Summary
Durchflusszytometrie Imaging bietet einen idealen Ansatz um die morphologische und funktionelle Veränderung der Zellen auf individuelle und populational Ebene zu erkennen. Gestörten endocytic Funktion für Lipid Antigenpräsentation in Schadstoff-exponierten menschlichen dendritischen Zellen wurde mit einem kombinierten transkriptomischen Profilierung der Genexpression und morphologischen Demonstration des Handels mit Protein nachgewiesen.
Abstract
Populational Analysen der morphologischen und funktionellen Veränderung der endocytic Proteine sind aufgrund der Nachfrage der Bilderfassung in einer Einzelzelle Ebene und statistische Bildanalyse auf einem populational Niveau anspruchsvoll. Um diese Schwierigkeit zu überwinden, zum wir bildgebende Durchflusszytometrie und transkriptomischen profiling (RNA-Seq) veränderten subzelluläre Lokalisation des Clusters Differenzierung 1D Protein (CD1d) verbundenen bestimmen mit eingeschränkter endocytic Genexpression in menschlichen Dendritische Zellen (DCs), die die gemeinsame lipophilen ausgesetzt wurden Luft Schadstoff Benzo [a] pyren. Die NS1 CD1d und endocytic Marker Lamp1-Proteine aus Tausenden von Zelle Bilder mit imaging-Durchflusszytometrie wurde mit Ideen und ImageJ-Fidschi analysiert Programme. Zahlreiche zelluläre Bilder mit Co gefärbten CD1d und Lamp1 Proteine wurden nach Anspritzung auf CD1d visualisiert+Lamp1+ DCs mit Ideen. Die verbesserte CD1d und Lamp1 NS1 auf BaP Exposition weiter demonstriert wurde, mit thresholded Scatterplots, getestet mit Mander des Koeffizienten für Co lokalisierte Intensität und geplottet basierend auf dem Prozentsatz von Co lokalisierten Bereichen mit ImageJ-Fidschi. Unsere Daten bieten einen vorteilhaften Instrumental- und bioinformatische Ansatz zur Messung von Protein NS1 auf Einzel- und populational zellulären Ebenen beeinträchtigtes funktionelle Ergebnis transkriptomischen Änderung in Schadstoff-exponierten Menschen unterstützen DCs.
Introduction
Antigenpräsentation umfasst in der Regel intrazelluläre Protein Menschenhandel, die oft mit Morphologische Charakterisierung und phänotypischen Profilierung der antigenpräsentierende Zellen1,2,3 untersucht wurden . Um die Vorteile der Bildgebung und Phänotypisierung Methoden zu integrieren, beschreiben wir eine bildgebende Analyseplattform auf Einzelzelle und Einwohnerzahlen zu einem veränderten Protein NS1 in menschlichen dendritischen Zellen (DCs) zeigen. Im Peptid Antigenpräsentation große Histocompatibility complex (MHC) Klasse I Moleküle binden eine kurze Peptid (8-10 Rückstände) in das endoplasmatische Retikulum konventionellen CD8 aktivieren+ T-Zellen, während MHC-Klasse-II-Moleküle relativ länger binden Peptid (~ 20 Rückstände) in endocytic Fächern für konventionelle CD4 aktivieren+ T Zellen1,4. Im Gegensatz dazu werden Lipid-spezifischen T-Zellen durch CD1 Proteine mit Lipid-Antigenen, die vor allem in endocytic Fächern5,6geladen aktiviert. Lipid Antigenpräsentation erfordert die Versorgung von Lipid-Metaboliten in Lipid Metabolismus7,8,9,10 und das Laden von funktionalen Lipid-Metaboliten auf CD1 Proteine in produziert endocytic Fächer5,6. In diesem Zusammenhang kritisieren verschiedene zelluläre Faktoren modulieren Lipid Antigenpräsentation, vor allem in Umweltexposition von lipophilen Schadstoffen und Erkrankungen des Immunsystems, definiert werden. In dieser Studie verwendeten wir transkriptomischen Analyse, Bild Profilierung und zellulären und populational bildgebende Analyse der menschlichen Monocyte abgeleitet DCs bestimmen das endocytic Protein Menschenhandel zur Lipid Antigenpräsentation in Schadstoff-Exposition. Natürlich kann diese kombinierte Plattform genutzt werden, um Studium der subzellulären Protein Menschenhandel und NS1 in verschiedenen biologischen Prozessen.
