Summary
Imágenes de citometría de flujo proporciona un enfoque ideal para detectar la alteración morfológica y funcional de las células a nivel individual y poblacional. Alteración función endocíticas para la presentación de antígeno lípido en las células dendríticas humanas expuestas al contaminante se demostró con un combinado transcriptómicos de perfiles de expresión génica y manifestación morfológica de la proteína trata.
Abstract
Análisis poblacionales de la alteración morfológica y funcional de proteínas endocíticas son difíciles debido a la demanda de captura de la imagen en un análisis estadístico y nivel de la imagen de unicelular a nivel poblacional. Para superar esta dificultad, utilizamos imágenes de citometría de flujo y transcriptómicos perfiles (RNA-seq) para determinar localización subcelular alterado del grupo de proteínas de 1d de diferenciación (CD1d) asociado con expresión génica endocíticas deteriorada en humanos las células dendríticas (DCs), que fueron expuestas a la común lipofílico aire agente contaminador benzo [a] pireno. La colocalización de CD1d y proteínas endocíticas marcador Lamp1 de miles de imágenes celular con citometría de flujo de imagen fue analizada usando IDEAS y ImageJ-Fiji programas. Numerosas imágenes de celulares con proteínas Co teñidas de CD1d y Lamp1 fueron visualizados después de bloquear el CD1d+Lamp1+ DCs con IDEAS. La colocalización CD1d y Lamp1 mejorada sobre BaP exposición quedó demostrada además con thresholded diagramas de dispersión, probado con coeficientes de Mander de intensidad Co localizada y trazado basado en el porcentaje de áreas Co localizadas con ImageJ-Fiji. Nuestros datos proporcionan un enfoque instrumental y bioinformáticas ventajoso para medir la colocalización de proteínas a nivel celular individual y poblacional, apoyar un resultado funcional deterioro de transcriptómicos alteración en humanos expuestos a contaminantes DCs.
Introduction
Presentación del antígeno implica típicamente la proteína intracelular trata de personas, que se ha investigado a menudo mediante caracterización morfológica y fenotípica mediante perfiles del antígeno que presenta las células1,2,3 . Para integrar las ventajas de la proyección de imagen y métodos phenotyping, describimos una plataforma de análisis imágenes a nivel de la población para demostrar una colocalización de proteínas alteradas en células dendríticas humanas (DCs) y unicelular. En la presentación del antígeno del peptide, complejo principal de histocompatibilidad (MHC) clase I moléculas un péptido corto (8-10 residuos) se unen en el retículo endoplásmico para activar convencional CD8 células+ T, mientras que las moléculas de MHC clase II unen un relativamente largo péptido (~ 20 residuos) en compartimentos endocíticos activar convencionales CD4+ T las células1,4. Por el contrario, lípidos específicos de células T son activadas por proteínas CD1 con antígenos de lípidos cargados principalmente en compartimentos endocíticos5,6. Presentación del antígeno lípido requiere el suministro de metabolitos de lípidos producidos en lípidos metabolismo7,8,9,10 y la carga de metabolitos de lípidos funcionales a las proteínas CD1 en compartimentos endocíticos5,6. En este contexto, varios factores celulares modulando la presentación del antígeno lipídico, especialmente en la exposición ambiental de contaminantes lipofílicos y trastornos del sistema inmune, son críticos para definir. En este estudio, se utilizan análisis transcriptómico, perfiles de imagen y análisis de imagen celular y poblacional de DCs derivados de monocitos humanos para determinar el tráfico de proteínas endocíticas que contribuyen a la presentación del antígeno lípido en la exposición de contaminantes. Ciertamente, esta plataforma combinada puede aplicarse al estudio de tráfico de proteínas subcelulares y colocalización en diferentes procesos biológicos.
Técnicamente, la localización subcelular de la proteína fue demostrada generalmente usando microscopia confocal y analizados estadísticamente en un número limitado de células detectado1,2,3,11. Por otra parte, citometría de flujo ha sido ampliamente aplicada a poblaciones de la célula de la puerta con señales Co teñidas de múltiples proteínas en un nivel celular12; sin embargo, esto carece de una visualización detallada de colocalización de proteínas subcelulares. Para lograr el análisis integrales y estadísticos de porcentaje colocalización de proteínas a nivel celular y población, incorporamos enfoques de perfiles y análisis para determinar las características de la colocalización de la proteína con biológicos la proyección de imagen relevancia. Específicamente, utilizamos proyección de imagen de citometría de flujo para detectar la colocalización de CD1d y proteína de la membrana lisosomal asociada 1 (Lamp1) proteínas en este estudio. Análisis cuantitativo de moléculas colocalized era previamente difícil de realizarse a escala poblacional. En este estudio, adaptó el programa ImageJ-Fiji examinar el porcentaje de colocalización de proteínas con un gran número de células Co nivel celular tanto poblacional como individual. En concreto, hemos medido áreas Co localizadas, intensidad y tamaño poblacional para apoyar la conclusión de que la proteína de CD1d en gran parte se mantuvo en compartimentos endocíticos finales de humanos DCs en la exposición a un contaminante lipofílico benzo [a] pireno (BaP)13 . Este combinado celular y población de análisis proporcionan resultados altamente reproducibles, integrales y estadísticamente significativos de CD1d-Lamp1 colocalización correspondiente a la presentación del antígeno lípido inhibido.
