Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

دمج تصوير التدفق الخلوي والتنميط لتقييم الاتجار بتغيير CD1d اندوسيتيك ترانسكريبتوميك

Published: October 29, 2018 doi: 10.3791/57528
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Environmental Health, University of Cincinnati College of Medicine

Summary

ويوفر نهج مثالي للكشف عن تغيير الخصائص المورفولوجية والوظيفية للخلايا على الصعيدين الفردي وسكاني التصوير التدفق الخلوي. قد تجلى تعطل وظيفة اندوسيتيك لعرض مستضد الدهن في الخلايا الجذعية البشرية المعرضة للملوثات مع ترانسكريبتوميك مجتمعة التنميط التعبير الجيني ومظاهره المورفولوجية للاتجار بالبروتين.

Abstract

تحليل سكاني لتغيير الخصائص المورفولوجية والوظيفية للبروتينات اندوسيتيك صعبة بسبب الطلب على التقاط الصور في إجراء تحليل صورة الإحصائية ومستوى خلية واحدة على مستوى سكاني. وللتغلب على هذه الصعوبة، استخدمنا التصوير التدفق الخلوي وترانسكريبتوميك التنميط (الحمض النووي الريبي-seq) لتحديد تغيير التعريب سوبسيلولار بالمجموعة من التمايز د 1 البروتين (CD1d) المرتبطة بالتعبير الجيني اندوسيتيك البصر في الإنسان الخلايا الجذعية (DCs)، التي تتعرض للمشترك محبتين الهواء الملوثات بنزو [أ] بيرين. وقد تم تحليل كولوكاليزيشن CD1d والبروتينات علامة اندوسيتيك Lamp1 الآلاف من خلية الصور التي تم التقاطها مع التصوير التدفق الخلوي استخدام الأفكار وفيجي إيماجيج البرامج. كانت تصور العديد من الصور الخلوية مع البروتينات CD1d و Lamp1 شارك الملون بعد النابضة في CD1d+Lamp1+ وحدات تحكم المجال Dc باستخدام الأفكار. كولوكاليزاتيون CD1d و Lamp1 المعززة عند التعرض تجلى كذلك استخدام سكاتيربلوتس ثريشولديد، اختبار مع المعاملات في ماندر لكثافة مترجمة شارك، ودبر BaP استناداً إلى النسبة المئوية للمناطق شارك المترجمة باستخدام إيماجيج وفيجي. وتوفر البيانات لدينا نهج الآلي و bioinformatic مفيدة لقياس البروتين كولوكاليزاتيون على المستويات الخلوية كل واحد وسكاني، دعم البصر نتيجة وظيفية لتغيير ترانسكريبتوميك في الإنسان المعرضة للملوثات وحدات تحكم المجال Dc.

Introduction

مستضد العرض التقديمي عادة ما ينطوي على البروتين داخل الخلايا الاتجار بالأشخاص، التي قد تحقق غالباً استخدام توصيف الخصائص المورفولوجية والتنميط المظهرية من مستضد تقديم الخلايا1،2،3 . لدمج مزايا التصوير وأساليب فينوتيبينج، يصف لنا منصة تحليل تصوير في كل من خلية مفردة ومستويات السكان تبرهن كولوكاليزيشن تغيير بروتين في الخلايا الجذعية البشرية (DCs). في الببتيد مستضد العرض الرئيسية histocompatibility المعقد (MHC) الفئة الأولى جزيئات الربط ببتيد قصيرة (8-10 البقايا) في هيولى لتنشيط CD8 التقليدية+ تي الخلايا، بينما MHC class ثانيا جزيئات تربط أطول نسبيا الببتيد (بقايا ~ 20) في مقصورات اندوسيتيك لتنشيط خلايا CD4 التقليدية الخلايا+ ر1،4. على النقيض من ذلك، يتم تنشيط خلايا تي الخاصة بالدهن من البروتينات CD1 مع المستضدات الدهن تحميل أساسا في المقصورات اندوسيتيك5،6. يتطلب عرض مستضد الدهن المعروض من نواتج الأيض الدهون المنتجة في دهن الأيض7،،من89،10 والتحميل من نواتج الأيض الدهني الوظيفية للبروتينات CD1 في المقصورات اندوسيتيك5،6. وفي هذا السياق، مختلف العوامل الخلوية تحوير المادة الدهنية مستضد العرض، لا سيما في التعرض البيئي للملوثات محبتين والاضطرابات المناعية، أمرا حاسما لتعريفها. في هذه الدراسة، استخدمنا التحليل ترانسكريبتوميك وتنميط الصورة وتحليل التصوير الخلوية وسكاني للبشرية DCs المشتقة من الوحيدات لتحديد البروتين اندوسيتيك الاتجار بالمساهمة في عرض مستضد الدهن في التعرض للملوثات. بالتأكيد، يمكن تطبيق هذا المنهاج المشترك لدراسة الاتجار بالبروتين سوبسيلولار وكولوكاليزاتيون في مختلف العمليات البيولوجية.