Technisch, zeigte Protein subzelluläre Lokalisation in der Regel mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie und statistisch analysiert in einer begrenzten Anzahl von gefundenen Zellen1,2,3,11. Darüber hinaus wurde Durchflusszytometrie weitgehend auf Tor Zell-Populationen mit Co gefärbten Signale von mehreren Proteinen auf einem zellularen Niveau12angewendet; Das fehlen jedoch einer detaillierte Visualisierung der subzellulären Protein NS1. Um umfassende und statistische Analysen der Prozentsatz Protein NS1 Ebene Mobilfunk und der Bevölkerung zu erreichen, integrieren wir imaging Profilierung und Analyse Ansätze bestimmen die Eigenschaften des Proteins NS1 mit biologischen Relevanz. Insbesondere verwenden wir bildgebende Durchflusszytometrie NS1 CD1d und lysosomale verbundenen Membranprotein 1 (Lamp1) erkennen Proteine in dieser Studie. Quantitative Analyse der colocalized Moleküle war bisher schwierig, in einem populational Maßstab durchgeführt werden. In dieser Studie haben wir die ImageJ-Fidschi-Programm, den Anteil an Protein NS1 mit einer großen Anzahl von Co gefärbten Zellen populational und einzelner zellulärer Ebene untersuchen angepasst. Insbesondere haben wir gemessen Co lokalisierten Bereichen, Intensität und populational Größe zu der Schlussfolgerung, dass das CD1d-Protein weitgehend in späten endocytic Abteilen des menschlichen DCs in Exposition gegenüber einem lipophilen Schadstoffen Benzo [a] pyren (BaP)13 beibehalten wurde . Diese kombinierte zelluläre und Bevölkerung bildgebende Analyse zur Verfügung gestellt hoch reproduzierbare, umfassende und statistisch signifikante Ergebnisse der CD1d-Lamp1 NS1 für gehemmt Lipid Antigenpräsentation relevant.
Das Transkriptom des BaP-exponierten menschlichen DCs unterstützt nachdrücklich die Hypothese, dass endocytic Lipidstoffwechsel und CD1d endocytic Menschenhandel in BaP-Exposition beeinträchtigt wurden. Um diese Hypothese zu testen, haben wir bildgebende Durchflusszytometrie um die Bilder der DC Bevölkerung Profil, die mit mehreren Proteinen einschließlich CD1d, endocytic Markierungen und DC-Marker Co gebeizt wurden angewandt. Schließlich wurden Co gefärbten Zellen statistisch analysiert, um den Prozentsatz der Intensität und Bereiche der CD1d und Lamp1 NS1 zu demonstrieren.
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Protocol
Menschlichen Protokolle in dieser Studie wurden von der Institutional Review Board von der University of Cincinnati genehmigt und alle Methoden wurden gemäß den einschlägigen Richtlinien und Verordnungen durchgeführt. Die Hoxworth Blutzentrale am Medical Center University of Cincinnati wurden Blutproben von gesunden Spendern entnommen.
1. transkriptomischen Profilierung der Schadstoff ausgesetzt menschliche Monocyte abgeleitet DCs
- Insgesamt RNA-Extraktion von BaP-exponierten DCs
- Menschlichen DCs mit Zytokinen GM-CSF und IL-4 zu unterscheiden, und DCs, BaP für 4 Tage13setzen.
- BaP-exponierten DCs mit Durchflusszytometrie basierend auf der zum Ausdruck gebrachten Oberflächenmarker (Linie–HLA-DR+), von denen die meisten aus herkömmlichen DCs besteht zu sortieren (CD11c+CD1c+)13. In der Regel sortieren 10.000 DCs in Kulturmedium mit 10 % FBS, DCs bei 600 x g und 4 ° C für 6 min Zentrifugieren und umgehend entfernen den Überstand durch Absaugen mit einer 1 mL-Pipette-Spitze.
- Sobald der Überstand durch Absaugen entfernt wird, lösen Sie die Zelle Pellet durch Zugabe von 0,4 mL Lyse/Bindung Puffer aus dem RNA-Isolierung-Kit für die Lagerung in-80 ° C vor der RNA-Extraktion.
- Verwenden Sie das RNA-Isolierung-Kit mit dem total RNA-Extraktion-Protokoll, um total RNA-14zu extrahieren. Messen Sie die RNA-Integrität mit einem Bioanalyzer15.
- Transkriptomischen Analyse der sortierten DCs (Abbildung 1A)
- Bereiten Sie die Bibliothek für RNA-Seq mit einer RNA-Bibliothek Vorbereitungssatz. Kurzum: fragment die isolierte Poly-A-RNA (~ 200 bp), reverse transkribieren die Fragmente der 1. Strang der cDNA, und führen Sie durch den zweiten Strang cDNA Synthese mit dUTP beschriftet.
- Verbinden Sie Doppelstrang DNA an den Adapter mit einer Haarnadelstruktur nach Perle Reinigung, Reparatur von Ende und dA-Tailing. Verbrauchsteuern Sie die Uracil-Rückstände in den 2. Strang der cDNA und Adapter Schleife mit Benutzer (Uracil-spezifische Exzision Reagenz) Enzym Strang Spezifität und öffnen Sie die Adapter-Schleife für die PCR.
- Führen Sie 13 Zyklen der PCR mit universal und Index-spezifische Primer, um die indizierte Bibliothek zu bereichern. Bereinigen Sie die Bibliothek und laufen auf einem Bioanalyzer DNA hohe Empfindlichkeit Chip Bibliothek Qualitätsprüfung und Größenverteilung.
- Verwenden Sie eine Bibliothek Quantifizierung Kit und ein Echtzeit-PCR-System in Kombination mit Bibliotheksinformationen Größe berechnen Bibliothek Konzentration über eine Standardkurve Methode.
