Summary
Imaging flödescytometri ger en idealisk metod för att upptäcka den morfologiska och funktionella ändringen av celler vid individ-och populational. Med en kombinerad transcriptomic profilering av genuttryck och morfologiska demonstration av protein människohandel påvisades störd endocytic funktion för lipid antigen presentation i förorening-exponerade mänskliga dendritiska celler.
Abstract
Populational analyser av morfologiska och funktionella förändringar i endocytic proteiner är utmanande på grund av efterfrågan av Bildinsamling på en enda cell nivå och statistisk bildanalys på populational nivå. För att övervinna denna svårighet, brukade vi imaging flödescytometri och transcriptomic profilering (RNA-seq) avgöra förändrad subcellulär lokalisering av kluster av differentiering 1d protein (CD1d) är associerad med nedsatt endocytic genuttryck i mänskliga dendritiska celler (DCs), som var utsatt till gemensamt lipofila luft förorening bens [a] pyren. Colocalization av CD1d och endocytic markör Lamp1 proteiner från tusentals cell-bilder som tagits med imaging flödescytometri analyserades med hjälp av idéer och ImageJ-Fiji program. Många cellulära bilder med samtidig färgade CD1d och Lamp1 proteiner var visualiserat efter gating på CD1d+Lamp1+ DCs med idéer. Den förbättrade CD1d och Lamp1 colocalization vid BaP exponering visades ytterligare använder thresholded scatterplots, testade med Manders koefficienter för co lokaliserade intensitet och ritade utifrån andelen Co lokaliserade områden använder ImageJ-Fiji. Våra data ger ett fördelaktigt instrumental och bioinformatiska tillvägagångssätt för att mäta protein colocalization på både enkel- och populational cellulära nivåer, stödja en nedsatt funktionell resultatet av transcriptomic ändring i förorening-exponerade mänskliga DCs.
Introduction
Antigen-presentation innebär normalt intracellulära protein människohandel, som ofta har undersökts med hjälp av morfologisk karakterisering och fenotypiska profilering av antigenpresenterande celler1,2,3 . För att integrera fördelarna med imaging och fenotypning metoder, beskriver vi en tänkbar analysplattform både encelliga och befolkningen nivå att demonstrera ett förändrat protein colocalization i mänskliga dendritiska celler (DCs). I peptid antigen-presentation, klass stora histocompatibility komplex (MHC) molekyler binder en kort peptid (8-10 rester) i endoplasmatiska retiklet att aktivera konventionella CD8+ T celler, medan MHC klass II molekyler binder en förhållandevis längre peptid (~ 20 rester) i endocytic fack att aktivera konventionella CD4+ T cells1,4. Däremot är lipid-specifika T-celler aktiveras av CD1 proteiner med lipid antigener laddad främst i endocytic fack5,6. Lipid antigen-presentation kräver tillhandahållande av lipid metaboliter produceras i lipid metabolism7,8,9,10 och lastning av funktionella lipid metaboliter till CD1 proteiner i endocytic fack5,6. I detta sammanhang är olika cellulära faktorer modulerande lipid antigen-presentation, särskilt i miljöexponering lipofila föroreningar och immunsjukdomar, kritiska definieras. I denna studie använde vi transcriptomic analys, bilden profilering och cellulära och populational bildanalys av mänskliga monocyt-derived DCs för att bestämma endocytic protein handel bidrar till lipid antigen-presentation i förorenande exponering. Visst, denna kombinerade plattformen kan tillämpas på studera subcellulär protein människohandel och colocalization i olika biologiska processer.
