Summary
Citometria a flusso di imaging fornisce un approccio ideale per rilevare l'alterazione morfologica e funzionale delle cellule a livello individuale e popolazionale. Funzione endocitico interrotte per la presentazione dell'antigene del lipido in cellule dendritiche umane esposti a inquinanti è stata dimostrata con un' Transcrittomica combinato del profilo di espressione genica e morfologiche dimostrazione di traffico della proteina.
Abstract
Popolazionale analisi dell'alterazione morfologica e funzionale delle proteine endocitiche sono difficili a causa della richiesta di acquisizione di immagini ad un'analisi di livello e Statistiche immagine singola cella a livello popolazionale. Per superare questa difficoltà, abbiamo usato imaging citometria a flusso e trascrittomica profilatura (RNA-seq) per determinare alterata localizzazione subcellulare del cluster di differenziazione 1d proteina (CD1d) connessa con l'espressione di gene endocitico compromessa in umani le cellule dendritiche (DCs), che sono stati esposti al comune lipofilico aria inquinante benzo pirene [a]. La colocalizzazione di CD1d e proteine endocitiche marker Lamp1 da migliaia di cellule immagini catturate con imaging citometria a flusso è stata analizzata utilizzando idee e ImageJ-Fiji programmi. Numerose immagini cellulare con co-macchiato CD1d e Lamp1 proteine sono state visualizzate dopo gating su CD1d+Lamp1+ DCs utilizzando idee. La colocalizzazione di CD1d e Lamp1 avanzata su BaP esposizione è stata ulteriormente dimostrata utilizzando con soglia scatterplot, testato con coefficienti di Mander per intensità co-localizzati e tracciati basato sulla percentuale di aree co-localizzate utilizzando ImageJ-Fiji. I nostri dati forniscono un approccio strumentale e bioinformatica vantaggioso per misurare la colocalizzazione di proteina a livello cellulare sia singolo che popolazionale, sostenendo un risultato funzionale alterato di trascrittomica alterazione in umani esposti a inquinanti Controller di dominio.
Introduction
Presentazione dell'antigene coinvolge tipicamente la proteina intracellulare di traffico, che è stato spesso studiata mediante caratterizzazione morfologica e profilatura fenotipica dell'antigene che presenta le cellule1,2,3 . Per integrare i vantaggi dell'imaging e metodi phenotyping, descriviamo una imaging piattaforma di analisi a livello di popolazione per dimostrare una colocalizzazione di proteina alterata in cellule dendritiche (DCs) e singola cella. Nella presentazione dell'antigene del peptide, complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe I molecole legare un peptide breve (8-10 residui) nel reticolo endoplasmatico per attivare CD8 convenzionale+ T cellule, mentre le molecole di MHC classe II legano una relativamente più lungo peptide (~ 20 residui) in compartimenti endocitosi per attivare convenzionale CD4 cellule+ T1,4. Al contrario, le cellule T del lipido-specifiche vengono attivate dalle proteine CD1 con antigeni lipidici caricati principalmente in compartimenti endocitico5,6. Presentazione dell'antigene del lipido richiede la fornitura dei metaboliti lipidici prodotti nel metabolismo dei lipidi7,8,9,10 e il caricamento dei metaboliti lipidici funzionale alle proteine CD1 in compartimenti endocitico5,6. In questo contesto, vari fattori cellulari modulando la presentazione dell'antigene del lipido, specialmente in esposizione ambientale delle sostanze inquinanti lipofilici e disturbi del sistema immunitario, sono fondamentali per essere definito. In questo studio, abbiamo usato analisi trascrittomica, immagine di profilatura e analisi di imaging cellulare e popolazionali di DCs monocito-derivato umano per determinare il traffico di proteine endocitiche contribuendo alla presentazione dell'antigene del lipido in esposizione della sostanza inquinante. Certamente, questa piattaforma combinata può essere applicata a studiare traffico sottocellulare della proteina e la colocalizzazione in diversi processi biologici.