- Proportional individuell indizierte kompatible Bibliotheken zu bündeln und passen Sie die endgültige Gesamtkonzentration bis 15 Uhr. Führen Sie Bibliothek Cluster Generation und Sequenz der Bibliothek bei einer Einstellung von einzelnen lesen 1 x 50 bp, 25 Millionen Lesevorgänge pro Probe zu generieren.
- Sequenzierung
- Laden Sie die Sequenzierung und Reagenzien zu den SBS und PE-Reagenz-Racks bzw. Indizierung. Legen Sie die Reagenzien im Wasserbad Laborqualität 1 h, bis das Eis geschmolzen und der Reagenzien in jede Flasche/Tube richtig gemischt.
- Die ICB Mischung indem das aufgetaute Farbstoff und-20 ° C Enzym zu der Flasche zubereiten und mischen. Bereiten Sie eine NaOH-Lösung gemäß den Anweisungen der Sequenzierung. Platzieren Sie alle Reagenzien bei 4 ° C bis zum Gebrauch.
- Während der 1 h Wartezeit, schalten Sie den Sequenzer. Warten Sie, bis das DONOTEJECT Laufwerk erscheinen und verbinden den Computer auf ein Netzlaufwerk.
- Die Sequenzer-Steuerungs-Software zu starten.
- Bereiten Sie 2 L Wartung Waschlösung, die 0,5 % Tween 20 und 0,03 % enthält ProClin 300 in Laborqualität Wasser.
- Fügen Sie in der SBS-Reagenz-Rack hinzu ~ 100 mL Waschlösung Wartung zu jedem der 8 Flaschen und Schraubverschlüsse Trichter in die Flaschen. In der PE-Reagenz-Rack jedes der zehn 15 mL konische Rohre ~ 12 mL Waschlösung Wartung hinzu, und entsorgen Sie die Kappen.
- Laden Sie die beiden Zahnstangen mit der Lösung gefüllt Flaschen/Rohre zu den Sequenzer.
- Der Sequenzer-Steuerungssoftware wählen Sie die Wartung zu waschen; Folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm um die Sequenzer-Fluid-System zu reinigen, bis der Vorgang abgeschlossen ist.
- Starten Sie eine neue Folge im Register "Sequenz" aus der Software; leiten Sie die Ausgabedaten auf ein Netzlaufwerk. Wählen Sie Parameter für einzelne lesen 1 x 50 bp mit Einzelindex gemultiplext Bibliotheken.
- Optional, melden Sie sich bei BaseSpace Sequenz Hub, so dass der Sequenzierung Status über einen Computer oder Smartphone aus der Ferne überwacht werden kann.
- Laden ein Beispielblatt für die Entpackung und Reagenz Informationen entsprechend der Software-Anforderung.
- Laden Sie SBS und PE Reagenzien in den Sequenzer. Entlüften Sie das System mit einer gebrauchten Durchflusszelle (~ 15 min).
- Nach Abschluss die Cluster-Generation (~4.5 h), die Durchflusszelle herausnehmen, leicht spray die Messzelle mit Wasser und wischen Sie es mit Linsenpapier trocken. Leicht spray die Messzelle mit 95 % igem Ethanol und trocken wischen. Überprüfen Sie gegen ein Licht, um sicherzustellen, dass die Oberfläche sauber ohne Schmutz oder Salz Rückstand ist.
- Nachdem der Prime Schritt abgeschlossen ist, laden Sie die gruppierten Durchflusszelle und beginnen Sie die Sequenzierung. Die Sequenz-Analyse-Viewer-Software wird automatisch gestartet.
- Überwachen Sie die Sequenzierung Datenqualität über SAV einschließlich Cluster Dichte, liest-Pass-Filter, Cluster-Pass Filter %, % ≥Q30, Legacy Phase/Prophase %, Indizierung, QC, etc. , das hilft zu verstehen, die Datenqualität und zu beheben.
- Ändern Sie die Strömung Zelle Dichtung und führen Sie eine Wartung zu waschen, nachdem die Sequenzierung abgeschlossen ist. Der Sequenzer ist bereit für den nächsten Lauf.
- Bioinformatische Analyse
- Durchführen Sie Bioinformatik RNA-Seq-Daten-Analyse-13.
2. Weg-Analyse der transkriptomischen Profile (Abbildung 1 b)
- Mithilfe einer Staucher Bioconductor um resultierende gen Ausdruck Intensität zählt zwischen BaP-exponierten und nicht-exponierten DCs von drei Gebern zu vergleichen. Dann identifizieren differentiell exprimierten Genen zwischen BaP-exponierten und nicht-exponierten DCs auf Basis der absoluten Falte Änderung (> 2 Falten) und die falsche Entdeckung (FDR) - eingestellten p- Werte (< 0,05).
- Um die funktionale Cluster differentiell Vorhersagen ausgedrückt Gene, verwenden die ToppCluster-Software-Paket zu suchen die veränderten Gene gegen mehrere Datenbanken einschließlich KEGG und REACTOME und clustering Daten generieren. ToppCluster nutzt die hypergeometrische Test um funktionale Anreicherung über die gen Liste Anreicherung Analyse16zu erhalten.
