Summary
成像流式细胞术提供了一种理想的方法来检测细胞在个体和种群水平的形态学和功能改变。对污染物暴露的人树突状细胞中脂质抗原表达的破坏内吞功能进行了转录组基因表达和蛋白质贩运形态表现的综合分析。
Abstract
种群分析内吞蛋白的形态和功能变化, 是由于单细胞水平的图像采集需求和种群水平的统计图像分析所带来的挑战。为了克服这一困难, 我们使用了成像流式细胞仪和转录组分析 (RNA 序列) 来确定分化1d 蛋白 (CD1d) 与人内吞基因表达受损相关的亚细胞定位树突状细胞 (DCs), 暴露于常见的亲油性空气污染物苯并 (a) 芘。用想法和 ImageJ-斐济方案分析了数以千计的细胞图像采集的 CD1d 和内吞标记 Lamp1 蛋白的共定位。在 CD1d+Lamp1+ DCs 的控制下, 使用 CD1d 和 Lamp1 蛋白的多种蜂窝图像进行了可视化处理。在 BaP 曝光时增强的 CD1d 和 Lamp1 共定位进一步证明使用阈值散点图, 用 Mander 的系数进行共局部强度测试, 并根据使用 ImageJ-斐济的共同本地化区域的百分比进行绘制。我们的数据提供了一种有利的工具和生物信息学方法, 用于测量单个和种群细胞水平的蛋白质共定位, 支持在污染物暴露的人类中转录组变化的功能性结果受损。Dcs。
Introduction
抗原呈现通常涉及细胞内蛋白的贩运, 这是经常调查使用的形态学表征和表型分析的抗原呈现细胞1,2,3.为了整合成像和分型方法的优点, 我们描述了在单细胞和种群水平的成像分析平台, 以演示在人类树突状细胞 (DCs) 中改变的蛋白质共定位。在多肽抗原表达中, 主要的组织相容复合物 (MHC) I 类分子结合在内质网中的短肽 (8-10 残留物) 激活传统的 CD8+ T 细胞, 而 MHC II 类分子结合一个相对较长的内吞中的肽 (约20个残留物) 激活常规 CD4+ T 细胞1,4。相比之下, 脂质特异性 T 细胞是由 CD1 蛋白激活的, 脂质抗原主要载于内吞夹层5,6。脂质抗原的表现需要提供脂代谢产物在脂质新陈代谢7,8,9,10和负载的功能性脂代谢物 CD1 蛋白质内吞隔间5,6。在这种情况下, 各种细胞因子调节脂质抗原的表现, 特别是在环境暴露的亲脂性污染物和免疫紊乱, 是至关重要的定义。在本研究中, 我们使用转录组分析, 图像分析, 和细胞和种群成像分析的人单核细胞衍生的 DCs, 以确定内吞蛋白的贩运导致在污染物暴露的脂质抗原呈现。当然, 该组合平台可用于研究不同生物过程中亚细胞蛋白的贩运和共定位。
从技术上讲, 亚细胞蛋白的定位通常使用共聚焦显微镜进行演示, 并在数量有限的检测到的细胞1、2、3、11中进行统计分析。此外, 流式细胞仪已广泛应用于细胞12级多蛋白共染色信号的门细胞种群;然而, 这缺乏亚细胞蛋白共定位的详细可视化。为了在细胞和种群水平上实现对蛋白质共定位百分比的综合和统计分析, 我们结合了成像分析和分析方法, 以确定蛋白质共定位的特征与生物关联。具体来说, 我们使用影像流式细胞仪检测 CD1d 和溶酶相关膜蛋白 1 (Lamp1) 蛋白的共定位。增强分子的定量分析以前很难在种群尺度上进行。在这项研究中, 我们调整了 ImageJ-斐济计划, 在种群和个体细胞水平上, 研究大量共染色细胞的蛋白质共定位的百分比。具体而言, 我们测量了共局部面积、强度和种群大小, 以支持结论: CD1d 蛋白主要保留在人类 DCs 的晚期内吞夹层中, 接触到一种亲脂性污染物 (苯并) 芘 (BaP)13.这种结合细胞和人口成像分析提供了高度可重复性, 全面和统计学上显著的结果 CD1d-Lamp1 共定位相关的抑制脂质抗原呈现。
