाधित endocytic समारोह जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन की तस्करी के रूपात्मक प्रदर्शन की एक संयुक्त transcriptomic रूपरेखा के साथ प्रदर्शन किया गया ।

Abstract

endocytic प्रोटीन के रूपात्मक और कार्यात्मक परिवर्तन का जनसंख्या विश्लेषण एक एकल कोशिका स्तर पर छवि कैप्चर की मांग और एक जनसंख्या स्तर पर सांख्यिकीय छवि विश्लेषण के कारण चुनौतीपूर्ण है । इस कठिनाई को दूर करने के लिए, हम मानव में बिगड़ा endocytic जीन अभिव्यक्ति के साथ जुड़े विभेदक 1 डी प्रोटीन (CD1d) के क्लस्टर के बदल उपसेलुलर स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए इमेजिंग प्रवाह cytometry और transcriptomic profiling (आरएनए-seq) का इस्तेमाल किया वृक्ष कोशिकाओं (dc), जो आम lipophilic वायु वायू benzo [क] pyrene से अवगत कराया गया । इमेजिंग प्रवाह cytometry के साथ कब्जा कर लिया सेल छवियों के हजारों से CD1d और endocytic मार्कर Lamp1 प्रोटीन के colocalization विचारों और ImageJ-फिजी कार्यक्रमों का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था । सह सना हुआ CD1d और Lamp1 प्रोटीन के साथ कई सेलुलर छवियों CD1d पर गेटिंग के बाद visualized+Lamp1+ dc विचारों का उपयोग कर रहे थे । बढ़ाया CD1d और BaP एक्सपोजर पर Lamp1 colocalization आगे सीमा scatterplots, सह स्थानीयकृत तीव्रता के लिए मांडर के गुणांक के साथ परीक्षण का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था, और ImageJ-फिजी का उपयोग सह स्थानीयकृत क्षेत्रों के प्रतिशत के आधार पर साजिश रची । हमारे डेटा एक लाभप्रद वाद्य और bioinformatic दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए दोनों एकल और जनसंख्या वाले सेलुलर स्तर पर प्रोटीन colocalization उपाय, प्रदूषक में transcriptomic परिवर्तन के एक बिगड़ा कार्यात्मक परिणाम का समर्थन मानव उजागर Dc.

Introduction

प्रतिजन प्रस्तुति आम तौर पर intracellular प्रोटीन के तस्करी, जो अक्सर रूपात्मक लक्षण वर्णन और प्रतिजन की कोशिकाओं1,2,3 पेश की phenotypic profiling का उपयोग कर जांच की गई है शामिल . इमेजिंग और phenotyping विधियों के लाभों को एकीकृत करने के लिए, हम एक इमेजिंग विश्लेषण प्लेटफ़ॉर्म दोनों एकल कक्ष और जनसंख्या स्तर पर मानव वृक्ष कोशिकाओं (dc) में एक बदल प्रोटीन colocalization प्रदर्शित करने के लिए का वर्णन । में पेप्टाइड प्रतिजन प्रस्तुति, प्रमुख histocompatibility परिसर (MHC) वर्ग मैं अणु एक छोटी पेप्टाइड बांध (8-10 अवशेषों) endoplasmic जालिका में पारंपरिक सीडी 8 को सक्रिय करने के लिए+ टी कोशिकाओं, जबकि MHC वर्ग द्वितीय अणुओं एक अपेक्षाकृत लंबे समय बांध endocytic डिब्बों में पेप्टाइड (~ 20 अवशेषों) पारंपरिक CD4+ टी कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए1,4. इसके विपरीत, लिपिड विशिष्ट टी कोशिकाओं endocytic डिब्बों में मुख्य रूप से लोड लिपिड एंटीजन के साथ CD1 प्रोटीन द्वारा सक्रिय कर रहे हैं5,6. लिपिड प्रतिजन प्रस्तुति लिपिड चयापचय में उत्पादित लिपिड चयापचयों की आपूर्ति की आवश्यकता है7,8,9,10 और CD1 में प्रोटीन के लिए कार्यात्मक लिपिड चयापचयों की लोडिंग endocytic कंपार्टमेंट5,6. इस संदर्भ में, विभिंन सेलुलर कारकों लिपिड प्रतिजन प्रस्तुति, विशेष रूप से lipophilic प्रदूषक और प्रतिरक्षा विकारों के पर्यावरणीय जोखिम में, को परिभाषित किया जा करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । इस अध्ययन में, हम transcriptomic विश्लेषण, छवि profiling, और सेलुलर और मानव monocyte के जनसंख्याीय इमेजिंग विश्लेषण-प्राप्त dc का उपयोग करने के लिए endocytic प्रोटीन की तस्करी में योगदान करने के लिए लिपिड antigen प्रस्तुति में प्रदूषक जोखिम का निर्धारण किया । निश्चित रूप से, इस संयुक्त मंच के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है सेलुलर प्रोटीन की तस्करी और colocalization विभिंन जैविक प्रक्रियाओं में ।

तकनीकी रूप से, सेलुलर प्रोटीन स्थानीयकरण आम तौर पर फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था और सांख्यिकीय का पता लगाया कोशिकाओं की एक सीमित संख्या में विश्लेषण1,2,3,11. इसके अलावा, फ्लो cytometry मोटे तौर पर एक सेलुलर स्तर पर कई प्रोटीन के सह-दाग संकेतों के साथ गेट सेल आबादी के लिए लागू किया गया है12; हालांकि, इस उपसेलुलर प्रोटीन colocalization का एक विस्तृत दृश्य का अभाव है । दोनों सेलुलर और जनसंख्या के स्तर पर प्रतिशत प्रोटीन colocalization के व्यापक और सांख्यिकीय विश्लेषण प्राप्त करने के लिए, हम इमेजिंग रूपरेखा और विश्लेषण को शामिल करने के लिए जैविक के साथ प्रोटीन colocalization की सुविधाओं का निर्धारण दृष्टिकोण प्रासंगिकता. विशेष रूप से, हम इस अध्ययन में CD1d और lysosomal-एसोसिएटेड झिल्ली प्रोटीन 1 (Lamp1) प्रोटीन के colocalization का पता लगाने के लिए इमेजिंग फ्लो cytometry का उपयोग करें । colocalized अणुओं का मात्रात्मक विश्लेषण पहले एक जनसंख्या पैमाने पर किया जाना मुश्किल था । इस अध्ययन में, हम ImageJ-फिजी कार्यक्रम अनुकूलित करने के लिए दोनों जनसंख्या और व्यक्तिगत सेलुलर स्तर पर सह सना हुआ कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के साथ प्रोटीन colocalization के प्रतिशत की जांच । विशेष रूप से, हम सह स्थानीयकृत क्षेत्रों, तीव्रता, और जनसंख्या के आकार के इस निष्कर्ष है कि CD1d प्रोटीन काफी हद तक एक lipophilic प्रदूषक benzo [एक] pyrene (BaP) 13 के लिए जोखिम में मानव dc के देर endocytic डिब्बों में रखा गया था समर्थन करने के लिए मापा . यह संयुक्त सेलुलर और जनसंख्या इमेजिंग विश्लेषण प्रदान की उच्च reproducible, व्यापक, और सांख्यिकीय महत्वपूर्ण परिणाम के CD1d-Lamp1 बाधित लिपिड प्रतिजन प्रस्तुति के लिए प्रासंगिक colocalization ।

