Summary
Imaging flowcytometri gir en ideell tilnærming for å oppdage morfologiske og funksjonell endring av celler på personlige og populational. Forstyrret endocytic funksjonen for lipid antigen presentasjon i forurensende-eksponerte menneskelige dendrittiske celler ble demonstrert med en kombinert transcriptomic profilering av genuttrykk og morfologiske demonstrasjon av protein menneskehandel.
Abstract
Populational analyser av morfologiske og funksjonell endring av endocytic proteiner er utfordrende på grunn av etterspørselen av image fange på en enkelt celle nivå og statistisk analyse på et populational nivå. For å overkomme dette problemet, brukte vi tenkelig flowcytometri og transcriptomic profilering (RNA-seq) for å finne endrede subcellular lokalisering av klyngen differensiering 1d protein (CD1d) forbundet med nedsatt endocytic genuttrykk i menneskelig dendrittiske celler (DCer), som ble utsatt for felles lipofile luft forurensende benzo [a] pyrene. Colocalization av CD1d og endocytic markør Lamp1 proteiner fra tusenvis av cellen bilder tatt med imaging flowcytometri ble analysert ved hjelp av ideer og ImageJ-Fiji programmer. Mange mobilnettet bilder med co farget CD1d og Lamp1 proteiner var visualisert etter gating på CD1d+Lamp1+ DCs skylden. De forbedrede CD1d og Lamp1 colocalization på BaP eksponering ble ytterligere demonstrert bruker thresholded scatterplots, testet med Manders koeffisientene for samlokalisert intensitet og plottet avhengig av samlokalisert med ImageJ-Fiji. Våre data gir en fordelaktig instrumental og bioinformatic tilnærming for å måle protein colocalization på både enkelt og populational mobilnettet nivå, støtte en svekket funksjonelle utfallet av transcriptomic endring i forurensende-eksponerte menneskelige DCs.
Introduction
Antigen presentasjon innebærer vanligvis intracellulær protein menneskehandel, som har ofte blitt undersøkt morfologiske karakterisering og fenotypiske profilering av antigen presentere celler1,2,3 . For å integrere fordelene med bildebehandling og phenotyping metoder, beskriver vi en tenkelig analyse plattform for både enkeltceller og innbyggere nivåer å demonstrere en endret protein colocalization i menneskelige dendrittiske celler (DCs). I peptid antigen presentasjon, store histocompatibility kompleks (MHC) klasse I molekyler binde et kort peptid (8-10 rester) i det endoplasmatiske retikulum aktivere konvensjonelle CD8+ T celler, mens molekylene av MHC klasse II binde en relativt lengre peptid (~ 20 rester) i endocytic avdelinger å aktivere konvensjonelle CD4+ T celler1,4. Derimot er lipid-spesifikke T-celler aktivert ved CD1 proteiner med lipid antigener hovedsakelig i endocytic rom5,6. Lipid antigen presentasjon krever tilførsel av lipid metabolitter produsert i lipid, metabolisme,7,,8,,9,,10 og lasting av funksjonelle lipid metabolitter CD1 proteiner i endocytic rom5,6. I denne sammenheng er ulike cellulære faktorer modulerende lipid antigen presentasjon, spesielt i miljømessige eksponering lipofile stoffer og immune sykdommer, avgjørende for defineres. I denne studien brukte vi transcriptomic analyse, bilde profilering og mobilnettet og populational tenkelig analyse av menneskelig monocytt-avledet DCs for å bestemme endocytic protein smugling bidra til lipid antigen presentasjon forurensende eksponering. Sikkert, denne kombinerte plattformen kan brukes til å studere subcellular protein narkotikahandel og colocalization i ulike biologiske prosesser.