bap 暴露的人类 DCs 的转录组强烈支持内吞脂代谢和 CD1d 内吞贩运在 BaP 暴露中受损的假说。为了测试这个假说, 我们应用影像流式细胞仪来分析与多种蛋白质共染色的 DC 种群的图像, 包括 CD1d、内吞标记和直流标记。最后, 对共染色细胞进行统计分析, 以证明 CD1d 和 Lamp1 共定位的强度和面积的百分比。
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Protocol
这项研究中的人类协议得到了辛辛那提大学机构审查委员会的批准, 所有方法都按照相关的指导方针和条例进行。来自辛辛那提大学医疗中心远见卓识血液中心的健康捐献者的血液样本获得。
1. 污染物暴露的人单核细胞源 DCs 的转录组分析
- BaP 暴露 DCs 的总 RNA 提取
- 使用细胞因子 GM 脑脊液和 IL-4 区分人 dcs, 并将 dcs 暴露在 BaP 中4天13。
- 使用流式细胞仪对 BaP 公开的 DCs 进行排序基于表面表达的标记 (谱系-HLA-DR+), 其中大部分由常规 DCs (CD11c+CD1c+)13组成。通常情况下, 将1万个 DCs 分类为包含 10% FBS 的培养基, 离心 dc 在 600 x g 和4摄氏度6分钟, 并使用1毫升移液头立即去除吸液。
- 一旦通过吸入去除上清液, 在 rna 提取前, 从 rna 分离试剂盒中加入0.4 毫升裂解/结合缓冲液以储存-80 摄氏度, 裂解细胞颗粒。
- 使用 rna 分离试剂盒与总 rna 提取协议提取总 rna14。使用 Bioanalyzer15测量 RNA 完整性。
- 排序 DCs 的转录组分析 (图 1A)
- 使用 rna 库制备试剂盒准备 rna 序列库。简而言之, 片段分离的聚 A RNA (约 200 bp), 反转转录的片段到 cDNA 的第一链, 并遵循第二链 cdna 合成标记与 dUTP。
- 结扎双链 cDNA 对适配器具有一个干环结构后, 珠纯化, 末端修复和大尾尾矿。使用用户 (尿嘧啶特定切除试剂) 酶在 cDNA 和适配器环路的第二链中尿嘧啶残留物, 以保持链特异性, 并打开用于 PCR 的适配器环路。
- 使用通用和特定于索引的引物执行13循环 PCR, 丰富索引库。清理库并在 Bioanalyzer DNA 高灵敏度芯片上运行, 以检查库的质量和大小分布。
- 使用库量化试剂盒和实时 PCR 系统结合库大小信息,通过标准曲线法计算库浓度。
- 按比例池单独编入索引的兼容库, 并将最终总浓度调整为下午15点。在单读 1x 50 bp 的设置下执行库集群生成并序列化库, 以便每个样本生成约2500万次读取。
- 测 序
- 分别将测序和索引试剂加载到 SBS 和 PE 试剂架上。将试剂放在实验室级水浴中1小时, 直到所有的冰融化, 每个瓶子/管子中的试剂混合得当。
- 将解冻的染料和-20 摄氏度的酶添加到瓶子中并混合, 准备好 ICB 混合物。根据测序说明制备氢氧化钠溶液。将所有试剂放置在4摄氏度, 直至使用完毕。
- 在1小时等待期间, 对音序器通电。等待 DONOTEJECT 驱动器出现并将计算机连接到网络驱动器。
- 启动音序器控制软件。
- 准备 2 L 的维护洗涤解决方案, 其中包含0.5% 补间20和 0.03% ProClin 300 在实验室级水。
- 在 SBS 试剂架中, 将100毫升的维护洗涤解决方案添加到8个瓶子中, 并将漏斗帽固定在瓶子上。在 PE 试剂架中, 将12毫升的维护洗涤液加入十15毫升锥形管中, 然后丢弃盖子。
- 将两个机架与溶液灌装瓶/管装入音序器。
- 从音序器控制软件中, 选择维护洗涤;按照屏幕上的说明清洁音序器流体系统, 直到过程完成。
- 从软件的"序列"标签开始新的运行;将输出数据定向到网络驱动器。使用单索引多路复用库选择单读 1x 50 bp 的参数。