BaP की transcriptome-उजागर मानव dc दृढ़ता से इस परिकल्पना का समर्थन किया है कि endocytic लिपिड चयापचय और CD1d endocytic ्े BaP एक्सपोजर में ख़राब थे । इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, हम प्रोफ़ाइल के लिए इमेजिंग प्रवाह cytometry लागू डीसी जनसंख्या कि CD1d, endocytic मार्करों, और डीसी मार्करों सहित कई प्रोटीन के साथ सह दाग थे की छवियों । अंत में, सह दाग कोशिकाओं सांख्यिकीय तीव्रता और CD1d और Lamp1 colocalization के क्षेत्रों का प्रतिशत प्रदर्शित करने के लिए विश्लेषण किया गया ।

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Protocol

इस अध्ययन में मानव प्रोटोकॉल सिनसिनाटी विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था और सभी तरीकों को प्रासंगिक दिशा निर्देशों और विनियमों के अनुसार प्रदर्शन किया गया । स्वस्थ दाताओं से रक्त के नमूने सिनसिनाटी मेडिकल सेंटर के विश्वविद्यालय में Hoxworth रक्त केंद्र से प्राप्त किया गया ।

1. प्रदूषक-उजागर मानव Monocyte की Transcriptomic profile-व्युत्पन्न dc

  1. कुल आरएनए निष्कर्षण BaP-उजागर dc
    1. साइटोकिंस जीएम-सीएसएफ और IL-4 का उपयोग कर मानव dc अंतर, और 4 दिन13के लिए BaP करने के लिए dc बेनकाब ।
    2. सॉर्ट BaP-exposed dc का उपयोग प्रवाह cytometry सतह पर आधारित मार्करों (वंश-एचएलए-डॉ+), जिनमें से अधिकांश पारंपरिक dc (CD11c+CD1c+)13शामिल हैं । आमतौर पर, 10% FBS युक्त संस्कृति मध्यम में १०,००० dc सॉर्ट, ६०० x g और 6 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर dc केंद्रापसारक, और तुरंत एक 1 मिलीलीटर पिपेट टिप का उपयोग कर आकांक्षा द्वारा supernatant हटा दें ।
    3. एक बार supernatant आकांक्षा द्वारा हटा दिया जाता है, शाही सेना निष्कर्षण से पहले-८० ° c में भंडारण के लिए आरएनए आइसोलेशन किट से ०.४ मिलीलीटर Lysis/
    4. कुल आरएनए निकालने के लिए कुल आरएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल के साथ आरएनए अलगाव किट का प्रयोग करें14. एक विश्लेषक15का उपयोग कर आरएनए अखंडता को मापने ।
  2. सॉर्ट किए गए dc का Transcriptomic विश्लेषण (चित्र 1a)
    1. एक आरएनए पुस्तकालय तैयारी किट का उपयोग कर आरएनए-seq के लिए पुस्तकालय तैयार करें । संक्षेप में, अलग पाली टुकड़ा-एक आरएनए (~ २०० बीपी), रिवर्स सीडीएनए के 1 किनारा करने के लिए टुकड़े टाइप करना, और dUTP के साथ लेबल दूसरा किनारा सीडीएनए संश्लेषण द्वारा पालन करें ।
    2. Ligate डबल किनारा एक स्टेम के साथ एडाप्टर के लिए सीडीएनए-पाश संरचना के बाद मनका शुद्धि, अंत की मरंमत और दा-पूंछ । सीडीएनए और एडाप्टर लूप के उपयोगकर्ता (uracil-विशिष्ट उत्पाद एजेंट) एंजाइम के साथ किनारा विशिष्टता बनाए रखने के लिए और पीसीआर के लिए एडाप्टर लूप खोलने के लिए 2 कतरा में uracil अवशेषों को एक्साइज ।
      1. अनुक्रमित पुस्तकालय को समृद्ध करने के लिए यूनिवर्सल और सूचकांक विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग कर पीसीआर के 13 चक्र प्रदर्शन । पुस्तकालय को साफ और एक विश्लेषक डीएनए उच्च संवेदनशीलता चिप पर चलाने के लिए पुस्तकालय की गुणवत्ता और आकार वितरण की जांच ।
    3. एक मानक वक्र विधि के माध्यम से पुस्तकालय एकाग्रता की गणना करने के लिए पुस्तकालय के आकार की जानकारी के साथ संयुक्त एक पुस्तकालय ठहराव किट और एक वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली का प्रयोग करें ।
    4. आनुपातिक पूल व्यक्तिगत रूप से अनुक्रमित संगत पुस्तकालयों और 15 बजे अंतिम कुल एकाग्रता समायोजित करें । लाइब्रेरी क्लस्टर जनरेशन और अनुक्रम एकल पढ़ें 1x ५० bp की एक सेटिंग पर पुस्तकालय उत्पंन करने के लिए ~ २५,०००,००० प्रति नमूना पढ़ता है ।
  3. Sequencing
    1. क्रमश: SBS और पीई रिएजेंट रैक के लिए अनुक्रमण और अनुक्रमण एजेंट लोड । एक प्रयोगशाला में रिएजेंट प्लेस-1 h के लिए ग्रेड पानी स्नान जब तक सभी बर्फ पिघला हुआ है और प्रत्येक बोतल में रिएजेंट/
    2. बोतल और मिश्रण करने के लिए गल डाई और-20 डिग्री सेल्सियस एंजाइम जोड़कर ICB मिश्रण तैयार करें । sequencing निर्देशों के अनुसार एक NaOH समाधान तैयार करें । उपयोग करने के लिए तैयार जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी एजेंट प्लेस ।