Teknisk, subcellular protein lokalisering ble vanligvis demonstrert med AC confocal mikroskopi og statistisk analysert i et begrenset antall oppdaget celler1,2,3,11. Videre har flowcytometri blitt bredt brukt til gate celle populasjoner med co farget signaler av flere proteiner på en mobilnettet nivå12; men mangler dette en detaljert visualisering av subcellular protein colocalization. For å oppnå omfattende og statistiske analyser av prosenten protein colocalization både mobilnettet og befolkningen, innlemme vi imaging profilering og analyse tilnærminger for å bestemme funksjonene i protein colocalization med biologiske relevans. Spesifikt bruker vi tenkelig flowcytometri for å oppdage colocalization av CD1d og lysosomale-assosiert membran protein 1 (Lamp1) proteiner i denne studien. Kvantitativ analyse av colocalized molekyler var tidligere vanskelig utføres på populational skala. I denne studien tilpasset vi ImageJ-Fiji skal undersøke prosentandelen av protein colocalization med et stort antall co farget celler på både populational og personlige mobilnettet nivå. Spesielt målt vi samlokalisert områder, intensitet og populational størrelse å støtte konklusjonen at CD1d protein ble stort sett beholdt i slutten endocytic deler av menneskelig DCs eksponering for en lipofile forurensende benzo [a] pyrene (BaP)13 . Denne kombinerte mobilnettet og befolkningen imaging analyse leveres svært reproduserbare, omfattende og statistisk signifikant resultatene av CD1d-Lamp1 colocalization gjelder for hemmet lipid antigen presentasjon.
Transcriptome av BaP-eksponerte menneskelige DCs støttet sterkt hypotesen at endocytic lipid metabolisme og CD1d endocytic handel ble nedsatt i BaP eksponering. For å teste hypotesen, brukt vi tenkelig flowcytometri profilen bilder av DC befolkningen var co farget med flere proteiner inkludert CD1d, endocytic markører og DC markører. Til slutt, co farget celler var statistisk analysert for å demonstrere prosentandelen av intensitet og områder av CD1d og Lamp1 colocalization.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menneskelige protokoller i denne studien var godkjent av institusjonelle gjennomgang styret ved University of Cincinnati og alle metodene ble utført i henhold til relevante retningslinjer og regler. Blodprøver fra friske blodgivere ble innhentet fra Hoxworth blod Center ved University of Cincinnati Medical Center.
1. Transcriptomic profilering av forurensende-eksponerte menneskelige monocytt-avledet DCs
- Totale RNA utvinning av BaP-eksponerte DCs
- Skille menneskelig DCs cytokiner GM-CSF og IL-4, og utsette DCs til BaP for 4 dager13.
- Sortere BaP-eksponerte domenekontrollere som bruker flowcytometri basert på overflaten uttrykt markører (Lineage-HLA-DR+), hvorav fleste består av konvensjonelle DCs (CD11c+CD1c+)13. Vanligvis sortere 10.000 DCs til kultur medium med 10% FBS, sentrifuge DCs på 600 x g og 4 ° C i 6 min, og umiddelbart fjerne nedbryting av aspirasjon bruker et 1 mL pipette tips.
- Når nedbryting er fjernet av aspirasjon, lyse celle pellet ved å legge til 0,4 mL Lysis Binding Buffer fra RNA isolering kit for lagring i-80 ° C før RNA utvinning.
- Bruk RNA isolering kit med totalt RNA utvinning protokollen for å ekstra det totale RNA14. Måle RNA integritet ved hjelp av en Bioanalyzer15.
- Transcriptomic analyse av sorterte DCs (figur 1A)
- Forberede biblioteket RNA-seq bruker en RNA biblioteket forberedelse kit. Kort sagt, fragmentere isolert poly-en RNA (~ 200 bp), reverse transkribere fragmenter til den 1ste stranden av cDNA, og følge av andre strand cDNA syntese merket med dUTP.
- Ligate dobbel tråd cDNA til kortet med en stilk-loop etter perle rensing, slutten-reparasjon og dA tailing. Avgiftsdirektoratet uracil rester i den 2 stranden av cDNA og adapter sløyfen med brukeren (Uracil-spesifikke Excision reagens) enzymet opprettholde strand spesifisitet og åpne kortet loopen for PCR.
- Utfør 13 sykluser av PCR bruker universal og indeks-spesifikke primere for å berike indekserte biblioteket. Rydde opp i biblioteket og kjøre på en Bioanalyzer DNA høy følsomhet chip å sjekke biblioteket kvaliteten og størrelse distribusjon.
- Bruke et bibliotek kvantifisering kit og en sanntids PCR-system kombinert med bibliotekinformasjon til å beregne biblioteket konsentrasjon via standardkurve metode.
- Proporsjonalt basseng individuelt indekserte kompatibel biblioteker og justere den endelige totale konsentrasjonen til 15 pM. Utfør biblioteket klynge generasjon og sekvens biblioteket innstillingen enkelt lese 1 x 50 bp til å generere ~ 25 millioner leser per eksempel.