- (可选) 登录 BaseSpace 序列集线器, 以便通过计算机或智能手机远程监视排序状态。
- 上传解复用样品表, 并根据软件要求提供试剂信息。
- 将 SBS 和 PE 试剂加载到音序器中。使用所用的流单元 (约15分钟) 对系统进行质数处理。
- 一旦群集生成完成 (约4.5 小时), 请将流池取出, 用清水将流动池轻轻喷洒, 并用透镜纸擦干。用95% 乙醇轻轻喷洒流动细胞, 然后擦干。检查光线以确保表面清洁, 没有碎屑或盐残留物。
- 完成主步骤后, 加载群集流单元格并开始排序。序列分析查看器软件将自动启动。
- 通过 SAV 监控测序数据质量, 包括簇密度、读取通滤波器、簇通滤波器%、% ≥Q30、遗留阶段/前期%、索引 QC等. 这有助于了解数据质量并进行故障排除。
- 在测序完成后, 更换流动单元垫片并进行维护清洗。音序器已准备好下一次运行。
- 生物信息学分析
- 执行生物信息学 RNA-seq 数据分析13。
2. 转录组型材的通路分析 (图 1B)
- 使用磨边机 Bioconductor 比较来自三个捐助者的 BaP 暴露和非公开 DCs 之间的结果基因表达强度计数。然后, 根据绝对褶皱变化 (> 2 褶皱) 和假发现率 (FDR) 调整p值 (< 0.05), 确定 BaP 暴露和非公开 DCs 之间的差异表达基因。
- 为了预测差异表达基因的功能聚类, 使用 ToppCluster 软件包在多个数据库 (包括 KEGG 和 REACTOME) 上搜索改变的基因, 并生成聚类数据。ToppCluster 使用超几何测试通过基因列表富集分析16获得功能丰富。
- 进一步将这些函数集群的结果输入到 Cytoscape17,18版 3.3.0, 这是一个广泛使用的开源软件平台, 用于可视化复杂网络。因此, 涉及不同簇或通路的基因, 包括内吞簇和脂质代谢, 都显示在一个网络中, 其颜色注释为基因表达的平均褶皱变化 (图 1B)13。
3. CD1d 和 Lamp1 共定位的影像流式细胞仪
- BaP 暴露 DCs 的抗体标记
- 公开 0.5 x 106人 DCs 到5.94 毫米 BaP 4 天在37°c 在2毫升完整的杜尔贝科的修改鹰的媒介。以 400 x g 离心的方法收获 dcs 10 分钟. 通过孵化细胞与人血清阻滞剂和抗人 Fc 受体抗体在冰中孵育10分钟, 包括抗人 CD16、CD32 和 CD64 抗体, 阻断分化的 dcs。
- 孵化明亮的紫罗兰 421-抗 CD1c (L161), 藻红蛋白/菁染料 7 (PE/Cy7)-抗 HLA-DR, 和 PE/Cy5-anti-CD11c 与 DCs 20 分钟在冰。表 1显示了抗体的列表。
- 使用 PBS 中的4% 多聚甲醛固定 DCs, 并使用透化洗涤缓冲器 permeabilize 它们。使用 PE 标记纯化的抗人 CD1d (51.1) 和 Alexa 氟647标记 anti-Lamp1 (CD107a) (H4A3) 的混合物进行胞内染色。
- 成像流式细胞仪测量 (图 2)
- 使用一个40X 物镜在辛辛那提儿童医院流式细胞术核心中利用成像流仪对染色样品进行分析, 在直径约10毫米的细胞中产生300像素。一像素大小约为0.5 毫米0.5 毫米的对象。
- 根据制造商的指示, 以不偏不倚的方式获取1万个蜂窝图像。
4. 流式细胞术图像的影像学分析
- 使用想法软件进行共定位分析 (图 2)
- 通过将非染色样品的荧光强度设定在阈值以下, 并在常规流式细胞仪数据中设置不沾污的自发荧光, 以单染色与无染色样品进行补偿分析。
- 栅极染色细胞获得 HLA-DR+CD11c+CD1d+Lamp1 + 细胞 (图 2A) 的子集, 并在封闭子集中显示蜂窝图像 (图 2B).
