Summary
Imaging flowcytometri giver en ideel metode til påvisning af de morfologiske og funktionelt ændring af celler på individuelle og befolkningsmæssige niveauer. Forstyrret endocytic funktion for lipid antigen præsentation i forurenende-eksponerede menneskelige dendritiske celler blev demonstreret med et kombineret transkriptom profilering af genekspression og morfologiske demonstration af protein handel.
Abstract
Befolkningsmæssige analyser af de morfologiske og funktionelle ændringer i endocytic proteiner er udfordrende på grund af efterspørgsel af billedoptagelse på en enkelt celle niveau og statistiske billedanalyse på befolkningsmæssige plan. For at overvinde denne vanskelighed, brugte vi imaging flowcytometri og transkriptom profilering (RNA-seq) til at bestemme ændrede subcellulært lokalisering af klyngen af differentiering 1d protein (CD1d) forbundet med nedsat endocytic genekspression i menneskelige dendritiske celler (DCs), som blev udsat for den fælles lipofile luft forurenende benzo [a] pyren. Colocalization af CD1d og endocytic markør Lamp1 proteiner fra tusindvis af celle billeder taget med imaging flowcytometri blev analyseret ved hjælp af ideer og ImageJ-Fiji programmer. Talrige cellulære billeder med co farvede CD1d og Lamp1 proteiner blev visualiseret efter gating på CD1d+Lamp1+ DCs ved hjælp af ideer. Den forbedrede CD1d og Lamp1 colocalization ved BaP eksponering blev finpudset ved hjælp af thresholded scatterplots, testet med Manders koefficienter for Co lokaliserede intensitet, og afbildet baseret på andelen af co lokaliserede områder ved hjælp af ImageJ-Fiji. Vores data give en fordelagtig instrumental og bioinformatic tilgang for at måle protein colocalization på både enkelt og befolkningsmæssige cellulære niveauer, støtte en nedsat funktionel resultatet af transkriptom ændring i forurenende-eksponerede mennesker DCs.
Introduction
Antigen præsentation involverer typisk intracellulær protein menneskehandel, som ofte blev undersøgt ved hjælp af morfologiske karakteristika og fænotypiske profilering af antigen præsentere celler1,2,3 . For at integrere fordelene af billedbehandling og fænotyper metoder, beskriver vi en billeddannelse analyse platform på både enkelt celle og befolkning niveauer til at vise en ændret protein colocalization i menneskelige dendritiske celler (DCs). I peptid antigen præsentation, store histocompatibility complex (MHC) klasse I molekyler binder en kort peptid (8-10 restkoncentrationer) i det endoplasmatiske reticulum at aktivere konventionelle CD8+ T celler, mens MHC klasse II molekyler binder en forholdsvis længere peptid (~ 20 restkoncentrationer) i endocytic rum at aktivere konventionelle CD4+ T-celler1,4. Derimod aktiveres lipid-specifikke T-celler ved CD1 proteiner med lipid antigener indlæst hovedsagelig i endocytic rum5,6. Lipid antigen præsentation kræver levering af lipid metabolitter produceret i lipid metabolisme7,8,9,10 og lastning af funktionelle lipid metabolitter til CD1 proteiner i endocytic rum5,6. I denne forbindelse er forskellige cellulære faktorer modulerende lipid antigen præsentation, især i miljømæssig eksponering af lipofile stoffer og immune lidelser, kritisk skal defineres. I denne undersøgelse brugte vi transkriptom analyse, billede profilering og cellulære og befolkningsmæssige imaging analyse af humane monocyt-afledte DCs for at bestemme endocytic protein handel bidrager til lipid antigen præsentation i forurenende eksponering. Bestemt, denne kombinerede platform kan anvendes til at studere subcellulært protein handel og colocalization i forskellige biologiske processer.