من الناحية التقنية، تجلى التعريب سوبسيلولار البروتين عادة استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] وتحليلها إحصائيا في عدد محدود من الكشف عن الخلايا1،2،،من311. وعلاوة على ذلك، التدفق الخلوي طبق على نطاق واسع إلى بوابة الخلية السكان مع إشارات شارك الملون البروتينات متعددة على مستوى خلوي12؛ ولكن هذا يفتقر إلى وضع تصور مفصل للبروتين سوبسيلولار كولوكاليزيشن. لتحقيق تحليلات شاملة وإحصائية لنسبة البروتين كولوكاليزاتيون على المستويين الخلوي والسكان، ونحن إدراج التصوير نهج التنميط والتحليل لتحديد ملامح كولوكاليزاتيون البروتين مع البيولوجية أهمية. على وجه التحديد، يمكننا استخدام التصوير التدفق الخلوي للكشف عن كولوكاليزيشن CD1d وغشاء الليزوزومية المرتبطة بالبروتين 1 (Lamp1) البروتينات في هذه الدراسة. وكان التحليل الكمي لجزيئات كولوكاليزيد سابقا صعبة يجب القيام بها في نطاق سكاني. في هذه الدراسة، علينا تكييف البرنامج ImageJ-فيجي للنظر في النسبة المئوية للبروتين كولوكاليزاتيون مع عدد كبير من الخلايا الملون المشترك على المستويين الخلوي سكاني والفردية. على وجه التحديد، قمنا بقياس المجالات شارك المترجمة وكثافة وحجم سكاني تدعم الاستنتاج بأن البروتين CD1d أبقى إلى حد كبير في أواخر مقصورات اندوسيتيك للإنسان وحدات تحكم المجال Dc في التعرض الملوثات محبتين بنزو [أ] بيرين (BaP)13 . توفير هذا الخلوي مجتمعة والسكان التصوير تحليل النتائج استنساخه بدرجة عالية وشاملة ويعتد به إحصائيا من CD1d-Lamp1 كولوكاليزيشن ذات الصلة بالمادة الدهنية تحول دون مستضد العرض التقديمي.

الترنسكربيتوم Dc البشرية المعرضة BaP تؤيد بقوة الفرضية القائلة بأن الأيض الدهني اندوسيتيك والاتجار اندوسيتيك CD1d كانت ضعف في التعرض BaP. لاختبار هذه الفرضية، طبقنا التصوير التدفق الخلوي الشخصية صور سكان العاصمة التي كانت تشارك ملطخة بالبروتينات متعددة بما في ذلك العاصمة علامات وعلامات اندوسيتيك و CD1d. أخيرا، حللت إحصائيا الخلايا الملون المشترك لإظهار النسبة المئوية لكثافة ومناطق كولوكاليزيشن CD1d و Lamp1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بروتوكولات البشرية في هذه الدراسة قد أقر "المجلس الاستعراض المؤسسي" لجامعة سينسيناتي، وأجريت جميع الأساليب وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة واللوائح. وتم الحصول على عينات دم من المانحين صحية من مركز الدم هوكسوورث في المركز الطبي في جامعة سينسيناتي.

1-ترانسكريبتوميك التنميط من المعرضة للملوثات البشرية المشتقة من الوحيدات وحدات تحكم المجال Dc