    3. 1 एच प्रतीक्षा अवधि के दौरान, sequencer पर बिजली. प्रकट होने के लिए DONOTEJECT ड्राइव के लिए प्रतीक्षा करें और कंप्यूटर को किसी नेटवर्क ड्राइव से कनेक्ट करें ।
    4. sequencer नियंत्रण सॉफ्टवेयर लॉंच ।
    5. 2 एल रखरखाव धोने समाधान है कि ०.५% के बीच 20 और ०.०३% ProClin ३०० प्रयोगशाला ग्रेड पानी में शामिल है तैयार करें ।
    6. SBS रिएजेंट रैक में, 8 बोतलों में से प्रत्येक के लिए रखरखाव धोने समाधान के ~ १०० मिलीलीटर जोड़ें, और पेंच बोतलों को कीप टोपियां । पीई रिएजेंट रैक में, १० १५ मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए रखरखाव धोने समाधान के ~ 12 मिलीलीटर जोड़ें, और टोपियां त्यागें ।
    7. sequencer करने के लिए समाधान भरा बोतलों/ट्यूबों के साथ दो रैक लोड ।
    8. sequencer नियंत्रण सॉफ्टवेयर से, रखरखाव धोने का चयन; प्रक्रिया पूरी हो गई है जब तक sequencer द्रव प्रणाली को साफ करने के लिए स्क्रीन पर निर्देशों का पालन करें.
    9. सॉफ्टवेयर से "अनुक्रम" टैब में एक नया रन शुरू; आउटपुट डेटा को किसी नेटवर्क ड्राइव पर निर्देशित करें । एकल सूचकांक मल्टीप्लेक्स्ड पुस्तकालयों के साथ सिंगल रीडिंग 1x ५० बीपी के लिए पैरामीटर्स चुनें ।
    10. वैकल्पिक रूप से, अनुक्रमण स्थिति दूर से एक कंप्यूटर या स्मार्ट फोन के माध्यम से नजर रखी जा सकता है ताकि BaseSpace अनुक्रम हब में लॉग ।
    11. मल्टीप्लेक्स के लिए एक नमूना पत्रक अपलोड करें और सॉफ़्टवेयर आवश्यकता के अनुसार रिएजेंट जानकारी प्रदान करें ।
    12. SBS और पीई एजेंट sequencer करने के लिए लोड । प्राइम एक इस्तेमाल प्रवाह सेल के साथ प्रणाली (~ 15 मिनट) ।
    13. एक बार जब क्लस्टर पीढ़ी (~ ४.५ ज) पूरा हो गया है, फ्लो सेल बाहर ले, हल्के से पानी के साथ प्रवाह सेल स्प्रे, और पोंछ यह लेंस कागज का उपयोग कर सूखी । हल्के से ९५% इथेनॉल के साथ प्रवाह सेल स्प्रे और यह सूखी पोंछ । एक प्रकाश के खिलाफ जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि सतह मलबे या नमक के अवशेषों के बिना साफ है ।
    14. प्रधानमंत्री कदम पूरा होने के बाद, संकुल प्रवाह सेल लोड और अनुक्रमण शुरू करते हैं । अनुक्रम विश्लेषण व्यूअर सॉफ़्टवेयर स्वचालित रूप से प्रारंभ किया जाएगा ।
    15. क्लस्टर घनत्व सहित SAV के माध्यम से अनुक्रमण डेटा गुणवत्ता की निगरानी, पास फिल्टर पढ़ता, क्लस्टर पास फ़िल्टर%,% ≥ Q30, विरासत चरण/यह डेटा की गुणवत्ता और समस्या निवारण को समझने में मदद करता है ।
    16. प्रवाह सेल गैसकेट बदलें और अनुक्रमण पूरा होने के बाद एक रखरखाव धोने प्रदर्शन करते हैं । sequencer अगले चलाने के लिए तैयार है ।
  4. Bioinformatic विश्लेषण
    1. प्रदर्शन bioinformatics आरएनए-seq डेटा विश्लेषण13.

2. Transcriptomic प्रोफाइल के मार्ग विश्लेषण (आंकड़ा 1b)

  1. तीन दाताओं से BaP उजागर और गैर उजागर dc के बीच परिणामी जीन अभिव्यक्ति तीव्रता गिनती की तुलना करने के लिए एक edgeRer का उपयोग करें । फिर, निरपेक्ष फ़ोल्ड परिवर्तन (> 2 फ़ोल्ड्स) और false डिस्कवरी दर (एफडीआर)-समायोजित p-मान (< 0.05) पर आधारित BaP-exposed और गैर-उजागर dc के बीच अंतरपूर्ण जीन की पहचान करें ।
  2. विभेदक व्यक्त जीन के कार्यात्मक समूहों की भविष्यवाणी करने के लिए, ToppCluster सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग करने के लिए KEGG और REACTOME सहित कई डेटाबेस के खिलाफ बदल जीन खोज और clustering डेटा उत्पंन करते हैं । ToppCluster अतिगुणोत्तर माध्य परीक्षण का उपयोग करता है जीन सूची संवर्धन विश्लेषण के माध्यम से कार्यात्मक संवर्धन प्राप्त16।
  3. इसके अलावा इनपुट इन फ़ंक्शन क्लस्टर से परिणाम Cytoscape17,18 संस्करण 3.3.0, जटिल नेटवर्क visualizing के लिए एक मोटे तौर पर इस्तेमाल खुला स्रोत सॉफ्टवेयर मंच । इस प्रकार, endocytic समूहों और लिपिड चयापचय सहित विभिन्न समूहों या रास्ते में शामिल जीन, जीन अभिव्यक्ति की औसत गुना परिवर्तन के रंग एनोटेशन के साथ एक नेटवर्क में दिखाया गया है (आंकड़ा 1b)13.