Teknisk, subcellulært protein lokalisering viste normalt bruger Konfokal mikroskopi og statistisk analyseres i et begrænset antal fundne celler1,2,3,11. Derudover er flowcytometri blevet bredt anvendt til gate cellepopulationer med co farves signaler af flere proteiner på en cellulært niveau12; dette mangler imidlertid en detaljeret visualisering af subcellulært protein colocalization. For at opnå en omfattende og statistiske analyser af procentdel protein colocalization på både cellulære og befolkning niveauer, vil vi indarbejde imaging profilering og analyse med henblik på at bestemme funktionerne i protein colocalization med biologiske relevans. Specifikt, vi bruger imaging flowcytometri til at registrere colocalization af CD1d og lysosomale-associerede membranen protein 1 (Lamp1) proteiner i denne undersøgelse. Kvantitativ analyse af colocalized molekyler var tidligere vanskeligt skal udføres på en befolkningsmæssige skala. I denne undersøgelse tilpasset vi ImageJ-Fiji program til at undersøge procentdelen af protein colocalization med et stort antal Co farvede celler både befolkningsmæssige og individuelle cellulære niveau. Specifikt, målte vi Co lokaliserede områder, intensitet og befolkningsmæssige størrelse til støtte for den konklusion, at CD1d proteinet i vid udstrækning blev bibeholdt i slutningen endocytic rum af menneskelige DCs i eksponering for en lipofile forurenende benzo [a] pyren (BaP)13 . Denne kombinerede cellulære og befolkningen imaging analyse fastsat meget reproducerbar, omfattende og statistisk signifikante resultater af CD1d-Lamp1 colocalization relevant for hæmmet lipid antigen præsentation.
Transkriptom af BaP-eksponerede menneskelige DCs støttet kraftigt den hypotese, at endocytic lipid metabolisme og CD1d endocytic menneskehandel blev nedsat i BaP eksponering. For at teste denne hypotese, anvendte vi imaging flowcytometri for at profilere de billeder af DC befolkning, der var Co farves med flere proteiner, herunder CD1d, endocytic markører og DC markører. Endelig var Co farvede celler statistisk analyseres for at påvise procentdelen af intensitet og områder af CD1d og Lamp1 colocalization.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menneskelige protokoller i denne undersøgelse blev godkendt af det institutionelle Review Board af University of Cincinnati og alle metoder blev udført i overensstemmelse med de relevante retningslinjer og forordninger. Blodprøver fra raske donorer blev indhentet fra Hoxworth blod Center ved University of Cincinnati Medical Center.
1. transkriptom profilering af forurenende stof-eksponerede humane monocyt-afledte DCs
- Total RNA udvinding af BaP-eksponerede DCs
- Skelne menneskelige DCs ved hjælp af cytokiner GM-CSF og IL-4, og udsætte DCs til BaP for 4 dage13.
- Sortere BaP-eksponerede DCs bruger flowcytometri baseret på overfladen udtrykkes markører (slægt-HLA-DR+), hvoraf størstedelen består af konventionelle DCs (CD11c+CD1c+)13. Typisk, sortere 10.000 DCs i dyrkningsmediet indeholdende 10% FBS, centrifugeres DCs ved 600 x g og 4 ° C for 6 min, og straks fjerne supernatanten ved aspiration ved hjælp af en 1 mL pipette tip.
- Når supernatanten fjernes ved aspiration, lyse celle pellet ved at tilføje 0,4 mL af Lysis/Binding Buffer fra RNA isolering kit til opbevaring i-80 ° C før RNA udvinding.
- Bruge RNA isolering kit med total RNA udvinding protokollen hen til uddrag den samlede RNA14. Måle RNA integritet ved hjælp af en Bioanalyzer15.
- Transkriptom analyse af sorterede DCs (figur 1A)
- Forberede biblioteket for RNA-seq bruger et RNA bibliotek forberedelse kit. Kort sagt, splitte den isolerede poly-A RNA (~ 200 bp), omvendt transskribere fragmenter til den 1st strand af cDNA, og følger af den anden streng cDNA syntese mærket med dUTP.
- Ligate dobbeltstrenget cDNA til adapter med en stem-loop-struktur efter perle rensning, reparation af slutningen og dA-hale. Punktafgifter uracil rester i den 2nd strand af cDNA og adapter løkken med bruger (Uracil-specifikke Excision reagens) enzym til at opretholde strand specificitet og åbne adapter løkke til PCR.
- Udføre 13 cyklusser af PCR ved hjælp af universelle og indeks-specifikke primere til at berige den indekserede bibliotek. Rydde op i biblioteket og køre på en Bioanalyzer DNA høj følsomhed chip til at kontrollere bibliotek kvalitet og størrelse distribution.
- Bruge et bibliotek kvantificering kit og en real-time PCR system kombineret med biblioteket størrelse oplysninger til at beregne bibliotek koncentration via en standardkurve metode.
- Forholdsmæssigt pool individuelt indekserede kompatibel biblioteker og justere den endelige samlede koncentration til 15 pM. Udføre bibliotek klynge generation og sekvens i biblioteket på en indstilling af enkelt Læs 1 x 50 bp at generere ~ 25 millioner læsninger pr. prøve.