  1. استخراج الحمض النووي الريبي مجموع البلدان النامية المعرضة BaP
    1. التفريق بين وحدات تحكم المجال Dc البشرية باستخدام السيتوكينات GM-CSF، وايل-4، وفضح وحدات تحكم المجال Dc إلى BaP لمدة 4 أيام13.
    2. فرز DCs يتعرض BaP استخدام التدفق الخلوي استناداً إلى علامات أعرب السطحية (النسب–هلا-الدكتور+)، معظمها يتكون من وحدات تحكم المجال Dc التقليدية (CD11c+CD1c+)13. نموذجياً، فرز 10,000 وحدات تحكم المجال Dc في الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 10% FBS، الطرد المركزي وحدات تحكم المجال Dc في 600 × g و 4 درجة مئوية لمدة 6 دقائق، وعلى الفور إزالة المادة طافية بالشفط باستخدام تلميح ماصة 1 مل.
    3. حالما تتم إزالة المادة طافية بالطموح، بيليه الخلية عن طريق إضافة 0.4 مل من "المخزن المؤقت" تحلل/ملزمة من عدة عزل الحمض النووي الريبي للتخزين في-80 درجة مئوية قبل استخراج الحمض النووي الريبي.
    4. استخدام طقم عزل الحمض النووي الريبي مع مجموع البروتوكول استخراج الحمض النووي الريبي لاستخراج الحمض النووي الريبي إجمالي14. قياس سلامة الجيش الملكي النيبالي باستخدام بيواناليزير15.
  2. تحليل ترانسكريبتوميك لفرز وحدات تحكم المجال Dc (الشكل 1A)
    1. إعداد المكتبة للجيش الملكي النيبالي-seq باستخدام مجموعة أدوات إعداد مكتبة الجيش الملكي النيبالي. وباختصار، تفتيت الجيش الملكي النيبالي بولي-أ معزولة (~ 200 bp)، وعكس نسخ الأجزاء إلى 1 حبلا من كدنا، واتبع بتوليف حبلا كدنا الثاني المسمى بواسطة dUTP.
    2. اضطر كدنا حبلا مزدوجة للمحول مع هيكل حلقة جذعية بعد تنقية حبة، إصلاح نهاية وتراجع دا. المكوس بقايا اليوراسيل في ستراند 2 حلقة كدنا ومحول مع الإنزيم المستخدم (كاشف الختان اليوراسيل على حدة) للحفاظ على خصوصية حبلا وفتح حلقة المحول لبكر.
      1. إجراء دورات 13 من PCR باستخدام كبسولة تفجير العالمية والخاصة بالرقم القياسي لإثراء المكتبة المفهرسة. تنظيف المكتبة وتشغيله على شريحة "بيواناليزير الحمض النووي حساسية عالية" للتحقق من جودة المكتبة وحجم التوزيع.
    3. استخدام أدوات القياس الكمي مكتبة ونظام PCR الوقت الحقيقي جنبا إلى جنب مع معلومات حجم مكتبة لحساب المكتبة التركيز عن طريق أسلوب منحنى المعياري.
    4. التناسب تجمع مكتبات متوافقة مفهرسة فردياً وضبط التركيز الكلي النهائي إلى 15 بعد الظهر. أداء الجيل الكتلة مكتبة وتسلسل المكتبة في إعداد قراءة واحدة 1 × 50 شركة بريتيش بتروليوم لتوليد 25 مليون على ما يلي كل عينة.
  3. التسلسل
    1. تحميل الترتيب وفهرسة الكواشف على رفوف كاشف SBS وبي، على التوالي. ضع الكواشف في حمام مائي درجة مختبر ح 1 حتى جميعا قد ذاب الجليد ومختلطة الكواشف في كل زجاجة/الأنبوبة بشكل صحيح.
    2. إعداد مزيج السلعية بإضافة إنزيم المذابة صبغ و-20 درجة مئوية إلى الزجاجة ومزيج. إعداد حل هيدروكسيد الصوديوم طبقاً للإرشادات التي تظهر في التسلسل. وضع جميع المواد الكاشفة في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للاستخدام.
    3. خلال ح 1 في انتظار فترة، السلطة في التسلسل. الانتظار لمحرك الأقراص دونوتيجيكت تظهر وقم بتوصيل الكمبيوتر إلى محرك أقراص شبكة اتصال.
    4. إطلاق برامج التحكم المنظم.
    5. إعداد 2 لتر حل صيانة المياه والصرف الصحي الذي يحتوي على 0.5% 20 توين و 0.03% المياه 300 درجة المختبر في بروكلين.
    6. في الرف كاشف SBS، إضافة ~ 100 مل من محلول الغسيل الصيانة لكل من زجاجات 8، والمسمار القمع أغطية للزجاجات. في الرف كاشف PE، إضافة ~ 12 مل من محلول صيانة المياه والصرف الصحي لكل من عشرة أنابيب مخروطية الشكل 15 مل، وتجاهل القبعات.
    7. رفوف تحميل الاثنين مع الحل تعبئة الزجاجات/أنابيب إلى جهاز التسلسل.
    8. من برامج التحكم المنظم، اختر "الغسيل الصيانة"؛ اتبع الإرشادات على الشاشة لتنظيف نظام التسلسل السوائل حتى يتم إكمال العملية.
    9. البدء "تشغيل جديدة" في علامة التبويب "سلسلة" من البرنامج؛ توجيه إخراج البيانات إلى محرك أقراص شبكة اتصال. اختر معلمات لقراءة واحدة 1 × 50 شركة بريتيش بتروليوم مع مكتبات فهرس واحد متعدد.
    10. بشكل اختياري، تسجيل الدخول إلى "لوحة الوصل التسلسل باسيسبيس" حيث أنه يمكن رصد حالة التسلسل عن بعد عن طريق الكمبيوتر أو الهاتف الذكي.
    11. تحميل "ورقة عينة" ل demultiplexing وتوفير المعلومات كاشف وفقا لمتطلبات البرامج.
    12. تحميل الكواشف SBS و PE للتسلسل. رئيس الوزراء النظام مع خلية تدفق المستخدمة (~ 15 دقيقة).
    13. وبمجرد الانتهاء من توليد الكتلة (ح ~4.5)، إخراج الخلية تدفق، طفيفة رش الخلية تدفق بالماء، ومسح الجاف باستخدام ورق العدسة. طفيفة رش الخلية تدفق مع الإيثانول 95% والقضاء على الجفاف. تحقق ضد ضوء للتأكد من أن السطح نظيفة دون الحطام أو بقايا الملح.
    14. بعد إكمال خطوة رئيس الوزراء، تحميل الخلية تدفق متفاوت المسافات وتبدأ التسلسل. سوف يتم تلقائياً تشغيل البرنامج "عارض تحليل تسلسل".
    15. مراقبة جودة البيانات التسلسل عبر ساف بما في ذلك كثافة الكتلة، ما يلي: تمرير مرشح، تمرير كتلة عامل التصفية %، % ≥Q30، وتركه المرحلة/الطور الأول %، فهرسة ومراقبة الجودة، إلخ وهذا يساعد على فهم نوعية البيانات، واستكشاف الأخطاء وإصلاحها.
    16. تغيير طوقا خلية تدفق وأداء "يغسل الصيانة" بعد الانتهاء من التسلسل. التسلسل جاهز للتشغيل التالية.
  4. تحليل بيوينفورماتيك
    1. أداء تحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي13المعلوماتية الحيوية.

2-مسار تحليل الملامح ترانسكريبتوميك (الشكل 1B)

  1. استخدم المقلم بيوكوندوكتور لمقارنة التهم كثافة التعبير الجيني الناتجة بين وحدات تحكم المجال Dc BaP مكشوفة وغير مكشوفة من ثلاث جهات مانحة. ثم تحديد الجينات أعرب متفاوتاً بين وحدات تحكم المجال Dc BaP المكشوفة وغير المكشوفة استناداً إلى التغيير المطلق إضعاف (> طيات 2) واكتشاف كاذبة معدل القيم (FDR)-المعدل ف-(< 0.05).
  2. للتنبؤ مجموعات وظيفية من خلطات أعرب عن الجينات، استخدام حزمة البرامج توبكلوستير للبحث عن المورثات المعدلة ضد العديد من قواعد البيانات بما في ذلك كيج وريكتومي وتوليد بيانات التجميع. توبكلوستير يستخدم اختبار الهندسة الفوقية للحصول على الإثراء الوظيفي عن طريق تحليل إثراء قائمة الجينات16.
  3. كذلك إدخال النتائج من هذه المجموعات الدالة إلى سيتوسكابي17،18 نسخة 3.3.0، منصة برمجيات مصدر مفتوح المستخدمة على نطاق واسع لتصور الشبكات المعقدة. وهكذا تظهر الجينات المشاركة في مجموعات مختلفة أو المسارات، بما في ذلك استقلاب الدهون، ومجموعات اندوسيتيك في شبكة الاتصال مع الشرح لون من إضعاف متوسط تغير الجينات التعبير (الشكل 1B)13.