Tecnicamente, la localizzazione sottocellulare della proteina solitamente è stata dimostrata usando la microscopia confocal e analizzati statisticamente in un numero limitato di cellule rilevato1,2,3,11. Inoltre, citometria a flusso è stato ampiamente applicato a popolazioni di cellule di cancello con segnali co-macchiati delle proteine multiple a un livello cellulare12; Tuttavia, questo non dispone di una visualizzazione dettagliata di colocalizzazione subcellulare della proteina. Per ottenere analisi complete e statistiche di colocalizzazione di proteina percentuale a livello cellulare e popolazione, incorporiamo approcci di profilatura e di analisi per determinare le caratteristiche di colocalizzazione di proteina con biologico di imaging rilevanza. In particolare, utilizziamo imaging citometria a flusso per rilevare la colocalizzazione di CD1d e proteine di membrana lisosomiale-collegata 1 (Lamp1) proteine in questo studio. Analisi quantitativa delle molecole colocalized era precedentemente difficile da eseguirsi alla scala popolazionale. In questo studio, abbiamo adattato il programma ImageJ-Fiji per esaminare la percentuale di colocalizzazione di proteine con un gran numero di cellule co-marcate a livello cellulare sia popolazionale e individuali. In particolare, abbiamo misurato zone co-localizzate, intensità e dimensione popolazionale a sostegno della conclusione che la proteina CD1d in gran parte è stata conservata in compartimenti tardi endocitosi di DCs umano nell'esposizione a un inquinante lipofilico benzo [a] pirene (BaP)13 . Questa popolazione analisi di imaging e combinato cellulare fornito risultati altamente riproducibili, completi e statisticamente significative di CD1d-Lamp1 colocalizzazione pertinenti alla presentazione dell'antigene lipidica inibita.
Il trascrittoma di BaP-esposti umano DCs fortemente sostenuto l'ipotesi che il metabolismo lipidico endocitosi e CD1d endocitico traffico sono stati alterati in BaP esposizione. Per verificare questa ipotesi, abbiamo applicato imaging flusso cytometry per profilare le immagini della popolazione DC che co-sono state macchiate con più proteine tra cui CD1d, endocitosi marcatori e DC. Infine, le cellule co-macchiate sono state analizzate statisticamente per dimostrare la percentuale di intensità e aree di colocalizzazione CD1d e Lamp1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protocolli di umani in questo studio sono stati approvati dalla Institutional Review Board dell'Università di Cincinnati e tutti i metodi sono stati eseguiti in conformità con le direttive e i regolamenti. I campioni di sangue da donatori sani sono stati ottenuti dal centro di sangue Hoxworth presso l'Università di Cincinnati Medical Center.
1. Transcrittomica profilatura di esposti a inquinanti umano DCs monocito-derivato
- Estrazione di RNA totale dei DCs BaP-esposti
- Differenziare umano DCs tramite citochine GM-CSF e IL-4 ed esporre DCs per BaP per 4 giorni13.
- Ordinare DCs BaP-esposti mediante citometria a flusso basato sui marcatori di superficie espressi (lignaggio–HLA-DR+), la maggioranza dei quali è costituito da DCs convenzionali (CD11c+CD1c+)13. In genere, ordinare 10.000 DCs in mezzo di coltura contenente 10% FBS, centrifugare DCs a 600 x g e a 4 ° C per 6 minuti e immediatamente eliminare il surnatante tramite aspirazione usando la punta di una pipetta da 1 mL.
- Una volta che il surnatante viene rimosso mediante aspirazione, lisare il pellet cellulare aggiungendo 0,4 mL di tampone di lisi/associazione dal kit di isolamento del RNA per la conservazione a-80 ° C prima dell'estrazione di RNA.
- Utilizzare il kit di isolamento del RNA con il protocollo di estrazione di RNA totale per estrarre l' RNA totale14. Misurare l'integrità di RNA usando un Bioanalyzer15.
- Analisi trascrittomica di ordinato DCs (Figura 1A)
- Preparare la libreria per RNA-seq utilizzando un kit di preparazione di RNA biblioteca. In breve, frammento isolato RNA poli-A (~ 200 bp), inversione trascrivere i frammenti al 1 ° filone del cDNA e seguire la seconda sintesi del cDNA filo etichettata con dUTP.
- Lega i doppio filamento cDNA per l'adattatore con una struttura del gambo-ciclo dopo purificazione perlina, fine-riparazione e dA-tailing. Asportare i residui di uracile nel filo del 2 ° del ciclo del cDNA e adattatore con enzima utente (uracile-specifica l'asportazione reagente) per mantenere la specificità di strand e aprire l'anello adattatore per PCR.
- Eseguire 13 cicli di PCR utilizzando primers universali e indice specifico per arricchire la libreria indicizzata. Ripulire la libreria ed eseguire su un chip Bioanalyzer DNA ad alta sensibilità per controllare la qualità di raccolta e distribuzione dimensione.
- Utilizzare un kit di quantificazione di libreria e un sistema PCR in tempo reale combinata con informazioni sulle dimensioni di libreria per calcolare concentrazione libreria tramite un metodo di curva standard.
- Proporzionalmente piscina individualmente indicizzate librerie compatibili e regolare la concentrazione totale finale a 15 pM. Eseguire la generazione di cluster di biblioteca e la libreria in un'impostazione di lettura singola 1 x 50 bp per generare letture 25 milioni per campione di sequenza.