- Sekventering
- Indlæse Sekventeringen og indeksering reagenser til SBS og PE reagens stativerne, henholdsvis. Placer reagenserne i vandbad laboratorium-grade 1 h, indtil al isen er smeltet og reagenser i hver flaske/slange er mixet ordentligt.
- Forberede ICB mix ved at tilføje optøede farvestof og -20 ° C enzymet til flasken og bland. Forberede en NaOH opløsning efter sekvensering instrukser. Placere alle reagenser ved 4 ° C indtil klar til brug.
- Venter på periode, magt på sequenceren i løbet af 1 h. Vente på DONOTEJECT drevet vises og slutte computeren til et netværksdrev.
- Lancere sequencer kontrol software.
- Forberede 2 L vedligeholdelse vaskeopløsning, der indeholder 0,5% Tween 20 og 0,03% ProClin 300 i laboratoriet-grade vand.
- I SBS reagens rack, tilføje ~ 100 mL vedligeholdelse vaskeopløsning til hver af de 8 flasker og tragt skruelåg til flasker. I PE reagens rack, tilføje ~ 12 mL vedligeholdelse vaskeopløsning til hver af de ti 15 mL konisk rør, og kassér caps.
- Læg de to stativer med løsning fyldt flasker/rør til sequencer.
- Fra sequencer kontrol software, skal du vælge vedligeholdelse vask; Følg vejledningen på skærmen for at rense sequencer væske system, indtil processen er fuldført.
- Start en ny køre i fanen "SEKVENS" fra softwaren; direkte output-data til et netværksdrev. Vælg parametre for enkelt Læs 1 x 50 bp med enkelt indeks multipleksede biblioteker.
- Valgfrit, logge ind BaseSpace sekvens Hub så at overvåge sekventering status fjernt via en computer eller smart telefon.
- Uploade en prøve ark til demultiplexing og give reagens oplysninger efter software krav.
- Indlæse SBS og PE reagenser til sequencer. Prime system med en brugt flow celle (~ 15 min).
- Når klyngen generation er afsluttet (~4.5 h), tegne en flow-celle, spray let cellen flow med vand og tørre det tørt ved hjælp af linsen papir. Let spray cellen flow med 95% ethanol og tørre det tørt. Tjek mod en lys for at sikre, at overfladen er ren uden snavs eller salt rester.
- Når Prime trin er fuldført, indlæse grupperet flow-cellen og starte Sekventeringen. Sekvens analyse Viewer-softwaren startes automatisk.
- Overvåge sequencing datakvalitet via SAV herunder klynge tæthed, læser pass filter, klynge pass filter %, % ≥Q30, Legacy fase/prophase %, indeksering QC, etc. dette hjælper til at forstå datakvaliteten og fejlfinding.
- Ændre flow celle pakning og udføre en vedligeholdelse vask efter Sekventeringen er afsluttet. Sequenceren er klar til det næste løb.
- Bioinformatic analyse
- Udføre Bioinformatik RNA-seq data analyse13.
2. pathway analyse af transkriptom profiler (figur 1B)
- Brug en edgeR Bioconductor for at sammenligne resulterende gen expression intensitet tæller mellem BaP-eksponerede og ikke-eksponerede DCs fra tre donorer. Derefter identificere varierende udtrykte gener mellem BaP-eksponerede og ikke-eksponerede DCs baseret på den absolutte fold ændring (> 2 folder) og den falske opdagelse Vurder (FDR) - justerede p- værdier (< 0,05).
- For at forudsige de funktionelle klynger af varierende udtrykte gener, bruger ToppCluster softwarepakke til at søge de ændrede gener mod flere databaser, herunder KEGG og REACTOME og generere klyngedannelse data. ToppCluster bruger Hypergeometrisk test for at opnå funktionelle berigelse via gen liste berigelse analyse16.
- Yderligere input resultater fra disse funktion klynger til Cytoscape17,18 gengivelse 3.3.0, et bredt anvendte open source software-platform til at visualisere komplekse netværk. Således er gener involveret i forskellige klynger eller veje, herunder endocytic klynger og lipid metabolisme, vist i et netværk med farve anmærkning af gennemsnit fold ændring af genet udtryk (figur 1B)13.
