Summary
Stroom cytometry Imaging biedt een ideale aanpak voor het detecteren van de morfologische en functionele wijziging van cellen op individuele en populational niveau. Verstoorde endocytotische functie voor lipide antigeen presentatie in verontreinigende stoffen blootgesteld menselijke dendritische cellen werd aangetoond met een gecombineerde transcriptomic profilering van genexpressie en morfologische demonstratie van eiwit mensenhandel.
Abstract
Populational analyses van de morfologische en functionele wijziging van endocytotische eiwitten zijn uitdagend vanwege de vraag van Fotolader op een eencellige niveau en statistische beeldanalyse op een populational niveau. Om deze moeilijkheid te overwinnen, we gewend imaging stroom cytometry en transcriptomic (RNA-seq) profilering bepalen veranderde subcellular localisatie van het cluster van differentiatie 1d eiwit (CD1d) die zijn gekoppeld met verminderde endocytotische genexpressie in mens dendritische cellen (DC's), die werden blootgesteld aan de lipofiele common air pollutant benzo [a] pyreen. De colocalization van CD1d en endocytotische marker Lamp1 eiwitten uit duizenden cel beelden met imaging stroom cytometry werd geanalyseerd met behulp van ideeën en ImageJ-Fiji programma's. Talrijke cellulaire beelden met mede gekleurd CD1d en Lamp1 eiwitten waren gevisualiseerd na gating op CD1d+Lamp1+ DCs met behulp van ideeën. De verbeterde CD1d en Lamp1 colocalization bij BaP blootstelling werd verder aangetoond met behulp van thresholded scatterplots, getest met Mander de coëfficiënten voor co gelokaliseerde intensiteit, en uitgezet op basis van het percentage van de medefinanciering gelokaliseerde gebieden met behulp van ImageJ-Fiji. Onze gegevens geven een voordelige instrumentaal en bioinformatic aanpak voor het meten van eiwit colocalization zowel één als populational cellulaire niveau, ter ondersteuning van een verminderde functionele uitkomst van transcriptomic wijziging in verontreinigende stoffen blootgesteld mens DCs.
Introduction
Antigeen presentatie omvat normaliter intracellulaire eiwitten mensenhandel, die is vaak onderzocht met behulp van morfologische karakterisering en fenotypische profilering van antigeen presentatie van cellen1,2,3 . Om de voordelen van beeldvorming en fenotypering methoden te integreren, beschrijven we een imaging platform van de analyse op zowel eencellige als populatie aan te tonen een veranderd eiwit colocalization in menselijke dendritische cellen (DC's). In peptide-antigeen presentatie, grote histocompatibility complex (MHC) klasse I moleculen binden een korte peptide (8-10 residuen) in het endoplasmatisch reticulum te activeren van conventionele CD8+ T cellen, terwijl de MHC klasse II moleculen binden een relatief langere peptide (~ 20 residuen) in endocytotische compartimenten te activeren van conventionele CD4+ T cellen1,4. In tegenstelling, worden lipide-specifieke T-cellen geactiveerd door CD1 eiwitten met lipide antigenen geladen voornamelijk in endocytotische compartimenten5,6. Lipide antigeen presentatie bepaalt de levering van lipide metabolieten geproduceerd in8,9,10 , lipide metabolisme7,en het laden van functionele lipide metabolieten voor CD1 eiwitten in endocytotische compartimenten5,6. In dit verband zijn verschillende cellulaire factoren moduleren van lipide antigeen presentatie, met name in de milieublootstelling van lipofiele verontreinigende stoffen en immuun aandoeningen, cruciaal voor worden gedefinieerd. In deze studie, we gewend transcriptomic analyse, afbeelding profilering en cellulaire en populational imaging analyse van menselijke monocyt-afgeleide DCs bepalen de endocytotische eiwit mensenhandel bij te dragen aan lipide antigeen presentatie blootstelling van de verontreinigende stof. Zeker, dit gecombineerde platform kan worden toegepast op het bestuderen van eiwit subcellular mensenhandel en colocalization in verschillende biologische processen.