3. CD1d और Lamp1 Colocalization के इमेजिंग फ्लो Cytometry

  1. BaP-उजागर dc का एंटीबॉडी लेबलिंग
    1. बेनकाब ०.५ एक्स 106 मानव dc ५.९४ mM BaP करने के लिए 4 दिनों के लिए ३७ ° c में पूर्ण है Dulbecco संशोधित ईगल के माध्यम से 2 मिलीलीटर में । हार्वेस्ट dc द्वारा ४०० x g पर 10 मिनट के लिए । एंटी मानव CD16, CD32, और CD64 एंटीबॉडी सहित बर्फ में 10 मिनट के लिए मानव सीरम अवरोधक और विरोधी मानव एफसी रिसेप्टर एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं की मशीन द्वारा विभेदित dc ब्लॉक.
    2. मशीन प्रतिभाशाली वायलेट ४२१-विरोधी CD1c (L161), phycoerythrin/cyanine डाई 7 (पीई/Cy7)-विरोधी एचएलए-डॉ, और पीई/Cy5-विरोधी CD11c बर्फ में 20 मिनट के लिए dc के साथ । तालिका 1 एंटीबॉडी की इस सूची से पता चलता है ।
    3. पंजाबियों में 4% paraformaldehyde के साथ dc को ठीक करें और उंहें Permeabilization वॉश बफ़र से permeabilize । intracellular पीई का एक मिश्रण के साथ धुंधला प्रदर्शन-लेबल शुद्ध विरोधी मानव CD1d (५१.१) और Alexa Fluor ६४७-लेबल विरोधी Lamp1 (CD107a) (H4A3) ।
  2. इमेजिंग फ्लो cytometry माप (चित्रा 2)
    1. एक 40X उद्देश्य का उपयोग कर सिनसिनाटी बच्चों के अस्पताल के प्रवाह cytometry कोर में एक इमेजिंग प्रवाह cytometer का उपयोग दाग नमूने का विश्लेषण के लिए व्यास में लगभग 10 मिमी के साथ एक सेल के लिए ३०० पिक्सल उपज । एक पिक्सेल आकार लगभग ०.५ mm द्वारा ०.५ mm ऑब्जेक्ट का है ।
    2. निर्माता के निर्देश के अनुसार एक निष्पक्ष तरीके से १०,००० सेलुलर छवियों का अधिग्रहण ।

4. इमेजिंग प्रवाह Cytometry छवियों का विश्लेषण

  1. Colocalization विश्लेषण विचार सॉफ्टवेयर का उपयोग (चित्रा 2)
    1. BaP autofluorescence के साथ गैर-दाग BaP-उजागर dc सहित, सीमा के नीचे गैर-दाग नमूनों की प्रतिदीप्ति तीव्रता सेट करके एकल-दाग बनाम गैर-दाग नमूनों के साथ क्षतिपूर्ति निष्पादित करें, जैसा कि रुटीन फ़्लो cytometry डेटा में किया गया है विश्लेषण.
    2. गेट सना हुआ कोशिकाओं एचएलए के सबसेट प्राप्त करने के लिए-DR+CD11c+CD1d+Lamp1+ कोशिकाओं (चित्रा 2a) और gated उपसेट (चित्रा बी) में सेलुलर छवियों को दिखाने के.
    3. दो तकनीकी समावेश मानदंड के आधार पर एक png प्रारूप में सेल छवियों को बचाने के लिए, मजबूत सह सना हुआ संकेत और CD1d और Lamp1 प्रोटीन के उपसेलुलर स्थानीयकरण के दृश्य उपस्थिति, ImageJ-फिजी (चित्रा बी) का उपयोग कर colocalization विश्लेषण के लिए ।
  2. colocalization विश्लेषण (चित्रा 3) करने के लिए सॉफ्टवेयर ImageJ-फिजी का उपयोग करें ।
    1. १०० बचाया सेल छवियों गैर उजागर और BaP-उजागर मानव dc, क्रमशः (3 ए आंकड़ा) के लिए विलय करके इनपुट छवि फ़ाइलें तैयार करें ।
    2. विश्लेषण CD1d (Red) और Lamp1 (Green) colocalization का प्रयोग एक scatterplot.
      1. भागो ImageJ-फिजी कार्यक्रम । १०० सेल छवियों के साथ. png फ़ाइल खोलें (आंकड़ा 4 बी और चित्रा 4a): "फ़ाइल । खोलें "।
      2. या तो एक लाल या एक हरे चैनल के साथ दो छवियों में विलय लाल और हरे चैनलों के साथ छवि भाजित: "छवि । रंग | चैनल विभाजित करें "।
      3. ड्रा एक आज्ञाओं का उपयोग कर scatterplot "विश्लेषण । Colocalization | Colocalization थ्रेसहोल्ड ". "PrintScreen" कुंजी का उपयोग कर scatterplot सहेजें ।
    3. प्रत्येक एकल सेलुलर छवि (n = 100) (चित्रा 4B) के लिए मांडर के colocalization गुणांक की गणना
      1. "अंडाकार" चयन उपकरण का उपयोग कर विभाजित चैनलों के साथ छवि फ़ाइल पर एक एकल सेल छवि का चयन करें.
      2. आज्ञाओं का प्रयोग करें "विश्लेषण । Colocalization | Colocalization थ्रेसहोल्ड ". "चैनल 1" का चयन करें संवाद बॉक्स ऑफ़ इंटरेस्ट (ROI) के क्षेत्र से. प्रत्येक सेल छवि के लिए "मांडर का उपयोग थ्रेसहोल्ड" सहित सभी परिकलन विकल्प रखें ।
      3. सभी १०० कक्ष छवियों के लिए इस परिकलन को दोहराएँ ।
      4. सहेजें और एक स्प्रेडशीट का उपयोग कर परिणाम खोलें ।
      5. "थ्रेशोल्ड मांडर के गुणांक" के लिए औसत और मानक त्रुटियों को प्लॉट करें (n = 100, 0 का अर्थ है कोई colocalization और 1 का अर्थ है परफेक्ट colocalization) । BaP-exposed और गैर-उजागर समूहों (चित्र 4B) के बीच तुलना के लिए p मान की गणना करने के लिए विद्यार्थी का t-परीक्षण का उपयोग करें ।
    4. एकाधिक कक्ष छवियों (n = 100) (चित्र 4c) के लिए CD1d और Lamp1 के बीच थ्रेशोल्ड पिक्सेल तीव्रता सह-अनुवादित का प्रतिशत परिकलित करें ।
      1. 4.2.3 में एक ही विश्लेषण प्रोटोकॉल का उपयोग करें और इसके अतिरिक्त परिणाम विकल्प "थ्रेशोल्ड colocalized ऊपर% तीव्रता"का चयन करें ।
      2. मांडर के colocalization गुणांकों के साथ मिलकर इस विश्लेषण का प्रदर्शन करें ।
      3. इसी प्रकार CD1d और Lamp1 के बीच% तीव्रता colocalized के लिए औसत और मानक त्रुटियां प्लॉट करें । BaP-exposed और गैर-उजागर समूहों (चित्र 4c) के बीच तुलना के लिए p मान की गणना करने के लिए विद्यार्थी के t-परीक्षण का उपयोग करें ।