Tekniskt, subcellulär protein lokalisering visades vanligtvis använder konfokalmikroskopi och statistiskt analyserats i ett begränsat antal upptäckta celler1,2,3,11. Dessutom har flödescytometri i stort sett tillämpats på gate cellpopulationer med samtidig färgade signaler av flera proteiner på en cellulär nivå12; Detta saknar dock en detaljerad visualisering av subcellulär protein colocalization. För att uppnå övergripande och statistiska analyser av procentandel protein colocalization på både cellulär och befolkningen måste införliva vi imaging profilering och analys metoder för att fastställa funktionerna i protein colocalization med biologiska betydelse. Specifikt vi använda imaging flödescytometri för att upptäcka colocalization av CD1d och lysosomala-associerade membranprotein 1 (Lamp1) proteiner i denna studie. Kvantitativ analys av colocalized molekyler var tidigare svår att utföras på en populational skala. I denna studie anpassat vi programmet ImageJ-Fiji att undersöka andelen protein colocalization med ett stort antal Co färgade celler på både populational och enskilda cellulära nivåer. Specifikt, mätt vi Co lokaliserade områden, intensitet och populational storlek till stöd för slutsatsen att proteinet CD1d var till stor del kvar i sena endocytic fack i mänskliga DCs exponering för en lipofila förorenande bens [a] pyren (BaP)13 . Denna kombinerade mobilnät och befolkningen imaging analys gav mycket reproducerbara, omfattande och statistiskt signifikanta resultat av CD1d-Lamp1 colocalization relevanta för hämmad lipid antigen-presentation.
Transkriptom av BaP-exponerade mänskliga DCs har starkt stöd för hypotesen att endocytic lipidmetabolismen och CD1d endocytic handel var nedsatt i BaP exponering. För att testa denna hypotes, tillämpat vi imaging flödescytometri för att profilera de bilder av DC befolkning som var samtidig färgas med flera proteiner inklusive CD1d, endocytic markörer och DC markörer. Slutligen analyserades statistiskt samarbete färgade celler för att Visa procentandelen av intensitet och områden av CD1d och Lamp1 colocalization.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mänskliga protokoll i denna studie godkändes av den institutionella Review Board vid University of Cincinnati och alla metoder utfördes i enlighet med de relevanta riktlinjer och förordningar. Blodprov från friska donatorer erhölls från Hoxworth blodcentralen vid University of Cincinnati Medical Center.
1. Transcriptomic profilering av förorening-exponerade mänskliga monocyt-derived DCs
- Total RNA-extraktion av BaP-exponerade DCs
- Differentiera mänskliga DCs med hjälp av cytokiner GM-CSF och IL-4, och utsätta DCs till BaP för 4 dagar13.
- Sortera BaP-exponerade DCs med flödescytometri baserat på de uttryckta ytmarkörer (härstamning–HLA-DR+), varav merparten består av konventionella DCs (CD11c+CD1c+)13. Typiskt, sortera 10.000 DCs i odlingsmedium som innehåller 10% FBS, Centrifugera DCs 600 x g- och 4 ° C i 6 min, och omedelbart ta bort supernatanten genom aspiration med en 1 mL pipettspetsen.
- När supernatanten avlägsnas genom aspiration, lyse cellpelleten genom att lägga till 0,4 mL Lysis/bindande buffert från RNA isolering kit för lagring i-80 ° C före RNA-extraktion.
- Använd RNA isolering kit med total RNA extraktion protokoll för att extrahera den totala RNA14. Mäta RNA integritet med hjälp av en Bioanalyzer15.
- Transcriptomic analys av sorterade DCs (figur 1A)
- Förbereda biblioteket för RNA-seq med en RNA bibliotek förberedelser kit. Kort sagt, fragment isolerade poly-A RNA (~ 200 bp), omvänd transkribera fragment till 1: a delen av cDNA och följ genom andra strand cDNA syntes märkt med dUTP.
- Ligera double strand cDNA på adaptern med en stam-loop struktur efter pärla rening, slutet-reparera och dA-tailing. Punktskatt på uracil resthalter i den 2: a delen av cDNA och adapter slingan med användaren (Uracil-specifika Excision Reagent) enzymet att upprätthålla strand specificitet och öppna adapter slingan för PCR.
- Utföra 13 cykler av PCR med universal och index-specifika primers för att berika det indexerade biblioteket. Städa upp i biblioteket och köra på en Bioanalyzer DNA hög känslighet-chip för att kontrollera bibliotek kvalitet och storlek distribution.
- Använd ett bibliotek kvantifiering kit och en realtids PCR-system kombineras med bibliotek storleksinformation att beräkna bibliotek koncentration via en standardkurva metod.
- Proportionellt pool individuellt indexerade kompatibla bibliotek och justera den slutliga totala koncentrationen till 15 pM. Utföra bibliotek kluster generation och sekvens biblioteket på en inställning av enda Läs 1 x 50 bp att generera ~ 25 miljoner läsningar per prov.