- Sequenziamento
- Caricare il sequenziamento e l'indicizzazione di reagenti per i rack di reagente SBS e PE, rispettivamente. Porre i reagenti in un bagno di acqua di laboratorio-grado per 1 h fino a quando tutto il ghiaccio si è sciolto e i reagenti in ogni bottiglia/tubo sono miscelati correttamente.
- Preparare la miscela ICB aggiungendo l'enzima scongelato, colorante e -20 ° C alla bottiglia e mescolare. Preparare una soluzione di NaOH secondo le istruzioni di sequenziamento. Posizionare tutti i reagenti a 4 ° C fino all'uso.
- Durante la 1 h potenza del sequenziatore di periodo, di attesa. Attendere che l'unità DONOTEJECT a comparire e collegare il computer a un'unità di rete.
- Avviare il software di controllo di sequencer.
- Preparare 2 L di soluzione di lavaggio di manutenzione che contiene 0,5% Tween 20 e 0,03% ProClin 300 in laboratorio-grado acqua.
- Nel rack reagente SBS, aggiungere ~ 100 mL di soluzione di lavaggio di manutenzione per ciascuna delle 8 bottiglie e tappi a vite imbuto per le bottiglie. Nel rack PE reagente, aggiungere ~ 12 mL di soluzione di lavaggio di manutenzione a ciascuno dei dieci provette coniche da 15 mL e gettare i tappi.
- Caricare due cesti con il soluzione riempito bottiglie/tubi per il sequencer.
- Il software di controllo di sequencer, scegliere il lavaggio di manutenzione; seguire le istruzioni sullo schermo per pulire il sistema fluido di sequencer, fino a quando il processo è completato.
- Avviare una nuova esecuzione nella scheda "Sequenza" dal software; dirigere l'output dei dati su un'unità di rete. Scegliere i parametri per la singola lettura 1 x 50 bp con unico indice multiplexata librerie.
- Facoltativamente, accedere all'hub di sequenza di BaseSpace modo che lo stato di ordinamento può essere monitorato da remoto tramite un computer o smart phone.
- Caricare un foglio di esempio per demiscelare e forniscono informazioni di reagente secondo il requisito del software.
- Caricare i reagenti SBS e PE per il sequencer. Preparare il sistema con una cella di flusso utilizzati (~ 15 min).
- Una volta completata la generazione di cluster (~4.5 h), togliere la cella di flusso, leggermente spruzzare la cella di flusso con acqua e pulire asciugare con carta per lenti. Leggermente spruzzare la cella di flusso con etanolo al 95% e asciugarlo. Verifica contro una luce per assicurarsi che la superficie sia pulita senza detriti o residui di sale.
- Una volta completata la fase di primo, caricare la cella di flusso in cluster e avviare il sequenziamento. Verrà avviato automaticamente il software del Visualizzatore di analisi di sequenza.
- Monitorare la qualità dei dati di sequenziamento tramite SAV compreso densità di cluster, filtro passa letture, cluster pass filtro %, ≥Q30%, % di fase/profase Legacy, QC, ecc. , che questo aiuta a capire la qualità dei dati e risolvere i problemi di indicizzazione.
- Cambiare la guarnizione di cella di flusso ed eseguire un lavaggio di manutenzione dopo aver completato il sequenziamento. Il sequencer è pronto per la prossima corsa.
- Analisi bioinformatica
- Eseguire bioinformatica RNA-seq dati analisi13.
2. percorso analisi dei profili di trascrittomica (Figura 1B)
- Utilizzare un edgeR Bioconductor per confrontare risultante gene espressione intensità conteggi tra controller di dominio BaP-esposti e non esposti da tre donatori. Quindi, identificare geni differenzialmente espressi tra BaP-esposti e non esposti DCs basata sul cambiamento assoluto piega (> 2 pieghe) e la falsa scoperta valuta i valori (FDR) - regolato p-(< 0.05).
- Per predire i gruppi funzionali di differenzialmente espressi geni, utilizzare il pacchetto di software ToppCluster per cercare i geni alterati contro diversi database compresi KEGG e REACTOME e generare dati di clustering. ToppCluster utilizza il test ipergeometrica per ottenere arricchimento funzionale tramite il gene elenco arricchimento analisi16.
- Ulteriore contributo i risultati da questi ammassi di funzione a Cytoscape17,18 versione 3.3.0, una piattaforma di software ampiamente usato open source per la visualizzazione di reti complesse. Così, i geni coinvolti in diversi cluster o vie, compreso i cluster di endocitosi e metabolismo dei lipidi, sono mostrati in una rete con annotazione di colore del cambiamento piega media del gene expression (Figura 1B)13.