- Sekvensering
- Last sekvensering og indeksering reagenser til SBS og PE reagens rackene, henholdsvis. Plasser reagenser i et laboratorium-grade vannbad 1t til alle isen har smeltet og reagenser i hver flaske/tube er blandet riktig.
- Klargjør ICB blandingen ved å legge til tinte fargestoff og 20 ° C enzymet flasken og bland. Forberede en NaOH løsning instruerte sekvensering. Plass reagenser på 4 ° C til klar til bruk.
- Under 1 h ventetid, makt på sequenceren. Vent til DONOTEJECT stasjonen og koble datamaskinen til en nettverksstasjon.
- Start sequencer Kontrollprogramvaren.
- Forberede vedlikehold vaskeløsning som inneholder 0,5% mellom 20 og 0,03% 2 L ProClin 300 i laboratoriet-klasse vann.
- Legg ~ 100 mL vedlikehold vaskeløsning i SBS reagens stativet, til hver av 8 flasker og trakt skrulokk til flaskene. Legge til ~ 12 mL vedlikehold vaskeløsning i hver av de ti 15 mL konisk rørene PE reagens stativet, og forkaste caps.
- Legg to stativer med løsning fylt flasker/rør til sequenceren.
- Sequencer Kontrollprogramvaren, Velg vedlikehold vask; Følg instruksjonene på skjermen for å rengjøre sequencer væske systemet til prosessen er fullført.
- Starte en ny kjøre i kategorien "SEQUENCE" fra programvaren; direkte utdataene til en nettverksstasjon. Velg parametere for enkelt lese 1 x 50 bp med én indeks multiplekset biblioteker.
- Eventuelt logge BaseSpace sekvens huben slik at sekvensering status kan overvåkes eksternt via en datamaskin eller smart telefon.
- Laste opp en Sample ark for demultiplexing og gi reagens informasjon etter programvare kravet.
- Last SBS og PE reagenser til sequenceren. Prime systemet med en brukt flyt celle (~ 15 min).
- Når klyngen generasjon er fullført (~4.5 h), ta flyt cellen ut, spray lett flyt cellen med vann og tørk det tørke bruker linsen. Lett spray flyt cellen med 95% etanol og tørk den tørr. Sjekk mot en lys for å sikre at overflaten er ren uten rusk eller salt rester.
- Etter at statsminister trinn er fullført, laste gruppert flyt cellen og starte sekvensering. Sekvensen analyse seer programvare startes automatisk.
- Overvåke sekvensering datakvaliteten via SAV inkludert klynge tetthet, leser-pass filter, klynge pass filter %, % ≥Q30, eldre fase/prophase %, indeksering QC, etc. dette bidrar til å forstå datakvaliteten og feilsøke.
- Endre flyt celle pakningen og utføre en vedlikehold vask etter sekvensering er fullført. Sequenceren er klar for neste.
- Bioinformatic analyse
- Utføre bioinformatikk RNA-seq data analyse13.
2. sti analyse av Transcriptomic profiler (figur 1B)
- Bruk en edgeR Bioconductor for å sammenligne resulterende gene expression intensitet teller mellom BaP-utsatt og ikke-utsatt DCs fra tre givere. Identifisere deretter narkotikalovgivningen uttrykt gener mellom BaP-utsatt og ikke-utsatt DCs basert på absolutte fold endringen (> 2 Folder) og false oppdagelsen rate (FDR) - justert p- verdier (< 0,05).
- Å forutsi de funksjonelle klyngene av ulikt uttrykt gener, bruk ToppCluster programvarepakken å søke endret genene mot flere databaser som KEGG og REACTOME og generere klynging data. ToppCluster bruker hypergeometriske testen vil ha funksjonelle berikelse via genet listen berikelse analyse16.
- Videre inn resultatene fra disse funksjonen klynger Cytoscape17,18 versjon 3.3.0, en bredt brukt åpen kildekode programvareplattform for å visualisere komplekse nettverk. Dermed vises gener involvert i ulike klynger eller veier, inkludert endocytic klynger og lipid metabolisme, i et nettverk med farge merknad for gjennomsnitt fold endring av gene expression (figur 1B)13.
