Summary
フローサイトメトリーをイメージング細胞個々 および地方レベルでの形態学的、機能的変化を検出するための理想的なアプローチを提供します。中断エンドサイトーシス汚染物質にさらされたひと樹状細胞における脂質抗原提示機能を遺伝子発現と蛋白質の売買の形態のデモの複合トランスクリプトームのプロファイルを示した。
Abstract
エンドサイトーシスの蛋白質の形態学的、機能的変化の個体群解析いついてレベルで単一細胞レベルで統計画像解析画像キャプチャの需要のために挑戦しています。この困難を克服するためとを使ってイメージング フローサイトメトリー トランスクリプトーム (RNA シーケンス) をプロファイリング分化 1 d タンパク質 (CD1d) のクラスターの関連付けられている細胞内局在性変化を決定する人間の障害エンドサイトーシス遺伝子発現と脂溶性の共通にさらされた樹状細胞 (Dc)、空気汚染物質ベンゾ ピレン []。CD1d とフローサイトメトリーをイメージングを用いた細胞画像の数千からエンドサイトーシス マーカー Lamp1 蛋白質の共存は、アイデアや ImageJ フィジーを用いて解析したプログラム。共同染色 CD1d と Lamp1 蛋白質と多数の携帯電話画像 CD1d のゲーティング後, 可視化された+Lamp1+の Dc のアイデアを使用しています。BaP 露出マンダーの共局在の強度係数テストどちらられる散布図を使用して、プロットに示されたさらに強化された CD1d と Lamp1 の共存は、ImageJ フィジーを用いた共局在の面積の割合に基づいています。私たちのデータが汚染物質にさらされた人間のトランスクリプトーム変質の障害の機能的予後をサポート、シングル、いついての細胞レベルでのタンパク質共存を測定する有利なインストゥルメンタルとバイオ情報アプローチを提供します。Dc。
Introduction
抗原提示は通常多くの場合形態的特性と抗原提示細胞1,2,3 の表現型プロファイリングを使用して検討されているが、人身売買、細胞内のタンパク質を含む.イメージングと表現方法の利点を統合するには、単一のセルでひと樹状細胞 (Dc) で変更されたタンパク質の共局在を示す人口レベルのイメージング解析プラットフォームをについて説明します。ペプチド抗原提示で主要組織適合複合体 (MHC) クラス I の分子従来 CD8 をアクティブにする小胞体の短いペプチド (8-10 残基) をバインド+ T 細胞、MHC クラス II 分子結合比較的長い間従来の CD4 をアクティブにエンドサイトーシスのコンパートメントにおけるペプチド (~ 20 残基)+ T 細胞1,4。対照的に、脂質特異的 T 細胞はエンドサイトーシス コンパートメント5,6を中心に読み込まれる脂質抗原と CD1 の蛋白質によってアクティブ化されます。脂質抗原提示が脂質代謝脂質代謝7,8,9,10と CD1 の蛋白質代謝産物の機能性脂質のロードの物の供給を必要とします。エンドサイトーシス コンパートメント5,6。この文脈では、脂質抗原提示、特に脂溶性の汚染物質と免疫疾患の環境の露出の調節細胞要因を定義する重要です。本研究では汚染物質の暴露で脂質抗原提示に貢献してエンドサイトーシス蛋白質の売買を決定するためのトランスクリプトーム解析、イメージ プロファイル、およびひと単球由来の Dc の細胞および個体群のイメージング解析を使いました。確かに、この組み合わせのプラットフォームは、細胞内の蛋白質の売買と異なる生物学的プロセスの共存を勉強に適用できます。
技術的には、共焦点顕微鏡を用いて、統計的に検出された細胞1,2,3,11の限られた数の分析、蛋白質の細胞レベル下のローカリゼーション通常示されました。また、フローサイトメトリーは広く細胞レベル12; 複数のタンパク質の共同染色信号ゲート細胞集団に適用されています。しかし、これは細胞内の蛋白質の共存の詳細な可視化を欠いています。生物的蛋白質ハラーゼの機能を決定するためのプロファイルと分析アプローチをイメージングを取り入れる割合タンパク質共存携帯および人口レベルでの包括的かつ統計的分析を達成するために関連性。CD1d およびリソソーム膜蛋白質 1 (Lamp1) の共存を検出するイメージング フローサイトメトリーを用いて具体的には、本研究ではタンパク質。コードして, 分子の定量解析が難しかった以前いついての規模で演奏されます。本研究で我々 はいついて、個々 の細胞レベルで共同染色細胞数が多いタンパク質ハラーゼの割合を調べるための ImageJ フィジー プログラムを適応しました。具体的には、CD1d タンパク質が、親油性の汚染物質ベンゾ [a] ピレン (BaP)13 にさらされる人間の Dc の後半のエンドサイトーシス コンパートメントで保持された主結論を支持する人口サイズ、強度、共局在領域を測定しました。.この複合携帯と画像解析の人口抑制脂質抗原提示に関連する CD1d Lamp1 共存の再現性の高い、包括的、かつ統計的に有意な結果を提供しました。