3. flusso Cytometry di CD1d e Lamp1 colocalizzazione di imaging
- Anticorpo di etichettatura di BaP-esposti DCs
- Expose 0,5 x 106 umano DCs a 5,94 mM BaP per 4 giorni a 37 ° C in 2 mL di Dulbecco completa Medium dell'Aquila per volta. Vendemmia DCs mediante centrifugazione a 400 x g per 10 min. blocco il DCs differenziato incubando le cellule con siero umano blocker e anticorpi del ricevitore di Fc anti-umani per 10 min in ghiaccio, tra cui anticorpi anti-umani CD16, CD32 e CD64.
- Incubare viola brillante 421-anti-CD1c (L161), ficoeritrina/cianina tingere 7 (PE/Cy7) - anti - HLA-DR e PE/Cy5-anti-CD11c con DCs per 20 min in ghiaccio. La tabella 1 Mostra l'elenco degli anticorpi.
- Difficoltà DCs con paraformaldeide al 4% in PBS e li permeabilize con tampone di lavaggio di permeabilizzazione. Eseguire la colorazione intracellulare con una miscela di PE-labeled purificato anti-umano CD1d (51,1) e Alexa Fluor 647-etichetta anti-Lamp1 (CD107a) (H4A3).
- Misurazione di citometria a flusso (Figura 2) di imaging
- Analizzare i campioni macchiati utilizzando un citometro a flusso imaging presso il nucleo di citometria a flusso dell'ospedale dei bambini di Cincinnati utilizzando un obiettivo 40x per produrre 300 pixel per una cella con circa 10 mm di diametro. Dimensione di un pixel è di circa 0,5 mm di 0.5 mm dell'oggetto.
- Acquisizione di 10.000 immagini cellulare in modo imparziale secondo le istruzioni del fabbricante.
4. analisi di flusso Cytometry immagini di imaging
- Analisi di colocalizzazione utilizzando idee software (Figura 2)
- Eseguire la compensazione con singolo-macchiato contro campioni non macchiato impostando l'intensità della fluorescenza di campioni non tinto sotto la soglia, tra cui non macchiato di BaP-esposti DCs con BaP autofluorescenza, come dati di routine flusso cytometry analisi.
- Cancello macchiato le cellule per ottenere i sottoinsiemi di HLA-DR+CD11c+CD1d+Lamp1+ cellule (Figura 2A) e visualizza immagini cellulare i sottoinsiemi gated (Figura 2B).
- Salvare le immagini di cella in un formato png basato su due criteri di inclusione tecniche, la presenza visiva di forti segnali co-macchiati e localizzazione subcellulare delle proteine CD1d e Lamp1, per le analisi di colocalizzazione usando ImageJ-Fiji (Figura 2B).
- Utilizzare software ImageJ-Fiji per eseguire analisi di colocalizzazione (Figura 3).
- Preparare i file di immagine in ingresso unendo le 100 immagini di cella salvato per DCs umano non esposte e BaP-esposti, rispettivamente (Figura 3A).
- Analizzare CD1d (rosso) e Lamp1 colocalizzazione (verde) utilizzando un scatterplot.
- Eseguire il programma di ImageJ-Fiji. Aprire il file. png con 100 immagini di cella (Figura 3B e Figura 4A): "File | Apri".
- Dividere l'immagine con canali rosso e verde Unite in due immagini con un rosso o un canale verde: "immagine | Colore | Dividere i canali".
- Disegnare un scatterplot utilizzando i comandi "Analyze | Colocalizzazione | Soglia di colocalizzazione". Salvare il scatterplot utilizzando il tasto "Stamp" .
- Calcolare i coefficienti di colocalizzazione di Mander per ogni singola immagine cellulare (n = 100) (Figura 4B)
- Selezionare un'immagine singola cella sul file di immagine con canali di divisione utilizzando il "ovale" strumento di selezione.
- Utilizzare i comandi "Analyze | Colocalizzazione | Soglia di colocalizzazione". Selezionare "Canale 1" dalla finestra di dialogo della regione di interesse (ROI). Mantenere tutte le opzioni di calcolo, tra cui "Mander utilizzando soglie" per ogni immagine di cella.
- Ripetere questo calcolo per tutte le immagini di 100 cellule.
- Salvare e aprire i risultati utilizzando un foglio di calcolo.
- Tracciare i media e gli errori standard per "Coefficienti di Mander con soglia" (n = 100, 0 significa nessuna colocalizzazione e 1 significa colocalizzazione perfetto). Utilizzare test t di Student per calcolare il valore di p per il confronto tra gruppi di BaP-esposti e non esposti (Figura 4B).