3. imaging flowcytometri CD1d og Lamp1 Colocalization
- Antistoff merking av BaP-eksponerte DCs
- Utsett 0.5 x 106 menneskelige DCs 5.94 mm BaP i 4 dager på 37 ° C i 2 mL komplett Dulbecco endret Eagle's Medium. Høste DCs med sentrifugering 400 x g for 10 min. blokk differensiert DCs av rugende celler med humant serum blokkering og anti-Fc reseptor antistoffer i 10 min i isen, inkludert anti-CD16, CD32 og CD64 antistoffer.
- Inkuber briljante Violet 421-anti-CD1c (L161), phycoerythrin/cyanine fargestoff 7 (PE/Cy7) - anti - HLA-DR og PE/Cy5-anti-CD11c med DCs for 20 min i isen. Tabell 1 viser listen av antistoffer.
- Fastsette DCs med 4% paraformaldehyde i PBS og permeabilize dem med Permeabilization vaskebuffer. Utføre den intracellulær flekker med en blanding av PE-merket renset anti-menneskelig CD1d (51,1) og Alexa Fluor 647-merket anti-Lamp1 (CD107a) (H4A3).
- Imaging måling av cytometri (figur 2)
- Analysere farget eksemplene bruker en tenkelig flyt cytometer flyt cytometri kjernen i Cincinnati Children's Hospital bruker en 40 X målsetting til 300 piksler for en celle med rundt 10 mm diameter. Én piksel er ca 0,5 mm ved 0,5 mm for objektet.
- Hente 10.000 mobilnettet bilder på en saklig måte i henhold til produsentens instruksjoner.
4. imaging analyser av flyt cytometri bilder
- Colocalization analyse med ideer programvare (figur 2)
- Utføre kompensasjon med single-farget versus ikke-farget eksempler ved å angi fluorescens intensiteten av ikke-farget prøver under grensen, inkludert ikke-farget BaP-eksponerte DCs med BaP autofluorescence, som rutinemessig flyt cytometri data analyse.
- Gate farget celler for å hente delsett av HLA-DR+CD11c+CD1d+Lamp1+ celler (figur 2A) og Vis mobilnettet bilder i gated delsettene (figur 2B).
- Lagre celle bilder i png format basert på to tekniske inklusjonskriterier, visuell tilstedeværelse av sterke co farget signaler og subcellular lokalisering av CD1d og Lamp1 proteiner, for de colocalization analysene bruker ImageJ-Fiji (figur 2B).
- Bruk programvare ImageJ-Fiji for å utføre colocalization analyse (Figur 3).
- Klargjør inndatabildet filene ved å flette 100 lagrede celle bildene for ikke-eksponert og BaP-utsatt menneskelige DCer, henholdsvis (figur 3A).
- Analysere CD1d (rød) og Lamp1 (grønn) colocalization med en scatterplot.
- Kjør ImageJ-Fiji program. Åpne filen png med 100 celle bilder (figur 3B og figur 4A): "fil | Åpne".
- Dele bildet med flettede røde og grønne kanaler i to bilder med enten en rød eller en grønn kanal: "bilde | Farge | Split kanaler".
- Tegne et scatterplot ved hjelp av kommandoene "analyser | Colocalization | Colocalization terskel". Lagre scatterplot bruke "PrintScreen" -tasten.
- Beregne Mander's colocalization koeffisientene for hver enkelt mobilnettet bilde (n = 100) (figur 4B)
- Velg en enkelt celle bilde på bildefilen med delt kanalene benytter det "Oval" verktøyet.
- Bruke kommandoer "analyser | Colocalization | Colocalization terskel". Velg "Kanal 1" i dialogboksen regionen rundt (ROI). Holde alle Beregningsalternativer inkludert "Manders bruke terskler" for hver celle bilde.
- Gjenta denne beregningen for alle 100 celle bilder.
- Lagre og åpne resultatene med et regneark.
- Plot gjennomsnittet og standardfeil for "Thresholded Mander koeffisientene" (n = 100, 0 betyr ingen colocalization og 1 betyr perfekt colocalization). Bruke Student t-test for å beregne p verdien for sammenligningen mellom BaP-utsatt og ikke-utsatt grupper (figur 4B).
- Beregne prosent av thresholded pixel intensitet Co lokalisert mellom CD1d og Lamp1 for flere celle bilder (n = 100) (figur 4C).