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Representative Results

lipophilic वायू BaP मानव dc में endocytic जीन क्लस्टर्स बदल । मानव monocyte प्रत्येक दाता से प्राप्त dc (n = 3) BaP के साथ और पारंपरिक dc, जो आगे आरएनए निष्कर्षण और transcriptomic विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया के रूप में वर्णित के लिए हल की मशीन थे . जीन अभिव्यक्ति के सामान्य होने पर, BaP के बीच बदल जीन उजागर और गैर उजागर समूहों के कार्यात्मक सहसंबंध के अनुसार संकुल थे विभेदक व्यक्त जीन । हम इनपुट बदल जीन सूची Toppcluster कार्यक्रम16 के लिए प्रासंगिक सेलुलर रास्ते के विश्लेषण के लिए और एक झूठी डिस्कवरी दर (एफडीआर) पी मूल्यों (आंकड़ा 1b) के सुधार का उपयोग कर सांख्यिकीय परीक्षण प्रदर्शन करते हैं । कई प्रमुख बदल जीन समूहों, लिपिड चयापचय और endocytic कार्यों सहित, BaP-उजागर dc में पहचान की गई । इस अध्ययन में, हम विशेष रूप से endocytic तस्करी के कार्यात्मक परीक्षण पर ध्यान केंद्रित, क्योंकि CD1 मध्यस्थता प्रतिजन प्रस्तुति endocytic मार्ग में लिपिड प्रतिजन लदान पर अत्यधिक निर्भर किया गया है5,19, 20,21.

इमेजिंग फ्लो cytometry का उपयोग करते हुए CD1d endocytic ्े प्रदर्शन किया है । इमेजिंग प्रवाह cytometry का उपयोग कर सेल छवियों की एक बड़ी संख्या प्राप्त करने पर, हम विचार कार्यक्रम का उपयोग करने के लिए आसानी से गेटिंग कोशिका आबादी सह के माध्यम से व्यक्तिगत सेलुलर छवियों कल्पना का प्रयोग शुरू कर दिया कई एंटीबॉडी (चित्रा 2a) के साथ दाग । विशेष रूप से, हम एचएलए-DR और CD11c के साथ CD1d और Lamp1 सह अभिव्यक्ति (चित्रा 2a) के साथ dc दिखाने के लिए प्रमुख डीसी जनसंख्या सह दाग गेट करने में सक्षम थे. सह दाग संकेत CD1d और Lamp1 (चित्रा 2a) के दोहरे दाग के साथ सेल जनसंख्या गेटिंग के माध्यम से समृद्ध किया जा सकता है । हमने पहले गैर-उजागर सामान्य dc को CD1d और Lamp1 प्रोटीन की न्यूनतम colocalization के साथ दिखाया, CD1d endocytic के बेसल स्तर का संकेत है और शारीरिक स्थितियों (चित्रा 2 बी)5में सतह की अभिव्यक्ति के उच्च स्तर, 19,20,21. CD1d और Lamp1 प्रोटीन के colocalization को मापने के लिए, हम शुरू में विचारों का इस्तेमाल किया CD1d और Lamp1 जोखिम13के साथ BaP प्रोटीन के बीच उज्ज्वल विस्तार समानता का एक मामूली वृद्धि दिखाने के लिए । उज्ज्वल विस्तार समानता दो कारकों के सहसंबंध के परीक्षण के लिए है पियरसन सहसंबंध गुणांक के आधार पर गणना की गई थी, जबकि CD1d और Lamp1 प्रोटीन शारीरिक स्थिति में अत्यधिक छा की संभावना नहीं थे, यह दर्शाता है कि CD1d करने में सक्षम है कार्यात्मक लिपिड एंटीजन प्राप्त करने के लिए देर endocytic डिब्बों के माध्यम से क्षणिक यातायात. इस प्रकार, यह अधिक जैविक रूप से सार्थक करने के लिए परीक्षण है कि क्या BaP जोखिम में CD1d प्रोटीन देर endocytic डिब्बों में अधिक बनाए रखने के रूप में छा CD1d और Lamp1 में इमेजिंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर फिजी का उपयोग प्रोटीन का बढ़ा प्रतिशत से परिलक्षित ImageJ पैकेज । अंत में, देर endocytic डिब्बों में CD1d प्रोटीन की अवधारण को कार्यात्मक BaP जोखिम में बदल endocytic जीन प्रोफाइल की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