Eiwit subcellular localisatie bleek technisch, meestal met behulp van de confocal microscopie en statistisch geanalyseerd in een beperkt aantal gedetecteerde cellen1,,2,,3,11. Bovendien is cytometry van de stroom in grote lijnen toegepast op poort cel populaties met mede gebeitst signalen van meerdere eiwitten op een cellulair niveau12; echter, dit ontbreekt een gedetailleerde visualisatie van eiwit subcellular colocalization. Om uitgebreide en statistische analyses van percentage eiwit colocalization niveau van zowel de cellulaire en de bevolking, nemen we imaging profilering en analyse benaderingen om te bepalen van de kenmerken van eiwitten colocalization met biologische relevantie. Specifiek, we imaging stroom cytometry gebruiken voor het detecteren van de colocalization van CD1d en lysosomale-geassocieerde membraan eiwit 1 (Lamp1) eiwitten in deze studie. Kwantitatieve analyse van colocalized moleculen was eerder moeilijk op een populational schaal moet worden uitgevoerd. In deze studie aangepast we de ImageJ-Fiji-programma te onderzoeken het percentage eiwit colocalization met een groot aantal CO gekleurde cellen zowel populational als individuele cellulair niveau. Specifiek, we gemeten CO gelokaliseerde gebieden, intensiteit en populational grootte om de conclusie dat de CD1d proteïne was grotendeels bewaard in late endocytotische compartimenten van menselijke DCs blootstelling aan een lipofiele verontreinigende stof benzo [a] pyreen (BaP)13 te steunen . Deze gecombineerde cellulaire en bevolking imaging analyse zeer reproduceerbaar, uitgebreide en statistisch significante resultaten van CD1d-Lamp1 colocalization relevant zijn voor geremde lipide antigeen presentatie opgeleverd.
Transcriptome van BaP-blootgesteld menselijke DCs voorstander groot van de hypothese dat endocytotische lipide metabolisme en CD1d endocytotische handel in BaP blootstelling werden aangetast. Om te testen deze hypothese, pasten we imaging stroom cytometry om het profiel van de beelden van DC bevolking die samen met meerdere eiwitten met inbegrip van CD1d en endocytotische markeringen DC markeringen werden gekleurd. Ten slotte, mede gekleurde cellen zijn statistisch geanalyseerd om aan te tonen van het percentage van de intensiteit en gebieden van CD1d en Lamp1 colocalization.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menselijke protocollen in deze studie werden goedgekeurd door de institutionele Review Board van de University of Cincinnati en alle methoden werden uitgevoerd volgens de relevante richtlijnen en verordeningen. Bloedmonsters van gezonde donoren waren van de Hoxworth bloed Center aan de University of Cincinnati Medical Center.
1. Transcriptomic profilering van verontreinigende stoffen-blootgesteld menselijke monocyt-afgeleide DCs
- Totaal RNA extractie van BaP-blootgesteld DCs
- Onderscheiden van menselijke DCs met behulp van cytokines GM-CSF en IL-4, en bloot DCs aan BaP voor 4 dagen13.
- Sorteren van BaP-blootgesteld DCs met behulp van stroom cytometry op basis van de oppervlakte uitgedrukt markers (-Lineage HLA-DR+), waarvan het merendeel uit conventionele DCs bestaat (CD11c+CD1c+)13. Typisch, het sorteren van 10.000 DCs in kweekmedium dat 10% FBS, DCs Centrifugeer bij 600 x g- en 4 ° C voor 6 min, en onmiddellijk de bovendrijvende vloeistof verwijderen door aspiratie met behulp van een 1 mL pipet tip.
- Zodra het supernatant wordt verwijderd door aspiratie, lyse de cel pellet door 0.4 mL Lysis/bindende Buffer van het RNA isolatie kit voor opslag in-80 ° C vóór de RNA extractie toe te voegen.
- Gebruik de RNA isolatie kit met de totale RNA extractie protocol uitpakken van de totale RNA-14. Het meten van de RNA-integriteit met behulp van een Bioanalyzer15.
- Transcriptomic analyse van gesorteerde DCs (figuur 1A)
- De bibliotheek voorbereiden RNA-seq met behulp van een RNA bibliotheek voorbereiding kit. Kortom, het fragment van de geïsoleerde poly-A-RNA (~ 200 bp), omgekeerde transcriberen de fragmenten naar het 1e onderdeel van cDNA, en volg door het tweede onderdeel cDNA synthese aangeduid met dUTP.
- Dubbele streng cDNA aan de adapter met een stam-lusstructuur na zuivering van de kraal, eind-repareren en dA-tailing afbinden. Accijnzen de uracil-residuen in het 2e onderdeel van de lus van het cDNA en adapter met gebruiker (Uracil-specifieke excisie reagens) enzym te handhaven van de specificiteit van de strand en open de lus van de adapter voor PCR.
- 13 cycli van PCR met behulp van universele en index-specifieke primers te verrijken de geïndexeerde bibliotheek uit te voeren. Opruimen van de bibliotheek en draaien op een hoge gevoeligheid van Bioanalyzer DNA-chip te controleren van de kwaliteit van de bibliotheek en het formaat van de distributie.
- Gebruik een bibliotheek kwantificering kit en een real-time PCR-systeem gecombineerd met informatie over de bibliotheek voor het berekenen van bibliotheek concentratie via een standaard curve-methode.
- Proportioneel bundelen individueel geïndexeerde compatibel bibliotheken en aanpassen van de definitieve totale concentratie tot en met 15 pM. Het uitvoeren van bibliotheek cluster generatie en het volgnummer van de bibliotheek bij een instelling van één lezen 1 x 50 bp voor het genereren van 25 miljoen ~ leest per monster.