- Sekvensering
- Ladda sekvensering och indexering reagenser till SBS och PE reagens racken, respektive. Placera reagenserna i ett laboratorium-grade vattenbad för 1 h tills all is har smält och reagenser i varje flaska/röret blandas ordentligt.
- Förbereda den ICB-mix genom att enzymet upptinade färgen och -20 ° C till flaskan och blanda. Förbereda en NaOH-lösning enligt instruktionerna sekvensering. Placera alla reagenser vid 4 ° C tills klar att använda.
- Under 1 h vänteperiod, power på sequencer. Vänta tills DONOTEJECT enheten visas och ansluta datorn till en nätverksenhet.
- Starta programvaran sequencer kontroll.
- Förbered 2 L underhåll tvättlösning som innehåller 0,5% Tween-20 och 0,03% ProClin 300 i laboratorium-grade vatten.
- I SBS reagens rack, tillsätt ~ 100 mL underhåll tvättlösning till varje 8 flaskor, och tratt skruvlock till flaskorna. Tillsätt ~ 12 mL underhåll tvättlösning till varje av de tio 15 mL koniska rör PE reagens rack, och kassera mössor.
- Ladda två rack med lösningen fyllda flaskor/tuber till sequencer.
- Från sequencer kontroll mjukvaran, välja underhåll tvätten; Följ instruktionerna på skärmen för att rengöra sequencer vätska systemet tills processen är klar.
- Starta en ny kör i fliken ”sekvens” från programvaran; direkt utdata till en nätverksenhet. Välj parametrar för enda Läs 1 x 50 bp med enda index multiplexed bibliotek.
- Du kan också logga in på BaseSpace sekvens navet så att sekvensering status kan övervakas på distans via en dator eller smart telefon.
- Ladda upp ett prov blad för demultiplexning och tillhandahålla reagens information enligt kravet på programvara.
- Ladda SBS och PE reagenser till sequencer. Prime systemet med en begagnad flöde cell (~ 15 min).
- När den kluster-generationen är klar (~4.5 h), ta cellen flöde ut, spraya lätt cellen flöde med vatten, och torka den torr med objektivet papper. Lätt spray cellen flöde med 95% etanol och torka det torrt. Kontrollera mot ett ljus att se till att ytan är ren utan skräp eller salt rester.
- Efter steget Prime är klar, Ladda cellen klustrade flöde och börja sekvensering. Sekvens analysen Viewer-programvara startas automatiskt.
- Övervaka kvaliteten på sekvensering uppgifterna via SAV inklusive kluster densitet, läser lågpassfilter, kluster passera filtret %, % ≥Q30, Legacy fas/profas %, indexering, QC, etc. detta bidrar till att förstå kvaliteten på uppgifterna och felsöka.
- Ändra flödet cell packningen och utföra en underhåll tvätt efter sekvenseringen är klar. Sequencer är redo för nästa körning.
- Bioinformatiska analyser
- Utföra bioinformatik RNA-seq data analys13.
2. väg analys av Transcriptomic profiler (figur 1B)
- Använd ett kantverk Bioconductor för att jämföra resulterande gen uttryck intensitet räknas mellan BaP-exponerade och icke exponerade DCs från tre givare. Sedan, identifiera Differentiellt uttryckta gener mellan BaP-exponerade och icke exponerade DCs baserat på absolut vik ändra (> 2 veck) och falsk upptäckten Betygsätt (FDR) - justerade p- värden (< 0,05).
- För att förutsäga de funktionella kluster av differentially uttryckt gener, använda programpaketet ToppCluster att söka de förändrade generna mot flera databaser inklusive KEGG och REACTOME och generera kluster data. Hypergeometrisk testet används i ToppCluster för att få funktionella berikning via genen lista anrikning analys16.
- Ytterligare input resultaten från dessa funktionen kluster till Cytoscape17,18 Version 3.3.0, en i stort sett använda open source programvaruplattform för att visualisera komplexa nätverk. Således, generna som är involverade i olika kluster eller vägar, däribland endocytic kluster och lipidmetabolismen, visas i ett nätverk med färg annotering av i genomsnitt fold förändringen av genen uttryck (figur 1B)13.