सह स्थानीयकृत तीव्रता और CD1d और Lamp1 प्रोटीन के बीच क्षेत्र मापा गया था । एक reproducible थ्रेशोल्ड सेटिंग और सह स्थानीयकृत क्षेत्रों और तीव्रता के प्रतिशत को प्राप्त करने के लिए, हम ImageJ-फिजी22, जो भी कई अन्य अध्ययनों में उपयोग किया गया है लागू23,24,25. हम बेतरतीब ढंग से चुनें CD1d+Lamp1+ कोशिकाओं मजबूत सह दाग और CD1d और Lamp1 प्रोटीन के स्पष्ट उपसेलुलर स्थानीयकरण के रूप में इनपुट छवियों (चित्रा बी) के रूप में । व्यक्तिगत सेलुलर छवियों को एक सुसंगत विश्लेषण के लिए एक एकल छवि फ़ाइल को विलय किया जा सकता है (3 ए आंकड़ा) । हमारे अध्ययन में, हम १०० सेल छवियों विलय और यह कार्यक्रम में खोला "colocalisation थ्रेसहोल्ड" (चित्र बी) की स्थापना द्वारा विश्लेषण । दो चैनलों (पीई-लेबल CD1d और AF647-लेबल्ड Lamp1) के बीच पिक्सेल तीव्रता का colocalization इन १०० सेल इमेज (फिगर 4a) से सह-स्थानीयकृत पिक्सल का पता लगाकर एक scatterplot के साथ समग्र रूप से दिखाया गया था । इस प्लॉट में, क्षैतिज और अनुलंब रेखाएं लागतों की सीमाएं दर्शाती है और विकर्ण रेखाएं दो चैनलों के बीच समग्र पिक्सेल तीव्रता के अनुपात का प्रतिनिधित्व करती हैं । लागतों की दहलीज दो ओवरलैप चैनलों से कमजोर पिक्सल को हटाने के लिए एक दृश्य सेटिंग प्रदान करता है. परिणामस्वरूप scatterplot BaP एक्सपोजर में CD1d और Lamp1 प्रोटीन की एक वृद्धि हुई colocalization से पता चलता है । इसके अलावा, हम मांडर के गुणांक (फिगर 4B) का उपयोग करके CD1d और Lamp1 प्रोटीन के बीच colocalization की डिग्री quantified । नतीजतन, मांडर के गुणांकों में CD1d और Lamp1 के बीच बढ़ी हुई colocalization का प्रदर्शन BaP-उजागर dc के साथ तुलना गैर-प्रखरता dc के साथ होता है, जैसा कि सांख्यिकीय रूप से छात्र के t-परीक्षणों (figure 4B) द्वारा समर्थित होता है । हालांकि, अगर प्रोटीन तीव्रता colocalized और गैर colocalized क्षेत्रों के बीच विषम है, colocalized तीव्रता colocalized क्षेत्रों के लिए अद्वितीय हो जाएगा । इसलिए तीव्रता (फिगर 4c) के आधार पर colocalization को आगे की परीक्षा देना भी जरूरी है । एक परिणाम के रूप में, प्रत्येक स्तंभ colocalized तीव्रता के प्रतिशत की एक औसत गणना का प्रतिनिधित्व करता है BaP के बीच एकाधिक सेल छवियों से (n = 100) उजागर और गैर उजागर शर्तों सह स्थानीयकृत प्रोटीन की एक जोड़ी के लिए । विद्यार्थी का t-परीक्षण भी BaP-exposed और संकेत मानक त्रुटियों के साथ गैर-उजागर समूहों के बीच सांख्यिकीय महत्व (n = 100, p< 0.001) दिखाएं । कुल मिलाकर, हमारे डेटा प्रदर्शित करता है कि CD1d प्रोटीन देर endosomes में BaP जोखिम में बनाए रखा गया था, समर्थन है कि BaP बदल जीन अभिव्यक्ति आगे बिगड़ा endocytic समारोह और CD1d ्े की ओर जाता है ।

संक्षेप में, CD1d-Lamp1 colocalization BaP एक्सपोजर पर बढ़ाता है । कई मानकों पर आधारित सेल छवियों (चित्रा बी4), के साथ scatterplots सहित ओवरलैप पिक्सेल तीव्रता (चित्रा 4a), बढ़ाया मांडर के गुणांक (चित्रा 4B), और ओवरलैप तीव्रता का प्रतिशत बढ़ा ( चित्र 4c), BaP एक्सपोज़र पर CD1d endocytic अवधारण का समर्थन । सेलुलर छवियों के इस colocalization विश्लेषण प्रोटीन colocalization की डिग्री निर्धारित करने के लिए एक सटीक दृष्टिकोण है और कोशिका कार्यों के जैविक तंत्र का प्रदर्शन, उदाहरण के लिए, endocytic बाधित endocytic जीन के साथ संगत समारोह अभिव्यक्ति, आगे CD1d के बाधित सक्रियण करने के लिए योगदान-प्रतिबंधित टी कोशिकाओं13.

Figure 1
चित्रा 1 : डीसी transcriptomes के गड़बड़ी में BaP एक्सपोजर (क) आरएनए-Seq का फ़्लोचार्ट. सबसे पहले, गुणवत्ता नियंत्रण (QC) विश्लेषण कुल आरएनए की गुणवत्ता की जांच करने के लिए किया गया था । एक स्वचालित प्रणाली और इनपुट के रूप में उच्च गुणवत्ता वाले कुल आरएनए का प्रयोग, पाली-एक आरएनए पृथक किया गया था, जो पाली में समाप्त rRNA का प्रदर्शन-एक आरएनए QC विश्लेषण. पाली-एक आरएनए तो पीसीआर के माध्यम से स्वचालित पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण के अधीन था । अगले, प्रवर्धित पुस्तकालय की उंमीद उपज और आकार वितरण के साथ QC के लिए एक के लिए विश्लेषक द्वारा विश्लेषण किया गया । qPCR ठहराव के बाद, अनुक्रमित पुस्तकालयों परित और अनुक्रमण के लिए प्रवाह कक्ष पर संकुल रहे थे, और sequencing डेटा की गुणवत्ता वास्तविक समय पर नजर रखी थी । अक्ष प्रवाह cytometry दाग संकेतों के सापेक्ष गिनती का प्रतिनिधित्व करता है । (ख) परिवर्तित जीनों को विभिन्न कार्यात्मक समूहों में समूहीकृत किया गया और endocytic फ़ंक्शन और लिपिड चयापचय से जुड़े जीन क्लस्टर दिखाए गए हैं. लाल: CD1d; हरा: Lamp1 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : सेलुलर छवियों का विश्लेषण विचार कार्यक्रम का उपयोग कर । (क) Monocyte स्वस्थ दाताओं से प्राप्त dc सबसे पहले एचएलए पर gated थे-डॉ + CD11c + कोशिकाओं और gated+CD1d पर आगे Lamp1 + विचार कार्यक्रम का उपयोग कर कोशिकाओं । (ख) सेलुलर छवियों एचएलए-DR+CD11c+CD1d + Lamp1+ जनसंख्यासेलुलर छवि दृश्य के लिए से निकाले गए थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : फिजी-ImageJ प्रोग्राम का उपयोग करके सेलुलर छवियों का विश्लेषण । मजबूत सह CD1d और Lamp1 प्रोटीन के दाग के साथ कोशिकाओं को बेतरतीब ढंग से फिजी-ImageJ का उपयोग छवि विश्लेषण के लिए चयन किया गया, लेकिन या तो CD1d या Lamp1 प्रोटीन के लिए अदृश्य या कमजोर धुंधला के साथ कोशिकाओं * चित्र बीमें के रूप में शामिल किया गया था । (क) इन बेतरतीब ढंग से चयनित सेलुलर छवियों एक इनपुट छवि के रूप में एक छवि फ़ाइल में इकट्ठे हुए थे । (ख) colocalization विश्लेषण हरे और लाल दोनों चैनलों के लिए colocalization थ्रेसहोल्ड की स्थापना के माध्यम से किया गया था । scatterplots थ्रेशोल्ड परिकलन के साथ जनरेट किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : CD1d और दीपक की Colocalization 1 प्रोटीन । समान डेटासेट का उपयोग शर्मा एट अल में रिपोर्ट की गई. 13, BaP-exposed और गैर-उजागर शर्तों पर dc से CD1d और Lamp1 प्रोटीन के बीच सह स्थानीयकृत पिक्सेल तीव्रता recalculated किया गया था और scatterplots (A) के साथ दिखाया गया है । CD1d और Lamp1 colocalization के लिए मांडर के गुणांकों की गणना की गई थी और उन्हें चयनित सेल इमेज (B) से औसतन एक साथ दिखाया गया है । सह-अनुवादित पिक्सेल तीव्रता का प्रतिशत भी परिकलित किया गया था (C) । सांख्यिकीय महत्व (n = 100, p < 0.001) गैर-उजागर समूह की तुलना में विद्यार्थी के t-परीक्षणों के साथ प्राप्त किया गया था । मानक त्रुटियां दर्शाई गईं । डेटा एक स्वस्थ दाता से कोशिकाओं के साथ एक परख से कर रहे हैं । दो स्वतंत्र परख समान परिणाम के साथ प्रदर्शन किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