BaP 公開人間 Dc のトランスクリプトームは強くエンドサイトーシス脂質代謝と CD1d エンドサイトーシス人身売買された BaP 露出で損なわれること仮説をサポートしました。この仮説をテストするため CD1d、エンドサイトーシスのマーカー、および DC マーカーを含む複数のタンパク質を染色共同 DC 人口の画像をプロフィールにイメージング フローサイトメトリーを適用されます。最後に、共同染色細胞は強度の割合と CD1d と Lamp1 共存のエリアを示す統計的に分析しました。
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Protocol
本研究では人間のプロトコルは、シンシナティ大学の制度上の審査委員会によって承認された、すべてのメソッドが関連するガイドラインと規則に従って行われました。健康なドナーから血液サンプルは、シンシナティ大学医療センターの Hoxworth の血液センターから得られました。
1. トランスクリプトームのひと単球由来の汚染物質にさらされた Dc のプロファイリング
- BaP 公開 Dc の総 RNA の抽出
- サイトカインの GM-CSF と il-4 によるを使用して人間の Dc を区別し、4 日間13BaP に DCs を公開します。
- フローサイトメトリー (リネージュ-HLA+)、表面発現マーカーに基づいての大部分は、従来の DCs を使用して BaP 公開 Dc を並べ替える (CD11c+CD1c+)13。通常、10% を含む培養液中に 10,000 の Dc を並べ替える FBS、600 x g と 6 分の 4 ° C で Dc を遠心し、1 mL のピペット チップを使用して吸引により上清をすぐに削除します。
- 上清を吸引により削除すると、RNA の抽出前に-80 ° C で保管するため RNA 分離キットから 0.4 mL の溶解/結合バッファーを追加することによって細胞ペレットを溶解させます。
- 総 RNA の抽出のプロトコルと RNA 分離キットを使用して総 RNA14を抽出します。バイオアナライザー15を使用して RNA の整合性を測定します。
- 並べ替えられた Dc (図 1 a) のトランスクリプトーム解析
- RNA シーケンス RNA ライブラリ作成キットを使用してライブラリを準備します。一言で言えば、隔離されたポリ A RNA のフラグメント (~ 200 bp)、逆、cDNA の第 1 ストランドにフラグメントを書き写すし、dUTP ラベルの付いた 2 番目の鎖 cDNA 合成によって従います。
- ビーズの浄化、終わり、修復や dA テーリング後茎ループ構造を持つアダプターに二重鎖 cDNA を縛る。鎖特異性を維持し、PCR のためアダプター ループを開きユーザー (ウラシル固有切除試薬) 酵素の cDNA とアダプターのループの第 2 鎖でウラシル残基を切除します。
- インデックス付きのライブラリを豊かにする普遍的なインデックス固有のプライマーを用いた PCR の 13 のサイクルを実行します。ライブラリをクリーンアップし、ライブラリの品質をチェックし、サイズ分布バイオアナライザー DNA 高感度チップで実行します。
- ライブラリ定量キットを使用して、リアルタイム PCR システムはライブラリ濃度で計算するライブラリ サイズ情報と標準曲線法を組み合わせます。
- 比例して個別にインデックスの互換性ライブラリをプールし、15 に最終濃度を調整する午後。ライブラリ クラスター生成を実行し、サンプルあたり 2500 万読み取りを生成する単一の読み込みを 1 x 50 bp の設定でライブラリをシーケンスします。
- シーケンス
- 順序とそれぞれ SBS と PE の試薬ラックに試薬をインデックスを読み込みます。すべての氷が溶けるまで 1 h の研究室グレードの水風呂で試薬を配置し、各ボトル/チューブの試薬は適切に混合します。
- ボトルに解凍の染料、-20 ° C の酵素を追加することによって ICB ミックスを準備し、ミックスします。シーケンスに従って NaOH 溶液を準備します。使用する準備ができるまで、4 ° C ですべての試薬を配置します。
- 1 h の間に待機期間、シーケンサーの電源を入れます。DONOTEJECT ドライブが表示され、コンピューターをネットワーク ドライブに接続を待ちます。