- Weiter geben Sie die Ergebnisse aus dieser Funktion Cluster Cytoscape17,18 Version 3.3.0, eine allgemein verwendeten open-Source-Software-Plattform zur Visualisierung von komplexer Netzwerken. So werden die Gene in verschiedenen Clustern oder Wege, einschließlich endocytic Cluster und Fettstoffwechsel, in einem Netzwerk mit Farbe Anmerkung die gemittelten Falte Veränderung des Gens Ausdruck (Abbildung 1 b)13angezeigt.
(3) Bildgebung Durchflusszytometrie CD1d und Lamp1 NS1
- Antikörper Kennzeichnung von BaP-exponierten DCs
- Expose 0,5 x 106 menschlichen DCs 5,94 mm BaP für 4 Tage bei 37 ° C in 2 mL komplette Dulbecco geändert Eagle Medium. Ernten Sie DCs durch Zentrifugation bei 400 X g für 10 min. Block die differenzierte DCs durch Inkubation der Zellen mit humanem Serum-Blocker und Anti-Human Fc-Rezeptor Antikörper für 10 min im Eis, einschließlich Anti-Human CD64 CD16 und CD32 Antikörper.
- Inkubieren Sie brillante violett 421-Anti-CD1c (L161), Phycoerythrin/Cyanin färben 7 (PE/Cy7) - Anti - HLA-DR und PE/Cy5-Anti-CD11c mit DCs für 20 min in Eis. Tabelle 1 zeigt die Liste der Antikörper.
- DCs mit 4 % Paraformaldehyd in PBS befestigen und permeabilize sie mit Permeabilisierung Waschpuffer. Führen Sie die intrazelluläre Färbung mit einer Mischung aus PE-Label gereinigten Anti-Human CD1d (51,1) und Alexa Fluor 647-markierten Anti-Lamp1 (CD107a) (H4A3).
- Imaging-Zytometrie Durchflussmessung (Abbildung 2)
- Analysieren Sie die gefärbten Proben unter Verwendung einer bildgebenden Durchflusszytometer Herzstück Flow Cytometry Cincinnati Kinderkrankenhaus mit einem 40 X Objektiv 300 Pixel für eine Zelle mit ca. 10 mm Durchmesser liefern. Ein-Pixel-Größe ist ca. 0,5 mm x 0,5 mm des Objekts.
- 10.000 zellulären Bilder unvoreingenommen nach Anleitung des Herstellers zu erwerben.
4. Bildgebung Analysen der Flow Cytometry Bilder
- NS1 Analyse mit Ideen-Software (Abbildung 2)
- Führen Sie Entschädigung mit Single-gefärbten versus nicht-gefärbten Proben durch Festlegen der Fluoreszenzintensität-gefärbten Proben unterhalb der Schwelle, einschließlich nicht-gefärbten BaP-exponierten DCs mit BaP Autofluoreszenz, wie routinemäßige Flow Cytometry Daten Analyse.
- Tor gefärbten Zellen erhalten die Teilmengen von HLA-DR+CD11c+CD1d+Lamp1+ Zellen (Abbildung 2A) und zelluläre Bilder anzeigen in den gated Teilmengen (Abbildung 2 b).
- Speichern Sie Zelle Bilder im Png-Format basierend auf zwei technische Einschlusskriterien, die visuelle Präsenz der starke Co gefärbten Signale und subzelluläre Lokalisation der CD1d und Lamp1 Proteine, für die NS1-Analysen mit ImageJ-Fidschi (Abbildung 2 b).
- Verwenden Sie Software ImageJ-Fidschi NS1 Analyse (Abbildung 3).
- Bereiten Sie die Bild-Dateien durch die Zusammenlegung der 100 gespeicherte Zelle Bilder für nicht-exponierten und BaP-exponierten menschlichen DCs bzw. (Abb. 3A).
- Analysieren Sie CD1d (rot) und Lamp1 (grün) NS1 mit ein Streudiagramm.
- ImageJ-Fidschi-Programm ausführen. Öffnen Sie die PNG-Datei mit 100 Bildern der Zelle (Abb. 3 b und Abbildung 4A): "Datei | Offene".
- Das Bild mit zusammengeführten roten und grünen Kanäle in zwei Bilder mit einem roten oder grünen Kanals aufgeteilt: "Bild | Farbe | Split Kanäle".
- Zeichnen Sie ein Streudiagramm mit den Befehlen "Analyze | NS1 | NS1 Threshold". Speichern Sie das Streudiagramm mit der "PrintScreen" -Taste.
- Berechnen die Mander NS1 Koeffizienten für jedes Einzelbild zellulären (n = 100) (Abbildung 4 b)
- Wählen Sie eine einzelne Zelle Bild auf die Image-Datei mit Split-Kanäle mit der "Oval" Auswahl-Werkzeug.
- Verwenden Sie die Befehle "Analyze | NS1 | NS1 Threshold". Wählen Sie "Channel 1" aus der Dialogbox der Region of Interest (ROI). Halten Sie alle Berechnungsoptionen einschließlich der "Mander es Verwendung Schwellenwerte" für jedes Bild der Zelle.