3-تصوير التدفق الخلوي CD1d وكولوكاليزيشن Lamp1

  1. جسم وسم BaP تتعرض البلدان النامية
    1. فضح 0.5 × 106 DCs البشرية إلى 5.94 مم BaP لمدة 4 أيام في 37 درجة مئوية في 2 مل من إكمال دولبيكو المتوسطة "تعديل النسر". حصاد وحدات تحكم المجال Dc بالطرد المركزي في 400 غرام x للحد الأدنى 10 كتلة DCs المتباينة التي تفرخ الخلايا مع مانع مصل الدم البشري والإنسان المضادة الأجسام المضادة لمستقبلات Fc لمدة 10 دقيقة في الجليد، بما في ذلك الأجسام المضادة الإنسان CD16 و CD32 و CD64.
    2. احتضان "البنفسجي الرائع" 421-مكافحة--CD1c (L161)، فيكوريثرين/سينين صبغ 7 (PE/Cy7)--مكافحة--هلا-الدكتور، و PE/Cy5-ضد-CD11c مع وحدات تحكم المجال Dc لمدة 20 دقيقة في الجليد. ويبين الجدول 1 قائمة بهذه الأجسام المضادة.
    3. إصلاح وحدات تحكم المجال Dc مع بارافورمالدهيد 4% في برنامج تلفزيوني وبيرميبيليزي لهم مع "المخزن المؤقت للغسيل بيرميبيليزيشن". القيام بتلوين داخل الخلايا مع مزيج الإنسان المضادة المنقاة PE المسمى CD1d (51.1) والمسمى أليكسا فلور 647 مكافحة--Lamp1 (CD107a) (H4A3).
  2. التصوير قياس التدفق الخلوي (الشكل 2)
    1. تحليل العينات ملطخة باستخدام سيتوميتير تدفق تصوير في صميم التدفق الخلوي لمستشفى سينسيناتي "الأطفال" استخدام هدفا X 40 تسفر عن 300 بكسل لخلية مع حوالي 10 ملم في القطر. حجم بكسل واحد حوالي 0.5 مم من 0.5 مم للكائن.
    2. الحصول على 10000 صور الخلوية بطريقة غير متحيزة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

4-التصوير تحليلات للتدفق الخلوي الصور

  1. تحليل كولوكاليزيشن باستخدام أفكار البرمجيات (الشكل 2)
    1. أداء التعويض مع الملطخة واحد مقابل عينات غير ملطخة بتعيين كثافة fluorescence عينات غير الملون عن العتبة، بما في ذلك غير الملون DCs BaP مكشوف مع BaP أوتوفلوريسسينسي، كما هو الحال في بيانات روتينية التدفق الخلوي تحليل.
    2. بوابة الملون الخلايا للحصول على مجموعات فرعية من هلا-الدكتور+CD11c+CD1d+Lamp1+ الخلايا (الشكل 2A) وإظهار الصور الخلوية في مجموعات فرعية المبوب (الشكل 2).
    3. حفظ صور الخلية في تنسيق png استناداً إلى معايير الاشتمال التقنية اثنين، البصرية وجود إشارات قوية شارك الملون والتعريب سوبسيلولار للبروتينات CD1d و Lamp1، للتحاليل كولوكاليزاتيون باستخدام إيماجيج وفيجي (الشكل 2).
  2. استخدام برنامج إيماجيج وفيجي لإجراء تحليل كولوكاليزيشن (الشكل 3).
    1. إعداد ملفات الصورة المدخلة عن طريق دمج الصور المحفوظة خلية 100 لغير المكشوفة والمعرضة BaP DCs البشرية، على التوالي (الشكل 3A).
    2. تحليل CD1d (أحمر) و Lamp1 كولوكاليزاتيون (الأخضر) باستخدام سكاتيربلوت.
      1. قم بتشغيل برنامج إيماجيج وفيجي. فتح ملف.png مع 100 صور الخلية (الشكل 3B و الشكل 4A): "الملف | فتح ".
      2. تقسيم الصورة مع قنوات الأحمر والأخضر المدمجة إلى اثنين من الصور مع قناة خضراء أو حمراء: "صورة | لون | تقسيم القنوات ".
      3. رسم سكاتيربلوت استخدام الأوامر "تحليل | كولوكاليزيشن | عتبة كولوكاليزيشن ". حفظ سكاتيربلوت استخدام مفتاح "PrintScreen" .
    3. حساب ماندر في كولوكاليزاتيون معاملات لكل صورة الخلوية واحدة (n = 100) (الشكل 4 باء)
      1. حدد صورة خلية واحدة فقط في ملف الصورة مع تقسيم القنوات باستخدام "البيضاوي" أداة التحديد.
      2. استخدام أوامر "تحليل | كولوكاليزاتيون | عتبة كولوكاليزيشن ". حدد "القناة الأولى" من مربع الحوار لمنطقة فائدة (العائد على الاستثمار). الاحتفاظ بكافة خيارات الحساب، بما في ذلك "ماندر لاستخدام عتبات" لكل صورة الخلية.
      3. كرر هذه العملية الحسابية لكل 100 خلية الصور.
      4. حفظ وفتح النتائج باستخدام جدول بيانات.
      5. الأرض متوسط والأخطاء المعيارية "معاملات ثريشولديد ماندر" (n = 100, 0 يعني لا كولوكاليزاتيون و 1 يعني الكمال كولوكاليزاتيون). استخدم اختبار t للطالب لحساب قيمة ف للمقارنة بين المجموعات BaP المكشوفة وغير المكشوفة (الشكل 4 باء).
    4. حساب النسبة المئوية لكثافة بكسل ثريشولديد مترجمة المشترك بين CD1d و Lamp1 لصور متعددة في الخلية (n = 100) (الشكل 4).
      1. استخدام بروتوكول تحليل نفسه في 4.2.3 وحدد الخيار نتيجة "% كثافتها عتبة كولوكاليزيد"بالإضافة إلى ذلك.
      2. إجراء هذا التحليل جنبا إلى جنب مع معاملات كولوكاليزاتيون في ماندر.
      3. وبالمثل الأرض متوسط والأخطاء المعيارية لكثافة % كولوكاليزيد بين CD1d و Lamp1. استخدم اختبار t للطالب لحساب قيمة ف للمقارنة بين المجموعات BaP المكشوفة وغير المكشوفة (الشكل 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الملوثات محبتين BaP تبديل مجموعات الجينات اندوسيتيك في DCs المشتقة من الوحيدات DCs. الإنسان البشري من كل جهة مانحة (n = 3) المحتضنة مع BaP وفرزها لوحدات تحكم المجال Dc التقليدية، التي كانت تستخدم كذلك لتحليل الحمض النووي الريبي الاستخراج وترانسكريبتوميك كما هو موضح . عند تطبيع التعبير الجيني، جمعت الجينات المتغيرة بين المجموعات BaP المكشوفة وغير المكشوفة وفقا للعلاقة الوظيفية الأثران عن الجينات. ونحن إدخال قائمة الجينات المعدلة للبرنامج توبكلوستير16 لتحليل المسارات الخلوية ذات الصلة وإجراء الاختبار الإحصائي باستخدام تصحيح معدل (FDR) اكتشاف كاذبة لقيم p (الشكل 1B). وحددت عدة مجموعات الجينات المعدلة الرئيسية، بما في ذلك استقلاب الدهون ووظائف اندوسيتيك، في DCs BaP مكشوف. في هذه الدراسة، ونحن تركز تحديداً على اختبار وظيفية الاتجار اندوسيتيك، لأنه تم عرض مستضد CD1 بوساطة اعتماداً كبيرا على مستضد الدهن تحميل في المسار اندوسيتيك5،19، 20،21.