- Sequencing
- De volgorde en indexeren reagentia aan de SBS en PE reagens rekken, respectievelijk laden. Plaats de reagentia in een laboratorium-grade waterbad voor 1 h tot al het ijs is gesmolten en de reagentia in elke fles/buis goed zijn gemengd.
- Voorbereiden van de ICB-mix door de ontdooide enzym kleurstof en -20 ° C toe te voegen aan de fles en meng. Bereid een NaOH oplossing volgens de instructies van de sequencing. Plaats alle reagentia bij 4 ° C tot klaar voor gebruik.
- Tijdens de 1 h wachten periode, macht op de sequencer. Wacht voor het station van de DONOTEJECT weergegeven en de computer verbinding te maken met een netwerkstation.
- Start de sequencer controlesoftware.
- Bereiden van 2 L van onderhoud Wash oplossing 0,5% tween-20 en 0,03 bevat % ProClin 300 in laboratorium-grade water.
- In het SBS reagens rek, voeg toe ~ 100 mL onderhoud Wash oplossing aan elk van de 8 flessen en trechter schroefdeksels naar de flessen. In het PE reagens rek, Voeg ~ 12 mL onderhoud Wash oplossing aan elk van de tien 15 mL conische buisjes en negeren de caps.
- Laden van de twee rekken met de oplossing gevulde flessen/buizen naar de sequencer.
- De software van de controle van de sequencer, kies het onderhoud wassen; Volg de instructies op het scherm om het vloeibare systeem van sequencer schoon totdat het proces is voltooid.
- Nieuwe sessie starten in het "SEQUENCE" tabblad van de software; direct de uitvoergegevens naar een netwerkstation. Kies parameters voor één lezen 1 x 50 bp met enkele index multiplexed bibliotheken.
- Optioneel, log in op de BaseSpace volgorde Hub zodat de sequencing-status op afstand kan worden gecontroleerd via een computer of smartphone.
- Upload een monster blad voor demultiplexing en informeren van het reagens volgens de vereiste software.
- Laden van SBS en PE reagentia aan de sequencer. Prime het systeem met een gebruikte stroom cel (~ 15 min).
- Zodra de cluster-generatie is voltooid (~4.5 h), nemen de cel stroom, licht de stroom cel te spuiten met water en veeg het droog met behulp van lens papier. Licht de stroom cel spray met 95% ethanol en veeg het droog. Controleren tegen een licht om ervoor te zorgen dat het oppervlak schoon zonder vuil of zout residu is.
- Nadat de eerste stap is voltooid, de cel geclusterde stroom laden en start de sequencing. De sequentie analyse Viewer software zal automatisch worden gestart.
- Waken over de kwaliteit van de gegevens rangschikken via SAV met inbegrip van cluster dichtheid, leest pasfilter, cluster pass filter %, % ≥Q30, Legacy fase/profase %, QC, etc. die dit helpt om te begrijpen van de kwaliteit van de gegevens en het oplossen van problemen met indexeren.
- Wijzig de stroom cel pakking en uitvoeren van een onderhoud wassen nadat de sequencing is voltooid. De sequencer is klaar voor de volgende run.
- Bioinformatic analyse
- Bioinformatics RNA-seq data analyse13uit te voeren.
2. pathway analyse van Transcriptomic profielen (figuur 1B)
- Gebruik een edgeR Bioconductor te vergelijken van de graven van de intensiteit van resulterende gen expressie tussen BaP-blootgesteld en niet-blootgesteld DCs van drie donoren. Vervolgens identificeren differentially uitgedrukte genen tussen BaP-blootgesteld en niet-blootgesteld DCs gebaseerd op de absolute vouw verandering (> 2 plooien) en de valse ontdekking stem (FDR) - gecorrigeerde p- waarden (< 0,05).
- Te voorspellen de functionele clusters van differentially uitgedrukte genen, gebruik van het softwarepakket ToppCluster de veranderde genen tegen verschillende gegevensbanken, met inbegrip van KEGGEN en REACTOME zoeken en genereren van clustering gegevens. De hypergeometrische test van de ToppCluster wordt gebruikt om functionele verrijking via de gene lijst verrijking analyse16.
- Verdere inbreng de resultaten uit deze functie clusters Cytoscape17,18 versie 3.3.0, een over het algemeen gebruikte open source softwareplatform voor het visualiseren van complexe netwerken. Dus, de genen die betrokken zijn bij de verschillende clusters of paden, met inbegrip van endocytotische clusters en lipide metabolisme, worden weergegeven in een netwerk met aantekening van de kleur van de verandering van de gemiddelde vouw van gen expressie (figuur 1B)13.