- Wiederholen Sie diese Berechnung für alle 100 Zelle Bilder.
- Speichern Sie und öffnen Sie die Ergebnisse mit einer Tabellenkalkulation.
- Handlung der Durchschnitt und Standardfehler für "Thresholded Mander Koeffizienten" (n = 100, 0 bedeutet keine NS1 und 1 perfekte ns1). Verwenden Sie Studenten t-Test zur Berechnung des p -Wert für den Vergleich zwischen BaP-exponierten und nicht-exponierten Gruppen (Abbildung 4 b).
- Berechnen Sie den Prozentsatz der thresholded Pixel Intensität Co zwischen CD1d und Lamp1 für mehrere Bilder der Zelle lokalisiert (n = 100) (Abbildung 4).
- Verwenden Sie die gleiche Analyse-Protokoll in 4.2.3 und wählen Sie zusätzlich das Ergebnis Option "% Intensität über Schwelle colocalized".
- Führen Sie diese Analyse zusammen mit der Mander NS1 Koeffizienten.
- In ähnlicher Weise Grundstück dem Durchschnitt und Standardfehler für % Intensität zwischen CD1d und Lamp1 colocalized. Verwenden Sie Studenten t-Test zur Berechnung des p -Wert für den Vergleich zwischen BaP-exponierten und nicht-exponierten Gruppen (Abbildung 4).
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Representative Results
Die lipophile Schadstoff BaP verändert endocytic gen-Cluster in menschlichen DCs. Human Monocyte abgeleitet DCs von jedem Spender (n = 3) wurden mit BaP inkubiert und sortiert für konventionelle DCs, die weiter für RNA-Extraktion und transkriptomischen Analyse wie beschrieben verwendet wurden . Nach der Normalisierung der Genexpression wurden veränderte Gene zwischen BaP-exponierten und nicht-exponierten Gruppen entsprechend der funktionalen Zusammenhang differentiell exprimierten Gene gruppierten. Wir geben die veränderte Gen-Liste zu Toppcluster Programm16 für die Analyse der relevanten zelluläre Signalwege und führen den statistischen Test mit einer false Discovery Rate (FDR) Korrektur der p -Werte (Abbildung 1 b). Im BaP-exponierten DCs wurden mehrere große veränderte Gen-Cluster, Fettstoffwechsel und endocytic Funktionen, einschließlich identifiziert. In dieser Studie wir speziell für die Funktionsprüfung des endocytic Handels, weil CD1-vermittelten Antigenpräsentation wurde stark abhängig von der Lipid-Antigen laden im endocytic Weg5,19, 20,21.
CD1d endocytic Menschenhandel wird demonstriert mit bildgebenden Durchflusszytometrie. Nach dem erhalten einer großen Anzahl von Zelle Bilder mit bildgebenden Durchflusszytometrie, begannen wir mit dem Ideen-Programm, um zelluläre Einzelbilder durch bequem Anspritzung Zellpopulationen Co gebeizt mit mehreren Antikörper (Abbildung 2A) zu visualisieren. Insbesondere konnten wir zum Tor der Ballungszentren DC mit HLA-DR und CD11c um weitere DCs mit CD1d und Lamp1 Co Ausdruck (Abbildung 2A) zeigen Co gebeizt. Co gefärbten Signale durch Anspritzung der Zellpopulation mit doppelten Fleck CD1d und Lamp1 bereichert werden können (Abbildung 2A). Wir zeigten zuerst die nicht exponierten normalen DCs mit minimalen NS1 CD1d und Lamp1 Proteine, unter Angabe der basalen Ebene von CD1d endocytic Menschenhandel und hohes Maß an Oberflächenexpression bei physiologischen Bedingungen (Abb. 2 b)5, 19,20,21. Um die NS1 CD1d und Lamp1 Proteine zu messen, haben wir zunächst Ideen zeigen einen leichten Anstieg der hellen Detail Ähnlichkeit zwischen CD1d und Lamp1 Proteine mit BaP-Exposition-13. Die helle Detail Ähnlichkeit wurde basierend auf der Pearson Korrelationskoeffizient für die Korrelation der beiden Faktoren zu testen, während CD1d und Lamp1 Proteine unwahrscheinlich stark überlappt in physiologischen Zustand waren, darauf hinweist, dass CD1d kann berechnet vorübergehend Verkehr durch späten endocytic Fächer, funktionale Lipid-Antigene zu erhalten. So ist es mehr biologisch sinnvoll zu testen, ob das CD1d-Protein in der BaP-Exposition mehr in den späten endocytic Abteilen behält, wie Sie sich durch den erhöhten Prozentsatz von überlappenden CD1d und Lamp1 Proteine, die mit Hilfe der bildgebenden Analyse Software Fidschi in der ImageJ-Paket. Aufbewahrung des CD1d-Proteins im späten endocytic Fächer ist zu guter Letzt lässt sich funktional veränderte endocytic gen-Profile in der BaP-Exposition zu bestätigen.