3. imaging flowcytometri af CD1d og Lamp1 Colocalization
- Antistof mærkning af BaP-eksponerede DCs
- Expose 0,5 x 106 menneskelige DCs til 5.94 mM BaP i 4 dage ved 37 ° C i 2 mL af komplet Dulbecco ændret Eagle's Medium. Høste DCs ved centrifugering ved 400 x g i 10 min. blok de differentierede DCs ved at inkubere celler med humant serum blocker og -anti-humant Fc receptor antistoffer i 10 min i isen, herunder antihumant CD16, CD32 og CD64 antistoffer.
- Inkuber strålende Violet 421-anti-CD1c (L161), phycoerythrin/cyanine farve 7 (PE/Cy7) - anti - HLA-DR, og PE/Cy5-anti-CD11c med DCs i 20 min. i isen. Tabel 1 viser denne liste af antistoffer.
- Fix DCs med 4% PARAFORMALDEHYD i PBS og permeabilize dem med Permeabilization Wash Buffer. Udføre intracellulær farvning med en blanding af PE-mærket renset-anti-humant CD1d (51,1) og Alexa Fluor 647-mærket anti-Lamp1 (CD107a) (H4A3).
- Imaging flowmåling flowcytometri (figur 2)
- Analysere de farvede prøver ved hjælp af en billeddannelse flow forskellige flowcytometri-kernen flow i Cincinnati children's Hospital ved hjælp af en 40 X mål for at give 300 pixels for en celle med omkring 10 mm i diameter. Én pixel størrelse er ca 0.5 mm af 0,5 mm for objektet.
- Erhverve 10.000 cellulære billeder i en fordomsfri måde i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger.
4. imaging analyser af Flow flowcytometri billeder
- Colocalization analyse ved hjælp af ideer software (figur 2)
- Udføre kompensation med single-farvede versus ikke-farvede prøver ved at indstille fluorescens-intensiteten af ikke-farvede prøver tærsklen, herunder ikke-farvede BaP-eksponerede DCs med BaP autofluorescence, som i rutinemæssige flow flowcytometri data analyse.
- Gate farvede celler for at opnå delmængder af HLA-DR+CD11c+CD1d+Lamp1+ celler (figur 2A) og Vis cellulære billeder i de låge delmængder (figur 2B).
- Gemme celle billeder i png-format baseret på to tekniske inklusionskriterierne, visuelle tilstedeværelsen af stærke Co farves signaler og subcellulært lokalisering af CD1d og Lamp1 proteiner, for colocalization analyser ved hjælp af ImageJ-Fiji (figur 2B).
- Brug software ImageJ-Fiji til at udføre colocalization analyse (figur 3).
- Forberede input billedfiler ved at flette de 100 gemte celle billeder for ikke-eksponerede og BaP-eksponerede menneskelige DCs, henholdsvis (figur 3A).
- Analysere CD1d (rød) og Lamp1 (grøn) colocalization ved hjælp af en scatterplot.
- Køre ImageJ-Fiji program. Åbn filen .png med 100 celle billeder (figur 3B og figur 4A): "fil | Åbn".
- Split billede med flettede røde og grønne kanaler i to billeder med enten en rød eller en grøn kanal: "billede | Farve | Opdele kanaler".
- Tegne en scatterplot ved hjælp af kommandoerne "Analyze | Colocalization | Colocalization tærskel". Gemme scatterplot med tasten "PrintScreen" .
- Beregne Mander's colocalization koefficienter for hver enkelt cellulær billede (n = 100) (figur 4B)
- Marker en enkelt celle billede på billedfilen med split kanaler benytter den "Oval" markeringsværktøjet.
- Bruge kommandoerne "Analyze | Colocalization | Colocalization tærskel". Vælg "Kanal 1" fra dialogboksen i region af interesse (ROI). Holde alle beregningsindstillinger herunder "Manders brug af tærskler" for hver celle billede.
- Gentag denne beregning for alle 100 celle billeder.
- Gemme og åbne resultaterne ved hjælp af et regneark.
- Plot gennemsnit og standardafvigelser for "Thresholded Mander koefficienter" (n = 100, 0 betyder ingen colocalization og 1: perfekt colocalization). Bruge Student's t-test for at beregne p -værdien for sammenligning mellem BaP-eksponerede og ikke-eksponerede grupper (figur 4B).
- Beregn procent af thresholded pixel intensitet Co lokaliseret mellem CD1d og Lamp1 for flere celle billeder (n = 100) (fig. 4 c).