3. beeldvorming Stroom Cytometry van CD1d en Lamp1 Colocalization
- Antilichaam labeling van BaP-blootgesteld DCs
- Bloot 0,5 x 106 menselijke DCs tot 5.94 mM BaP voor 4 dagen bij 37 ° C in 2 mL zuiver volledige Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium. DCs oogsten door centrifugeren bij 400 x g gedurende 10 min. blok, wordt het gedifferentieerde DCs door cellen met blocker van menselijk serum en anti-menselijke Fc receptor antistoffen voor 10 min in ijs, met inbegrip van anti-menselijke CD16, CD32 en CD64 antilichamen aan het broeden.
- Incubeer briljante Violet 421-anti-CD1c (L161), phycoerythrin/cyanine kleurstof 7 (PE/Cy7) - anti - HLA-DR, en PE/Cy5-anti-CD11c met DCs gedurende 20 min. in ijs. Tabel 1 geeft deze lijst van antilichamen.
- Herstellen van DCs met 4% paraformaldehyde in PBS en permeabilize hen met Permeabilization was Buffer. Uitvoeren van de intracellulaire kleuring met een mengsel van PE-geëtiketteerden gezuiverde anti-menselijke CD1d (51.1) en de Alexa Fluor 647-geëtiketteerden anti-Lamp1 (CD107a) (H4A3).
- Imaging stroom cytometry meting (Figuur 2)
- Analyseer de gebeitst monsters met behulp van een beeldvormende stroom cytometer de stroom cytometry kern van Cincinnati Kinderziekenhuis met behulp van een 40 X doelstelling opleveren van 300 pixels voor een cel met ongeveer 10 mm diameter. Één pixel grootte is ongeveer 0,5 mm door 0,5 mm van het object.
- Verwerven van 10.000 cellulaire beelden op onpartijdige wijze volgens de instructie van de fabrikant.
4. imaging Analyses van Stroom Cytometry beelden
- Colocalization analyse met behulp van ideeën software (Figuur 2)
- Uitvoeren van schadevergoeding met één gebeitste ten opzichte van niet-gekleurd monsters door het instellen van de intensiteit van de fluorescentie van niet-gekleurd monsters onder de drempel, met inbegrip van niet-gekleurd BaP-blootgesteld DCs met BaP autofluorescence, net als in de routine stroom cytometry gegevens analyse.
- Gate gekleurd cellen te verkrijgen van de deelverzamelingen van HLA-DR+CD11c+CD1d+Lamp1+ cellen (figuur 2A) en Toon cellulaire afbeeldingen in de gated deelverzamelingen (figuur 2B).
- Cel afbeeldingen opslaan in een png-indeling op basis van twee technische inclusie criteria, de visuele aanwezigheid van sterke mede gebeitst signalen en subcellular localisatie van CD1d en Lamp1 eiwitten, voor de analyses van de colocalization met behulp van ImageJ-Fiji (figuur 2B).
- Software ImageJ-Fiji gebruiken voor het uitvoeren van de analyse van de colocalization (Figuur 3).
- Bereid de bestanden voor de invoerafbeelding door de samenvoeging van de 100 beelden opgeslagen cel voor niet-blootgesteld en BaP-blootgesteld menselijke DCs, respectievelijk (figuur 3A).
- Analyseren van de CD1d (rood) en Lamp1 (groen) colocalization met behulp van een scatterplot.
- ImageJ-Fiji programma uitvoeren. Open het PNG-bestand met 100 beelden van de cel (figuur 3B en figuur 4A): "bestand | Open".
- De afbeelding met samengevoegde rode en groene kanalen splitsen in twee beelden met een rode of een groene kanaal: "afbeelding | Kleur | Kanalen splitsen".
- Tekenen van een scatterplot met behulp van de opdrachten "Analyze | Colocalization | Colocalization drempel". Sla de scatterplot met behulp van de "PrintScreen" -toets.
- Berekenen van Mander colocalization coëfficiënten voor elke één cellulaire afbeelding (n = 100) (figuur 4B)
- Selecteer een afbeelding van de eencellige op het afbeeldingsbestand met kanalen splitsen met behulp van de "ovale" gereedschap.
- Gebruik de opdrachten "Analyze | Colocalization | Colocalization drempel". Selecteer "Kanaal 1" in het dialoogvenster regio van belang (ROI). Houd alle Berekeningsopties met inbegrip van "Mander van met behulp van drempels" voor elke cel afbeelding.
- Herhaal deze berekening voor alle 100 cel afbeeldingen.
- Opslaan en openen van de resultaten met behulp van een werkblad.
- Uitzetten van de gemiddelden en de standaardfouten voor "Thresholded Mander de coëfficiënten" (n = 100, 0 betekent geen colocalization en 1 betekent perfect colocalization). Van de Student t-test gebruiken voor het berekenen van de p -waarde voor de vergelijking tussen de groepen van het BaP-blootgesteld en niet-blootgesteld (figuur 4B).