3. imaging flödescytometri av CD1d och Lamp1 Colocalization
- Antikropp märkning av BaP-exponerade DCs
- Exponera 0,5 x 106 mänskliga DCs till 5.94 mM BaP för 4 dagar vid 37 ° C i 2 mL komplett Dulbeccos modifierade örnens Medium. Skörda DCs genom centrifugering vid 400 x g i 10 min. Block differentierade DCs av ruva celler med humant serum blocker och anti-humant Fc receptor antikroppar i 10 min i is, inklusive anti-humant CD16, CD32 och CD64 antikroppar.
- Inkubera lysande violett 421-anti-CD1c (L161), phycoerythrin/cyanin färga 7 (PE/Cy7) - anti - HLA-DR, och PE/Cy5-anti-CD11c med DCs i 20 min i is. Tabell 1 visar denna lista av antikroppar.
- Fixa DCs med 4% PARAFORMALDEHYD i PBS och permeabilize dem med permeabilisering tvättbuffert. Utföra den intracellulära färgning med en blandning av PE-märkt renat anti-human CD1d (51,1) och Alexa Fluor 647-märkt anti-Lamp1 (CD107a) (H4A3).
- Imaging flödescytometri flödesmätning (figur 2)
- Analysera de färgade prover med en tänkbar flödescytometer kärnan flödescytometri flöde i Cincinnati Children's Hospital använder ett 40 X-objektiv för att ge 300 pixlar för en cell med runt 10 mm i diameter. En bildpunkt storlek är ungefär 0,5 mm med 0,5 mm för objektet.
- Förvärva 10.000 cellulära bilder på ett opartiskt sätt enligt tillverkarens anvisning.
4. imaging analyser av flöde flödescytometri bilder
- Colocalization analys med idéer programvara (figur 2)
- Utföra ersättning med singel-färgade kontra icke-färgade prover genom att ange fluorescensintensiteten hos icke-färgade prover under tröskeln, inklusive icke-färgade BaP-exponerade DCs med BaP autofluorescens, liksom i rutinmässiga flödesdata flödescytometri analys.
- Gate färgade celler för att få delmängder av HLA-DR+CD11c+CD1d+Lamp1+ celler (figur 2A) och Visa cellulära bilder i gated delmängder (figur 2B).
- Spara cell bilder i png format baserat på två tekniska inklusionskriterier, visuella förekomsten av starka Co färgade signaler och subcellulär lokalisering av CD1d och Lamp1 proteiner, för de colocalization analyser med hjälp av ImageJ-Fiji (figur 2B).
- Använda programvara ImageJ-Fiji för att utföra colocalization analys (figur 3).
- Förbered filerna indatabilden genom sammanslagning 100 sparade cell bilderna för icke-exponerade och BaP-exponerade mänskliga DCs, respektive (figur 3A).
- Analysera CD1d (röd) och Lamp1 (grön) colocalization med ett spridningsdiagram.
- Kör ImageJ-Fiji programmet. Öppna .png-filen med 100 cell bilder (figur 3B och figur 4A): ”fil | Öppna ”.
- Dela upp bilden med sammanslagna röda och gröna kanalerna i två bilder med antingen en röd eller en grön kanal: ”bild | Färg | Dela kanaler ”.
- Rita ett spridningsdiagram med kommandona ”analysera | Colocalization | Tröskelvärde för colocalization ”. Spara den spridningsdiagram med knappen ”PrintScreen” .
- Beräkna Mander's colocalization koefficienter för varje enskild cellulära bild (n = 100) (figur 4B)
- Markera en enda cell bild på bildfilen med split kanaler med den ”Oval” markeringsverktyget.
- Använd kommandona ”analysera | Colocalization | Tröskelvärde för colocalization ”. Välj ”kanal 1” från dialogrutan region av intresse (ROI). Hålla alla Beräkningsalternativ inklusive ”Manders använda trösklar” för varje cell bild.
- Upprepa denna beräkning för alla 100 cell bilder.
- Spara och öppna resultaten med hjälp av ett kalkylblad.
- Rita genomsnittet och standardfel för ”thresholded Manders koefficienter” (n = 100, 0 betyder ingen colocalization och 1 betyder perfekt colocalization). Använda Students t-test för att beräkna värdet p för jämförelsen mellan BaP-exponerade och icke exponerade grupper (figur 4B).
- Beräkna procentandelen thresholded pixel intensitet Co lokaliserade mellan CD1d och Lamp1 för flera cell bilder (n = 100) (figur 4 c).