- 以 png 格式保存像元图像基于两个技术包含标准, 视觉存在强共染色信号和亚细胞定位的 CD1d 和 Lamp1 蛋白, 用于共定位分析使用 ImageJ-斐济 (图 2B)。
- 使用软件 ImageJ-斐济执行共定位分析 (图 3)。
- 通过将100保存的单元图像分别合并为非公开和 BaP 公开的人工 DCs, 准备输入图像文件 (图 3A)。
- 使用散点图分析 CD1d (红色) 和 Lamp1 (绿色) 共定位。
- 运行 ImageJ-斐济计划。打开带有100像元图像的. png 文件 (图 3B和图 4A): "文件 |打开 "。
- 使用红色或绿色通道将合并的红色和绿色通道分割成两张图像: "图像 |颜色 |拆分通道 "。
- 使用命令绘制散点图"分析 |共定位 |共定位阈值 "。使用"PrintScreen"键保存散点图。
- 计算每个单个蜂窝图像 (n=100) 的 Mander 的共定位系数 (图 4B)
- 使用 "椭圆形"选择工具在图像文件中选择单个单元格图像, 其中包含拆分通道。
- 使用命令"分析 |共定位 |共定位阈值 "。从感兴趣区域 (ROI) 的对话框中选择"通道 1" 。保留所有计算选项, 包括每个像元图像的"Mander 使用阈值" 。
- 对所有100像元图像重复此计算。
- 使用电子表格保存并打开结果。
- 绘制 "阈值 Mander 系数" 的平均值和标准误差 (n=100, 0 表示没有共定位, 1 表示完美共定位)。使用学生的 t-检验来计算 BaP 公开和非公开组之间比较的p值 (图 4B)。
- 计算多个像元图像 (n=100) 的 CD1d 和 Lamp1 之间的阈值像素强度百分比 (图 4C)。
- 在4.2.3 中使用相同的分析协议, 另外选择结果选项"% 强度高于阈值增强"。
- 与 Mander 的共定位系数一起执行此分析。
- 同样, 绘制 CD1d 和 Lamp1 之间强度增强的平均和标准误差。使用学生的 t-检验来计算 BaP 公开和非公开组之间比较的p值 (图 4C)。
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Representative Results
脂溶性污染物 BaP 改变了人类 DCs 中的内吞基因簇. 从每个捐献者 (n=3) 的人单核细胞衍生的 dcs 被孵化和排序为常规 DCs, 进一步用于 RNA 提取和转录组分析, 如所述.在基因表达正常化的基础上, 根据差异表达基因的功能相关性, 对 BaP 暴露和非暴露群体之间的改变基因进行聚类。我们将更改后的基因列表输入 Toppcluster 计划16 , 用于分析相关的细胞通路, 并使用错误发现率 (FDR) 校正p值进行统计测试 (图 1B)。在 BaP 暴露的 DCs 中, 发现了几种主要改变的基因簇, 包括脂代谢和内吞功能。在本研究中, 我们特别关注内吞的功能测试, 因为 CD1-mediated 抗原的表达高度依赖于内吞通路5、19中的脂质抗原加载, 20,21。
CD1d 内吞使用影像流式细胞仪进行展示。使用影像流式细胞仪获得大量细胞图像后, 我们开始使用 "想法" 程序, 通过方便的门控细胞种群 (图 2A) 共同染色, 可视化单个蜂窝图像。具体而言, 我们能够将与 HLA-DR 和 CD11c 共同染色的主要 DC 种群浇口, 以进一步显示 DCs 与 CD1d 和 Lamp1 共同表达式 (图 2A)。通过对 CD1d 和 Lamp1 的双重染色 (图 2A) 对细胞种群进行浇口, 可以丰富共染色信号。我们首先展示了 CD1d 和 Lamp1 蛋白的最小共定位的非暴露正常 DCs, 表明 CD1d 内吞贩运的基本水平和生理条件下的表面表达水平高 (图 2B)5, 19,20,21。为了测量 CD1d 和 Lamp1 蛋白的共定位, 我们最初使用的想法表明 CD1d 和 Lamp1 蛋白之间的明亮细节相似度略有增加, 与 BaP 暴露13。根据皮尔逊相关系数对两个因素的相关性进行了计算, 得出了明亮的细节相似性, 而 CD1d 和 Lamp1 蛋白在生理条件下不太可能发生高度重叠, 表明 CD1d 能够通过晚期内吞隔间的瞬时流量获得功能性脂质抗原。因此, 测试 CD1d 蛋白在 BaP 暴露中是否保留更多在晚期内吞隔间, 这是更有生物学意义的, 这反映在重叠的 CD1d 和 Lamp1 蛋白的增加百分比使用的成像分析软件斐济在ImageJ 包。最后, 在晚期内吞中保留 CD1d 蛋白可用于在 BaP 暴露中确认改变的内吞基因剖面的功能。