- Bereken het percentage van thresholded pixel intensiteit mede gelokaliseerd tussen CD1d en Lamp1 voor meerdere afbeeldingen van de cel (n = 100) (figuur 4C).
- Gebruik hetzelfde protocol analyse in 4.2.3 en bovendien selecteren de optie resultaat "% intensiteit boven drempel colocalized".
- Deze analyses samen met Mander van colocalization coëfficiënten uit te voeren.
- Ook de gemiddelde en standaardfouten voor % intensiteit colocalized tussen CD1d en Lamp1 worden uitgezet. Van de Student t-test gebruiken voor het berekenen van de p -waarde voor vergelijking tussen groepen van het BaP-blootgesteld en niet-blootgesteld (figuur 4C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De lipofiele verontreinigende stof BaP verandert endocytotische gene clusters in menselijke DCs. mens monocyt-afgeleide DCs van elke donor (n = 3) werden geïncubeerd met BaP en gesorteerd voor conventionele DCs, die verder voor RNA extractie en transcriptomic analyse gebruikt werden zoals beschreven . Bij de normalisatie van de genexpressie, werden veranderde genen tussen groepen BaP-blootgesteld en niet-blootgesteld geclusterd volgens de functionele correlatie van differentially uitgedrukte genen. Wij input van de lijst veranderde gen tot en met het Toppcluster programma16 voor de analyses van relevante cellulaire routes en uitvoeren van de statistische proef met behulp van een valse ontdekking tarief (FDR) correctie van p -waarden (figuur 1B). Verschillende belangrijke gewijzigde gene clusters, inclusief lipide metabolisme en endocytotische functies, werden geïdentificeerd in DCs BaP-blootgesteld. In deze studie, we specifiek gericht op de functionele test van endocytotische mensenhandel, omdat de CD1-gemedieerde antigeen presentatie is sterk afhankelijk van het lipide-antigeen laden in de endocytotische route5,19, 20,21.
CD1d endocytotische mensenhandel is aangetoond door middel van imaging cytometry van de stroom. Bij het verkrijgen van een groot aantal beelden van de cel met behulp van imaging stroom cytometry, zijn we begonnen met het programma ideeën visualiseren individuele cellulaire beelden via een gunstige gating cel populaties mede gekleurd met meerdere antilichamen (figuur 2A). Specifiek, konden we poort de grote DC bevolking mede gekleurd met HLA-DR en CD11c zodat de DCs met CD1d en Lamp1 co expressie (figuur 2A). Co gebeitst signalen kunnen worden verrijkt door het gating de celpopulatie met dubbele vlek van CD1d en Lamp1 (figuur 2A). Toonden we eerst de niet zichtbare normale DCs met minimale colocalization van CD1d en Lamp1 proteïnen, met vermelding van het basale niveau van CD1d endocytotische mensenhandel en hoog niveau van meningsuiting van de oppervlakte op fysiologische omstandigheden (figuur 2B)5, 19,20,21. Voor het meten van de colocalization van CD1d en Lamp1 eiwitten, we aanvankelijk gebruikt ideeën om te laten zien van een lichte verhoging van heldere detail gelijkenis tussen CD1d en Lamp1 eiwitten met BaP blootstelling13. De gelijkenis van de heldere detail was berekend op basis van van de Pearson correlatiecoëfficiënt voor het testen van de correlatie van twee factoren, terwijl CD1d en Lamp1 eiwitten onwaarschijnlijk sterk overlappen in fysiologische toestand waren, die aangeeft welk CD1d vermag Transient verkeer door laat endocytotische compartimenten voor functionele lipide antigenen. Het is dus meer biologisch zinvol om te testen of de CD1d proteïne in BaP blootstelling meer in de late endocytotische compartimenten, behoudt zoals blijkt uit het verhoogde percentage van overlappende CD1d en Lamp1 eiwitten met behulp van het imaging analyse software Fiji in de Pakket ImageJ. Behoud van de CD1d proteïne in late endocytotische compartimenten kan ten slotte worden gebruikt ter functioneel bevestiging veranderde endocytotische gene profielen in BaP blootstelling.