- シーケンサー制御ソフトウェアを起動します。
- 0.5% Tween 20 と 0.03% を含むメンテナンス洗浄ソリューションの 2 L ProClin 300 の研究室グレードの水を準備します。
- SBS 試薬ラック 8 ボトルとボトルに漏斗のネジキャップのそれぞれに 〜 100 mL のメンテナンス洗浄溶液を追加します。PE 試薬ラックで 10 15 mL の円錐管のそれぞれにメンテナンス洗浄液 〜 12 mL を追加し、キャップを破棄します。
- シーケンサーにいっぱいソリューション ボトル/チューブと 2 つのラックをロードします。
- シーケンサー制御ソフトウェアから選択メンテナンス洗浄;プロセスが完了するまで、シーケンサーの流体システムをきれいにする画面の指示に従います。
- ソフトウェアから「シーケンス」タブで新しい実行を開始ネットワーク ドライブへの出力データを直接します。多重単一インデックス ライブラリを単一の読み込みを 1 x 50 bp のパラメーターを選択します。
- シーケンスの状態をコンピューターまたはスマート フォンで遠隔監視できますので、必要に応じて、BaseSpace シーケンス ハブにログインします。
- 逆多重化のサンプル シートをアップロードし、ソフトウェア要件に従って試薬情報を提供します。
- シーケンサーに SBS PE 試薬をロードします。プライム使用フロー セル (~ 15 分) システム。
- クラスター生成が完了した後 (~4.5 h)、フロー ・ セルを取り出し、水とワイプ乾燥レンズ ペーパーを使用してフロー ・ セルを軽くスプレーします。軽く 95% エタノールのフロー ・ セルをスプレーし、拭き。表面が破片や残留のないクリーンであることを確認するライトをチェックします。
- 総理のステップを完了すると、クラスター化のフロー ・ セルを読み込み、シーケンスを開始します。シーケンス解析ビューアー ソフトウェアは自動的に開始されます。
- SAV の遺産相/前期 %、% ≥Q30 クラスター パス フィルター % 読み取りフィルター クラスター密度を含むインデックスの QC、これにより、データの品質を理解し、トラブルシューティング等を介してシーケンス データの品質を監視します。
- フロー電池ガスケットを変更し、シーケンスの完了後にメンテナンス洗浄を実行します。シーケンサーは次の実行を準備します。
- バイオ情報解析
- バイオインフォマティクス RNA シーケンス データ解析13を実行します。
2 トランスクリプトームのプロファイル (図 1 b) の経路解析
- 3 ドナーから BaP 曝露し、非曝露の Dc 間結果遺伝子発現強度カウントを比較するのに、エッジャー Bioconductor を使用します。絶対フォールドの変更に基づいて BaP 曝露し、非曝露の Dc 間特異的発現遺伝子を確認 (> 2 倍) と虚偽の発見率 (FDR) - 調整p- 値 (< 0.05)。
- 差動機能群を予測する遺伝子を表現、KEGG と REACTOME を含むいくつかのデータベースに対して変更された遺伝子を検索し、クラスタ リング データを生成する ToppCluster ソフトウェア パッケージを使用します。ToppCluster は、超幾何テストを使って遺伝子リスト濃縮分析16を介して豊かな機能を取得します。
- Cytoscape17,18バージョン 3.3.0、複雑なネットワークを可視化するため広く使用されているオープン ソース ソフトウェア プラットフォームにこれら関数クラスターから結果をさらに入力します。したがって、異なるクラスターまたは経路、エンドサイトーシス クラスター、脂質代謝などに関与する遺伝子は、遺伝子 (図 1 b) 式13の平均フォールドの変更の色アノテーションを使用したネットワークに表示されます。
3. CD1d と Lamp1 共存のフローサイトメトリーのイメージング
- BaP 公開 Dc の抗体の分類
- 完全なダルベッコの 2 mL で 37 ° C で 4 日間の 5.94 mm BaP 公開 0.5 x 106人間 Dc 変更イーグル培地。収穫は、Dc 細胞血清ブロッカー、抗ひと Fc 受容体抗体抗ひと CD64、CD32、CD16 抗体を含む氷で 10 分間インキュベートし、差別化された Dc を 400 x g で 10 分間ブロックでの遠心分離。
- 鮮やかなバイオレット 421-対策-CD1c (L161) 孵化させなさい、フィコエ リスリン/シアニン染料 7 (PE/Cy7) - 抗 HLA-DR、および PE/Cy5-抗 CD11c 氷で 20 分間の Dc と。表 1は、この抗体の一覧を示します。