- Calcolare la percentuale di intensità di pixel con soglia co-localizzato tra CD1d e Lamp1 per immagini multiple delle cellule (n = 100) (Figura 4).
- Utilizzare lo stesso protocollo di analisi in 4.2.3 e inoltre selezionare l' opzione di risultato "% intensità sopra soglia colocalized".
- Eseguire questa analisi insieme ai coefficienti di colocalizzazione di Mander.
- Allo stesso modo di tracciare i media e gli errori standard per intensità % colocalized tra CD1d e Lamp1. Utilizzare test t di Student per calcolare il valore di p per il confronto tra gruppi di BaP-esposti e non esposti (Figura 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L'inquinante lipofilico BaP altera cluster genici endocitosi in umano DCs. Human monocito-derivate DCs da ciascun donatore (n = 3) sono stati incubati con BaP e ordinati per DCs convenzionali, che più ulteriormente sono stati utilizzati per l'analisi di estrazione e trascrittomica RNA come descritto . Al momento la normalizzazione dell'espressione genica, geni alterati tra gruppi BaP-esposti e non esposti sono stati raggruppati secondo la correlazione funzionale dei geni differenzialmente espressi. Abbiamo ingresso nell'elenco gene alterato per il programma di Toppcluster16 per le analisi delle vie cellulari rilevanti ed eseguire il test statistico utilizzando una false discovery rate (FDR) correzione dei valori di p (Figura 1B). Diversi cluster di gene alterato principali, tra cui il metabolismo dei lipidi e funzioni di endocitosi, sono stati identificati in DCs BaP-esposti. In questo studio, ci siamo concentrati in particolare sul test funzionale del traffico endocitico, perché la presentazione dell'antigene CD1-mediata è stata fortemente dipendente l'antigene del lipido caricamento nell'endocitosi5,19, 20,21.
CD1d endocitico traffico è dimostrato mediante imaging citometria a flusso. All'ottenimento di un gran numero di immagini di cella mediante citometria a flusso imaging, abbiamo iniziato a utilizzare il programma di idee per visualizzare le singole immagini cellulare attraverso convenientemente gating popolazioni di cellule co-macchiate con gli anticorpi multipli (Figura 2A). In particolare, siamo riusciti a cancello la principale popolazione DC Co-macchiata con HLA-DR e CD11c per mostrare ulteriori controller di dominio con CD1d e Lamp1 co-espressione (Figura 2A). Co-macchiati segnali possono essere arricchiti con gating la popolazione delle cellule con doppia macchia di CD1d e Lamp1 (Figura 2A). Abbiamo mostrato in primo luogo non esposto normale controller di dominio con minimo colocalizzazione di proteine CD1d e Lamp1, che indica il livello basale di CD1d endocitico traffico e l'alto livello di espressione di superficie alle condizioni fisiologiche (Figura 2B)5, 19,20,21. Per misurare la colocalizzazione di proteine CD1d e Lamp1, abbiamo usato inizialmente idee per mostrare un lieve aumento di somiglianza brillante dettaglio CD1d e Lamp1 proteine con BaP esposizione13. La somiglianza di dettaglio brillante è stata calcolata in base il coefficiente di correlazione di Pearson per testare la correlazione di due fattori, mentre proteine CD1d e Lamp1 erano improbabile altamente sovrapposti in condizioni fisiologiche, che indica che CD1d è in grado di transitoriamente traffico attraverso compartimenti tardi endocitico ottenere antigeni lipidici funzionale. Così, è più biologicamente significativo per verificare se la proteina CD1d BaP esposizione mantiene più nei compartimenti endocitico tardi come riflesso tramite l'aumento della percentuale di proteine di CD1d e Lamp1 sovrapposte utilizzando l'imaging Fiji di software di analisi nella Pacchetto di ImageJ. Infine, ritenzione della proteina CD1d in compartimenti endocitico fine può essere utilizzato per confermare funzionalmente gene alterato endocitico profili in esposizione BaP.