Co gelokaliseerde intensiteit en gebied tussen CD1d en Lamp1 eiwitten werd gemeten. Voor het verkrijgen van een reproduceerbare drempel worden ingesteld en percentages van mede gelokaliseerde gebieden en intensiteit, pasten we ImageJ-Fiji22, die ook is gebruikt in verschillende andere studies23,24,25. Selecteren we willekeurig CD1d+Lamp1+ cellen met sterke co vlek en duidelijk subcellular localisatie van CD1d en Lamp1 eiwitten als invoerafbeeldingen (figuur 2B). Individuele cellulaire beelden kunnen worden samengevoegd tot een enkel installatiekopiebestand dat voor één consistente analyse (figuur 3A). In onze studie, wij samengevoegd 100 beelden van de cel en opende het in het programma te analyseren door het instellen van de "colocalisation drempels" (figuur 3B). De colocalization van pixel intensiteit tussen de twee kanalen (PE-label CD1d en Lamp1 AF647-label) werd algemeen met een scatterplot getoond door het detecteren van de co gelokaliseerde pixels vanaf deze 100 cel beelden (figuur 4A). In dit perceel, horizontale en verticale lijnen vertegenwoordigen Costes de drempels en de diagonale lijnen geven de verhouding tussen de algemene pixel intensiteit tussen de twee kanalen. Van de Costes drempel biedt een zichtbaar setting voor het verwijderen van zwakke pixels van twee overlappende kanalen. Het resulteerde scatterplot geeft een verhoogde colocalization van CD1d en Lamp1 eiwitten in BaP blootstelling. Bovendien, gekwantificeerd we de graad van colocalization tussen CD1d en Lamp1 eiwitten met behulp van Mander de coëfficiënten (figuur 4B). Bijgevolg, Mander de coëfficiënten tonen verhoogde colocalization tussen CD1d en Lamp1 in de late endocytotische compartimenten van BaP-blootgesteld DCs vergelijken met niet zichtbare DCs, statistisch worden ondersteund door de Student t-tests (figuur 4B). Nochtans, als eiwit intensiteit heterogene tussen colocalized en niet-colocalized, colocalized intensiteit zullen ongeëvenaarde naar colocalized gebieden. Daarom ook moeten verdere examen de colocalization gebaseerd op intensiteit (figuur 4C). Dientengevolge, elke kolom vertegenwoordigt een gemiddelde berekening van het percentage van colocalized intensiteit van meerdere beelden van de cel (n = 100) tussen de voorwaarden voor een paar mede gelokaliseerde eiwitten BaP-blootgesteld en niet-blootgesteld. Van de student t-tests tonen ook statistische significantie (n = 100, p< 0.001) tussen BaP-blootgesteld en niet zichtbare groepen met aangegeven standaardfouten. Over het geheel genomen onze gegevens tonen aan dat de CD1d proteïne werd behouden in de late Endosomen BaP belichting, ondersteunen dat BaP-gewijzigd genexpressie verder tot de verminderde endocytotische functie en CD1d handel leidt.
Kortom verbetert CD1d-Lamp1 colocalization bij BaP blootstelling. Meerdere parameters gebaseerd op cel beelden (figuur 2B), met inbegrip van scatterplots met overlappende pixel intensiteit (figuur 4A), enhanced Mander de coëfficiënten (figuur 4B), en verhoogd percentage van overlappende intensiteit ( Figuur 4C), ondersteunen de endocytotische retentie CD1d bij BaP blootstelling. Dit colocalization analyse van cellulaire beelden is een nauwkeurige benadering bepalen de mate van eiwit-colocalization en tonen van biologische mechanismen van functies van de cel, bijvoorbeeld endocytotische functie consistent met verstoorde endocytotische gen expressie, verder bij te dragen tot de geremde activering van CD1d-beperkte T cellen13.
Figuur 1 : Perturbation van DC transcriptomes in BaP blootstelling (A) stroomdiagram van RNA-Seq. Eerst, kwaliteitscontrole (QC) analyse werd uitgevoerd om te controleren de kwaliteit van de totale RNA. Met behulp van een geautomatiseerd systeem en totaal RNA van hoge kwaliteit zoals invoer, poly-A RNA werd geïsoleerd, die aangetoond uitgeput rRNA poly-A RNA QC analyse. De poly-A-RNA werd vervolgens onderworpen aan automatische mediawisselaar voorbereiding en indexeren via PCR. De versterkte bibliotheek werd vervolgens geanalyseerd door een Bioanalyzer voor QC met een verwachte opbrengst en grootteverdeling. Na qPCR de kwantificering, geïndexeerde bibliotheken werden gebundeld en geclusterd naar stroom cel voor het rangschikken, en de kwaliteit van de gegevens rangschikken real-time werd gecontroleerd. De as vertegenwoordigt relatieve graven van stroom cytometry kleuring van signalen. (B) Altered genen werden ingedeeld in verschillende functionele clusters en de gene clusters endocytotische functie en lipide metabolisme zijn gekoppeld worden weergegeven. Rood: CD1d; Groen: Lamp1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Analyse van de cellulaire beelden met behulp van het programma ideeën. (A) monocyt-afgeleide DCs van gezonde donoren waren ten eerste gated op HLA-DR + CD11c + cellen en meer gated op CD1d+Lamp1+ cellen met behulp van het programma van de ideeën. (B) cellulaire beelden werden gehaald uit de HLA-DR+CD11c+CD1d+Lamp1+ bevolking voor cellulaire afbeelding visualisatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Analyse van de cellulaire beelden met behulp van het programma