- Bruke samme analyse protokoll i 4.2.3 og i tillegg velger resultat alternativet "% intensitet over terskelen colocalized".
- Utføre denne analysen med Mander's colocalization koeffisienter.
- Tilsvarende plotte gjennomsnittet og standardfeil for % intensitet colocalized mellom CD1d og Lamp1. Bruke Student t-test for å beregne den p -verdien for sammenligning mellom BaP-eksponert og ikke-utsatt grupper (figur 4C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den lipofile forurensende BaP endrer endocytic genet klynger i menneskelig DCs. Human monocytt-avledet DCs fra hver giver (n = 3) ble inkubert med BaP og sortert for konvensjonelle DCs, som ble videre brukt for RNA utvinning og transcriptomic analyse som beskrevet . Ved normalisering av genuttrykk, var endret genene mellom BaP-eksponert og ikke-utsatt grupper gruppert etter funksjonelle sammenhengen av ulikt uttrykt gener. Vi inn listen endret genet til Toppcluster programmet16 for analyser av relevante mobilnettet og utføre statistiske testen bruker en false oppdagelsen rate (FDR) rettelse av p -verdier (figur 1B). Flere store endret genet klynger, inkludert lipid metabolisme og endocytic funksjoner, ble identifisert i BaP-eksponerte DCs. I denne studien vi fokuserer spesielt på Funksjonstesten for endocytic menneskehandel, fordi CD1-mediert antigen presentasjon er svært avhengig av lipid antigen lasting i endocytic veien5,19, 20,21.
CD1d endocytic menneskehandel er demonstrert ved hjelp imaging flowcytometri. Ved å få et stort antall celle bilder med bildebehandling flowcytometri, begynte vi å bruke ideer programmet for å visualisere mobilnettet enkeltbilder gjennom praktisk gating celle populasjoner co beiset med flere antistoffer (figur 2A). Spesielt kunne vi til gate store DC befolkningen co beiset med HLA-DR og CD11c for å vise ytterligere DCs med CD1d og Lamp1 co uttrykk (figur 2A). Co farget signaler kan bli beriket gjennom gating celle befolkningen med dobbel flekken av CD1d og Lamp1 (figur 2A). Vi først viste ikke-utsatt normal DCs med minimal colocalization av CD1d og Lamp1 proteiner, angir basale nivå av CD1d endocytic smugling og høy overflate uttrykk på fysiologiske forhold (figur 2B)5, 19,20,21. For å måle colocalization av CD1d og Lamp1 proteiner, brukt vi opprinnelig ideer til å vise en liten økning av lyse detalj likheten mellom CD1d og Lamp1 proteiner med BaP eksponering13. Lyse detalj likheten ble beregnet basert på den Pearson korrelasjonskoeffisient for tester korrelasjon av to faktorer, mens CD1d og Lamp1 proteiner var usannsynlig svært overlappes i fysiologiske forhold, som angir at CD1d er kjøpedyktig transiently trafikk gjennom sent endocytic avdelinger å få funksjonelle lipid antigener. Det er derfor mer biologisk meningsfylt å teste om CD1d proteinet i BaP eksponering beholder mer i slutten endocytic seksjonene som gjenspeiles av økte andelen overlappende CD1d og Lamp1 proteiner med imaging analyse programvare Fiji i den ImageJ pakke. Endelig kan oppbevaring av CD1d proteinet i slutten endocytic avdelinger brukes til å bekrefte funksjonelt endret endocytic genet profiler i BaP eksponering.