Area tra proteine CD1d e Lamp1 e co-localizzati intensità è stata misurata. Per ottenere un'impostazione di soglia riproducibile e percentuali di zone co-localizzate e intensità, abbiamo applicato ImageJ-Fiji22, che è stato utilizzato anche in diversi altri studi23,24,25. Scegliamo a caso CD1d+Lamp1+ cellule con co-macchia forte e chiaro subcellulare delle proteine CD1d e Lamp1 come immagini in ingresso (Figura 2B). Singole immagini cellulare possono essere unite in un file di immagine singola per una analisi coerente (Figura 3A). Nel nostro studio, abbiamo fuse 100 immagini di cella e ha aperto nel programma di analizzare impostando "soglie di colocalisation" (Figura 3B). La colocalizzazione di intensità di pixel tra i due canali (PE-labeled CD1d e AF647-labeled Lamp1) è stato indicato nel complesso con un scatterplot rilevando i pixel co-localizzati da queste immagini di 100 cella (Figura 4A). In questo grafico, linee orizzontali e verticali rappresentano le soglie di Costes e le linee diagonali rappresentano il rapporto di intensità di pixel complessiva tra due canali. Soglia di Costes fornisce un'impostazione visibile per la rimozione di pixel debole da due canali sovrapposti. Il risultato scatterplot Mostra una colocalizzazione aumentata delle proteine CD1d e Lamp1 nell'esposizione di BaP. Inoltre, abbiamo quantificato il grado di colocalizzazione tra proteine CD1d e Lamp1 utilizzando i coefficienti di Mander (Figura 4B). Di conseguenza, i coefficienti di Mander dimostrano maggiore colocalizzazione tra CD1d e Lamp1 in compartimenti tardi endocitosi di BaP-esposti DCs confrontando con DCs non esposte, come statisticamente supportato da t-test di Student (Figura 4B). Tuttavia, se intensità di proteina è eterogenea tra aree colocalized e non colocalized, colocalized intensità sarà senza pari alle aree colocalized. Di conseguenza, è anche necessario ulteriore esame la colocalizzazione basato sull'intensità (Figura 4). Di conseguenza, ogni colonna rappresenta un calcolo di una media di percentuale di intensità colocalized da immagini multiple delle cellule (n = 100) tra le condizioni di BaP-esposti e non esposti per un paio di proteine co-localizzati. T-test di Student mostrano anche la significatività statistica (n = 100, p< 0,001) tra gruppi di BaP-esposti e non esposti con errori standard indicati. Complessivamente, i nostri dati dimostrano che il CD1d proteina è stata mantenuta in late endosomes BaP esposizione, sostenendo che l'espressione genica di BaP-alterato ulteriormente conduce alla funzione alterata endocitosi e CD1d traffico.
In sintesi, CD1d-Lamp1 colocalizzazione migliora sopra l'esposizione di BaP. Più parametri basati su immagini di cella (Figura 2B), tra cui scatterplot con intensità di pixel sovrapposti (Figura 4A), enhanced coefficienti di Mander (Figura 4B) e aumentato la percentuale di intensità sovrapposta ( Figura 4), supporto CD1d endocitico ritenzione al BaP esposizione. Questa analisi di colocalizzazione di immagini cellulare è un approccio preciso per determinare il grado di colocalizzazione di proteina e dimostrare i meccanismi biologici delle funzioni cellulari, ad esempio, endocitosi funzione coerente con gene endocitico interrotte espressione, contribuendo ulteriormente all'attivazione inibita di T CD1d-ristrette cellule13.
Figura 1 : Perturbazione della DC trascrittomi BaP dell'esposizione (A) diagramma di flusso di RNA-seq. In primo luogo, analisi di controllo qualità (QC) è stata effettuata per esaminare la qualità del RNA totale. Utilizzando un sistema automatizzato e RNA totale di alta qualità come input, poli-A RNA è stato isolato, che ha dimostrato impoverito rRNA in poli-A analisi di RNA QC. Il RNA di poly-A è stato quindi sottoposto a libreria automatica preparazione e l'indicizzazione tramite PCR. Successivamente, la libreria amplificata è stata analizzata da un Bioanalyzer per QC con rendimento atteso e distribuzione delle dimensioni. Dopo qPCR quantificazione, librerie indicizzate sono state riunite ed cluster sulla cella di flusso per il sequenziamento e la qualità dei dati di sequenziamento è stato in tempo reale monitorati. L'asse rappresenta relativi conteggi di citometria a flusso macchiatura segnali. (B) geni alterati sono stati raggruppati in cluster funzionali diversi e vengono visualizzati i cluster genici associati con il metabolismo di lipidi e funzione endocitosi. Rosso: CD1d; Verde: Lamp1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Analisi di immagini cellulari utilizzando il programma idee. (A) il DCs monocito-derivato da sani donatori sono stati in primo luogo recintati su HLA-DR + CD11c + cellule e ulteriormente con cancello su CD1d+Lamp1+ celle utilizzando il programma di idee. Immagini cellulare (B) sono state estratte dal HLA-DR+CD11c+CD1d+Lamp1+ popolazione per la visualizzazione di immagini cellulare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Analisi di immagini cellulari utilizzando