ويظهر CD1d اندوسيتيك الاتجار استخدام التصوير التدفق الخلوي. عند الحصول على عدد كبير من الصور الخلية باستخدام التصوير التدفق الخلوي، بدأنا باستخدام برنامج أفكار لتصور الصور الفردية الخلوية عن طريق مريح النابضة السكان خلية يشترك ملطخة بأجسام مضادة متعددة (الشكل 2A). على وجه التحديد، تمكنا من بوابة الملون سكان العاصمة الكبرى شاركت مع الدكتور هلا و CD11c مواصلة إظهار وحدات تحكم المجال Dc مع التعبير المشارك CD1d و Lamp1 (الشكل 2A). يمكن إثراء إشارات الملون المشترك عن طريق النابضة سكان الخلية مع وصمة عار مزدوج CD1d و Lamp1 (الشكل 2A). واظهرنا أولاً غير مكشوف العادي وحدات تحكم المجال Dc مع كولوكاليزاتيون الحد الأدنى من البروتينات CD1d و Lamp1، مما يدل المستوى القاعدي للاتجار اندوسيتيك CD1d ومستوى عال من التعبير السطحي في الظروف الفسيولوجية (الشكل 2)5، 19،،من2021. لقياس كولوكاليزيشن للبروتينات CD1d و Lamp1، كنا في البداية الأفكار لإظهار زيادة طفيفة من التفصيل مشرق التشابه بين البروتينات CD1d و Lamp1 مع التعرض BaP13. التشابه في التفاصيل مشرق تم حسابه على أساس معامل الارتباط لبيرسون لاختبار الترابط بين هذين العاملين، بينما البروتينات CD1d و Lamp1 من غير المحتمل جداً تتداخل في الحالة الفسيولوجية، مشيراً إلى أن CD1d قادرة على عابر من المرور من خلال أواخر مقصورات اندوسيتيك للحصول على المستضدات الدهن الوظيفية. وهكذا، أنها ذات معنى أكثر بيولوجيا اختبار ما إذا كان البروتين CD1d في التعرض BaP يحتفظ أكثر في المقصورات اندوسيتيك الراحل كما يتضح من زيادة النسبة المئوية للبروتينات CD1d و Lamp1 المتراكبة في فيجي برمجيات تحليل التصوير باستخدام حزمة إيماجيج. أخيرا، يمكن استخدام الاحتفاظ بالبروتين CD1d في أواخر المقصورات اندوسيتيك وظيفيا تأكيد الملامح الجين اندوسيتيك تغيير في التعرض BaP.