- PBS で 4% パラホルムアルデヒドで Dc を固定し、透過洗浄バッファーとそれらを permeabilize します。(51.1) PE 標識精製された抗ひと CD1d の混合物と Alexa Fluor 647 標識抗 Lamp1 (CD107a) 細胞内染色を実行 (H4A3)。
- 流れの cytometry の測定 (図 2) をイメージング
- シンシナティ小児病院 40 × 対物を使用して直径の約 10 mm のセルの 300 ピクセルを生成するための流れの cytometry コアでイメージング フローサイトを使用して染色サンプルを分析します。1 つのピクセル サイズは、オブジェクトの 0.5 mm で約 0.5 mm です。
- 製造元の指示に従って公平な方法で 10,000 細胞画像を取得します。
4 流れの Cytometry のイメージのイメージング解析
- アイデア ソフトウェア (図 2) を使用して共局在解析
- ルーチンの流れ cytometry データのように、BaP 蛍光染色 BaP 公開 Dc を含む、しきい値以下の非染色サンプルの蛍光強度を設定することにより単一ステンド グラス対非染色サンプルの補正を行う解析。
- +CD1d HLA-DR+CD11c のサブセットを取得する細胞を染色ゲート+Lamp1+細胞 (図 2 a) と (図 2 b) ゲートのサブセットの表示細胞画像。
- Png 形式 2 の技術基準に基づく強力な共同染色信号の視覚的な存在や ImageJ フィジー (図 2 b) を使用して共局在解析の CD1d と Lamp1 タンパク質細胞内局在の細胞画像を保存します。
- ImageJ フィジーのソフトウェアを使用すると、共局在解析 (図 3) を実行できます。
- それぞれ人間 dc の非曝露し、BaP 公開 100 保存した携帯画像をマージすることで入力画像ファイルを準備 (図 3 a)。
- CD1d の分析 (赤) と Lamp1 (緑) の共存、散布図を使用します。
- ImageJ フィジー プログラムを実行します。100 セル画像 (図 3 bおよび図 4 a) で .png ファイルを開き: "ファイル |オープン"。
- 赤または緑のチャネルのいずれか 2 つの画像に結合の赤と緑のチャンネル イメージを分割: "画像 |カラー |チャンネルを分割"。
- コマンドを使用して散布図を描く」分析 |共存に関する研究 |共存のしきい値"。「PrintScreen」キーを使用して散布図を保存します。
- 各単一細胞イメージのマンダーの共存係数を計算 (n = 100) (図 4 b)
- 使用してチャンネルの分割と画像ファイルを 1 つのセル画像を選択、"楕円形"選択ツール。
- コマンドを使用して、"分析 |共存に関する研究 |共存のしきい値"。領域 (ROI) のダイアログ ボックスから「チャンネル 1」を選択します。各セルのイメージの「マンダーのしきい値を用いた」を含むすべての計算オプションを維持します。
- 100 セルのすべての画像にこの計算を繰り返します。
- 保存し、スプレッドシートを使用して結果を開きます。
- 平均と標準誤差」どちらられる Mander の係数」のプロット (n = 100、0 を意味なし共局在 1 完璧な共存)。スチューデントの t 検定を使用して、BaP 曝露し、非曝露グループ (図 4 b) 比較のp値を計算します。
- 複数のセル画像の CD1d と Lamp1 共局在のどちらられるピクセル強度のパーセントを計算 (n = 100) (図 4)。
- 4.2.3 で同じ解析プロトコルを使用し、さらに結果オプション「, しきい値を超える強度 %」を選択します。
- マンダーの共存係数と一緒にこの分析を実行します。
- 同様に平均と CD1d と Lamp1, % 強度の標準誤差をプロットします。スチューデントの t 検定を使用して、BaP 曝露し、非曝露グループ (図 4) 比較のp値を計算します。
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Representative Results