- Använda samma analys protokoll i 4.2.3 och dessutom Markera resultatet alternativet ”% intensitet tröskelvärdet för colocalized”.
- Utföra denna analys tillsammans med Mander's colocalization koefficienter.
- På samma sätt Rita genomsnittet och standardfel för % intensitet colocalized mellan CD1d och Lamp1. Använda Students t-test för att beräkna värdet p för jämförelse mellan BaP-exponerade och icke exponerade grupper (figur 4 c).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lipofila föroreningen BaP förändrar endocytic gen kluster i mänskliga DCs. mänskliga monocyt-derived DCs från varje givare (n = 3) var inkuberas med BaP och sorteras för konventionella DCs, som användes ytterligare för RNA extraktion och transcriptomic analys som beskrivs . Vid normalisering av genuttryck, var förändrade gener mellan BaP-exponerade och icke exponerade grupper grupperade enligt det funktionella sambandet mellan Differentiellt uttryckta gener. Vi ingång listan förändrade genen till Toppcluster program16 för analyser av relevanta cellulära vägar och genomföra statistiska testet använder en falsk upptäckten hastighet (FDR) korrigering av p -värden (figur 1B). Flera stora förändrad gen kluster, inklusive lipidmetabolism och endocytic funktioner, identifierades i BaP-exponerade DCs. I denna studie vi särskilt fokus på det funktionella testet av endocytic människohandel, eftersom CD1-medierad antigen-presentation har varit starkt beroende av lipid antigen laddar i endocytic väg5,19, 20,21.
CD1d endocytic människohandel demonstreras med imaging flödescytometri. Att få ett stort antal cell bilder med imaging flödescytometri, och vi började använda programmet idéer för att visualisera enskilda cellulära bilder genom bekvämt gating cellpopulationer Co färgas med flera antikroppar (figur 2A). Specifikt, kunde vi utfärda utegångsförbud för större DC befolkningen Co fläckade av HLA-DR och CD11c för att ytterligare Visa DCs med CD1d och Lamp1 samtidig uttryck (figur 2A). Co färgade signaler kan berikas genom gating cell befolkningen med dubbel fläck av CD1d och Lamp1 (figur 2A). Vi först visade icke-exponerade normala DCs med minimal colocalization av CD1d och Lamp1 proteiner, angivande av basal nivå av CD1d endocytic människohandel och hög nivå av ytan uttryck vid fysiologiska förhållanden (figur 2B)5, 19,20,21. För att mäta colocalization av CD1d och Lamp1 proteiner, brukade ursprungligen vi idéer visar en liten ökning av ljusa detalj likheten mellan CD1d och Lamp1 proteiner med BaP exponering13. Den ljusa detalj likheten var beräknas baserat på de Pearsons korrelationskoefficient för att testa sambandet mellan två faktorer, medan CD1d och Lamp1 proteiner var osannolikt högt överlappas i fysiologiska tillstånd, vilket indikerar att CD1d är kunna övergående trafik genom sena endocytic fack att få funktionella lipid antigener. Det är således mer biologiskt meningsfull att testa om CD1d proteinet i BaP exponering behåller mer i de sena endocytic fack vilket avspeglas i ökade andelen överlappande CD1d och Lamp1 proteiner med hjälp av Fijis imaging analys programvara i de ImageJ paket. Slutligen, retention av CD1d protein i sena endocytic fack kan användas funktionellt bekräfta förändrad endocytic gen profiler i BaP exponering.