- Brug den samme analyse protokol i 4.2.3 og desuden vælge resultat indstilling "% intensitet tærskel colocalized".
- Udføre denne analyse sammen med Mander's colocalization koefficienter.
- Tilsvarende plot gennemsnit og standardafvigelser for % intensitet colocalized mellem CD1d og Lamp1. Bruge Student's t-test for at beregne p -værdien for sammenligning mellem BaP-eksponerede og ikke-eksponerede grupper (figur 4 c).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den lipofile forurenende BaP ændrer endocytic gen klynger i menneskelige DCs. menneskelige monocyt-afledte DCs fra hver donor (n = 3) var inkuberes med BaP og sorteret for konventionelle DCs, som blev yderligere brugt til RNA udvinding og transkriptom analyse som beskrevet . Ved normalisering af genekspression, var ændrede gener mellem BaP-eksponerede og ikke-eksponerede grupper grupperet efter den funktionelle sammenhæng af varierende udtrykte gener. Vi input listen ændrede gen-Toppcluster program16 for analyser af relevante cellulære veje og udføre de statistiske test ved hjælp af en falsk opdagelse sats (FDR) korrektion af p -værdier (figur 1B). Flere store ændrede gen klynger, herunder lipid metabolisme og endocytic funktioner, blev identificeret i BaP-eksponerede DCs. I denne undersøgelse, vi specifikt fokuseret på de funktionelle test i endocytic handel, fordi CD1-medieret antigen præsentation har været stærkt afhængige af lipid antigen lastning i endocytic pathway5,19, 20,21.
CD1d endocytic handel er påvist ved hjælp af billedbehandling flowcytometri. Når han får et stort antal celle billeder ved hjælp af billedbehandling flowcytometri, begyndte vi at bruge programmet idéer til at visualisere individuelle cellulære billeder gennem bekvemt gating cellepopulationer Co farves med flere antistoffer (figur 2A). Specifikt, var vi i stand til gate befolkningens store DC Co farves med HLA-DR og CD11c til yderligere Vis DCs med CD1d og Lamp1 Co udtryk (figur 2A). Co farves signaler kan blive beriget gennem gating cellen befolkningen med dobbelt pletten af CD1d og Lamp1 (figur 2A). Vi først viste de ikke-eksponerede normale DCs med minimal colocalization af CD1d og Lamp1 proteiner, med angivelse af basal niveau for CD1d endocytic menneskehandel og højt niveau af overflade udtryk på fysiologiske tilstande (figur 2B)5, 19,20,21. For at måle colocalization af CD1d og Lamp1 proteiner, brugt vi oprindeligt ideer til at vise en svag stigning af lyse detaljer lighed mellem CD1d og Lamp1 proteiner med BaP eksponering13. Den lyse detaljer lighed var beregnet på baggrund af Pearsons korrelationskoefficient for afprøvning korrelation af to faktorer, mens CD1d og Lamp1 proteiner var usandsynligt meget overlappede i fysiologisk tilstand, der angiver, at CD1d er i stand til at forbigående trafik gennem sene endocytic rum at opnå funktionelle lipid antigener. Det er således mere biologisk meningsfuld at teste, om CD1d protein i BaP eksponering bevarer mere i de sene endocytic rum som reflekteres af den øgede andel af overlappende CD1d og Lamp1 proteiner ved hjælp af billedbehandling analyse software Fiji i de ImageJ pakke. Endelig kan tilbageholdelse af CD1d proteinet i slutningen endocytic rum bruges funktionelt bekræfte ændrede endocytic gen profiler i BaP eksponering.