van de Fiji-ImageJ. Cellen met sterke co vlek van CD1d en Lamp1 eiwitten werden willekeurig geselecteerd voor de analyse van de afbeelding met behulp van Fiji-ImageJ, maar cellen * met onzichtbare of zwakke kleuring voor CD1d of Lamp1 eiwit werd uitgesloten zoals in figuur 2B. (A) deze willekeurig geselecteerde mobiele beelden werden samengevoegd tot een enkel installatiekopiebestand dat als een invoerafbeelding. (B) de colocalization analyse werd uitgevoerd door het opzetten van de drempels van de colocalization voor zowel groene en rode kanalen. De scatterplots werden gegenereerd met de berekening van de drempel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Colocalization van CD1d en Lamp 1 eiwitten. Met soortgelijke dataset gemeld in Sharma et al. 13, mede gelokaliseerde pixel intensiteit tussen CD1d en Lamp1 eiwitten van DCs bij BaP-blootgesteld en niet-blootgesteld omstandigheden werd herberekend en weergegeven met scatterplots (A). Mander de coëfficiënten voor CD1d en Lamp1 colocalization werden berekend en worden getoond met een gemiddelde van de geselecteerde cel afbeeldingen (B). Ook was het percentage mede gelokaliseerde pixel intensiteit berekende (C). Statistische significantie (n = 100, p < 0.001) werd verkregen met de Student t-tests in vergelijking met de groep niet-blootgesteld. Standaardfouten werden aangegeven. Gegevens zijn afkomstig van één assay met cellen van een gezonde donor. Twee onafhankelijke tests werden uitgevoerd met vergelijkbare resultaten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Antilichamen | Fluorophores of secundair antilichaam | Kloon |
| HLA-DR | Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | L243 |
| CD11c | Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | 3.9 |
| CD1c | Briljante violet 421 | L161 |
| Gezuiverde anti-menselijke CD1d | PE-anti-muis IgG2b | 51.1 |
| Lamp1 | Alexa Fluor 647 (AF647) | CD107a(H4A3) |
Tabel 1: antilichamen gebruikt in deze studie. Als gevolg van gedeelde excitatie en emissie golflengten overlapt fluorophores PE/Cy5 en AF647 gedeeltelijk bij kleuring van signalen. We gebruiken deze fluorophores aan het label van een oppervlakte-proteïne (CD11c) en een intracellulaire eiwitten (Lamp1) respectievelijk overlappende te vermijden hun signaal op een subcellular niveau. We gebruiken ook optimale titratie en compensatie om te minimaliseren van de overlappende signalen tussen beide fluorophores.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Functionele bevestiging van een veranderd gen-traject is uitdagend, vanwege sterk beïnvloed genexpressie waarbij meerdere trajecten en de moeilijkheid om individuele en populational cellulaire activiteiten te integreren. Wij werkzaam imaging stroom cytometry specifiek test CD1d mensenhandel endocytotische compartimenten. Stroom cytometry Imaging integreert de populational meting van cellen en de afzonderlijke demonstratie van subcellular colocalization van meerdere eiwitten. Confocale microscopie heeft eerder verstrekte hoge resolutie bij de waardering van de eiwit-colocalization, en stroom cytometry vermag bieden uitgebreide fenotypering voor andere cel populaties. Stroom cytometry imaging combineert de voordelen van de confocal microscopie en stroom cytometry op aanvaardbare beeldresolutie te analyseren van eiwit colocalization op een opvallende manier voor functionele bevestiging van wijziging van de transcriptomic door milieu verontreinigende stoffen.
Analyses van colocalization van meerdere eiwitten in een populational schaal zijn technisch veeleisende, omdat (i) analyses van meerdere afzonderlijke cellen gedetailleerde zijn arbeidsintensief en relatief vooringenomen; (ii) het is moeilijk te definiëren een optimale drempel voor het interpreteren van overlappende pixels op basis van de intensiteit of het gebied van positieve kleuring; en (iii) evenwichtige observatie van individuele en populational cellen is van cruciaal belang. In deze studie zijn we gericht op het uitvoeren van een biologisch zinvol waarneming, een statistische significantie-test en een imaging demonstratie van mede gelokaliseerde eiwitten. Om dit te bereiken, verkregen we eerst duizenden afbeeldingen van menselijke DCs met behulp van imaging cytometry van de stroom. Kwantitatieve analyses van imaging bestanden gecombineerd een heldere detail gelijkenis met behulp van de software ideeën en een statistisch geteste colocalization analyse met behulp van Fiji-ImageJ. Het programma ideeën kunt gating de mede gekleurde bevolking, berekening van colocalization van twee eiwitten met behulp van de Pearson correlatiecoëfficiënt gebaseerde heldere detail gelijkenis, en willekeurig selecteren co cellen met subcellular localisatie van gekleurd eiwitten13. Om verder de biologische relevante demonstratie van mede gelokaliseerde eiwitten, we ImageJ-Fiji software gebruikt en toegepast van de Mander coëfficiënt voor de berekening van het percentage van de medefinanciering gelokaliseerde gebieden en overlappende pixel intensiteit om aan te tonen de mate van De lokalisatie van de CD1d in de endocytotische route.