وتم قياس كثافة المشترك المترجمة والمنطقة الواقعة بين البروتينات CD1d و Lamp1. للحصول على إعداد عتبة استنساخه والنسب المئوية للمجالات شارك المترجمة وكثافة، طبقنا ImageJ-فيجي22، التي استخدمت أيضا في عدة أخرى دراسات23،،من2425. نختار عشوائياً CD1d+Lamp1+ الخلايا مع وصمة عار المشاركة القوية والتعريب سوبسيلولار واضحة للبروتينات CD1d و Lamp1 كإدخال الصور (الشكل 2). يمكن دمج الصور الخلوية الفردية إلى ملف صورة واحدة لتحليل متسق واحد (الشكل 3A). في دراستنا، اندمجت 100 خلية الصور وفتحها في برنامج لتحليل عن طريق تعيين "عتبات كولوكاليساتيون" (الشكل 3). وأبدى عموما مع سكاتيربلوت كولوكاليزيشن كثافة بكسل بين قناتين (PE المسمى CD1d والمسمى AF647 Lamp1) عن طريق الكشف عن بكسل شارك مترجمة من هذه الصور 100 خلية (الشكل 4 أ). في هذه المؤامرة، والخطوط الأفقية والعمودية تمثل عتبات Costes في وخطوط قطرية تمثل نسبة كثافة بكسل عموما بين اثنين من القنوات. يوفر العتبة Costes مرئية لإزالة ضعيفة بكسل من قناتين المتراكبة. ويبين سكاتيربلوت وادي إلى كولوكاليزاتيون زيادة البروتينات CD1d و Lamp1 في التعرض BaP. وعلاوة على ذلك، نحن كمياً درجة كولوكاليزيشن بين البروتينات CD1d و Lamp1 باستخدام المعاملات في ماندر (الشكل 4 باء). ونتيجة لذلك، إثبات معاملات ماندر لزيادة كولوكاليزيشن بين CD1d و Lamp1 في أواخر المقصورات اندوسيتيك البلدان النامية المعرضة BaP مقارنة مع Dc غير مكشوف، كما تدعمها إحصائيا t-الاختبارات الطالب (الشكل 4 باء). ومع ذلك، إذا كانت كثافة البروتين غير متجانسة بين المناطق كولوكاليزيد وغير كولوكاليزيد، سوف تكون كثافة كولوكاليزيد لم يسبق لها مثيل للمناطق كولوكاليزيد. ولذلك، من الضروري أيضا لمواصلة الامتحان كولوكاليزيشن استناداً إلى كثافة (الشكل 4). كنتيجة لذلك، يمثل كل عمود حساب متوسط النسبة المئوية لكثافة كولوكاليزيد من صور متعددة الخلايا (n = 100) بين ظروف BaP المكشوفة وغير المكشوفة لزوج من البروتينات المشترك المترجمة. T-اختبارات الطالب كما تظهر دلالة إحصائية (n = 100، ف< 0.001) بين المجموعات BaP المكشوفة وغير المكشوفة مع الأخطاء القياسية المشار إليها. بالإجمال، إثبات البيانات الخاصة بنا أن CD1d البروتين استبقيت في أواخر اندوسوميس في التعرض BaP، دعم هذا التعبير الجيني BaP غيرت كذلك يؤدي إلى الدالة اندوسيتيك البصر والاتجار CD1d.

وباختصار، يعزز كولوكاليزاتيون CD1d-Lamp1 عند التعرض BaP. معلمات متعددة استناداً إلى صور الخلية (الشكل 2)، بما في ذلك سكاتيربلوتس بكثافة بكسل المتراكبة (الشكل 4 أ)، عززت المعاملات في ماندر (الشكل 4 باء)، وزيادة النسبة المئوية لكثافة المتراكبة ( 4 الرقم)، دعم الاحتفاظ CD1d اندوسيتيك في التعرض BaP. هذا التحليل كولوكاليزيشن للصور الخلوية نهج دقيق تحديد درجة كولوكاليزيشن البروتين وتبين الآليات البيولوجية لوظائف الخلية، متسقة مع جين اندوسيتيك تعطلت اندوسيتيك الدالة على سبيل المثال، التعبير، مما ساهم في تفعيل تحول دون تقييد CD1d تي الخلايا13.

Figure 1
الشكل 1 : اضطرابات في العاصمة ترانسكريبتوميس في التعرض BaP (أ) تخطيط انسيابي ما بعدها الجيش الملكي النيبالي أولاً، تم إجراء تحليل مراقبة الجودة (مراقبة الجودة) دراسة نوعية مجموع الجيش الملكي النيبالي. استخدام النظام الآلي ومجموع الجيش الملكي النيبالي عالية الجودة كما رنا الإدخال، وبولي-أ كانت معزولة، الذي أظهر المنضب الرنا الريباسي في تحليل الحمض النووي الريبي QC بولي-أ. ثم تعرض الجيش الملكي النيبالي بولي-أ لمكتبة مؤتمتة الإعداد والفهرسة عن طريق PCR. المقبل، وقد تم تحليل المكتبة تضخيم قبل بيواناليزير لمراقبة الجودة مع الغلة المتوقعة وحجم التوزيع. بعد التحديد الكمي قبكر، تجميع المكتبات المفهرسة ومتفاوت على خلية تدفق للتسلسل، وكانت نوعية تسلسل البيانات في الوقت الحقيقي رصد. ويمثل المحور التهم النسبي للتدفق الخلوي تلطيخ الإشارات. (ب) تم تجميع الجينات غيرت في مجموعات وظيفية مختلفة، وتظهر مجموعات الجينات المرتبطة بالأيض وظيفة ودهن اندوسيتيك. الأحمر: CD1d؛ الأخضر: Lamp1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : تحليل للصور الخلوية باستخدام البرنامج الأفكار. تم أولاً عن طريق بوابة المانحين (A) وحدات تحكم المجال Dc الوحيدات المستمدة من صحية على هلا-الدكتور + CD11c + الخلايا وكذلك بوابات في CD1d+Lamp1+ الخلايا باستخدام برنامج الأفكار. (ب) الصور الخلوية استخرجت من هلا-الدكتور+CD11c+CD1d+Lamp1+ السكان لرؤية الصورة الخلوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : تحليل للصور الخلوية باستخدام البرنامج فيجي-إيماجيج- الخلايا مع وصمة عار المشارك قوي من البروتينات CD1d و Lamp1 اختيرت عشوائياً لتحليل الصور باستخدام فيجي-إيماجيج، ولكن الخلايا * تلطيخ غير مرئية أو ضعيفة للبروتين أما CD1d أو Lamp1 تم استبعاد كما في الشكل 2. (A) الخلوية تم اختيارها عشوائياً هذه الصور تم تجميعها في ملف صورة واحدة كصورة إدخال. تم إجراء تحليل (ب) كولوكاليزيشن من خلال وضع عتبات كولوكاليزيشن قنوات الأخضر والأحمر على حد سواء. تم إنشاؤها في سكاتيربلوتس مع حساب العتبة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : كولوكاليزاتيون للبروتينات CD1d ومصباح 1- استخدام بيانات مماثلة ذكرت في شارما et al. إعادة حساب 13، كثافة بكسل مترجمة شارك بين البروتينات CD1d و Lamp1 من وحدات تحكم المجال Dc في ظروف BaP المكشوفة وغير المكشوفة وسيظهر مع سكاتيربلوتس (A). حسبت المعاملات في ماندر كولوكاليزاتيون CD1d و Lamp1 وإظهارها مع متوسط من الخلية المحددة الصور (ب). وكانت نسبة كثافة بكسل مترجمة شارك أيضا محسوب (ج). دلالة إحصائية (n = 100، ف < 0.001) تم الحصول عليها مع تي-اختبارات الطالب بالمقارنة بالمجموعة غير المعرضة. وأشير إلى الأخطاء المعيارية. بيانات مأخوذة من مقايسة واحدة مع خلايا من متبرع سليم. وأجريت فحوصات مستقلة اثنين مع نتائج مماثلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الأجسام المضادة فلوروفوريس أو جسم الثانوية استنساخ
الدكتور هلا فيكوريثرين/سيانيني 7 (PE/Cy7) L243
CD11c فيكوريثرين/سيانيني 5 (PE/Cy5) 3.9
CD1c البنفسجي الرائع 421 L161
الإنسان المضادة تنقية CD1d IgG2b PE-مكافحة--الماوس 51.1
Lamp1 فلور أليكسا 647 (AF647) CD107a(H4A3)