Samlokalisert intensitet og området mellom CD1d og Lamp1 proteiner ble målt. For å få en reproduserbar innstillingen og prosenter samlokalisert områder og intensitet, brukt vi ImageJ-Fiji22, som har også blitt brukt i flere andre studier23,24,25. Vi velger tilfeldig CD1d+Lamp1+ celler med sterk co flekk og fjern subcellular lokalisering av CD1d og Lamp1 proteiner som inndata bilder (figur 2B). Mobilnettet enkeltbilder kan slås sammen til en enkelt bildefil for en konsekvent analyse (figur 3A). I vår studie vi sammen 100 celle bilder og åpnet den i til å analysere ved å angi "colocalisation terskler" (figur 3B). Colocalization pixel intensitet mellom to kanaler (PE-merket CD1d og AF647-merket Lamp1) ble vist samlet med en scatterplot av oppdager samlokalisert bildepunktene fra bildene 100 celle (figur 4A). I denne tomten, vannrette og loddrette linjene representerer Costess terskler og de diagonale linjene representerer forholdet mellom generelle pixel intensitet mellom to kanaler. Den Costes terskelen gir en synlig innstilling for å fjerne svak bildepunkter fra to overlappende kanaler. Det resulterte scatterplot viser en økt colocalization av CD1d og Lamp1 proteiner i BaP eksponering. Videre kvantifisert vi graden av colocalization mellom CD1d og Lamp1 proteiner med Manders koeffisientene (figur 4B). Følgelig demonstrere Manders koeffisienter økt colocalization mellom CD1d og Lamp1 i sen endocytic deler av BaP-eksponerte DCs sammenligne med ikke-utsatt DCs, som statistisk støttes av Student t-tester (figur 4B). Men hvis protein intensitet er heterogene mellom colocalized og ikke-colocalized, vil colocalized intensitet være enestående colocalized områder. Derfor er det også nødvendig å ytterligere eksamen i colocalization basert på intensitet (figur 4C). Som et resultat, hver kolonne representerer et gjennomsnitt beregningen av colocalized intensitet fra flere celle bilder (n = 100) mellom BaP-utsatt og ikke-utsatt vilkår for et par samlokalisert proteiner. Student t-tester viser statistisk signifikans (n = 100, p< 0,001) mellom BaP-eksponert og ikke-utsatt grupper med angitte standardfeil. Helt, våre data viser at CD1d protein ble beholdt i slutten endosomes på BaP eksponering, støtter at BaP-forandret genuttrykk videre fører til svekket endocytic funksjonen og CD1d handel.
I sammendraget forbedrer CD1d-Lamp1 colocalization ved BaP eksponering. Flere parametere basert på celle bilder (figur 2B), inkludert scatterplots med overlappende pixel intensitet (figur 4A), forbedret Manders koeffisientene (figur 4B), og økt andelen overlappende intensitet ( Figur 4C), støtter CD1d endocytic oppbevaring på BaP eksponering. Denne colocalization analysen av mobilnettet bilder er en nøyaktig fastslå graden av protein colocalization og demonstrere biologiske mekanismer av celle-funksjoner, for eksempel endocytic funksjon samsvar med forstyrret endocytic genet uttrykk, ytterligere bidrar til hemmet aktivering av CD1d-begrenset T celler13.
Figur 1 : Forstyrrelsene av DC transcriptomes BaP eksponering (A) flytskjema for RNA-Seq. Først ble kvalitetskontroll (QC) analyse gjennomført for å undersøke kvaliteten på totalt RNA. Bruke automatisert system og høy kvalitet totale RNA som inndata, poly-A RNA ble isolert, utarmet som demonstrert rRNA i poly-en RNA QC analyser. Poly-en RNA ble deretter utsatt for automatisert bibliotek forberedelse og indeksering via PCR. Neste, forsterket biblioteket ble analysert ved et Bioanalyzer for QC med forventet avkastning og størrelsesDistribusjon. Etter qPCR kvantifisering, indekserte biblioteker var samlet og gruppert på flyt cellen for sekvensering, og sekvensering datakvaliteten var sanntid overvåket. Aksen representerer relativ antall flowcytometri flekker signaler. (B) Altered gener ble gruppert i ulike funksjonelle klynger og gene klynger tilknyttet endocytic funksjon og lipid metabolisme vises. Rød: CD1d; Grønn: Lamp1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Analyse av mobilnettet bilder ved hjelp av programmet ideer. (A) monocytt-avledet DCs fra sunn givere var for det første port på HLA-DR + CD11c + celler og ytterligere gated på CD1d+Lamp1+ celler ved hjelp av ideer-programmet. (B) Cellular bildene var Hentet fra HLA-DR+CD11c+CD1d+Lamp1+ befolkningen for mobilnettet bilde visualisering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Analyse av mobilnettet bilder ved hjelp av programmet