De kritieke stap voor het gebruik van het programma ImageJ-Fiji is het uitvoeren van eencellige imaging analyse. Variatie van het percentage eiwit colocalization van afzonderlijke cellen kan worden gecontroleerd in vergelijking met visueel samengevoegde kleuren van eencellige beelden. Het gemiddelde van het percentage eiwit colocalization uit alle 100 cellen, kan de middelen en de standaardfouten worden berekend om aan te tonen van eiwitten colocalization en functionele correlatie op een populational niveau. Deze analyse bioinformatica is eenvoudig en ongecompliceerd zonder dubbelzinnige resultaten, omdat deze analyse een reproduceerbare drempel-berekening biedt van de Costes methode voor de productie van hetzelfde resulteerde drempels voor de dezelfde gegevens en vergelijkbare drempelwaarden voor soortgelijke datasets26. De beperking van deze techniek is het arbeidsintensieve handmatige invoer van eencellige beelden en potentieel subjectieve selectie van visueel samen gekleurde cellen met behulp van de software van de ideeën. In onze studie, we analyseren 100 cel beelden uit elke groep en we reproduceerbare selectiecriteria, met inbegrip van sterke mede gebeitst signalen instellen en schakel subcellular localisatie van CD1d en Lamp1 eiwitten. Deze beperkingen overwinnen vereist technische verbetering van analytische software om batchanalyse en objectieve selectie van afzonderlijke cellen op basis van morfologische kenmerken buiten de kleuring intensiteit geboden door stroom cytometry. In samenvatting, gecombineerde cellulaire en bevolking bieden imaging analyse zeer reproduceerbaar, uitgebreide statistisch getest en biologisch relevante resultaten van percentage eiwit colocalization. Wij geloven dat deze CD1d-Lamp1 colocalization analyse kan dienen als een succesvol voorbeeld van hoog profiel cellulaire imaging analyses om bredere vragen op functionele en morfologische verandering van cellulaire eiwitten te beantwoorden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
De auteurs bedanken Robert Giulitto (Hoxworth bloed midden) voor menselijke bloedmonsters en Dr. Liang Niu voor de normalisatie van de genexpressie leest. Wij danken ook financiële steun van de National Institute of Environmental Health Sciences (ES006096), centrum voor milieu genetica (CEG) proefproject (S.H.), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (AI115358) (S.H.), Universiteit van Cincinnati University Research Council award (sh) en de Universiteit van Cincinnati College van geneeskunde Enhancement basisfinanciering (X. Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transcriptomics | Illumina | HiSeq 2500 v4 | Illumina HiSeq system |
| ImagingStream X | Millipore | 100220 | Imaging flow cytometry |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fisher | Total RNA extraction | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent | Total RNA QC analysis | |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher | PCR, enzyme reaction | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England Biolab | PolyA RNA purification | |
| Automated SMARTer Apollo system | Takara | PolyA RNA purification | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolab | Library preparation | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | DNA purification | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) | Thermo Fisher | Library quantification | |
| NEBNext Library Quant Kit | New England Biolab | Library quantification | |
| cBot | Illumina | Library cluster generation | |
| TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot – HS | Illumina | Library cluster generation | |
| HiSeq 1000 | Illumina | Sequencing | |
| TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles) | Illumina | Sequencing | |
| Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | Bio Legend | L243 | |
| Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | Bio Legend | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | Bio Legend | L161 | |
| PE-anti-mouse IgG2b | Bio Legend | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) | Bio Legend | CD107a(H4A3) |
References
- Roche, P. A., Cresswell, P. Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells. Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).
- Huang, S., et al. MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells. The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).
- Nakamura, N., et al. Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling. Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).
- Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P.
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Zajonc, D. M., Kronenberg, M. CD1 mediated T cell recognition of glycolipids. Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).
- Cox, D., et al. Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules. PloS one. 4 (5), e5325 (2009).
- Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments. Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).
- Huang, S., et al. Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).
- de Jong, A., et al. CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens. Nature. 15 (2), 177-185 (2014).
- Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Sharma, M., et al. Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants. Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).
- Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).
- Nachamkin, I., et al. Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene. Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).
- Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems. Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).
- Bauer-Mehren, A. Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape). Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).
- Cline, M. S., et al. Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape. Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).
- Huang, S., Moody, D. B. Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system. Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).
- Huang, S. Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis. Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).
- Moody, D. B., Porcelli, S. A. Intracellular pathways of CD1 antigen presentation. Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9 (7), 676-682 (2012).
- Diard, M., et al. Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype. Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Eliceiri, K. W., et al.
- Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).