Co lokaliserade intensitet och området mellan CD1d och Lamp1 proteiner mättes. För att erhålla en reproducerbar tröskel inställning och procentsatser av samtidig lokaliserade områden och intensitet, tillämpat vi ImageJ-Fiji22, som också har använts i flera andra studier23,24,25. Vi väljer slumpmässigt CD1d+Lamp1+ celler med stark samtidig fläcken och tydlig subcellulär lokalisering av CD1d och Lamp1 proteiner som ingående bilder (figur 2B). Enskilda cellulära bilder kan slås samman till en enda bildfil för en konsekvent analys (figur 3A). I vår studie, vi samman 100 cell bilder och öppnade det i programmet för att analysera genom att ställa ”colocalisation tröskelvärden” (figur 3B). Colocalization av pixel intensitet mellan två kanaler (PE-märkt CD1d och AF647-märkt Lamp1) visades övergripande med ett spridningsdiagram genom att upptäcka Co lokaliserade pixlarna från dessa 100 cell bilder (figur 4A). I denna sammansvärjning, horisontella och vertikala linjer representerar Costess tröskelvärden och de diagonala linjerna representerar förhållandet mellan totala pixel intensitet mellan två kanaler. Den Costes tröskel ger en synlig inställning för att ta bort svaga pixlar från två överlappande kanaler. Den resulterade spridningsdiagram visar en ökad colocalization av CD1d och Lamp1 proteiner i BaP exponering. Dessutom kvantifiera vi graden av colocalization mellan CD1d och Lamp1 proteiner med hjälp av Manders koefficienter (figur 4B). Följaktligen visar Manders koefficienter ökade colocalization mellan CD1d och Lamp1 i sena endocytic fack i BaP-exponerade DCs jämföra med icke-exponerade DCs, som statistiskt stöds av Students t-test (figur 4B). Om protein intensitet är heterogena mellan colocalized och icke-colocalized, kommer colocalized intensitet dock motstycke till colocalized områden. Därför är det också nödvändigt att ytterligare examen colocalization baserat på intensitet (figur 4 c). Som ett resultat, varje kolumn representerar en i genomsnitt beräkning av andelen colocalized intensitet från flera cell bilder (n = 100) mellan BaP-exponerade och icke exponerade villkor för ett par av samtidig lokaliserade proteiner. Student's t-test visar också statistisk signifikans (n = 100, p< 0,001) mellan BaP-exponerade och icke exponerade grupper med angivna standard fel. Våra data visar sammantaget att den CD1d protein var kvar i sena endosomes på BaP exponering, stödja det BaP-förändrat genuttrycket ytterligare leder till nedsatt endocytic funktion och CD1d människohandel.
Sammanfattningsvis ökar CD1d-Lamp1 colocalization vid BaP exponering. Flera parametrar baserat på cell bilder (figur 2B), inklusive scatterplots med överlappande pixel intensitet (figur 4A), enhanced Manders koefficienter (figur 4B), och ökade andelen överlappande intensitet ( Figur 4 c), stödja CD1d endocytic retention vid BaP exponering. Denna colocalization analys av cellulära bilder är en korrekt strategi att bestämma graden av protein colocalization och demonstrera biologiska mekanismer i cellfunktioner, till exempel endocytic funktion överensstämmer med störd endocytic gen uttryck, ytterligare bidrar till hämmas aktiveringen av CD1d begränsad T celler13.
Figur 1 : Störning av DC transcriptomes i BaP exponering (A) flödesschema för RNA-följande punkter Först, kvalitetskontroll (QC) analyser utfördes för att undersöka kvaliteten på total-RNA. Hjälp av ett automatiserat system och hög total-RNA som indata, poly-A RNA isolerades, utarmat som visat rRNA i poly-A RNA QC analys. Poly-A RNA utsattes sedan för automatiserat bibliotek förberedelse och indexering via PCR. Nästa, förstärkta biblioteket analyserades av en Bioanalyzer för QC med förväntade avkastning och storlek distribution. Efter qPCR kvantifiering, indexerade bibliotek var poolade och klustrade på flöde cell för sekvensering, och kvaliteten på sekvensering uppgifterna var realtid övervakas. Axeln representerar relativa räkningarna av flödescytometri färgning signaler. (B) Altered gener grupperades i olika funktionella kluster och gen klustren är associerad med endocytic funktion och lipid metabolism visas. Röd: CD1d; Grön: Lamp1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Analys av cellulära bilder med programmet idéer. (A), monocyt-derived DCs från friska donatorer var för det första gated på HLA-DR + CD11c + celler och ytterligare gated på CD1d+Lamp1+ celler använder programmet idéer. (B) cellulär bilder utvanns från HLA-DR+CD11c+CD1d+Lamp1+ befolkningen för cellulära bild visualisering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Analys