Fiji-ImageJ. Celler med sterk co flekken av CD1d og Lamp1 proteiner var tilfeldig valgt for bildeanalyse ved hjelp av Fiji-ImageJ, men celler * med usynlige eller svake flekker for enten CD1d eller Lamp1 protein ble utelatt som figur 2B. (A) disse tilfeldig valgt mobilnettet bilder ble samlet i en enkelt bildefil som inndata. (B) i colocalization-analyse ble gjennomført gjennom å sette colocalization grensene for både grønne og røde kanaler. Scatterplots ble generert med terskelen beregning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Colocalization av CD1d og lampe 1 proteiner. Bruke lignende dataset rapportert i Sharma et al. 13, samlokalisert pixel intensitet mellom CD1d og Lamp1 proteiner fra DCs på BaP-eksponert og ikke-eksponert ble beregnet og vist med scatterplots (A). Manders koeffisientene for CD1d og Lamp1 colocalization ble beregnet og vises med en gjennomsnittlig fra merkede cellen bilder (B). Andelen samlokalisert pixel intensitet var også beregnet (C). Statistisk signifikans (n = 100, p < 0,001) ble hentet med Student t-tester i forhold til ikke-eksponerte gruppen. Standardfeil ble angitt. Dataene er Hentet fra en analysen med celler fra en frisk donor. To uavhengige analyser ble utført med lignende resultater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Antistoffer | Fluorophores eller sekundær antistoff | Klone |
| HLA-DR | Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | L243 |
| CD11c | Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | 3.9 |
| CD1c | Briljante violet 421 | L161 |
| Renset anti-menneskelige CD1d | PE-anti-mus IgG2b | 51,1 |
| Lamp1 | Alexa Fluor 647 (AF647) | CD107a(H4A3) |
Tabell 1: antistoffer brukt i denne studien. Delte eksitasjon og utslipp bølgelengder overlappet fluorophores PE/Cy5 og AF647 delvis på flekker signaler. Vi bruker disse fluorophores til å merke en overflate protein (CD11c) og en intracellulær protein (Lamp1) for å unngå deres signal overlappende på et subcellular nivå. Vi bruker også optimal titrering og erstatning for å minimere overlappende signalene mellom begge fluorophores.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Funksjonell bekreftelse av en endret genet veien er utfordrende, på grunn av mye påvirket genuttrykk som involverer flere veier og vanskeligheter for å integrere individuelle og populational mobilnettet aktiviteter. Vi ansatt tenkelig flowcytometri spesielt prøve CD1d handel i endocytic avdelinger. Imaging flowcytometri integrerer populational måling av celler og personlige demonstrasjon av subcellular colocalization av flere proteiner. AC confocal mikroskopi har tidligere gitt høy oppløsning måle protein colocalization, og flowcytometri er kjøpedyktig skaffe omfattende phenotyping for ulike celle populasjoner. Imaging flowcytometri kombinerer fordelene med AC confocal mikroskopi og flowcytometri på akseptabel bildeoppløsning analysere protein colocalization i en høy-profil måte funksjonelle bekreftelse av transcriptomic endring av miljø miljøgifter.
Analyser av colocalization av flere proteiner i populational skala er teknisk krevende, fordi (i) detaljerte analyser av flere individuelle celler er arbeidskrevende og relativt partisk; (ii) det er vanskelig å definere en optimal terskelen for å tolke overlappende bildepunkter basert på intensiteten eller området positiv flekker; og (iii) balansert observasjon av individuelle og populational celler er avgjørende. I denne studien fokuserte vi på en biologisk meningsfull observasjon, en statistisk betydning test og et tenkelig demonstrasjon av samlokalisert proteiner. For å oppnå dette målet, får vi først tusenvis av bilder av menneskelige DCs tenkelig flowcytometri. Kvantitative analyser av imaging-filer sammen en lyse detalj likheten analyse ved hjelp av programvaren ideer og en statistisk testet colocalization analyse ved hjelp av Fiji-ImageJ. IDEER programmet lar gating co farget befolkningen, beregne colocalization av to proteiner med Pearsons korrelasjonskoeffisienten-baserte lyse detalj likheten, og tilfeldig velge co farget celler med subcellular lokalisering av proteiner13. For å oppnå ytterligere biologiske relevante demonstrasjon av samlokalisert proteiner, vi brukte ImageJ-Fiji programvare og brukt den Mander koeffisient for å beregne prosentdelen av samlokalisert områder og overlappet pixel intensitet for å demonstrere graden av CD1d lokalisering i endocytic veien.