脂溶性の汚染物質 BaP 変更各ドナーから人間人間 dc 単球由来 dcs エンドサイトーシス遺伝子群 (n = 3)、さらに前述の RNA 抽出とトランスクリプトーム解析に使用された従来の Dc の bap が培養され.遺伝子発現の正常化に BaP 公開し、非曝露群の間の変えられた遺伝子は、発現遺伝子の機能的相関によるとクラスター化されました。関連の携帯電話経路の解析のための Toppcluster プログラム16に変更された遺伝子リストを入力を行い、検定のp値 (図 1 b) の偽の発見率 (FDR) 補正を使用しています。脂質代謝とエンドサイトーシスの機能を含むいくつかの主要な変更された遺伝子クラスターは、BaP 公開 Dc で識別されました。本研究で具体的に着目エンドサイトーシス人身売買の機能テスト CD1 を介した抗原提示はエンドサイトーシス経路5,19,の読み込み脂質抗原に依存されているため20,21。
CD1d エンドサイトーシスの人身売買は、イメージング フローサイトメトリーを使用して示されています。イメージングのフローサイトメトリーを用いた細胞画像の大規模な番号を取得、複数抗体 (図 2 a) で共同染色の細胞集団を便利なゲートを通じて個々 の細胞画像を可視化するアイデアのプログラムを利用を開始しました。具体的には、ゲートの主要な DC 人口染色共同 HLA-DR と CD11c CD1d と Lamp1 共同式 (図 2 a) と Dc をさらに表示することができました。共同染色信号は CD1d と Lamp1 を二重染色の細胞集団をゲートによって濃縮することができます (図 2 a)。我々 はまず非公開通常 Dc CD1d と Lamp1 蛋白質の最小限の共存と CD1d エンドサイトーシス人身売買の基底レベルおよび生理学的条件 (図 2 b)5、表面表現の高レベルを示すを示した 19,20,21。CD1d と Lamp1 タンパク質の共局在を測定するには、最初 BaP 露出13CD1d と Lamp1 タンパク質間明るい詳細類似性のわずかな増加を表示するのにアイデアを使用しました。明るい詳細類似は CD1d と Lamp1 タンパク質が CD1d がすることができることを示す生理学的な状態で重なりが生じる可能性が高い 2 つの要因の相関関係をテストするためのピアソンの相関係数から算出しました。一過性後半エンドサイトーシス区画取得機能脂質抗原を通過するトラフィック。したがって、それは BaP 露出の CD1d タンパク質を保持より後半のエンドサイトーシスのコンパートメントでのイメージング解析ソフトウェア フィジーを使用して重複した CD1d と Lamp1 蛋白質の増加の割合を反映しているかどうかをテストするための生物学的意味のある、ImageJ パッケージ。最後に、後半のエンドサイトーシス コンパートメントの CD1d タンパク質の保持は機能的 BaP 露出の変更されたエンドサイトーシス遺伝子プロファイルを確認する使用できます。
共局在の強度と CD1d と Lamp1 蛋白質間の領域を測定しました。再現可能なしきい値の設定と共局在領域と強度の割合を得るためには、ImageJ フィジー22、いくつかその他研究23,24,25にも使用されているを適用されます。CD1d をランダムに選び+Lamp1+は強力な共同染色および CD1d と Lamp1 タンパク質 (図 2 b) の入力イメージとして明確な細胞内局在細胞します。個々 の携帯電話の画像は、1 つの一貫した分析 (図 3 a) の単一のイメージ ファイルにマージできます。本研究で我々 は 100 セル画像を合併し、「colocalisation しきい値」の設定を分析するプログラムで開く (図 3 b)。輝度 (PE 標識 CD1d の AF647 ラベル Lamp1) 2 チャンネル間の共存は、これら 100 セル画像 (図 4 a) から共局在のピクセルを検出することにより散布図と全体的な示されました。このプロットの Costes のしきい値を表す水平線と垂直線と斜めの線が 2 つのチャネル間の全体的な輝度の比を表します。Costes のしきい値は、2 つの重複したチャンネルから弱いピクセルを削除する表示設定を示します。結果の散布図は、BaP 露出の CD1d と Lamp1 蛋白質の増加の共存を示しています。さらに、我々 はマンダーの係数 (図 4 b) を用いた CD1d と Lamp1 タンパク質間の共存の度合いを定量化しました。その結果、マンダーの係数は CD1d と Lamp1 として統計的に学生の t テスト (図 4 b) によってサポートされている、非公開の Dc と比較する BaP 公開 Dc の後半エンドサイトーシス コンパートメント間増加の共存を示しています。ただし、タンパク質の強度がコードして, 非, 地域間異機種混在の場合コードして, 強度されませんコードして, エリアに並ぶものです。したがって、それもさらに試験強度 (図 4) に基づいて、共存に必要です。その結果、各列は、複数の携帯画像からコードして, 強度の割合の平均計算を表します (n = 100) 二つの共局在タンパク質の BaP 曝露し、非曝露条件の間。学生の t テストはまた統計的有意性を示す (n = 100、 p< 0.001) 示された標準誤差と BaP 公開し、非公開のグループ間。完全に、我々 のデータは BaP 露出で後期エンドソームで保持されたタンパク質 CD1d、さらに BaP 変更遺伝子の発現を支えるエンドサイトーシス機能障害と CD1d の人身売買につながることを示しています。