av cellulära bilder med programmet Fiji-ImageJ. Celler med stark samtidig fläck av CD1d och Lamp1 proteiner valdes slumpmässigt ut för bildanalys med hjälp av Fiji-ImageJ, men celler * med osynliga eller svag färgning för antingen CD1d eller Lamp1 protein uteslöts som i figur 2B. (A) dessa slumpmässigt utvalda cellular bilder var samlade i en enda bildfil som en indatabild. (B), colocalization analysen utfördes genom att fastställa colocalization trösklarna för både gröna och röda kanaler. Scatterplots genererades med tröskel beräkning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Colocalization av CD1d och lampa 1 proteiner. Använder liknande dataset rapporterade i Sharma o.a. 13, Co lokaliserade pixel intensitet mellan CD1d och Lamp1 proteiner från DCs BaP-exponerade och icke exponerade förhållanden var räknas om och visas med scatterplots (A). Manders koefficienter för CD1d och Lamp1 colocalization beräknades och visas med ett genomsnitt från markerade cellen bilder (B). Procentuella andelen Co lokaliserade pixel intensitet var också beräknat (C). Statistisk signifikans (n = 100, p < 0,001) erhölls med Student's t-test i jämförelse med icke-exponerade gruppen. Standardfel indikerades. Uppgifterna är från en analys med celler från friska donatorer. Två oberoende analyser utfördes med liknande resultat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Antikroppar | Fluorophores eller sekundär antikropp | Klon |
| HLA-DR | Fykoerytrin/cyanin 7 (PE/Cy7) | L243 |
| CD11c | Fykoerytrin/cyanin 5 (PE/Cy5) | 3.9 |
| CD1c | Lysande violett 421 | L161 |
| Renat anti-human CD1d | PE-anti-mus IgG2b | 51,1 |
| Lamp1 | Alexa Fluor 647 (AF647) | CD107a(H4A3) |
Tabell 1: antikroppar används i denna studie. På grund av delade excitation och utsläpp våglängder, fluorophores PE/Cy5 och AF647 delvis överlappade varandra på färgning signaler. Vi kan använda dessa fluorophores för att namnge en surface protein (CD11c) och en intracellulära protein (Lamp1) respektive för att undvika deras signal överlappande på subcellulär nivå. Vi använder också optimal titrering och ersättning för att minimera överlappade signalerna mellan båda fluorophores.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Funktionella bekräftelse av en förändrad gen-vägen är utmanande, på grund av allmänt påverkade genuttryck som involverar flera vägar och svårigheten att integrera enskilda och populational cellulära aktiviteter. Vi anställt imaging flödescytometri specifikt prov CD1d människohandel i endocytic fack. Imaging flödescytometri integrerar populational mätning av celler och enskilda demonstrationen av subcellulär colocalization av flera proteiner. Konfokalmikroskopi har tidigare gett hög upplösning mäta protein colocalization och flödescytometri kan erbjuda omfattande fenotypning för olika cellpopulationer. Imaging flödescytometri kombinerar fördelarna med konfokalmikroskopi och flödescytometri på acceptabel upplösning att analysera protein colocalization på en hög profil sätt för funktionella bekräftelse av transcriptomic ändring av miljömässiga föroreningar.
Analyser av colocalization av flera proteiner i en populational skala tekniskt krävande, eftersom (i) detaljerade analyser av flera enskilda celler är arbetsintensiva och relativt partisk; (ii) det är svårt att definiera en optimal tröskel för att tolka överlappande pixlar baserat på intensiteten eller område av positiv färgning; och (iii) balanserad observation av enskilda och populational celler är kritisk. I denna studie fokuserade vi på utför en biologiskt meningsfull observation, en statistisk signifikans test och en tänkbar demonstration av samtidig lokaliserade proteiner. För att uppnå detta mål, fått vi först tusentals bilder av mänskliga DCs använder imaging flödescytometri. Kvantitativa analyser av imaging filer kombineras en ljusa detalj likheten analys med hjälp av programvaran idéer och en statistiskt beprövade colocalization analys med Fiji-ImageJ. Programmet idéer tillåter gating Co färgade befolkningen, beräkna colocalization av två proteiner använda Pearsons korrelationskoefficient-baserade ljusa detalj likhet, och slumpmässigt välja Co färgade celler med subcellulär lokalisering av proteiner13. För att ytterligare uppnå biologisk relevanta demonstrationen av samtidig lokaliserade proteiner, vi använt ImageJ-Fiji programvara och tillämpas de Mander koefficient för att beräkna procentandelen av samtidig lokaliserade områden och överlappas pixel intensitet för att påvisa graden av CD1d lokalisering i endocytic väg.