एंटीबॉडी Fluorophores या माध्यमिक एंटीबॉडी क्लोन
एचएलए-डॉ Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) L243
CD11c Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) ३.९
CD1c शानदार वायलेट ४२१ L161
शुद्धि विरोधी मानव CD1d पीई-विरोधी माउस IgG2b ५१.१
Lamp1 एलेक्सा Fluor ६४७ (AF647) CD107a (H4A3)

तालिका 1: इस अध्ययन में प्रयुक्त एंटीबॉडी । साझा उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के कारण, fluorophores पीई/Cy5 और AF647 संकेत दाग पर आंशिक रूप से छा । हम इन fluorophores का उपयोग एक सतह प्रोटीन (CD11c) और एक intracellular प्रोटीन (Lamp1) क्रमशः लेबल के लिए एक उपसेलुलर स्तर पर अतिव्यापी अपने संकेत से बचने के लिए । हम भी इष्टतम अनुमापन और क्षतिपूर्ति का उपयोग दोनों fluorophores के बीच छा संकेतों को कम करने के लिए ।

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Discussion

एक बदल जीन मार्ग के कार्यात्मक पुष्टि चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि व्यापक रूप से प्रभावित जीन कई रास्ते और कठिनाई व्यक्तिगत और जनसंख्या सेलुलर गतिविधियों को एकीकृत करने के लिए शामिल अभिव्यक्ति की । हम कार्यरत इमेजिंग प्रवाह cytometry को विशेष रूप से endocytic कंपार्टमेंट में परीक्षण CD1d ्े । इमेजिंग प्रवाह cytometry कोशिकाओं की जनसंख्या माप और कई प्रोटीन के उपसेलुलर colocalization के व्यक्तिगत प्रदर्शन को एकीकृत करता है । फोकल माइक्रोस्कोपी पहले प्रोटीन colocalization को मापने में उच्च संकल्प प्रदान की है, और प्रवाह cytometry अलग कोशिका आबादी के लिए व्यापक phenotyping प्रदान करने में सक्षम है । इमेजिंग प्रवाह cytometry के लाभ को जोड़ती है फोकल माइक्रोस्कोपी और प्रवाह cytometry स्वीकार्य छवि संकल्प में प्रोटीन colocalization विश्लेषण करने के लिए एक उच्च प्रोफ़ाइल तरीके में transcriptomic परिवर्तन के कार्यात्मक पुष्टि के लिए पर्यावरण द्वारा प्रदूषण.

एक जनसंख्या के पैमाने में कई प्रोटीन के colocalization का विश्लेषण तकनीकी रूप से मांग कर रहे हैं, क्योंकि (i) एकाधिक व्यक्तिगत कोशिकाओं का विस्तृत विश्लेषण श्रम गहन और अपेक्षाकृत पक्षपातपूर्ण हैं; (ii) धनात्मक धुंधला होने की तीव्रता या क्षेत्र के आधार पर ओवरलैप पिक्सेल की व्याख्या करने के लिए एक इष्टतम सीमा निर्धारित करना कठिन है; और (iii) व्यक्तिगत और जनसंख्या की कोशिकाओं का संतुलित अवलोकन महत्वपूर्ण है । इस अध्ययन में, हम एक जैविक रूप से सार्थक अवलोकन, एक सांख्यिकीय महत्व परीक्षण, और सह के एक इमेजिंग प्रदर्शन-स्थानीयकृत प्रोटीन प्रदर्शन पर ध्यान केंद्रित किया । इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, हम सबसे पहले मानव dc के चित्र इमेजिंग प्रवाह cytometry का उपयोग कर के हजारों प्राप्त की । इमेजिंग फ़ाइलों का मात्रात्मक विश्लेषण एक उज्ज्वल विस्तार समानता सॉफ्टवेयर विचारों का उपयोग विश्लेषण और एक सांख्यिकीय परीक्षण colocalization फिजी-ImageJ का उपयोग विश्लेषण संयुक्त । विचार कार्यक्रम की अनुमति देता है सह गेटिंग जनसंख्या, दो प्रोटीन के colocalization की गणना पियरसन सहसंबंध गुणांक आधारित उज्ज्वल विस्तार समानता का उपयोग कर, और बेतरतीब ढंग से सह सेलुलर स्थानीयकरण के साथ कोशिकाओं का चयन प्रोटीन्स13. आगे सह स्थानीयकृत प्रोटीन के जैविक प्रासंगिक प्रदर्शन को प्राप्त करने के लिए, हम ImageJ-फिजी सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया और मांडर के गुणांक का प्रतिशत की गणना करने के लिए सह स्थानीयकृत क्षेत्रों और छा पिक्सेल तीव्रता का प्रदर्शन करने के लिए लागू की डिग्री endocytic मार्ग में CD1d स्थानीयकरण ।