要約すると、CD1d Lamp1 の共存は、BaP の露出に向上します。重複ピクセル強度 (図 4 a) で散布図を含むセル画像 (図 2 b) に基づいて複数のパラメーター マンダーの係数 (図 4 b) を向上し、オーバー ラップの強度 (の割合を増加図 4)、BaP 露出で CD1d エンドサイトーシス保持をサポートします。携帯電話の画像のこの共局在解析はエンドサイトーシス関数など、破壊されたエンドサイトーシス遺伝子と一致してタンパク質の共存の度合いを判断し、細胞機能の生物学的メカニズムを示す正確なアプローチ式13のセル CD1d 制限 T の抑制活性化にさらに貢献します。
図 1: BaP 露出で DC トランスクリプトームの摂動RNA シーケンスの (A) フローチャートまず、総 RNA の品質を確認して品質管理 (QC) 解析を行った。入力、ポリ A の RNA を分離した、自動化されたシステムと高品質の総 RNA を使用して、ポリ A RNA の品質管理における rRNA の枯渇を証明しました。ポリ A RNA は、自動化ライブラリを受ける準備と PCR によってインデックス作成します。次に、増幅されたライブラリは、利回りとサイズ分布 QC のバイオアナライザーによって分析されました。QPCR 定量化後インデックス ライブラリいたプールのフロー ・ セルの配列のためにクラスター化およびシーケンス データ品質でしたリアルタイム監視します。軸は、信号を染色、フローサイトメトリーの相対的な数を表します。(B)改変された遺伝子の機能の異なるクラスターにグループ化された、エンドサイトーシスの機能および脂質代謝に関連する遺伝子群が表示されます。赤: CD1d;緑: Lamp1。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: アイデアのプログラムを利用した細胞の画像解析します。(A) 単球由来 Dc から健康的なドナーがまず hla ゲート-DR + CD11c + 細胞とさらにゲート CD1d+Lamp1+アイデアのプログラムを用いた細胞します。(B) 携帯電話の画像は、HLA+CD11c から抽出した+CD1d+Lamp1+細胞イメージの可視化のための人口。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: フィジー ImageJ プログラムを利用した細胞の画像解析します。CD1d と Lamp1 タンパク質の共同染色と細胞を無作為フィジー-ImageJ を用いた画像解析が、目に見えないまたは弱い汚損 CD1d または Lamp1 タンパク質と細胞 *図 2 bのように除外されました。(A) これらのランダムに選択された携帯画像が入力イメージとして単一のイメージ ファイルに組み立てられました。緑と赤のチャンネルの共存しきい値を設定を通じて、共存 (B) 分析を行った。しきい値の計算式と、散布図が生成されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: CD1d とランプ 1 蛋白質の共存に注目。シャルマらの報告と同様のデータセットを使用して13、BaP 曝露し、非曝露条件で DCs から CD1d と Lamp1 タンパク質間の共局在の画素値は再計算され、[散布図 (A) に示すように。CD1d と Lamp1 共存のマンダーの係数を算出したし、選択したセル画像 (B) からの平均が表示されます。共局在ピクセル強度の割合も計算 (C) だった。統計的有意性 (n = 100、 p < 0.001) 非暴露群と比較して学生の t テストで得られました。標準誤差が示されました。データは健康なドナーからの細胞と 1 つの試金からです。同様の結果 2 つの独立したアッセイを行った。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 抗体 | フルオロまたは二次抗体 | クローン |
| HLA | フィコエ リスリン/シアニン 7 (PE/Cy7) | L243 |
| CD11c | フィコエ リスリン/シアニン 5 (PE/cy5 の組合せ) | 3.9 |