il programma di Fiji-ImageJ. Cellule con forte co-macchia delle proteine CD1d e Lamp1 sono stati scelti a caso per l'analisi di immagine utilizzando Fiji-ImageJ, ma cellule * con colorazione invisibile o debole per proteina CD1d o Lamp1 è stato escluso come in Figura 2B. (A) questi cellulari selezionati in modo casuale le immagini sono stato assemblato in un unico file immagine come un'immagine di input. (B) la colocalizzazione analisi è stata eseguita tramite l'impostazione delle soglie di colocalizzazione per i canali rossi e verde. Lo scatterplot sono stati generati con calcolo della soglia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Colocalizzazione di proteine CD1d e lampada 1. Utilizzo di dataset simili segnalati in Sharma et al. 13, intensità di pixel co-localizzato tra proteine CD1d e Lamp1 da DCs alle condizioni BaP-esposti e non esposti è stato ricalcolato e mostrato con scatterplot (A). Coefficienti di Mander colocalizzazione CD1d e Lamp1 sono stati calcolati e sono mostrati con una media da immagini cella selezionata (B). La percentuale di intensità di pixel co-localizzato è stato anche calcolato (C). Significatività statistica (n = 100, p < 0,001) è stata ottenuta con il test t di Student rispetto al gruppo non esposto. Gli errori standard sono stati indicati. Sono dati da un test con cellule da un donatore sano. Due analisi indipendenti sono state eseguite con risultati simili. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Anticorpi | Fluorofori o anticorpo secondario | Clone |
| HLA-DR | Ficoeritrina/cianina 7 (PE/Cy7) | L243 |
| CD11c | Ficoeritrina/cianina 5 (PE/Cy5) | 3.9 |
| CD1c | Viola brillante 421 | L161 |
| Purificato anti-umano CD1d | PE-anti-topo IgG2b | 51,1 |
| LAMP1 | Alexa Fluor 647 (AF647) | CD107a(H4A3) |
Tabella 1: gli anticorpi usati in questo studio. A causa di eccitazione condivisa e lunghezze d'onda di emissione, fluorofori PE/Cy5 e AF647 parzialmente sovrapposta nella macchiatura segnali. Usiamo questi fluorofori per etichettare una proteina di superficie (CD11c) e una proteina intracellulare (Lamp1) rispettivamente per evitare loro sovrapposizioni di segnale a livello subcellulare. Utilizziamo inoltre ottimale titolazione e compensazione per ridurre al minimo i segnali sovrapposti tra due fluorofori.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Conferma funzionale di una via di gene alterato è impegnativo, a causa di espressione genica ampiamente incastrato che coinvolgono le vie multiple e la difficoltà di integrare attività cellulari individuali e popolazionale. Abbiamo impiegato imaging flusso cytometry in particolare prova CD1d traffico endocitico scomparti. Citometria a flusso di imaging integra la misura popolazionale delle cellule e la dimostrazione individuo di colocalizzazione subcellulare delle proteine multiple. Microscopia confocale ha fornito precedentemente ad alta risoluzione nella misurazione colocalizzazione di proteina e citometria a flusso è in grado di fornire completa phenotyping per diverse popolazioni cellulari. Citometria a flusso di imaging combina i vantaggi della microscopia confocale e citofluorimetria a risoluzione immagine accettabile di analizzare colocalizzazione di proteina in un modo di alto-profilo funzionale conferma di trascrittomica alterazione ambientale inquinanti.
Analisi di colocalizzazione delle proteine multiple in una scala popolazionale sono tecnicamente impegnativo, perché (i) dettagliate analisi di più celle individuali sono laboriosi e relativamente prevenuto; (ii) è difficile definire una soglia ottimale per l'interpretazione di pixel sovrapposti in base l'intensità o la zona di macchiatura positiva; e (iii) equilibrato osservazione delle cellule individuali e popolazionali è fondamentale. In questo studio, ci siamo concentrati su come eseguire un'osservazione biologicamente significativo, un test di significatività statistica e una dimostrazione imaging delle proteine co-localizzati. Per raggiungere questo obiettivo, in primo luogo abbiamo ottenuto migliaia di immagini di DCs umano mediante imaging citometria a flusso. Analisi quantitative di file di imaging combinato un'analisi di somiglianza di brillante dettaglio utilizzando il software idee e un'analisi di colocalizzazione statisticamente testato utilizzando Fiji-ImageJ. Il programma idee permette gating della popolazione co-macchiata, calcolo colocalizzazione di due proteine utilizzando la somiglianza di dettaglio brillante basati su coefficiente di correlazione di Pearson, e co-selezionando in modo casuale macchiato le cellule con la localizzazione subcellulare di proteine13. Per raggiungere ulteriormente la dimostrazione pertinente biologica delle proteine co-localizzati, abbiamo usato software ImageJ-Fiji e applicato il coefficiente di Mander per calcolare la percentuale di aree co-localizzate e sovrapposti di intensità di pixel per dimostrare il grado di Localizzazione di CD1d nella endocitosi.