एकल कक्ष इमेजिंग विश्लेषण करने के लिए ImageJ-फिजी प्रोग्राम का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण चरण है । व्यक्तिगत कोशिकाओं से प्रतिशत प्रोटीन colocalization की भिंनता एकल सेल छवियों से नेत्रहीन विलय रंग की तुलना में निगरानी की जा सकती है । सभी १०० कोशिकाओं से प्रतिशत प्रोटीन colocalization औसत से, मतलब है और मानक त्रुटियों के लिए एक जनसंख्या स्तर पर प्रोटीन colocalization और कार्यात्मक सहसंबंध प्रदर्शित करने के लिए गणना की जा सकती है । यह bioinformatics विश्लेषण अस्पष्ट परिणामों से संबंधित किए बिना सरल और सीधा है, क्योंकि यह विश्लेषण समान डेटा सेट्स के लिए एक ही परिणामी थ्रेशोल्ड्स का उत्पादन करने के लिए लागतों की विधि का उपयोग करके reproducible थ्रेशोल्ड परिकलन प्रदान करता है और समान datasets के लिए समान थ्रेशोल्ड26. इस तकनीक की सीमा श्रम-एकल सेल छवियों और नेत्रहीनों के संभावित व्यक्तिपरक चयन के मैनुअल इनपुट है विचार सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कोशिकाओं दाग । हमारे अध्ययन में, हम प्रत्येक समूह से १०० सेल छवियों का विश्लेषण और हम मजबूत सह दाग संकेत और CD1d और Lamp1 प्रोटीन के स्पष्ट उपसेलुलर स्थानीयकरण सहित reproducible चयन मानदंड, सेट । इन सीमाओं पर काबू पाने विश्लेषणात्मक सॉफ्टवेयर के तकनीकी सुधार बैच विश्लेषण और एकल कोशिकाओं के उद्देश्य के चयन की अनुमति के लिए प्रवाह cytometry द्वारा प्रदान दाग तीव्रता से परे रूपात्मक सुविधाओं पर आधारित की आवश्यकता है । संक्षेप में, संयुक्त सेलुलर और जनसंख्या इमेजिंग विश्लेषण उच्च reproducible प्रदान करेगा, व्यापक, सांख्यिकीय परीक्षण, और प्रतिशत प्रोटीन colocalization के जैविक रूप से प्रासंगिक परिणाम । हमारा मानना है कि यह CD1d-Lamp1 colocalization विश्लेषण सेलुलर प्रोटीन के कार्यात्मक और रूपात्मक परिवर्तन पर व्यापक सवालों के जवाब देने के लिए उच्च प्रोफ़ाइल सेलुलर इमेजिंग विश्लेषण के एक सफल उदाहरण के रूप में सेवा कर सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है

Acknowledgments

लेखक रॉबर्ट Giulitto (Hoxworth रक्त केंद्र) मानव रक्त के नमूनों के लिए धंयवाद और जीन अभिव्यक्ति के सामांय के लिए डॉ लिआंग Niu पढ़ता है । हम भी राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान (ES006096), पर्यावरण आनुवंशिकी (CEG) पायलट परियोजना (S.H.), राष्ट्रीय एलर्जी और संक्रामक रोगों के संस्थान (AI115358) (S.H.), विश्वविद्यालय के लिए केंद्र से अनुदान सहायता धंयवाद सिनसिनाटी विश्वविद्यालय अनुसंधान परिषद पुरस्कार (S.H.), और चिकित्सा कोर संवर्धन अनुदान के सिनसिनाटी कॉलेज के विश्वविद्यालय (एक्स. जेड.) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transcriptomics Illumina HiSeq 2500 v4 Illumina HiSeq system
ImagingStream X Millipore 100220 Imaging flow cytometry
mirVana miRNA Isolation Kit Thermo Fisher Total RNA extraction
Agilent RNA 6000 Pico Kit Agilent Total RNA QC analysis
Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler Thermo Fisher PCR, enzyme reaction
NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module  New England Biolab PolyA RNA purification
Automated SMARTer Apollo system Takara PolyA RNA purification
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina New England Biolab Library preparation
Agencourt AMPure XP magnetic beads Beckman Coulter DNA purification 
2100 Bioanalyzer Agilent Library QC, size distribution analysis
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Library QC, size distribution analysis
QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) Thermo Fisher Library quantification
NEBNext Library Quant Kit New England Biolab Library quantification
cBot Illumina Library cluster generation
TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot – HS Illumina Library cluster generation
HiSeq 1000 Illumina Sequencing
TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles) Illumina Sequencing
Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) Bio Legend L243
Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) Bio Legend 3.9
Brilliant violet 421 Bio Legend L161
PE-anti-mouse IgG2b Bio Legend 51.1
Alexa Fluor 647 (AF647) Bio Legend CD107a(H4A3)

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References

  1. Roche, P. A., Cresswell, P. Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells. Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).
  2. Huang, S., et al. MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells. The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).
  3. Nakamura, N., et al. Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling. Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).
  4. Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).
  5. Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
  6. Zajonc, D. M., Kronenberg, M. CD1 mediated T cell recognition of glycolipids. Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).
  7. Cox, D., et al. Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules. PloS one. 4 (5), e5325 (2009).
  8. Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments. Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).
  9. Huang, S., et al. Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).
  10. de Jong, A., et al. CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens. Nature. 15 (2), 177-185 (2014).
  11. Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).
  12. Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
  13. Sharma, M., et al. Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants. Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).
  14. Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).
  15. Nachamkin, I., et al. Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene. Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).
  16. Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems. Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).
  17. Bauer-Mehren, A. Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape). Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).
  18. Cline, M. S., et al. Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape. Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).
  19. Huang, S., Moody, D. B. Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system. Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).
  20. Huang, S. Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis. Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).
  21. Moody, D. B., Porcelli, S. A. Intracellular pathways of CD1 antigen presentation. Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).
  22. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9 (7), 676-682 (2012).
  23. Diard, M., et al. Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype. Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).
  24. Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
  25. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature. 9 (7), 697-710 (2012).
  26. Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).

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Sharma, M., Zhang, X., Huang, S. Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking. J. Vis. Exp. (140), e57528, doi:10.3791/57528 (2018).

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