| CD1c | 鮮やかなバイオレット 421 | L161 |
| 精製された抗ひと CD1d | PE 抗マウス IgG2b | 51.1 |
| Lamp1 | Alexa Fluor 647 (AF647) | CD107a(H4A3) |
表 1: 本研究で使用される抗体です。フルオロ PE/Cy5 と AF647 は共有励起と発光波長のため、部分的に信号を染色で重複。細胞レベルでの表面蛋白質 (CD11c) および細胞内蛋白質 (Lamp1)、信号の重複を避けるためにそれぞれにラベルを付けるこれらの蛍光物質を使用します。私たちは両方 fluorophores の送信信号が重なってを最小限に抑えるためにも最適な滴定および補償を使用します。
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Discussion
複数の経路と個々 と個体群の細胞活動を統合する難しさを含む広く影響を受けた遺伝子発現のため、変更された遺伝子経路の機能確認は困難です。特にテスト CD1d エンドサイトーシスのコンパートメントに人身売買にイメージング フローサイトメトリーを採用しました。フローサイトメトリーをイメージングには、細胞の変化の測定、複数のタンパク質の細胞内局在の共存の個別デモンストレーションが統合されています。共焦点顕微鏡測定蛋白質の共存、高解像度を提供している以前とフローサイトメトリーは、異なる細胞集団の包括的な表現を提供することができます。共焦点顕微鏡やフローサイトメトリーを環境によってトランスクリプトーム変質の機能確認のため知名度の高い方法で蛋白質の共存を分析する許容画像解像度の利点を組み合わせたフローサイトメトリーをイメージング汚染物質。
いついてスケールで複数のタンパク質の共局在の解析は技術的に難しく、(i) 複数の個々 の細胞の解析の詳細なので、手間と比較的バイアス;(ii) 強度または肯定的な汚損; の領域に基づいてオーバー ラップするピクセルを解釈するための最適なしきい値を定義することは困難です。(iii) 個人といついて細胞のバランスの観察は重要です。本研究では、生物学的意味のある観察、統計的有意性テストと共局在タンパク質のイメージング デモンストレーションを実施に着目。この目標を達成するためには、イメージング フローサイトメトリーを使用して人間の Dc の画像の何千も我々 最初取得。イメージ ファイルの定量的解析を組み合わせてソフトウェアのアイデアを使用して明るい細部の類似性解析、フィジー ImageJ を用いた統計的テストの共存解析。アイデアのプログラムにより、共同染色の人口は、ピアソンの相関係数に基づく明るい細部の類似性を使用して 2 つのタンパク質の共局在を計算するゲートと共同の細胞内の局在と細胞を染色をランダムに選択タンパク質13。さらに共局在タンパク質の生物学的関連性の高いデモを達成するため、我々 ImageJ フィジー ソフトウェアを使用マンダーの共局在領域のパーセンテージを計算する係数を適用し、の程度を示すピクセル強度をオーバー ラップエンドサイトーシスの CD1d のローカライズ。
ImageJ フィジー プログラムを使用するための重要なステップは、単一細胞の画像解析を行うことです。個々 の細胞からタンパク質共存に注目率の変動は、単一のセル画像から視覚的に結合された色と比較して監視できます。100 のすべてのセルから割合タンパク質共存を平均することによって、蛋白質共存と地方レベルで機能の相関関係を実証する、手段と標準誤差が計算できます。このバイオインフォマティクス解析は簡単で、この分析は、再現可能なしきい値の計算式を提供していますので、あいまいな結果を意識せず簡単 Costes のメソッドを使用して同じを生成する同じデータ セットのしきい値の結果と似たようなデータセット26相当。この技法の制限は単一のセル画像の労働集約的な手入力やアイデアのソフトウェアを使用して視覚的に共同染色の細胞の潜在的主観的な選択。本研究で我々 は各グループからの 100 の細胞像を分析、強力な共同染色信号を含む再現可能な選択条件を設定 CD1d と Lamp1 タンパク質細胞内局在をクリアします。これらの制限を克服するには、バッチ分析できるように解析ソフトウェアの技術的な改善とフローサイトメトリーによって提供される染色強度を超えて形態学的特徴に基づく単一セルの評価・選択が必要です。要約すると、結合された携帯と人口イメージング解析割合タンパク質共存の再現性の高い、包括的な統計的にテスト、および生物学的関連性の高い結果を提供します。この CD1d Lamp1 共局在の解析は、細胞蛋白質の機能および形態の変化に関する広範な質問にお答えする知名度の高い細胞イメージング解析の成功例として使用できると考えています。