Co lokaliserede intensitet og området mellem CD1d og Lamp1 proteiner blev målt. For at opnå en reproducerbar tærskel indstilling og procenter af co lokaliserede områder og intensitet, anvendte vi ImageJ-Fiji22, der også har været brugt i flere andre undersøgelser23,24,25. Vi tilfældigt vælge CD1d+Lamp1+ celler med stærk Co bejdse og klar subcellulært lokalisering af proteiner, CD1d og Lamp1 som input billeder (figur 2B). Enkelte cellulære billeder kan flettes til en enkelt billedfil til en sammenhængende analyse (figur 3A). I vores undersøgelse, vi flettet 100 celle billeder og åbnet det i programmet til at analysere ved at sætte "colocalisation tærskler" (figur 3B). Colocalization af pixel intensitet mellem to kanaler (PE-mærket CD1d og AF647-mærket Lamp1) var vist samlet med en scatterplot ved at afsløre de Co lokaliserede pixel fra disse 100 celle billeder (figur 4A). I dette plot, vandrette og lodrette linjer repræsenterer Costess tærskler og de Diagonale linjer repræsenterer forholdet mellem overordnede pixel intensitet mellem to kanaler. Den Costes tærskel giver en synlig indstilling for at fjerne svage pixels fra to overlappende kanaler. Det resulterede scatterplot viser en øget colocalization af CD1d og Lamp1 proteiner i BaP eksponering. Desuden kvantificeres vi graden af colocalization mellem CD1d og Lamp1 proteiner Manders koefficienterne (figur 4B). Derfor demonstrere Manders koefficienter øget colocalization mellem CD1d og Lamp1 i slutningen endocytic rum af BaP-eksponerede DCs sammenligning med ikke-eksponerede DCs, som statistisk understøttet af Student's t-test (figur 4B). Men hvis protein intensitet er heterogene mellem colocalized og ikke-colocalized, colocalized intensitet vil være uden sidestykke til colocalized områder. Derfor er det også nødvendigt at yderligere eksamen i colocalization baseret på intensitet (figur 4 c). Som et resultat, hver kolonne repræsenterer et gennemsnit beregning af procentdelen af colocalized intensitet fra flere celle billeder (n = 100) mellem BaP-eksponerede og ikke-eksponerede betingelser for et par Co lokaliserede proteiner. Student's t-test viser også Statistisk signifikans (n = 100, p< 0,001) mellem BaP-eksponerede og ikke-eksponerede grupper med angivne standard fejl. Alt viser vores data, at CD1d protein blev bevaret i slutningen endosomes på BaP eksponering, støtter denne BaP-ændret gen expression yderligere fører til forringet endocytic funktion og CD1d handel.
I Resumé øger CD1d-Lamp1 colocalization ved BaP eksponering. Flere parametre baseret på celle billeder (figur 2B), herunder scatterplots med overlappende pixel intensitet (figur 4A), forbedret Manders koefficienter (figur 4B), og steg andelen af overlappende intensitet ( Figur 4 c), støtte CD1d endocytic fastholdelse på BaP eksponering. Denne colocalization analyse af cellulære billeder er en nøjagtig tilgang til at bestemme graden af protein colocalization og demonstrere biologiske mekanismer af cellefunktioner, eksempelvis endocytic funktion overensstemmelse med forstyrret endocytic gen udtryk, yderligere bidrager til hæmmet aktivering af CD1d-begrænset T celler13.
Figur 1 : Undertrykkelse af netbårne af DC transcriptomes i BaP eksponering (A) rutediagram af RNA-FF. Først, kvalitetskontrol (QC) analyse blev udført for at undersøge kvaliteten af total RNA. Ved hjælp af en automatiseret system og høj kvalitet total RNA, som input, poly-A RNA blev isoleret, forarmet som demonstrerede rRNA i poly-A RNA QC analyse. Poly-A RNA blev derefter udsat for automatiseret bibliotek forberedelse og indeksering via PCR. Næste, den forstærkede bibliotek blev analyseret af et Bioanalyzer for QC med forventet udbytte og størrelse distribution. Efter qPCR kvantificering, indekseret biblioteker var samlet og grupperet på flow celle til sekvensering, og sekventering datakvalitet var real-time overvåges. Akse repræsenterer relative tællinger af flowcytometri farvning signaler. (B) Altered gener var grupperet i forskellige funktionelle klynger og gen klynger tilknyttet endocytic funktion og lipid metabolisme er vist. Red: CD1d; Grøn: Lamp1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Analyse af cellulære billeder ved hjælp af programmet idéer. (A) monocyt-afledte DCs fra raske donorer blev først låge på HLA-DR + CD11c + celler og yderligere låge på CD1d+Lamp1+ celler ved hjælp af programmet idéer. (B) cellulære billeder blev udvundet fra HLA-DR+CD11c+CD1d+Lamp1+ befolkning for cellulær billede visualisering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Analyse af cellulære billeder ved hjælp af programmet Fiji-ImageJ. Celler med