Co lokalisierte Intensität und Fläche zwischen CD1d und Lamp1 Proteine gemessen wurde. Um eine reproduzierbare Schwellenwerteinstellung und Prozentsätze der Co lokalisierten Bereichen und Intensität zu erhalten, rechneten wir ImageJ-Fidschi,22, die auch in mehreren anderen Studien23,24,25verwendet worden ist. Wir wählen nach dem Zufallsprinzip CD1d+Lamp1+ Zellen mit starken Co Fleck und klare subzelluläre Lokalisation der CD1d und Lamp1 Proteine als Bilder (Abbildung 2 b). Zelluläre Einzelbilder können auf eine einzelne Image-Datei für eine konsequente Analyse (Abbildung 3A) zusammengeführt werden. In unserer Studie wir 100 Zelle Bilder zusammengeführt und eröffnete das Programm zu analysieren, indem Sie "Colocalisation Schwellenwerte" einstellen (Abb. 3 b). Die NS1 Pixel Intensität zwischen zwei Kanälen (PE-Label CD1d und AF647-mit der Bezeichnung Lamp1) insgesamt mit einem Streudiagramm zeigte sich durch die Erkennung der Co lokalisierte Pixel aus dieser Zelle 100 Bilder (Abb. 4A). In diesem Plot horizontale und vertikale Linien repräsentieren Costess Schwellenwerte und die diagonalen Linien stellen das Verhältnis der Pixel Gesamtintensität zwischen zwei Kanälen. Das Costes Schwelle bietet eine sichtbare Einstellung für schwache Pixel aus zwei überlappende Kanäle entfernen. Das führte Streudiagramm zeigt eine erhöhte NS1 CD1d und Lamp1 Proteine in BaP-Exposition. Darüber hinaus quantifiziert wir den Grad der NS1 zwischen CD1d und Lamp1 Proteine mit Mander Koeffizienten (Abbildung 4 b). Mander Koeffizienten zeigen folglich erhöhte NS1 zwischen CD1d und Lamp1 im späten endocytic Fächer der BaP-exponierten DCs Vergleich mit nicht-exponierten DCs, wie statistisch unterstützt durch Schüler des t-Tests (Abbildung 4 b). Jedoch wenn Protein Intensität zwischen colocalized und nicht colocalized Bereichen heterogen ist, werden colocalized Intensität beispiellose colocalized Bereiche. Daher ist es auch notwendig, weitere Prüfung die NS1 auf Intensität (Abbildung 4 basiert). Infolgedessen jede Spalte steht für eine durchschnittliche Berechnung der Prozentsatz der colocalized Intensität aus mehreren Bildern der Zelle (n = 100) zwischen BaP-exponierten und nicht-exponierten Bedingungen für ein paar Co lokalisierten Proteine. Student t-Tests zeigen auch statistischen Signifikanz (n = 100, p< 0,001) zwischen BaP-exponierten und nicht-exponierten Gruppen mit angegebenen Standardfehler. Unsere Daten zeigen insgesamt, dass das CD1d Protein in späten Endosomen bei BaP Belichtung beibehalten wurde, unterstützt die BaP-veränderte Genexpression weiter zur Beeinträchtigung der endocytic Funktion und CD1d Handel führt.
Zusammenfassend lässt sich sagen verbessert CD1d-Lamp1 NS1 bei BaP-Exposition. Mehrere Parameter basierend auf Zelle Bilder (Abb. 2 b), einschließlich Scatterplots mit überlappenden Pixel Intensität (Abb. 4A), verstärkt Mander Koeffizienten (Abbildung 4 b) und Anteil der überlappenden Intensität ( gestiegen Abbildung 4), CD1d endocytic Retention bei BaP-Exposition zu unterstützen. Diese NS1 Analyse der zellulären Bilder ist eine präzise Annäherung an bestimmen den Grad der Protein NS1 und biologische Mechanismen der Zellfunktionen, zeigen beispielsweise endocytic Funktion konsistent mit gestörten endocytic gen Ausdruck,13Zellen weiter einen Beitrag an die gehemmte Aktivierung der T CD1d eingeschränkt.