测定了 CD1d 与 Lamp1 蛋白之间的共局部强度和面积。为了获得可重现的阈值设置和共局部区域和强度的百分比, 我们应用了 ImageJ-斐济22, 它也被用于其他几个研究23,24,25。我们随机选择 CD1d+Lamp1+细胞与强大的共同染色和清晰的细胞定位 CD1d 和 Lamp1 蛋白作为输入图像 (图 2B)。单个蜂窝图像可以合并到单个图像文件中进行一致分析 (图 3A)。在我们的研究中, 我们合并了100细胞图像并在程序中打开它, 通过设置 "colocalisation 阈值" (图 3B) 进行分析。通过检测来自这100个像元图像的共局部像素 (图 4A), 在两通道之间 (PE 标记的 CD1d 和 AF647-labeled Lamp1) 之间的像素强度共定位整体显示为散点图。在这个图中, 水平和垂直线表示考斯特斯的阈值, 对角线表示两个通道之间的整体像素强度的比值。考斯特斯的阈值提供了一个可见设置, 用于从两个重叠通道中移除弱像素。结果散点图显示了 CD1d 和 Lamp1 蛋白在 BaP 暴露中增加的共定位。此外, 我们用 Mander 系数量化了 CD1d 和 Lamp1 蛋白之间的共定位程度 (图 4B)。因此, Mander 的系数表明, 与非公开的 dcs 相比, CD1d 和 Lamp1 的后期内吞隔间中的共定位增加了, 在学生 t 测试的统计支持下 (图 4B)。然而, 如果蛋白质强度在增强和非增强区域之间是异质的, 增强强度将是无与伦比的增强区域。因此, 还需要根据强度 (图 4C) 进一步检查共定位。因此, 每列都表示对一对共同本地化的蛋白质在 BaP 暴露和非暴露条件之间的增强强度百分比的平均计算。学生的 t-检验也显示了在 BaP 暴露的和非暴露的组之间的统计学意义 (n=100, p< 0.001) 与指示标准错误。总之, 我们的数据表明, CD1d 蛋白被保留在内涵体晚期的 bap 暴露, 支持 bap 改变基因表达进一步导致受损的内吞功能和 CD1d 贩运。
总之, CD1d-Lamp1 共定位提高了对 BaP 的暴露。基于像元图像的多个参数 (图 2B), 包括具有重叠像素强度的散点图 (图 4A)、增强的 Mander 系数 (图 4B) 和重叠强度的增加百分比 (图 4C), 支持 CD1d 内吞保留在 BaP 曝光。这种共定位分析的细胞图像是一个准确的方法来确定蛋白质共定位的程度和显示细胞功能的生物学机制, 例如, 内吞功能与中断的内吞基因一致表达, 进一步促进抑制激活 CD1d-restricted T 细胞13。
图 1: 转录在 BaP 暴露中的扰动(A) RNA 序列的流程图。首先, 进行质量控制 (QC) 分析以检验总 RNA 的质量。利用自动化系统和高质量的总 rna 作为输入, 对聚 rna 进行了分离, 证明了 rRNA 在 rna QC 分析中的耗尽。然后, 聚 A RNA 通过 PCR 进行自动化库的制备和索引。接着, 用 Bioanalyzer 对具有预期产量和大小分布的 QC 进行了放大库分析。定量化后, 将索引库汇集并聚集到流单元中进行测序, 并实时监测测序数据质量。轴表示流式细胞仪染色信号的相对计数。(B)改变的基因被分组在不同的功能组别, 并显示与内吞功能和脂质代谢相关的基因簇。红色: CD1d;绿色: Lamp1。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: 使用想法程序分析蜂窝图像.(A) 来自健康捐助者的单核细胞来源的 DCs 首先在 HLA-DR+CD11c+ 细胞上进行门控, 在 CD1d+Lamp1+细胞上使用想法程序进一步封闭。(B) 细胞图像从 HLA-DR+CD11c+CD1d+Lamp1 + 人口中提取, 用于蜂窝图像可视化。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 3: 使用斐济-ImageJ 计划对蜂窝图像进行分析.CD1d 和 Lamp1 蛋白的强共染色细胞被随机选择用于使用斐济-ImageJ 的图像分析, 但细胞 * 具有无形或弱染色的 CD1d 或 Lamp1 蛋白被排除如图 2B。(A) 这些随机选择的蜂窝图像作为输入图像组装成单个图像文件。(B) 通过设置绿色和红色通道的共定位阈值来执行共定位分析。使用阈值计算生成散点图。