stærk Co pletten af CD1d og Lamp1 proteiner var tilfældigt udvalgt til billedanalyse ved hjælp af Fiji-ImageJ, men celler * med usynlige eller svage farvning for enten CD1d eller Lamp1 protein var udelukket som i figur 2B. (A) disse tilfældigt udvalgte cellulære billeder blev samlet i en enkelt billedfil som et input billede. (B) colocalization analyse blev udført gennem indstillingen colocalization tærsklerne for både grøn og rød kanaler. Scatterplots blev genereret med tærsklen beregning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Colocalization af CD1d og lampe 1 proteiner. Ved hjælp af lignende datasæt rapporteret i Sharma et al. 13, co lokaliserede pixel intensitet mellem CD1d og Lamp1 proteiner fra DCs på BaP-eksponerede og ikke-eksponerede betingelser blev genberegnet og vist med scatterplots (A). Manders koefficienter for CD1d og Lamp1 colocalization blev beregnet og er vist med et gennemsnit fra markerede celle billeder (B). Procentdelen af co lokaliserede pixel intensitet var også beregnede (C). Statistisk signifikans (n = 100, p < 0,001) blev opnået med Student's t-test i forhold til den ikke-eksponerede gruppe. Standard fejl blev angivet. Data er fra en assay med celler fra raske donorer. To uafhængige assays blev udført med lignende resultater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Antistoffer | Fluorophores eller sekundær antistof | Klon |
| HLA-DR | Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | L243 |
| CD11c | Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | 3.9 |
| CD1c | Strålende violet 421 | L161 |
| Renset-anti-human CD1d | PE-anti-musen IgG2b | 51.1 |
| Lamp1 | Alexa Fluor 647 (AF647) | CD107a(H4A3) |
Tabel 1: antistofferne anvendes i denne undersøgelse. På grund af delte excitation og emission bølgelængder overlappet fluorophores PE/Cy5 og AF647 delvist på farvning signaler. Vi bruger disse fluorophores til at mærke en overflade proteiner (CD11c) og en intracellulær protein (Lamp1) henholdsvis at undgå deres signal overlapning på et subcellulært niveau. Vi bruger også optimal titrering og kompensation til at minimere de overlappede signaler mellem begge fluorophores.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Funktionelle bekræftelse af en ændret gen pathway udfordrende, på grund af almindeligt påvirket genekspression, der involverer flere veje og er vanskeligheden at integrere individuelle og befolkningsmæssige cellulære aktiviteter. Vi ansat imaging flowcytometri specifikt prøve CD1d menneskehandel i endocytic rum. Imaging flowcytometri integrerer den befolkningsmæssige måling af celler og individuelle demonstration af subcellulært colocalization af flere proteiner. Konfokal mikroskopi har tidligere givet høj opløsning i måling protein colocalization og flowcytometri er købedygtig levere omfattende fænotyper for forskellige cellepopulationer. Imaging flowcytometri kombinerer fordelene ved Konfokal mikroskopi og flowcytometri på acceptable billedopløsning analysere protein colocalization i en høj-profil måde efter funktionel bekræftelse af transkriptom ændring af miljømæssige forurenende stoffer.
Analyser af colocalization af flere proteiner i en befolkningsmæssige skala teknisk krævende, fordi (i) detaljerede analyser af flere individuelle celler er arbejdskrævende og relativt forudindtaget; (ii) det er vanskeligt at definere en optimal tærskel for at fortolke overlappende pixel baseret på intensitet eller område af positive farvning; og (iii) afbalanceret observation af individuelle og befolkningsmæssige celler er kritisk. I denne undersøgelse fokuserede vi på udfører en biologisk meningsfuld observation, en Statistisk signifikans test og en billeddannelse demonstration af co lokaliserede proteiner. For at nå dette mål, fået vi først tusindvis af billeder af menneskelige DCs ved hjælp af billedbehandling flowcytometri. Kvantitative analyser af imaging filer kombineret en lyse detaljer lighed analyse ved hjælp af software ideer og en statistisk afprøvede colocalization analyse ved hjælp af Fiji-ImageJ. Idéer-programmet giver mulighed for gating Co farves befolkningen, beregning af colocalization af to proteiner ved hjælp af Pearsons korrelationskoefficient-baserede lyse detaljer lighed, og tilfældigt vælge Co farvede celler med subcellulært lokalisering af proteiner13. For at opnå yderligere biologisk relevante demonstration af co lokaliserede proteiner, vi brugte ImageJ-Fiji software og anvendt den Mander koefficient for at beregne procentdelen af co lokaliserede områder og overlappede pixel intensitet for at vise graden af CD1d lokalisering i endocytic pathway.