الجدول 1: الأجسام المضادة المستخدمة في هذه الدراسة. بسبب الإثارة المشتركة وأطوال موجية الانبعاثات، تتداخل جزئيا fluorophores PE/Cy5 و AF647 في تلطيخ إشارات. نحن نستخدم هذه فلوروفوريس لتسمية بروتين سطحي (CD11c) وبروتين داخل الخلايا (Lamp1) على التوالي، لتفادي تداخل الإشارات على مستوى سوبسيلولار. نحن أيضا استخدام المعايرة المثلى والتعويض لتقليل الإشارات المتراكبة بين كلا فلوروفوريس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هو تحدي تأكيد طريقا المعدلة الجينات الوظيفية، بسبب الجينات أثرت على نطاق واسع التي تنطوي على مسارات متعددة، وصعوبة إدماج الأنشطة الخلوية الفردية وسكاني. استخدمنا التصوير التدفق الخلوي للتحديد اختبار CD1d الاتجار في المقصورات اندوسيتيك. التصوير التدفق الخلوي يدمج سكاني قياس الخلايا والمظاهرة كل من كولوكاليزيشن سوبسيلولار من البروتينات المتعددة. [كنفوكل] مجهرية سبق لها تقديم عالية الدقة في قياس كولوكاليزاتيون البروتين، والتدفق الخلوي قادرة على توفير فينوتيبينج شاملة للسكان خلية مختلفة. التصوير التدفق الخلوي يجمع بين مزايا الفحص المجهري [كنفوكل] والتدفق الخلوي في دقة وضوح الصورة مقبولة لتحليل كولوكاليزيشن البروتين بطريقة بارزة لتأكيد الوظيفية لتغيير ترانسكريبتوميك بالبيئة الملوثات.

تحليلات كولوكاليزيشن بروتينات متعددة في نطاق سكاني يطالبون من الناحية الفنية، لأنه (ط) بالتفصيل التحليلات متعددة الخلايا الفردية هي كثيفة العمالة ومنحازة نسبيا؛ (ثانيا) من الصعب تحديد حد أمثل لتفسير المتراكبة بكسل على أساس كثافة أو مجال تلطيخ إيجابية؛ (ثالثا) ومراقبة الخلايا الفردية وسكاني متوازن أمر حاسم. في هذه الدراسة، ركزنا على أداء ملاحظة ذات مغزى بيولوجيا، واختبار دلالة إحصائية، ومظاهره تصوير البروتينات المشترك المترجمة. لتحقيق هذا الهدف، ونحن الحصول أولاً على آلاف صور من وحدات تحكم المجال Dc البشرية استخدام التصوير التدفق الخلوي. التحليلات الكمية للتصوير الملفات جنبا إلى جنب تحليلاً تشابه تفاصيل مشرقة باستخدام البرمجيات الأفكار وإجراء تحليل كولوكاليزيشن اختبارها إحصائيا باستخدام فيجي-إيماجيج. ويسمح البرنامج الأفكار النابضة السكان شاركت الملون، وحساب كولوكاليزاتيون بروتينات هما استخدام تشابه تفاصيل مشرقة على أساس معامل الارتباط بيرسون، وعشوائياً اختيار المشترك الملون الخلايا مع التعريب سوبسيلولار من 13من البروتينات. إلى مواصلة تحقيق المظاهرة البيولوجية ذات الصلة من البروتينات مترجمة شارك، استخدمنا برامج إيماجيج وفيجي وتطبيق معامل ماندر حساب النسبة المئوية لمناطق محلية شاركت وتتداخل مع كثافة بكسل لإثبات درجة CD1d التعريب في المسار اندوسيتيك.