Il passaggio fondamentale per utilizzare il programma di ImageJ-Fiji consiste nell'eseguire la singola cella analisi di imaging. Variazione della percentuale colocalizzazione di proteina da singole celle possa essere monitorati rispetto ai colori visivamente Uniti da immagini di singola cellula. Calcolando la colocalizzazione di proteina percentuale da 100 tutte le cellule, i mezzi e gli errori standard può essere calcolati per dimostrare la colocalizzazione di proteina e correlazione funzionale a un livello popolazionale. Questa analisi bioinformatica è semplice e semplice senza riguardo risultati ambigui, perché questa analisi offre un calcolo soglia riproducibile utilizzando il metodo di Costes per produrre lo stesso portato soglie per gli stessi set di dati e soglie di simili per simili DataSet26. La limitazione di questa tecnica è l'input manuale laborioso delle immagini di singola cellula e potenzialmente soggettiva selezione delle cellule visivamente co-macchiate usando il software di idee. Nel nostro studio, analizziamo 100 immagini di cella da ciascun gruppo e abbiamo fissato criteri di selezione riproducibile, compresi i segnali co-macchiati forti e chiara localizzazione subcellulare delle proteine CD1d e Lamp1. Superare queste limitazioni richiede miglioramento tecnico dei software di analisi per consentire analisi batch e obiettiva selezione di singole celle in base a caratteristiche morfologiche oltre l'intensità di macchiatura fornito da citometria a flusso. Nella popolazione e sintesi, combinato cellular imaging analisi fornirà risultati altamente riproducibili, completi, testati statisticamente e biologicamente rilevanti di colocalizzazione di proteina percentuale. Crediamo che questa analisi di colocalizzazione CD1d-Lamp1 può servire come un esempio riuscito di alto profilo analisi di imaging cellulare a domande più ampio sulle alterazioni funzionali e morfologiche delle proteine cellulari.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Robert Giulitto (centro di sangue Hoxworth) per campioni di sangue umano e legge Dr. Liang Niu per la normalizzazione dell'espressione genica. Ringraziamo anche sovvenzioni dal National Institute of Environmental Health Sciences (ES006096), Center for progetto pilota ambientale genetica (CEG) (S.H.), Istituto nazionale di allergie e malattie infettive (AI115358) (S.H.), Università di Cincinnati University Research Council award (S.H.) e Università di Cincinnati College di medicina Enhancement finanziamento di base (X. Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transcriptomics | Illumina | HiSeq 2500 v4 | Illumina HiSeq system |
| ImagingStream X | Millipore | 100220 | Imaging flow cytometry |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fisher | Total RNA extraction | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent | Total RNA QC analysis | |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher | PCR, enzyme reaction | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England Biolab | PolyA RNA purification | |
| Automated SMARTer Apollo system | Takara | PolyA RNA purification | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolab | Library preparation | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | DNA purification | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) | Thermo Fisher | Library quantification | |
| NEBNext Library Quant Kit | New England Biolab | Library quantification | |
| cBot | Illumina | Library cluster generation | |
| TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot – HS | Illumina | Library cluster generation | |
| HiSeq 1000 | Illumina | Sequencing | |
| TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles) | Illumina | Sequencing | |
| Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | Bio Legend | L243 | |
| Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | Bio Legend | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | Bio Legend | L161 | |
| PE-anti-mouse IgG2b | Bio Legend | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) | Bio Legend | CD107a(H4A3) |
References
- Roche, P. A., Cresswell, P. Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells. Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).
- Huang, S., et al. MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells. The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).
- Nakamura, N., et al. Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling. Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).
- Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P.
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Zajonc, D. M., Kronenberg, M. CD1 mediated T cell recognition of glycolipids. Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).
- Cox, D., et al. Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules. PloS one. 4 (5), e5325 (2009).
- Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments. Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).
- Huang, S., et al. Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).
- de Jong, A., et al. CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens. Nature. 15 (2), 177-185 (2014).
- Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Sharma, M., et al. Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants. Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).
- Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).
- Nachamkin, I., et al. Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene. Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).
- Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems. Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).
- Bauer-Mehren, A. Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape). Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).
- Cline, M. S., et al. Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape. Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).
- Huang, S., Moody, D. B. Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system. Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).
- Huang, S. Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis. Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).
- Moody, D. B., Porcelli, S. A. Intracellular pathways of CD1 antigen presentation. Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9 (7), 676-682 (2012).
- Diard, M., et al. Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype. Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Eliceiri, K. W., et al.
- Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).