Abbildung 1 : Störung der DC Transkriptom BaP-Exposition (A) Flussdiagramm der RNA-seq. Erstens wurde Qualitätskontrolle (QC) Analyse durchgeführt, um die Qualität der gesamten RNA zu untersuchen. Mit einem automatisierten System und qualitativ hochwertige Gesamt-RNS wie Eingang, Poly-A-RNA isoliert wurde, erschöpft nachwiesen rRNA in Poly-A-RNA QC-Analyse. Die Poly-A-RNA wurde dann zur automatisierten Bibliothek unterzogen Vorbereitung und Indizierung über PCR. Als nächstes wurde die verstärkte Bibliothek einem Bioanalyzer für QC mit erwartete Rendite und Größenverteilung analysiert. Nach qPCR Quantifizierung, indizierte Bibliotheken wurden gebündelt gruppierten auf Durchflusszelle für die Sequenzierung und die Datenqualität der Sequenzierung wurde in Echtzeit überwacht. Die Achse repräsentiert die relative Anzahl der Durchflusszytometrie Fleckenbildung Signale. (B) Altered Gene wurden in verschiedene funktionale Cluster gruppiert und die gen-Cluster mit endocytic Funktion und Lipid-Stoffwechsel verbunden werden angezeigt. Rot: CD1d; Grün: Lamp1. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Analyse der zellulären Bilder mit dem Programm Ideen. (A) Monocyte abgeleitet DCs von gesunden Spendern waren erstens gated auf HLA-DR + CD11c + Zellen und weiter auf gated CD1d+Lamp1+ Zellen mit dem Ideen-Programm. (B) zellulären Bilder wurden aus der HLA-DR-+CD11c extrahiert+CD1d+Lamp1+ Bevölkerung für die zelluläre Bild Visualisierung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Analyse der zellulären Bilder mit dem Fidschi-ImageJ Programm. Zellen mit starken Co Fleck CD1d und Lamp1 Proteine wurden nach dem Zufallsprinzip ausgewählt, für die Bildanalyse mit Fidschi-ImageJ, aber Zellen * mit unsichtbaren oder schwache Färbung für CD1d oder Lamp1 Protein wurde ausgeschlossen, wie in Abbildung 2 b. (A) diese zufällig ausgewählten Handy Bilder wurden in eine einzelne Bilddatei als Eingabe Bild zusammengesetzt. (B) die NS1 Analyse wurde durchgeführt durch die NS1 Schwellenwerte für grüne und rote Kanäle einstellen. Die Scatterplots wurden mit Schwellenwertberechnung generiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : NS1 von Proteinen, CD1d und Lampe 1. Mit ähnlichen Dataset berichtet in Sharma Et al. 13, Co lokalisierte Pixel Intensität zwischen CD1d und Lamp1 Proteine aus DCs zu BaP-exponierten und nicht-exponierten Bedingungen wurde neu berechnet und mit Scatterplots (A) gezeigt. Mander Koeffizienten für CD1d und Lamp1 NS1 wurden berechnet und sind mit einem Durchschnitt von ausgewählten Zelle Bilder (B) gezeigt. Der Anteil der Co lokalisierte Pixel Intensität war auch berechnete (C). Statistische Signifikanz (n = 100, p < 0,001) wurde mit Student t-Tests im Vergleich zu der nicht exponierten Gruppe erhalten. Standardfehler angegeben wurden. Die Daten stammen aus einem Assay mit Zellen eines gesunden Spenders. Zwei unabhängige Tests wurden mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Antikörper | Fluorophore oder sekundäre Antikörper | Klon |
| HLA-DR | Phycoerythrin/Cyanin 7 (PE/Cy7) | L243 |
| CD11c | Phycoerythrin/Cyanin 5 (PE/Cy5) | 3.9 |
| CD1c | Brillante violett 421 | L161 |
| Gereinigte Anti-Human CD1d | PE-Anti-Maus IgG2b | 51.1 |
| Lamp1 | Alexa Fluor 647 (AF647) | CD107a(H4A3) |
Tabelle 1: in dieser Studie verwendeten Antikörper. Aufgrund der gemeinsamen Anregung und Emission Wellenlängen überlagert Fluorophore PE/Cy5 und AF647 teilweise an Färbung Signale. Wir verwenden diese Fluorophore, eine Oberfläche (CD11c) und eine intrazelluläre Protein (Lamp1) bzw. zu deren Signal Überschneidungen vermeiden auf subzellulärer Ebene zu kennzeichnen. Wir verwenden auch optimale Titration und Entschädigung, um die überlappende Signale zwischen beiden Fluorophore zu minimieren.
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Discussion
Funktionale Bestätigung über eine veränderte Gen Weg ist anspruchsvoll, wegen der stark belasteten Genexpression, an denen mehrere Wege und die Schwierigkeit, individuelle und populational Zellaktivitäten zu integrieren. Wir beschäftigten bildgebenden Durchflusszytometrie, speziell Test CD1d Handel in endocytic Fächern. Imaging Durchflusszytometrie integriert die populational Messung der Zellen und die individuelle Demonstration der subzellulären NS1 mehrere Proteine. Konfokale Mikroskopie hat zuvor hohen Auflösung bei der Messung von Protein NS1 und Durchflusszytometrie ist in der Lage, umfassende Phänotypisierung für unterschiedliche Zellpopulationen. Imaging-Durchflusszytometrie verbindet die Vorteile der konfokalen Mikroskopie und Durchflusszytometrie mit akzeptablen Bildauflösung Protein NS1 in gewissem Sinne hochkarätigen für funktionale Bestätigung der transkriptomischen Veränderung von Umwelt analysieren Schadstoffe.