Det kritiska steget för att använda programmet ImageJ-Fiji är att utföra enstaka cell imaging analys. Variant av procentandel protein colocalization från enskilda celler kan övervakas i jämförelse med visuellt sammanslagna färger från enstaka cell bilder. Genomsnitt i procent protein colocalization från alla 100 celler, kan medel och standardavvikelser beräknas för att demonstrera protein colocalization och funktionella korrelation på populational nivå. Bioinformatik analysen är enkel och okomplicerad utan om tvetydiga resultat, eftersom denna analys erbjuder en reproducerbar tröskel beräkning med den Costess metod för att producera samma resulterade tröskelvärden för samma datauppsättningar och liknande tröskelvärden för liknande datamängder26. Begränsning av denna teknik är den arbetsintensiva manuell inmatning av enstaka cell bilder och potentiellt subjektiva urval av visuellt samarbete färgade celler med hjälp av programmet idéer. I vår studie, analyserar vi 100 cell bilder från varje grupp och vi ställer reproducerbara urvalskriterier, inklusive starka Co färgade signaler och avmarkerar subcellulär lokalisering av CD1d och Lamp1 proteiner. Att övervinna dessa begränsningar kräver teknisk förbättring av analytisk programvara för att möjliggöra batch analys och objektiva urval av enstaka celler baserat på morfologiska egenskaper utöver färgning intensiteten som tillhandahålls av flödescytometri. I sammanfattning, kombinerade mobilnät och befolkningen kommer imaging analys ge mycket reproducerbara, omfattande, statistiskt beprövade och biologiskt relevanta resultat av procentandel protein colocalization. Vi anser att denna CD1d-Lamp1 colocalization analys kan fungera som ett lyckat exempel av hög profil cellular imaging analyser till svara på bredare frågor om funktionella och morfologisk förändring av cellulära proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja
Acknowledgments
Författarna tackar Robert Giulitto (Hoxworth blodcentralen) för humant blodprover och Dr Liang Niu för normalisering av genuttryck läser. Vi tackar också bevilja stöd från nationella Institute of Environmental Health Sciences (ES006096), centrum för miljö genetik (CEG) pilotprojekt (S.H.), nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar (AI115358) (S.H.), University of Cincinnati University Research Council award (S.H.) och universitetet i Cincinnati College av medicin Enhancement grundfinansiering (X. Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transcriptomics | Illumina | HiSeq 2500 v4 | Illumina HiSeq system |
| ImagingStream X | Millipore | 100220 | Imaging flow cytometry |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fisher | Total RNA extraction | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent | Total RNA QC analysis | |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher | PCR, enzyme reaction | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England Biolab | PolyA RNA purification | |
| Automated SMARTer Apollo system | Takara | PolyA RNA purification | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolab | Library preparation | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | DNA purification | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) | Thermo Fisher | Library quantification | |
| NEBNext Library Quant Kit | New England Biolab | Library quantification | |
| cBot | Illumina | Library cluster generation | |
| TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot – HS | Illumina | Library cluster generation | |
| HiSeq 1000 | Illumina | Sequencing | |
| TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles) | Illumina | Sequencing | |
| Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | Bio Legend | L243 | |
| Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | Bio Legend | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | Bio Legend | L161 | |
| PE-anti-mouse IgG2b | Bio Legend | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) | Bio Legend | CD107a(H4A3) |
References
- Roche, P. A., Cresswell, P. Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells. Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).
- Huang, S., et al. MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells. The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).
- Nakamura, N., et al. Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling. Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).
- Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P.
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Zajonc, D. M., Kronenberg, M. CD1 mediated T cell recognition of glycolipids. Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).
- Cox, D., et al. Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules. PloS one. 4 (5), e5325 (2009).
- Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments. Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).
- Huang, S., et al. Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).
- de Jong, A., et al. CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens. Nature. 15 (2), 177-185 (2014).
- Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Sharma, M., et al. Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants. Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).
- Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).
- Nachamkin, I., et al. Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene. Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).
- Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems. Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).
- Bauer-Mehren, A. Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape). Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).
- Cline, M. S., et al. Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape. Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).
- Huang, S., Moody, D. B. Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system. Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).
- Huang, S. Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis. Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).
- Moody, D. B., Porcelli, S. A. Intracellular pathways of CD1 antigen presentation. Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9 (7), 676-682 (2012).
- Diard, M., et al. Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype. Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Eliceiri, K. W., et al.
- Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).