Den kritiske trin for at bruge programmet ImageJ-Fiji er at udføre enkelt celle imaging analyse. Variation af procentdel protein colocalization fra enkelte celler kan kontrolleres i forhold til visuelt flettede farver fra enkelt celle billeder. Af gennemsnit procentdel protein colocalization fra alle 100 celler, kan middel og standardfejl beregnes for at demonstrere protein colocalization og funktionelle sammenhæng på en befolkningsmæssige plan. Denne Bioinformatik analyse er enkle og ligetil uden om tvetydige resultater, fordi denne analyse tilbyder en reproducerbar tærsklen beregning ved hjælp af Costess metode til at producere den samme resulterede tærskler for de samme datasæt og tilsvarende tærskelværdier for lignende datasæt26. Begrænsning af denne teknik er den arbejdskrævende manuelle input af enkelt celle billeder og potentielt subjektive udvalg af visuelt Co farvede celler ved hjælp af programmet idéer. I vores undersøgelse, vi analysere 100 celle billeder fra hver gruppe og vi indstille reproducerbare udvælgelseskriterier, herunder stærke Co farves signaler og fjerne subcellulært lokalisering af CD1d og Lamp1 proteiner. At overvinde disse begrænsninger kræver teknisk forbedring af analytisk software til at tillade batchanalyse og objektiv udvælgelse af enkelt celler baseret på morfologiske funktioner ud over farvning intensiteten forudsat ved flowcytometri. I sammendrag, kombinerede cellulære og befolkningen vil imaging analyse give meget reproducerbar, omfattende, statistisk afprøvede og biologisk relevante resultater af procentdel protein colocalization. Vi mener, at denne CD1d-Lamp1 colocalization analyse kan fungere som et vellykket eksempel på højt profilerede cellulære imaging analyser at besvare bredere spørgsmål om funktionelle og morfologiske ændringer af cellulære proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at videregive
Acknowledgments
Forfatterne takke Robert Giulitto (Hoxworth blod center) for menneskelige blodprøver og Dr. Liang Niu til normalisering af genekspression læser. Vi takker også tilskud fra nationale Institute of Environmental Health Sciences (ES006096), Center for miljømæssige genetik (CEG) pilot projekt (S.H.), National Institute for allergi og smitsomme sygdomme (AI115358) (S.H.), University of Cincinnati University Research Council award (S.H.), og University af Cincinnati College af medicin Enhancement kernefinansiering (X. Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transcriptomics | Illumina | HiSeq 2500 v4 | Illumina HiSeq system |
| ImagingStream X | Millipore | 100220 | Imaging flow cytometry |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fisher | Total RNA extraction | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent | Total RNA QC analysis | |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher | PCR, enzyme reaction | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England Biolab | PolyA RNA purification | |
| Automated SMARTer Apollo system | Takara | PolyA RNA purification | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolab | Library preparation | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | DNA purification | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) | Thermo Fisher | Library quantification | |
| NEBNext Library Quant Kit | New England Biolab | Library quantification | |
| cBot | Illumina | Library cluster generation | |
| TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot – HS | Illumina | Library cluster generation | |
| HiSeq 1000 | Illumina | Sequencing | |
| TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles) | Illumina | Sequencing | |
| Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | Bio Legend | L243 | |
| Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | Bio Legend | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | Bio Legend | L161 | |
| PE-anti-mouse IgG2b | Bio Legend | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) | Bio Legend | CD107a(H4A3) |
References
- Roche, P. A., Cresswell, P. Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells. Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).
- Huang, S., et al. MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells. The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).
- Nakamura, N., et al. Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling. Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).
- Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Zajonc, D. M., Kronenberg, M. CD1 mediated T cell recognition of glycolipids. Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).
- Cox, D., et al. Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules. PloS one. 4 (5), e5325 (2009).
- Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments. Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).
- Huang, S., et al. Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).
- de Jong, A., et al. CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens. Nature. 15 (2), 177-185 (2014).
- Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Sharma, M., et al. Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants. Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).
- Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).
- Nachamkin, I., et al. Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene. Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).
- Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems. Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).
- Bauer-Mehren, A. Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape). Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).
- Cline, M. S., et al. Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape. Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).
- Huang, S., Moody, D. B. Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system. Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).
- Huang, S. Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis. Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).
- Moody, D. B., Porcelli, S. A. Intracellular pathways of CD1 antigen presentation. Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9 (7), 676-682 (2012).
- Diard, M., et al. Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype. Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature. 9 (7), 697-710 (2012).
- Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).