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 4: 共定位 CD1d 和灯1蛋白.使用在夏尔马等中报告的类似数据集。13, 在 BaP 暴露和非暴露条件下, CD1d 和 Lamp1 蛋白之间的共局部像素强度重新计算, 并以散点图 (A) 显示。计算了 Mander 的 CD1d 和 Lamp1 共定位系数, 并以所选细胞图像 (B) 的平均值显示。同时计算了共局部像素强度的百分比 (C)。统计学意义 (n=100, p < 0.001) 是与非暴露组相比, 学生的 t 检验得到的。显示标准错误。数据来自一个健康捐献者的细胞。两个独立的实验进行了类似的结果。请点击这里查看这个数字的更大版本.
| 抗体 | 荧光基团或二抗 | 克隆 |
| HLA-DR | 藻红蛋白/菁 7 (PE/Cy7) | L243 |
| CD11c | 藻红蛋白/菁 5 (PE/Cy5) | 3。9 |
| CD1c | 亮紫罗兰色421 | L161 |
| 纯化抗人 CD1d | PE 抗小鼠 IgG2b | 51。1 |
| Lamp1 | Alexa 福陆 647 (AF647) | CD107a (H4A3) |
表 1: 本研究中使用的抗体.由于共享激发和发射波长, 荧光 PE/Cy5 和 AF647 部分重叠在染色信号。我们使用这些荧光基团分别标记表面蛋白 (CD11c) 和胞内蛋白 (Lamp1), 以避免它们在亚细胞水平上的信号重叠。我们还使用最佳滴定和补偿来最小化两个荧光基团之间的重叠信号。
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Discussion
改变基因通路的功能确认是有挑战性的, 因为广泛影响的基因表达涉及多个途径和困难, 以整合个人和种群细胞活动。我们使用影像流式细胞仪专门测试 CD1d 在内吞隔间的贩运。影像流式细胞仪集成了细胞的种群测量和多蛋白亚细胞共定位的个体演示。共聚焦显微镜在测量蛋白质共定位时提供了高分辨率, 流式细胞仪能够为不同的细胞群提供全面的分型。成像流式细胞仪将共聚焦显微镜和流式细胞术的优势与可接受的图像分辨率相结合, 以高姿态分析蛋白质共定位, 从而转录组环境变化的功能确认。污染物。
对多蛋白的共定位的分析在种群的规模是技术上要求, 因为 (i) 详细分析多个体细胞是劳动密集型和相对偏倚;(ii) 根据阳性染色的强度或面积, 很难确定解释重叠像素的最佳阈值;和 (iii) 对个体和种群细胞的平衡观察至关重要。在这项研究中, 我们专注于执行生物有意义的观察, 统计学意义测试, 和共同本地化的蛋白质的成像演示。为了实现这一目标, 我们首先使用成像流式细胞仪获得了数以千计的人 DCs 图像。图像文件的定量分析结合了一个明亮的细节相似性分析使用的软件思想和一个统计测试共定位分析使用斐济-ImageJ。该方案允许对共染色种群进行浇口, 用皮尔逊相关系数的明亮细节相似性计算两种蛋白质的共定位, 并随机选择共染色细胞进行亚细胞定位蛋白质13。为了进一步实现联合局部蛋白质的生物学相关演示, 我们使用了 ImageJ-斐济软件, 并应用 Mander 系数来计算共局部区域的百分比和重叠的像素强度, 以证明CD1d 在内吞通路中的定位。
使用 ImageJ-斐济计划的关键步骤是执行单细胞成像分析。与从单个细胞图像的视觉合并的颜色相比, 可以监测单个细胞的百分比蛋白共定位的变化。通过将所有100个细胞的百分比蛋白共定位平均, 可以计算方法和标准误差, 以证明蛋白质共定位和种群水平的功能相关性。这种生物信息学分析简单明了, 不涉及模糊结果, 因为此分析提供了一个可重现的阈值计算, 使用考斯特斯的方法为相同的数据集生成相同的结果阈值, 并类似数据集的类似阈值26。这种技术的局限性是人工密集型的人工输入的单细胞图像和潜在的主观选择视觉共染色细胞使用的想法软件。在我们的研究中, 我们分析每组100个细胞图像, 并设置可重现的选择标准, 包括强共染色信号和 CD1d 和 Lamp1 蛋白的透明亚细胞定位。克服这些局限性需要技术改进分析软件, 允许基于形态学特征的单细胞进行批量分析和客观选择, 超出流式细胞仪所提供的染色强度。总之, 细胞和人口成像分析将提供高重现性、全面、统计测试和生物相关的百分比蛋白共定位结果。我们相信这 CD1d-Lamp1 共定位分析可以作为一个成功的例子, 高剖面细胞成像分析, 以回答更广泛的问题的功能和形态学改变细胞蛋白。