Det kritiske trinnet ved hjelp av ImageJ-Fiji-programmet er å utføre enkeltcelle imaging analyse. Variant av prosenten protein colocalization fra enkeltceller kan overvåkes i forhold til visuelt flettede farger fra enkelt celle bilder. Ved å beregne prosenten protein colocalization fra alle 100 celler, kan midler og standardfeil beregnes for å demonstrere protein colocalization og funksjonelle korrelasjon på et populational nivå. Bioinformatikk analysen er enkel og grei uten tvetydig resultater, fordi denne analysen tilbyr en reproduserbar terskelen beregning ved hjelp av Costes metoden for å produsere den samme resulterte terskler for de samme datasettene og lignende terskler for lignende datasett26. Begrensning av denne teknikken er arbeidskrevende manuelle inndata enkeltcelle bilder og potensielt subjektive utvalg av visuelt co farget celler ved hjelp av ideer programvare. I vår studie vi analysere 100 celle bilder fra hver gruppe og vi setter reproduserbar utvalgskriterier, inkludert sterke co farget signaler og fjerne subcellular lokalisering av CD1d og Lamp1 proteiner. Overvinne disse begrensningene krever teknisk forbedring av analytisk programvare for å tillate satsvis analyse og objektive utvalg av enkeltceller basert på morfologiske funksjoner utover flekker intensiteten av flowcytometri. I Sammendrag, kombinert cellular og befolkningen vil imaging analyser gi svært reproduserbare, omfattende, statistisk testet og biologisk relevante resultatene av prosenten protein colocalization. Vi tror denne CD1d-Lamp1 colocalization analysen kan tjene som en vellykket eksempel på høyprofilerte mobilnettet tenkelig analyser besvare bredere spørsmål funksjonelle og morfologiske endring av mobilnettet proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre
Acknowledgments
Forfatterne takker Robert Giulitto (Hoxworth blod center) for menneskelig blodprøver og Dr. Liang Niu for normalisering av genuttrykk leser. Vi takker også gi støtte fra National Institute of Environmental Health Sciences (ES006096), Center for Environmental genetikk (CEG) pilotprosjekt (SH), National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer (AI115358) (SH), universitet Cincinnati University Research Council prisen (SH), og Universitetet i Cincinnati College i medisin kjernen ekstrautstyr midler (X. Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transcriptomics | Illumina | HiSeq 2500 v4 | Illumina HiSeq system |
| ImagingStream X | Millipore | 100220 | Imaging flow cytometry |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fisher | Total RNA extraction | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent | Total RNA QC analysis | |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher | PCR, enzyme reaction | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England Biolab | PolyA RNA purification | |
| Automated SMARTer Apollo system | Takara | PolyA RNA purification | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolab | Library preparation | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | DNA purification | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) | Thermo Fisher | Library quantification | |
| NEBNext Library Quant Kit | New England Biolab | Library quantification | |
| cBot | Illumina | Library cluster generation | |
| TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot – HS | Illumina | Library cluster generation | |
| HiSeq 1000 | Illumina | Sequencing | |
| TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles) | Illumina | Sequencing | |
| Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | Bio Legend | L243 | |
| Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | Bio Legend | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | Bio Legend | L161 | |
| PE-anti-mouse IgG2b | Bio Legend | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) | Bio Legend | CD107a(H4A3) |
References
- Roche, P. A., Cresswell, P. Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells. Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).
- Huang, S., et al. MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells. The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).
- Nakamura, N., et al. Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling. Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).
- Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P.
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Zajonc, D. M., Kronenberg, M. CD1 mediated T cell recognition of glycolipids. Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).
- Cox, D., et al. Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules. PloS one. 4 (5), e5325 (2009).
- Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments. Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).
- Huang, S., et al. Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).
- de Jong, A., et al. CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens. Nature. 15 (2), 177-185 (2014).
- Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Sharma, M., et al. Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants. Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).
- Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).
- Nachamkin, I., et al. Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene. Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).
- Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems. Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).
- Bauer-Mehren, A. Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape). Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).
- Cline, M. S., et al. Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape. Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).
- Huang, S., Moody, D. B. Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system. Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).
- Huang, S. Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis. Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).
- Moody, D. B., Porcelli, S. A. Intracellular pathways of CD1 antigen presentation. Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9 (7), 676-682 (2012).
- Diard, M., et al. Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype. Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Eliceiri, K. W., et al.
- Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).