الخطوة الحاسمة لاستخدام برنامج إيماجيج وفيجي لأداء وحيد الخلية تحليل التصوير. يمكن رصد التباين في نسبة البروتين كولوكاليزاتيون من خلايا فردية بالمقارنة مع الألوان المدمجة مرئية من الصور خلية مفردة. بحساب متوسط كولوكاليزاتيون البروتين نسبة مئوية من كافة الخلايا 100، يمكن حساب الوسائل والأخطاء المعيارية لإثبات كولوكاليزاتيون البروتين والعلاقة الوظيفية على مستوى سكاني. هذا التحليل المعلوماتية الحيوية بسيطة وواضحة دون فيما يتعلق بنتائج ملتبسة، نظراً لأن هذا التحليل يقدم حساب عتبة استنساخه باستخدام الأسلوب Costes لإنتاج نفس أدت إلى عتبات لنفس مجموعات البيانات و عتبات مماثلة ل مجموعات بيانات مماثلة26. الحد من هذا الأسلوب هو الإدخال اليدوي كثيفة العمالة للصور خلية مفردة ويحتمل أن تكون ذاتية تحديد خلايا بصريا شارك ملطخة باستخدام البرمجيات الأفكار. في دراستنا، نحن نحلل 100 خلية الصور من كل مجموعة ونحن تعيين معايير الاختيار قابل لإعادة الإنتاج، بما في ذلك إشارات الملون شاركت قوي وواضح التعريب سوبسيلولار للبروتينات CD1d و Lamp1. ويتطلب التغلب على هذه القيود التحسين التقني للبرامج التحليلية للسماح بتحليل دفعة وموضوعية تحديد خلايا مفردة استناداً إلى الخصائص المورفولوجية تتجاوز كثافة المصبوغة المقدمة من التدفق الخلوي. في الخلوي موجزة، مجتمعة، والسكان سيوفر التصوير تحليل النتائج استنساخه بدرجة عالية وشاملة وتم اختبارها إحصائيا والبيولوجية ذات الصلة لنسبة البروتين كولوكاليزاتيون. ونحن نعتقد أن هذا التحليل كولوكاليزاتيون CD1d-Lamp1 يمكن أن تخدم كمثال ناجح لتحليلات التصوير الخلوية مكانة عالية للإجابة على أسئلة أوسع نطاقا بشأن التعديلات الوظيفية والمورفولوجية للبروتينات الخلوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

Acknowledgments

يشكر المؤلفون جوليتو روبرت (مركز الدم هوكسوورث) لعينات الدم البشري ويقرأ الدكتور ليانغ نيو لتطبيع التعبير الجيني. ونشكر أيضا دعم منحة من "معهد البيئة الصحية العلوم الوطنية" (ES006096)، ومركز لعلم الوراثة البيئية (CEG) مشروع تجريبي (أدمغة)، المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (AI115358) (أدمغة)، جامعة منح "مجلس البحوث في جامعة سينسيناتي" (أدمغة)، وجامعة "سينسيناتي كلية للطب الأساسية تعزيز التمويل" (عاشرا ض.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transcriptomics Illumina HiSeq 2500 v4 Illumina HiSeq system
ImagingStream X Millipore 100220 Imaging flow cytometry
mirVana miRNA Isolation Kit Thermo Fisher Total RNA extraction
Agilent RNA 6000 Pico Kit Agilent Total RNA QC analysis
Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler Thermo Fisher PCR, enzyme reaction
NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module  New England Biolab PolyA RNA purification
Automated SMARTer Apollo system Takara PolyA RNA purification
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina New England Biolab Library preparation
Agencourt AMPure XP magnetic beads Beckman Coulter DNA purification 
2100 Bioanalyzer Agilent Library QC, size distribution analysis
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Library QC, size distribution analysis
QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) Thermo Fisher Library quantification
NEBNext Library Quant Kit New England Biolab Library quantification
cBot Illumina Library cluster generation
TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot – HS Illumina Library cluster generation
HiSeq 1000 Illumina Sequencing
TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles) Illumina Sequencing
Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) Bio Legend L243
Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) Bio Legend 3.9
Brilliant violet 421 Bio Legend L161
PE-anti-mouse IgG2b Bio Legend 51.1
Alexa Fluor 647 (AF647) Bio Legend CD107a(H4A3)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roche, P. A., Cresswell, P. Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells. Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).
  2. Huang, S., et al. MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells. The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).
  3. Nakamura, N., et al. Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling. Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).
  4. Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).
  5. Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
  6. Zajonc, D. M., Kronenberg, M. CD1 mediated T cell recognition of glycolipids. Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).
  7. Cox, D., et al. Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules. PloS one. 4 (5), e5325 (2009).
  8. Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments. Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).
  9. Huang, S., et al. Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).
  10. de Jong, A., et al. CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens. Nature. 15 (2), 177-185 (2014).
  11. Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).
  12. Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
  13. Sharma, M., et al. Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants. Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).
  14. Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).
  15. Nachamkin, I., et al. Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene. Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).
  16. Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems. Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).
  17. Bauer-Mehren, A. Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape). Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).
  18. Cline, M. S., et al. Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape. Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).
  19. Huang, S., Moody, D. B. Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system. Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).
  20. Huang, S. Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis. Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).
  21. Moody, D. B., Porcelli, S. A. Intracellular pathways of CD1 antigen presentation. Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).
  22. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9 (7), 676-682 (2012).
  23. Diard, M., et al. Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype. Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).
  24. Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
  25. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature. 9 (7), 697-710 (2012).
  26. Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 140، التصوير التدفق الخلوي، إيماجيج وفيجي، والأفكار، ترانسكريبتوميكس، تحليل المسار، سيتوسكابي
دمج تصوير التدفق الخلوي والتنميط لتقييم الاتجار بتغيير CD1d اندوسيتيك ترانسكريبتوميك
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sharma, M., Zhang, X., Huang, S.… More

Sharma, M., Zhang, X., Huang, S. Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking. J. Vis. Exp. (140), e57528, doi:10.3791/57528 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter