Summary
Cytometry 이미징 개인과 populational 수준에서 세포의 형태학 적 및 기능적 변경 감지 하는 이상적인 접근을 제공 합니다. 오염 물질에 노출 된 인간의 수지상 세포에 지질 항 원 프레 젠 테이 션에 대 한 방해 endocytic 기능 유전자 발현 및 단백질 매매의 형태학 데모의 프로 파일링 결합된 transcriptomic 시연 했다.
Abstract
Endocytic 단백질의 형태 및 기능 변경의 populational 분석은 이미지 캡처 populational 수준에서 단일 셀 수준 및 통계 이미지 분석에서의 수요로 인해 도전. 이 어려움을 극복 하기 위해 우리 사용 이미징 cytometry transcriptomic (RNA-seq)를 프로 파일링 관련 차별화 1 d 단백질 (CD1d)의 클러스터의 변경 된 subcellular 지역화가 결정을 인간에서 손상된 endocytic 유전자 발현과 닥터지 일반에 노출 된 수지상 세포 (DCs), 공기 오염 물질 benzo pyrene [a]. CD1d 셀 이미지 이미징 cytometry 점령의 수천에서 endocytic 마커 Lamp1 단백질의 colocalization 아이디어와 ImageJ 피지를 사용 하 여 분석 프로그램. CD1d에 게이팅 후 공동 스테인드 CD1d 및 Lamp1 단백질 많은 세포 이미지 시각화 했다+Lamp1+ Dc 아이디어를 사용 하 여. BaP 노출 했다 Mander의 계수 공동 지역화 된 강도를 테스트 하 고 플롯 thresholded scatterplots를 사용 하 여 입증 시 향상 된 CD1d 및 Lamp1 colocalization ImageJ 피지를 사용 하 여 공동 화 된 영역의 비율 기반으로 합니다. 우리의 데이터 오염 물질에 노출 된 인간의 transcriptomic 변경의 장애인된 기능 결과 지 원하는 단일 및 populational 세포 수준에서 단백질 colocalization를 측정 하는 유리 기 악 및 bioinformatic 접근 방식을 제공합니다 Dc입니다.
Introduction
프레 젠 테이 션 항 원 일반적으로 자주 조사 형태학 상 특성 및 phenotypic 항 원 제시 세포1,2,3의 프로 파일링을 사용 하 여, 세포내 단백질을 포함 . 이미징 및 형질 방법의 장점을 통합 하는 이미징 분석 플랫폼 단일 세포 및 인간 모 수석 세포 (DCs)에서 변경 된 단백질 colocalization를 보여 인구 수준에서 설명 합니다. 펩 티 드 항 원 프레 젠 테이 션에서 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC) 종류 I 분자 활성화 기존의 CD8 바인딩과 그물에 짧은 펩 티 드 (8-10 잔류물)을 바인딩할+ T 세포, MHC 종류 II 분자 바인딩 상대적으로 더 오래 동안 기존의 CD4 활성화 endocytic 구획에 있는 펩 티 드 (~ 20 잔류물)+ T 세포1,4. 반면, 지질 관련 T 세포 지질 항 원 endocytic 구획5,6에 주로 로드와 CD1 단백질에 의해 활성화 됩니다. 지질 항 원 프레 젠 테이 션에서 지질 물질 대사7,8,,910 와 로드에 CD1 단백질 기능 지질 대사 산물의 생산 지질 대사 산물의 공급 필요 endocytic 구획5,6. 이러한 맥락에서 변조 지질 항 원 프레 젠 테이 션, 질 성 오염 물질 및 면역 장애, 환경 노출에서 특히 다양 한 세포 요소는 정의할 수 중요 합니다. 이 연구에서 우리가 사용 transcriptomic 분석, 이미지 프로 파일링, 인간 monocyte 파생 된 Dc의 셀룰러 및 populational 이미징 분석 endocytic 단백질 오염 물질 노출에 지질 항 원 프레 젠 테이 션에 기여 매매 결정 하. 물론,이 결합 된 플랫폼 subcellular 단백질 매매 및 다른 생물학 과정에 colocalization를 공부 하 고 적용할 수 있습니다.
기술적으로, 단백질 subcellular 지 방화는 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 검색된 셀1,2,,311의 한정된 된 수에서 분석과 통계를 시연 일반적으로 했다. 또한, cytometry 광범위에 적용 된 세포 레벨12;에 여러 단백질의 공동 스테인드 신호 게이트 세포 인구 그러나,이 상세한 시각화 subcellular 단백질 colocalization의 부족. 휴대 및 인구 수준 비율 단백질 colocalization의 포괄적이 고 통계 분석을 달성 하기 위해 우리 이미징 생물학과 단백질 colocalization의 기능을 확인 하려면 프로 파일링 및 분석 접근 통합 관련성입니다. 특히, 우리를 사용 하 여 이미징 cytometry CD1d lysosomal 관련 막 단백질 1 (Lamp1)의 colocalization를 검출이 연구에서 단백질. Colocalized 분자의 정량 분석 populational 규모에서 이전 어려웠다. 이 연구에서 우리는 populational 및 개별 세포 수준에서 공동 스테인드 세포 수가 많은 단백질 colocalization의 비율을 조사 ImageJ 피지 프로그램 적응. 특히, 강도, 공동 화 된 지역과 CD1d 단백질 질 성 오염 물질 benzo [a] pyrene (BaP)13에 노출에 인간의 Dc의 늦은 endocytic 구획에 크게 유지 했다 결론을 지원 하기 위해 populational 크기 측정 . 이 결합 된 셀룰러 및 인구 분석 이미징 CD1d-Lamp1 colocalization 저해 지질 항 원 프레 젠 테이 션 관련의 높은 재현성, 포괄적인, 통계적으로 유의 한 결과 제공 합니다.
BaP에 노출 된 인간의 Dc transcriptome 강하게 endocytic 지질 대사 및 CD1d endocytic 밀매 BaP 노출에서 손상 했다 가설을 지원. 이 가설을 테스트 하기 위해 우리는 CD1d, endocytic 마커 및 DC 마커 포함 하는 여러 단백질으로 얼룩진 공동 했다 DC 인구의 이미지를 프로 파일링 하려면 이미징 cytometry 적용. 마지막으로, 공동 스테인드 셀 강도의 비율 및 CD1d 및 Lamp1 colocalization의 영역을 통계적으로 분석 되었다.
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Protocol
이 연구에서 인간의 프로토콜 신시내티 대학교의 기관 검토 위원회에 의해 승인 했다 및 모든 방법을 관련 지침 및 규정에 따라 수행 했다. 건강 한 기증자 로부터 혈액 샘플은 신시내티 대학 의료 센터에서 Hoxworth 혈액 센터에서 얻은 했다.
1. Transcriptomic 오염 물질에 노출 된 인간 Monocyte 파생 된 Dc의 프로 파일링
- BaP에 노출 된 Dc의 총 RNA 추출
- 인간의 Dc cytokines GM-CSF와 IL-4를 사용 하 여 차별화 하 고 BaP Dc 4 일13노출.
- BaP에 노출 된 Dc cytometry 표면 표현된 마커 (-계보 HLA-DR+)에 따라 기존 DCs의 구성의 대부분을 사용 하 여 정렬 (CD11c+CD1c+)13. 일반적으로 10%를 포함 하는 문화 매체로 10000 Dc 정렬 FBS, Dc 600 g x 6 분, 4 ° C에서 원심 및 포부 1 mL 피 펫 팁을 사용 하 여 여는 상쾌한을 즉시 제거.
- 일단은 상쾌한 포부에 의해 제거, RNA 격리 킷 RNA 추출 전에-80 ° C에 저장에서에서 세포/바인딩 버퍼의 0.4 mL를 추가 하 여 셀 펠 릿을 lyse.
- 총 RNA 추출 프로토콜 RNA 격리 키트를 사용 하 여 전체 RNA14추출. Bioanalyzer15를 사용 하 여 RNA 무결성을 측정 합니다.
- 정렬 된 Dc (그림 1A)의 Transcriptomic 분석
- RNA-seq RNA 라이브러리 준비 키트를 사용 하 여에 대 한 라이브러리를 준비 합니다. 간단히 말해서, 격리 된 폴 리 A RNA 조각 (~ 200 bp), 녹음, cDNA의 1 가닥을 조각 하 고 dUTP 표시 두 번째 가닥 cDNA 합성에 의해 따라.
- 비드 정화, 최종 수리 및 다 미행 후 줄기 루프 구조와 어댑터를 이중 가닥 cDNA를 선. 2 가닥 가닥 특이성을 유지 하 고 PCR 위한 어댑터 루프를 열고 사용자 (Uracil 전용 절단 시 약) 효소로 cDNA 및 어댑터 루프에서에서 uracil 잔류물 삭제하시오
- 인덱싱된 라이브러리를 풍부 하 게 보편적이 고 인덱스 전용 프라이 머를 사용 하 여 PCR의 13 주기를 수행 합니다. 라이브러리를 청소 하 고 라이브러리 품질을 확인 하 고 배포 크기를 Bioanalyzer DNA 높은 감도 칩에서 실행.
- 라이브러리 정량화 키트를 사용 하 고 실시간 PCR 시스템 결합 라이브러리 크기 정보 도서관 농도 를 통해 계산 하는 표준 곡선 방법.
- 비례적으로 개별적으로 인덱싱된 호환 라이브러리 수영장 하 고 15 최종 총 농도 조정 오후. 라이브러리 클러스터 생성을 수행 하 고 시퀀스 샘플 당 ~ 25 백만 읽기를 생성 하기 위해 단일 읽기 1 x 50 bp의 설정에서 라이브러리.
- 시퀀싱
- 시퀀싱 및 SBS와 PE 시 약 선반에 시 약을 각각 색인을 로드 합니다. 시 약 1 시간에 대 한 실험실 급 물 욕조에 모든 얼음이 녹아 때까지 놓고 각 병/튜브에 약 제대로 혼합 됩니다.
- 병 해 동된 염료와-20 ° C 효소를 추가 하 여 ICB 믹스를 준비 하 고 혼합. 시퀀싱의 지침에 따라 NaOH 솔루션을 준비 합니다. 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 모든 시 약을 배치 합니다.
- 1 시간 동안 전원 시퀀서에 대기 기간. DONOTEJECT 드라이브를 표시 하 고 네트워크 드라이브를 컴퓨터에 연결을 기다립니다.
- 시퀀서 제어 소프트웨어를 시작 합니다.
- ProClin 300에서 실험실 급 물 2 L 0.5% 트윈 20, 0.03% 포함 된 유지 관리 세척 솔루션의 준비.
- SBS 시 약 선반에 각 8 병, 그리고 병에 나사 깔때기 뚜껑의 정비 세척 솔루션의 ~ 100 mL를 추가 합니다. PE 시 약 선반에 10 15 mL 원뿔 튜브의 각 유지 관리 세척 솔루션의 ~ 12 mL을 추가 하 고 모자를 삭제 합니다.
- 시퀀서에 가득 솔루션 병/튜브와 함께 두 개의 선반을 로드 합니다.
- 시퀀서 제어 소프트웨어에서 선택 유지 관리 세척; 프로세스가 완료 될 때까지 시퀀서 유체 시스템을 청소 하려면 화면의 지침을 따릅니다.
- 소프트웨어;에서 "시퀀스" 탭에서 새로운 실행을 시작합니다 네트워크 드라이브에 출력 데이터를 직접. 단일 인덱스 멀티플렉스 라이브러리와 단일 읽기 1 x 50 bp에 대 한 매개 변수를 선택 합니다.
- 필요에 따라 로그인 BaseSpace 시퀀스 허브는 컴퓨터 또는 스마트 휴대 전화를 통해 시퀀싱 상태를 원격으로 모니터링할 수 있습니다.
- 샘플 시트를 디 멀티플렉싱에 대 한 업로드 하 고 소프트웨어 요구에 따라 시 약 정보를 제공.
- 시퀀서에 SBS와 PE 시 약을 로드 합니다. 프라임 시스템 사용된 흐름 셀 (~ 15 분).
- 클러스터 생성이 완료 되 면 (~4.5 h), 흐름 셀을 꺼내, 가볍게 닦아 렌즈 종이 사용 하 여 건조와 물, 흐름 셀을 스프레이. 가볍게 흐름 셀 95% 에탄올 스프레이 하 고 닦아 건조. 표면 파편 또는 소금 잔여물 없이 깨끗 한 있는지 확인 하는 빛에 대 한 확인 하십시오.
- 주요 단계를 완료 한 후 클러스터 된 흐름 셀을 로드 하 고 시퀀싱을 시작. 시퀀스 분석 뷰어 소프트웨어가 자동으로 시작 됩니다.
- SAV 클러스터 밀도, 읽기 패스 필터, 클러스터 패스 필터 %, ≥Q30%, 레거시 위상/의향 %, QC, 등 이 데이터 품질을 이해 하 고 문제를 해결 하는 데 도움이 인덱싱을 통해 시퀀싱 데이터 품질을 모니터링 합니다.
- 흐름 세포 가스 켓을 변경 하 고 시퀀싱을 완료 한 후 유지 관리 세척을 수행. 시퀀서는 다음 실행에 대 한 준비가 되었습니다.
- Bioinformatic 분석
- 생물 정보학 RNA-seq 데이터 분석13를 수행 합니다.
2. 경로 분석 Transcriptomic 프로필 (그림 1B)의
- 저 Bioconductor를 사용 하 여 결과 유전자 표현 강도 카운트 3 기증자 로부터 BaP 노출, 비 노출 Dc 사이 비교. 다음, 절대 배 변화에 따라 BaP 노출, 비 노출 Dc 사이 차동 표현한 유전자를 식별 (> 2 겹)과 거짓 발견 비율 (FDR)-조정된 p-값 (< 0.05).
- 차동의 기능 클러스터 예측 유전자 표현, ToppCluster 소프트웨어 패키지 KEGG 및 REACTOME를 포함 하 여 여러 데이터베이스에 대해 변경 된 유전자 검색 및 클러스터링 데이터 생성을 사용 하 여. ToppCluster 사용 초기 하 시험 유전자 목록 농축 분석16통해 기능 풍부 합니다.
- 또한 이러한 기능 클러스터에서 Cytoscape17,18 버전 3.3.0, 복잡 한 네트워크를 시각화에 대 한 광범위 하 게 사용 되는 오픈 소스 소프트웨어 플랫폼의 결과 입력 합니다. 따라서, 다른 클러스터 또는 경로 endocytic 클러스터 등 지질 대사에 관여 하는 유전자는 유전자 (그림 1B) 식13의 평균된 배 변경의 컬러 주석 사용 하 여 네트워크에 표시 됩니다.
3. 이미징 Cytometry CD1d 및 Lamp1 Colocalization
- 항 체는 BaP 노출 Dc의 라벨
- 완전 한 Dulbecco의 2 개 mL에서 37 ° C에서 4 일 동안 5.94 m m BaP에 노출 0.5 x 106 인간의 Dc 수정 독수리의 매체. 수확 Dc 10 분 블록에 대 한 400 x g에서 원심 분리 하 여 차별화 된 Dc 인간의 혈 청 차단기와 얼음, 안티-인간의 CD16, CD32, 및 CD64 항 체를 포함 하 여 10 분 동안 안티 인간 Fc 수용 체 항 체는 세포를 배양 하 여.
- 화려한 바이올렛 421-안티-CD1c (L161)를 품 어, phycoerythrin/cyanine 염색 7 (PE/Cy7)-안티-HLA-DR, 그리고 PE/Cy5-안티-CD11c 얼음에 20 분에 대 한 Dc와. 표 1 항 체의이 목록을 보여 줍니다.
- PBS에서 4 %paraformaldehyde Dc를 수정 하 고 Permeabilization 워시 버퍼 permeabilize. 알 렉 사 Fluor 647 표시 된 안티-Lamp1 (CD107a)와 PE 라는 순화 안티 인간 CD1d의 혼합물 (51.1) 얼룩이 지는 세포내 수행 (H4A3).
- 영상 교류 cytometry 측정 (그림 2)
- 약 10 m m 직경에 있는 셀에 대 한 300 픽셀을 40 X 목표를 사용 하 여 신시내티 아동 병원의 교류 cytometry 핵심 영상 교류 cytometer를 사용 하 여 스테인드 샘플을 분석 합니다. 1 픽셀 크기는 개체의 0.5 m m로 약 0.5 m m입니다.
- 제조업체의 지시에 따라 공평한 방식으로 10000 세포 이미지를 획득.
4. 영상 분석 흐름 Cytometry 이미지의
- Colocalization 분석 아이디어 소프트웨어 (그림 2)를 사용 하 여
- 수행과 보상 비 묻은 샘플 대 BaP autofluorescence, 일상적인 흐름 cytometry 데이터에서와 BaP 노출 Dc 스테인드 비를 포함 하 여 임계값 비 물 샘플의 형광 강도 설정 하 여 단일 스테인드 분석입니다.
- +CD1d HLA-DR+CD11c의 하위 집합을 얻기 위해 셀 스테인드 게이트+Lamp1+ 세포 (그림 2A)와 (그림 2B) 문이 하위 집합에 표시 세포 이미지.
- Png 형식 두 기술 포함 기준에 따라 강력한 공동 스테인드 신호의 시각적 존재와 ImageJ 피지 (그림 2B)를 사용 하 여 colocalization 분석 CD1d 및 Lamp1 단백질의 subcellular 지 방화 셀 이미지를 저장 합니다.
- 소프트웨어 ImageJ 피지를 사용 하 여 수행 하는 colocalization 분석 (그림 3).
- 비 노출 및 BaP에 노출 된 인간의 Dc에 대 한 각각 100 저장된 셀 이미지를 병합 하 여 입력된 이미지 파일 준비 (그림 3A).
- CD1d 분석 (빨강) 및 Lamp1 (그린) colocalization는 scatterplot를 사용 하 여.
- ImageJ 피지 프로그램을 실행 합니다. 100 셀 이미지 (그림 3B 와 그림 4A).png 파일을 열고: "파일 | 열기".
- 빨간색 또는 녹색 채널 두 이미지로 병합 된 빨간색과 녹색 채널 이미지를 분할: "이미지 | 컬러 | 채널 분할".
- 명령을 사용 하 여 scatterplot 그리기 "분석 | Colocalization | Colocalization 임계값". Scatterplot "PrintScreen" 키를 사용 하 여 저장 합니다.
- 각 단일 세포 이미지 Mander의 colocalization 계수를 계산 (n = 100) (그림 4B)
- 분할 채널 사용 하 여 이미지 파일에 이미지를 단일 셀을 선택 합니다 "타원형" 선택 도구.
- 명령을 사용 하 여 "분석 | Colocalization | Colocalization 임계값". 관심 (ROI) 영역 대화 상자에서 "채널 1"을 선택 합니다. 각 셀 이미지 "Mander의 사용 하 여 임계값"을 비롯 한 모든 계산 옵션을 유지 합니다.
- 모든 100 셀 이미지에 대 한이 계산을 반복 합니다.
- 저장 하 고 스프레드시트를 사용 하 여 결과 엽니다.
- 평균 및 표준 오류 "thresholded Mander의 계수" 플롯 (n = 100, 0은 아무 colocalization 및 1 의미 완벽 한 colocalization). 스튜던트 t-검정을 사용 하 여 BaP 노출, 비 노출 그룹 (그림 4B) 사이 비교에 대 한 p 값을 계산.
- Thresholded 픽셀 강도 공동 CD1d와 Lamp1 사이 여러 셀 이미지에 대 한 지역화의 %를 계산 (n = 100) (그림 4C).
- 4.2.3에 동일한 분석 프로토콜을 사용 하 고 또한 결과 옵션 "colocalized 임계값 % 강도"를선택 합니다.
- Mander의 colocalization 계수 함께이 분석을 수행 합니다.
- 마찬가지로 평균 및 표준 오류 CD1d와 Lamp1 사이 colocalized % 강도 플롯. 스튜던트 t-검정을 사용 하 여 BaP 노출, 비 노출 그룹 (그림 4C) 사이 비교에 대 한 p 값을 계산.
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Representative Results
질 성 오염 물질 BaP 변경 각 기증자 로부터 인간의 Dc. 인간의 monocyte 파생 된 Dc에서 endocytic 유전자 클러스터 (n = 3) BaP 함께 incubated 되었고 기존의 DCs, RNA 추출 및 분석용 transcriptomic 설명 된 대로 추가 사용에 대 한 정렬 . 유전자 발현의 정규화에 따라 BaP 노출, 비 노출 그룹 간의 변경된 유전자 차동 표현한 유전자의 기능 상관 관계에 따라 클러스터 했다. 우리는 Toppcluster 프로그램16 관련 세포 경로 분석에 대 한 변경 된 유전자 목록을 입력 하 고 p 값 (그림 1B)의 틀린 발견 비율 (FDR) 보정을 사용 하 여 통계 시험을 수행. 지질 대사 및 endocytic 기능을 포함 하 여 몇 가지 주요 변경된 유전자 클러스터 BaP 노출 Dc에서 발견 됐다. 이 연구에서 우리가 구체적으로에 초점을 맞춘 endocytic 인신 매매의 기능 테스트 CD1 중재 항 원 프레 젠 테이 션 endocytic 통로5,19, 에 지질 항 원에 매우 의존 하고있다 때문에 20,21.
CD1d endocytic 밀매 이미징 cytometry 사용 하 여 증명 됩니다. 셀 이미지 이미징 cytometry 사용의 많은 수를 취득, 우리 아이디어 프로그램을 사용 하 여 편리 하 게 공동 여러 항 체 (그림 2A)으로 물 세포 인구 게이팅을 통해 개별 세포 이미지를 시각화 하기 위해 시작 했다. 특히, 우리 문 주요 DC 인구 공동 HLA-DR 및 CD11c CD1d 및 Lamp1 공동 식 (그림 2A) DCs 추가 표시 물 수 있었다. 공동 스테인드 신호 CD1d 및 Lamp1의 두 배 얼룩과 셀 인구 게이팅을 통해 농축 될 수 있습니다 (그림 2A). 우리는 먼저 비공개 일반 Dc CD1d 및 Lamp1 단백질의 최소한의 colocalization와 CD1d endocytic 인신 매매의 기초 수준 및 생리 적 조건 (그림 2B)5, 표면 식의 높은 수준을 나타내는 보였다 19,,2021. CD1d 및 Lamp1 단백질의 colocalization를 측정 하기 위해 우리는 처음 BaP 노출13CD1d 및 Lamp1 단백질 사이 밝은 세부 유사성의 약간의 증가를 아이디어 사용. 밝은 세부 유사성 CD1d 및 Lamp1 단백질은 가능성이 높은 CD1d 수 나타내는 생리 적 조건에 겹쳐 두 요인의 상관 관계를 테스트 하기 위한 Pearson의 상관 계수를 기준으로 계산 했다 정도 늦은 endocytic 구획 기능 지질 항 원을 통해 트래픽을 합니다. 따라서, 그것은 더 생물학적으로 의미 있는 BaP 노출에서 CD1d 단백질 유지 더 늦은 endocytic 구획에에서 이미징 분석 소프트웨어 피지를 사용 하 여 겹친된 CD1d 및 Lamp1 단백질의 증가 비율에 의해 반영 되는지 테스트 하는 ImageJ 패키지입니다. 마지막으로, 늦은 endocytic 구획에 CD1d 단백질의 보존 BaP 노출 프로 파일 변경된 endocytic 유전자를 확인 하는 기능을 사용할 수 있습니다.
공동 화 된 강도와 CD1d 및 Lamp1 단백질 사이의 영역 측정 했다. 재현할 수 임계값 설정 및 공동 화 된 지역 및 강도 백분율을 얻으려면, 우리는 ImageJ 피지22를 또한 여러 가지 다른 연구23,,2425에 사용 되었습니다 적용. 우리는 무작위로 CD1d 선택+Lamp1+ 입력된 이미지 (그림 2B)로 CD1d 및 Lamp1 단백질의 subcellular 분명 지역화와 강한 공동 얼룩 세포. 개별 세포 이미지는 하나의 일관 된 분석 (그림 3A)에 대 한 단일 이미지 파일에 병합할 수 있습니다. 우리의 연구에서 우리는 100 셀 이미지를 병합 하 고 "colocalisation 임계값"을 설정 하 여 분석 하는 프로그램에서 열립니다 (그림 3B). 2 개의 채널 (PE 라는 CD1d 및 AF647 표시 Lamp1) 사이의 픽셀 강도의 colocalization이 100 셀 이미지 (그림 4A)에서 공동 화 된 픽셀을 감지 하 여 한 scatterplot와 전반적인 표시 했다. 이 음모에 가로 및 세로 라인 Costes의 임계값 나타내고 대각선 라인 두 채널 사이의 전체 픽셀 휘도의 비율을 나타냅니다. Costes의 임계값 두 개의 중첩된 채널에서 약한 픽셀을 제거에 대 한 표시 설정을 제공 합니다. 결과 scatterplot BaP 노출 CD1d 및 Lamp1 단백질의 증가 colocalization를 보여 줍니다. 또한, 우리 Mander의 계수 (그림 4B)를 사용 하 여 하는 CD1d 및 Lamp1 단백질 사이 colocalization의 정도 측정할. 따라서, Mander의 계수는 CD1d와 BaP 노출 Dc 통계적으로 학생의 t 시험 (그림 4B) 지원으로 비공개 Dc와 비교의 늦은 endocytic 구획에 Lamp1 사이 증가 colocalization를 보여 줍니다. 그러나, colocalized 및 colocalized 비 지역 사이 이종 단백질 강도 이면 colocalized 강도가 됩니다 colocalized 지역에 최고. 따라서, 그것은 또한 추가 시험 강도 (그림 4C) 기반으로 하는 colocalization 하는 데 필요한입니다. 결과적으로, 각 열 여러 셀 이미지에서 colocalized 강도의 비율의 평균된 계산을 나타냅니다 (n = 100) BaP 노출 비 노출 조건 공동 화 된 단백질의 쌍 사이. 학생의 t-테스트는 또한 통계적 의미를 표시 (n = 100, p< 0.001) 표시 된 표준 오류와 BaP 노출, 비 노출 그룹 사이. 모두, 우리의 데이터 CD1d 단백질 BaP 노출에서 늦은 endosomes에 유지 되었다, 손상 endocytic 기능과 CD1d 밀매에 리드는 BaP 변경 유전자 발현을 추가 지 원하는 보여 줍니다.
요약 하자면, CD1d-Lamp1 colocalization BaP 노출 시 향상 시킵니다. 여러 중첩된 픽셀 강도 (그림 4A), scatterplots를 포함 한 셀 이미지 (그림 2B)에 따라 Mander의 계수 (그림 4B), 향상 된 변수와 겹쳐 강도 ( 의 비율을 증가 그림 4C), BaP 노출에서 CD1d endocytic 보존을 지원. 세포질 이미지의이 colocalization 분석은 단백질 colocalization의 정도 확인 하 고 세포 기능의 생물 학적 메커니즘을 설명 하는 정확한 접근 등 endocytic 기능 방해 endocytic 유전자와 일치 식,13의 셀 추가 CD1d-제한 된 T의 저해 활성화에 기여 합니다.
그림 1 : DC transcriptomes BaP 노출에서의 섭 동 RNA-이의 (A) 순서도 첫째, 품질 관리 (QC) 분석 총 RNA의 품질 검사를 수행 했습니다. 자동화 시스템 및 높은-품질 총 RNA을 사용 하 여 입력, 폴 리 RNA 격리 되면서, 폴 리-RNA QC 분석에서 rRNA 고갈는 설명 했다. 폴 리 A RNA 자동화 라이브러리 높였을 다음 준비 및 PCR을 통해 인덱싱. 다음, 증폭된 라이브러리 예상된 생산량 및 크기 분포와 QC에 대 한 Bioanalyzer에 의해 분석 되었다. 정량 부 량, 후 인덱싱된 라이브러리 풀링된 시퀀싱, 흐름 셀에 클러스터이 고 시퀀싱 데이터 품질은 실시간 모니터링. 축은 cytometry 신호 얼룩의 상대적 수를 나타냅니다. (B) 변경 된 유전자는 서로 다른 기능 클러스터에서 분류 되었다 고 endocytic 기능과 지질 물질 대사와 관련 된 유전자 클러스터 표시 됩니다. 레드: CD1d; 그린: Lamp1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 아이디어 프로그램을 사용 하 여 셀룰러 이미지의 분석. (A) 건강 한에서 Dc Monocyte 파생 된 기증자 했다 첫째로 HLA에 문이-박사 + CD11c + 세포 및 추가에 문이 CD1d+Lamp1+ 아이디어 프로그램을 사용 하 여 셀. (B) 세포 이미지 HLA-DR+CD11c에서에서 추출한+CD1d+Lamp1+ 세포 이미지 시각화를 위한 인구. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 피지 ImageJ 프로그램을 사용 하 여 셀룰러 이미지의 분석. CD1d 및 Lamp1 단백질의 강력한 공동 얼룩과 셀이 피지 ImageJ를 사용 하 여 이미지 분석에 대 한 무작위로 선택 했다 하지만 셀 * 보이지 않는 또는 약한 CD1d 또는 Lamp1 단백질에 대 한 얼룩과 그림 2B에서 제외. (A)이 무작위로 선택 된 휴대 이미지 입력 이미지를 단일 이미지 파일에 조립 되었다. (B)는 colocalization 분석은 녹색 및 빨간색 채널 colocalization 임계값 설정을 통해 수행 되었다. 임계값 계산은 scatterplots 생성 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : CD1d 및 램프 1 단백질의 colocalization. Sharma 외 에 보고 비슷한 데이터 집합을 사용 하 여 13, BaP 노출 비 노출 조건에 DCs에서 CD1d 및 Lamp1 단백질 사이 공동 지역화 된 픽셀 강도 계산 되었고 scatterplots (A)와 함께 표시. Mander의 계수 CD1d 및 Lamp1 colocalization 계산 하 고 선택한 셀 이미지 (B)에서 평균 표시 됩니다. 공동 화 된 픽셀 휘도의 비율 또한 계산된 (C) 이었다. 통계적 의미 (n = 100, p < 0.001) 노출 되지 않은 그룹에 비해 학생의 t-테스트와 함께 취득 했다. 표준 오류를 표시 했다. 데이터 분석 한 결과에서 건강 한 기증자 로부터 세포와는. 두 개의 독립적인 분석 실험은 유사한 결과 수행 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 항 체 | Fluorophores 또는 이차 항 체 | 클론 |
| HLA-DR | Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | L243 |
| CD11c | Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | 3.9 |
| CD1c | 화려한 바이올렛 421 | L161 |
| 순화 안티 인간 CD1d | PE-안티-마우스 IgG2b | 51.1 |
| Lamp1 | 알 렉 사 Fluor 647 (AF647) | CD107a(H4A3) |
표 1:이 연구에 사용 된 항 체. 공유 여기 및 방출 파장, fluorophores PE/Cy5 및 AF647 부분적으로 겹쳐 신호를 얼룩이 지기에. 이러한 fluorophores subcellular 수준에서 표면 단백질 (CD11c)와 세포내 단백질 (Lamp1) 그들의 신호 중복을 피하려고 각각 레이블을 사용 합니다. 우리 또한 두 fluorophores 사이의 겹친된 신호를 최소화 하기 위해 최적의 적정 및 보상 사용 합니다.
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Discussion
변경 된 유전자 통로의 기능 확인 널리 영향 을된 유전자 발현 포함 여러 통로 개인과 populational 세포 활동을 통합 하는 데 어려움 때문에 도전적 이다. 우리는 특별히 테스트 CD1d endocytic 구획에 인신 매매를 이미징 cytometry 고용. Cytometry 이미징 셀의 populational 측정 및 여러 단백질의 subcellular colocalization의 개별 데모 통합 합니다. Confocal 현미경 검사 법은 이전 단백질 colocalization를 측정에 높은 해상도 제공 하 고 cytometry 다른 세포 인구에 대 한 포괄적인 형질을 제공할 수 있다. Confocal 현미경 검사 법 및 cytometry transcriptomic 변경의 기능 확인에 대 한 높은-프로 파일 방식으로 환경에 의해 단백질 colocalization 분석 하 허용 이미지 해상도 장점을 결합 cytometry 이미징 오염 물질입니다.
Populational 규모 있는 여러 단백질의 colocalization의 분석은 기술적으로 요구 하 고, 때문에 (i) 상세한 여러 개의 개별 셀의 분석은 노동 집약과 상대적으로 편견; (ii) 그것은 강도 또는 긍정적인 얼룩이 지기;의 영역 중첩된 픽셀을 해석 하기 위한 최적의 임계값을 정의 하기 어려운 그리고 (iii) 개인 및 populational 셀의 균형 잡힌된 관찰이 중요. 이 연구에서 우리는 생물학적으로 의미 있는 관찰, 통계적 의미 테스트 및 공동 화 된 단백질의 이미징 데모 수행에 집중 했다. 이 목표를 달성 하기 위해 우리가 먼저 획득 인간의 Dc의 이미지의 수천 이미징 cytometry 사용 하 여 이미지 파일의 정량 분석 소프트웨어 아이디어를 사용 하 여 밝은 세부 유사성 분석 및 통계적 테스트 colocalization 분석 피지 ImageJ를 사용 하 여 결합. 아이디어 프로그램 게이팅 공동 스테인드 인구, 피어슨의 상관 계수 기반 밝은 세부 유사성을 사용 하 여 두 단백질의 colocalization를 계산 하는 것을 허용 한다. 그리고 공동의 subcellular 지 방화 된 셀 스테인드 임의로 선택 단백질13. 더 달성 하기 위해 공동 화 된 단백질의 생물 학적 관련 데모, 우리 ImageJ 피지 소프트웨어를 사용 및 적용 Mander의 계수 공동 화 된 분야의 비율을 계산 하 고 중첩의 정도 설명 하기 위해 픽셀 강도 CD1d 지역화 endocytic 통로.
ImageJ 피지 프로그램을 사용 하기 위한 중요 한 단계 단일 셀 이미징 분석을 수행 하는 것입니다. 시각적으로 병합 된 단일 셀 이미지 색상에 비해 개별 셀에서 백분율 단백질 colocalization의 변화를 모니터링할 수 있습니다. 모든 100 셀에서 백분율 단백질 colocalization를 평균 하 여 populational 수준에서 단백질 colocalization 및 기능을 보여 주기 위해 수단 및 표준 오류를 계산할 수 있습니다. 이 생물 정보학 분석은 간단 하 고이 분석 제공 재현할 수 임계값 계산 하기 때문에 모호한 결과 관하지 없이 간단 같은 생산 Costes의 메서드를 사용 하 여 동일한 데이터 집합에 대 한 임계값 결과 및 유사한 데이터 집합26하는 유사한 임계값 이 기술의 한계는 단일 셀 이미지의 노동 집약적인 수동 입력 및 아이디어 소프트웨어를 사용 하 여 시각적으로 공동 스테인드 셀의 잠재적으로 주관적인 선택 이다. 우리의 연구에서 각 그룹에서 100 셀 이미지 분석 하 고 재현할 수 선택 기준, 강한 공동 스테인드 신호를 포함 하 여 설정 CD1d 및 Lamp1 단백질의 subcellular 지 방화의 선택을 취소. 이러한 한계를 극복 일괄 처리 분석 수 있도록 분석 소프트웨어의 기술 향상 및 cytometry 제공한 착 강도 넘어 형태학 기능에 따라 단일 셀의 객관적인 선택이 필요 합니다. 요약, 결합 셀룰러 및 인구에서 이미징 분석 백분율 단백질 colocalization의 높은 재현성, 포괄적인, 통계적으로 시험 하는 그리고 생물학으로 관련 된 결과 제공할 것입니다. 우리는이 CD1d-Lamp1 colocalization 분석 세포 단백질의 기능과 형태 변경에 광범위 한 질문에 대답을 높은 프로필 세포 이미징 분석의 성공적인 예로 사용할 수 있습니다 믿습니다.
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Disclosures
저자 공개할 게 없다
Acknowledgments
저자는 인간의 혈액 샘플에 대 한 로버트 Giulitto (Hoxworth 혈액 센터) 감사 및 유전자 발현의 정규화에 대 한 박사 Liang Niu 읽습니다. 우리는 또한 보조금 지원에서 국립 연구소의 환경 건강 과학 (ES006096) 감사, 환경 유전학 (CEG) 파일럿 프로젝트 (상훈), 알레르기 국립 연구소와 전염병 (AI115358)를 위한 센터 (상훈)의 대학 신시내티 대학 연구 위원회 포상 (상훈), 그리고 대학의 신시내티 대학의 약 코어 향상 자금 (X. Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transcriptomics | Illumina | HiSeq 2500 v4 | Illumina HiSeq system |
| ImagingStream X | Millipore | 100220 | Imaging flow cytometry |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fisher | Total RNA extraction | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent | Total RNA QC analysis | |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher | PCR, enzyme reaction | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England Biolab | PolyA RNA purification | |
| Automated SMARTer Apollo system | Takara | PolyA RNA purification | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolab | Library preparation | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | DNA purification | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) | Thermo Fisher | Library quantification | |
| NEBNext Library Quant Kit | New England Biolab | Library quantification | |
| cBot | Illumina | Library cluster generation | |
| TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot – HS | Illumina | Library cluster generation | |
| HiSeq 1000 | Illumina | Sequencing | |
| TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles) | Illumina | Sequencing | |
| Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | Bio Legend | L243 | |
| Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | Bio Legend | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | Bio Legend | L161 | |
| PE-anti-mouse IgG2b | Bio Legend | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) | Bio Legend | CD107a(H4A3) |
References
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