Analysen des NS1 mehrere Proteine in einer populational Skala sind technisch anspruchsvoll, da (i) Analysen von mehreren Einzelzellen detaillierte sind arbeitsintensiv und relativ voreingenommen; (Ii) Es ist schwierig, einen optimalen Schwellenwert für die Interpretation der überlappenden Pixel anhand der Intensität oder Bereich der positive Färbung zu definieren; und (Iii) ausgewogene Beobachtung der individuellen und populational Zellen ist von entscheidender Bedeutung. In dieser Studie konzentrierten wir uns auf eine biologisch sinnvolle Beobachtung, eine statistische Signifikanz-Test und eine bildgebende Demonstration von Co lokalisierten Proteinen durchführen. Um dieses Ziel zu erreichen, erhalten wir Tausende von Bildern der menschlichen DCs mit bildgebenden Durchflusszytometrie. Quantitative Analysen von imaging-Dateien kombiniert eine helle Detail Ähnlichkeit mit der Software Ideen und eine statistisch getesteten NS1 Analyse mit Fidschi-ImageJ. Das Ideen-Programm ermöglicht Anspritzung Co gefärbten Bevölkerung, NS1 zweier Proteine mit Pearsons Korrelationskoeffizient basierende heller Detail Ähnlichkeit, Berechnung und Auswahl nach dem Zufallsprinzip Co gefärbten Zellen mit subzelluläre Lokalisation der Proteine-13. Um die biologische relevanten Demonstration von Co lokalisierten Proteinen weiter zu erreichen, wir ImageJ-Fidschi-Software verwendet und die Mander Koeffizienten zur Berechnung des Anteils des Co lokalisierten Bereichen angewendet und überlappten Pixel Intensität um den Grad an zeigen CD1d Lokalisierung in den endocytic Weg.
Der entscheidende Schritt für die Verwendung von ImageJ-Fidschi-Programm ist es, einzelne Zelle bildgebende Analyse durchführen. Variation der Prozentsatz Protein NS1 aus einzelnen Zellen kann im Vergleich zu visuell zusammengeführten Farben aus Bildern einzelne Zelle überwacht werden. Anhand der durchschnittlichen Prozentsatz Protein NS1 aus allen 100 Zellen, können die Mittel und Standardfehler berechnet werden, Protein NS1 und funktionalen Zusammenhang auf populational Niveau nachweisen. Diese Bioinformatik-Analyse ist einfach und unkompliziert ohne mehrdeutige Ergebnisse, da diese Analyse eine reproduzierbare Schwellenwertberechnung bietet das Costes-Methode verwenden, um dasselbe zu produzieren führte Schwellenwerte für die gleichen Datensätze und ähnliche Schwellenwerte für ähnliche Datensätze26. Die Einschränkung dieser Technik ist die arbeitsintensive manuelle Eingabe der einzelnen Zelle Bilder und potenziell subjektive Auswahl von optisch Co gefärbten Zellen mit Hilfe der Ideen-Software. In unserer Studie analysieren wir 100 Zelle Bilder aus jeder Gruppe und wir reproduzierbare Auswahlkriterien, einschließlich starke Co gefärbten Signale setzen und klare subzelluläre Lokalisation der CD1d und Lamp1 Proteine. Diese Beschränkungen zu überwinden erfordert eine technische Verbesserung der Analysesoftware Chargenanalyse ermöglichen und objektive Auswahl einzelner Zellen auf Basis von morphologischen Merkmalen über die Färbung Intensität von Durchflusszytometrie zur Verfügung gestellt. Zusammenfassung, kombinierte zelluläre und Bevölkerung sorgen bildgebende Analyse hoch reproduzierbare, umfassenden statistisch getestet und biologisch relevante Ergebnisse der Prozentsatz Protein NS1. Wir glauben, dass diese CD1d-Lamp1 NS1 Analyse als ein gelungenes Beispiel für hochkarätige zelluläre Bildgebung Analysen für breitere Fragen auf funktionelle und morphologische Veränderung der zelluläre Proteine dienen kann.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben
Acknowledgments
Die Autoren danken Robert Giulitto (Hoxworth Blutzentrale) für menschlichen Blutproben und Dr. Liang Niu für die Normalisierung der Genexpression liest. Wir danken auch Zuschüsse aus dem National Institute of Environmental Health Sciences (ES006096), Zentrum für ökologische Genetik (CEG) Pilotprojekt (SH), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (AI115358) (s.h.), Universität Cincinnati University Research Council Award (SH) und Universität von Cincinnati College of Medizin Enhancement Grundfinanzierung (X. Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transcriptomics | Illumina | HiSeq 2500 v4 | Illumina HiSeq system |
| ImagingStream X | Millipore | 100220 | Imaging flow cytometry |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fisher | Total RNA extraction | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent | Total RNA QC analysis | |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher | PCR, enzyme reaction | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England Biolab | PolyA RNA purification | |
| Automated SMARTer Apollo system | Takara | PolyA RNA purification | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolab | Library preparation | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | DNA purification | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) | Thermo Fisher | Library quantification | |
| NEBNext Library Quant Kit | New England Biolab | Library quantification | |
| cBot | Illumina | Library cluster generation | |
| TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot – HS | Illumina | Library cluster generation | |
| HiSeq 1000 | Illumina | Sequencing | |
| TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles) | Illumina | Sequencing | |
| Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | Bio Legend | L243 | |
| Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | Bio Legend | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | Bio Legend | L161 | |
| PE-anti-mouse IgG2b | Bio Legend | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) | Bio Legend | CD107a(H4A3) |
References
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