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Disclosures
著者がある何も開示するには
Acknowledgments
著者はヒトの血液サンプルのロバート Giulitto (Hoxworth 血液センター) を感謝し、博士梁ニュウ遺伝子発現の正常化のための読み取り。また助成金サポートから、国立環境衛生研究所 (ES006096) に感謝し、環境遺伝学 (CEG) パイロット プロジェクト (件名標目等)、国立研究所のアレルギー ・感染症 (AI115358) のセンター (s. h.) の大学シンシナティ大学研究評議会賞 (件名標目等) は、大学のシンシナティ大学の医学コア強化資金 (X. Z)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transcriptomics | Illumina | HiSeq 2500 v4 | Illumina HiSeq system |
| ImagingStream X | Millipore | 100220 | Imaging flow cytometry |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fisher | Total RNA extraction | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent | Total RNA QC analysis | |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher | PCR, enzyme reaction | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England Biolab | PolyA RNA purification | |
| Automated SMARTer Apollo system | Takara | PolyA RNA purification | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolab | Library preparation | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | DNA purification | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) | Thermo Fisher | Library quantification | |
| NEBNext Library Quant Kit | New England Biolab | Library quantification | |
| cBot | Illumina | Library cluster generation | |
| TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot – HS | Illumina | Library cluster generation | |
| HiSeq 1000 | Illumina | Sequencing | |
| TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles) | Illumina | Sequencing | |
| Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | Bio Legend | L243 | |
| Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | Bio Legend | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | Bio Legend | L161 | |
| PE-anti-mouse IgG2b | Bio Legend | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) | Bio Legend | CD107a(H4A3) |
References
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