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Disclosures
作者没有什么可透露的
Acknowledgments
作者感谢罗伯特 Giulitto (远见卓识血液中心) 的人血液样本和良牛医生的基因表达的规范化读。我们还感谢国家环境健康科学研究所 (ES006096)、环境遗传学中心 (CEG) 试点项目 (史绍熙)、国家过敏和传染性疾病研究所 (AI115358) (史绍熙) 的赠款支持, 大学辛辛那提大学研究委员会奖 (史绍熙) 和辛辛那提大学医学院核心增强资金 (x.z.)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transcriptomics | Illumina | HiSeq 2500 v4 | Illumina HiSeq system |
| ImagingStream X | Millipore | 100220 | Imaging flow cytometry |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fisher | Total RNA extraction | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent | Total RNA QC analysis | |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher | PCR, enzyme reaction | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England Biolab | PolyA RNA purification | |
| Automated SMARTer Apollo system | Takara | PolyA RNA purification | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolab | Library preparation | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | DNA purification | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) | Thermo Fisher | Library quantification | |
| NEBNext Library Quant Kit | New England Biolab | Library quantification | |
| cBot | Illumina | Library cluster generation | |
| TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot – HS | Illumina | Library cluster generation | |
| HiSeq 1000 | Illumina | Sequencing | |
| TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles) | Illumina | Sequencing | |
| Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | Bio Legend | L243 | |
| Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | Bio Legend | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | Bio Legend | L161 | |
| PE-anti-mouse IgG2b | Bio Legend | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) | Bio Legend | CD107a(H4A3) |
References
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