El transcriptoma de DCs humanos expuestos al BaP apoya firmemente la hipótesis de que lípidos endocíticas y CD1d endocíticas tráfico fueron deterioradas en exposición de BaP. Para probar esta hipótesis, aplicamos imagen flujo cytometry Profile a las imágenes de la población de DC que co fueron manchadas con múltiples proteínas incluyendo CD1d, marcadores endocíticos y DC. Por último, co células se analizaron estadísticamente para demostrar el porcentaje de intensidad y zonas de CD1d y Lamp1 colocalización.
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Protocol
Protocolos de humanos en este estudio fueron aprobados por la Junta de revisión institucional de la Universidad de Cincinnati y se realizaron todos los métodos de las normas y directrices pertinentes. Se obtuvieron muestras de sangre de donantes sanos desde el centro de sangre de centro en centro médico de la Universidad de Cincinnati.
1. transcriptómicos perfiles de expuestos a contaminantes derivados de monocitos humanos DCs
- Extracción de RNA total de DCs BaP-expuesto
- Diferenciar DCs humanas mediante citocinas GM-CSF e IL-4 y expuestos DCs BaP durante 4 días13.
- Tipo DCs BaP expuestos mediante citometría de flujo basado en los marcadores superficiales expresados (linaje–HLA-DR+), la mayoría de los cuales consiste en DCs convencionales (CD11c+CD1c+)13. Por lo general, ordenar 10.000 DCs en medio de cultivo con 10% FBS, Centrifugue DCs a 600 x g y 4 ° C durante 6 minutos y retire inmediatamente el sobrenadante por aspiración utilizando una pipeta de 1 mL.
- Una vez retirado el sobrenadante por aspiración, lyse el precipitado de células mediante la adición de 0,4 mL de tampón de lisis/atascamiento del kit de aislamiento de RNA para el almacenaje de-80 ° C antes de la extracción de RNA.
- Utilice el kit de aislamiento de RNA con el protocolo de extracción de RNA total para extraer el RNA total14. Medir la integridad del RNA usando un equipo Bioanalyzer15.
- Análisis transcriptómico de DCs ordenadas (figura 1A)
- Preparar la biblioteca usando un kit de preparación de la biblioteca de RNA RNA-seq. En Resumen, fragmento del RNA aislado de poly-A (~ 200 bp), retroceso transcribir los fragmentos a la 1 º hebra de cDNA y seguir por la segunda síntesis de cDNA de filamento con dUTP.
- Ligar el cDNA de doble cadena al adaptador con una estructura de lazo del vástago después de la purificación de grano, reparación final y dA seguimiento. Suprimir los residuos de uracilo en el filamento 2 del cDNA y el adaptador de bucle con enzima de usuario (Uracil-específicas supresión reactivo) para mantener la especificidad de la cadena y abrir el bucle adaptador para PCR.
- Realizar 13 ciclos de PCR usando las cartillas universales y específicas de índice para enriquecer la biblioteca indexada. Limpieza de la biblioteca y ejecuta en un chip de equipo Bioanalyzer ADN de alta sensibilidad para comprobar la calidad de biblioteca y distribución del tamaño.
- Utilice un kit de cuantificación de la biblioteca y un sistema PCR en tiempo real combinado con información de tamaño de la biblioteca para calcular concentración de biblioteca a través de un método de la curva estándar.
- Proporcional piscina bibliotecas compatibles individualmente indexadas y ajustar la concentración total final a 15 pM. Realizar la generación del cluster de biblioteca y la biblioteca en un entorno de lectura solo 1 x 50 bp para generar 25 millones lecturas por muestra la secuencia.
- Secuencia
- Carga la secuenciación e indexación reactivos a los estantes el reactivo SBS y PE, respectivamente. Colocar los reactivos en un baño de agua grado laboratorio para 1 h hasta que el hielo se haya derretido y los reactivos en cada tubo de botella se mezclan correctamente.
- Preparar la mezcla ICB añadiendo la enzima descongelada de tinte y -20 ° C a la botella y mezclar. Preparar una solución de NaOH según las instrucciones de la secuencia. Coloque todos los reactivos a 4 º C hasta que esté listo para usar.
- Durante 1 h en espera, energía en el secuenciador. Espere para que DONOTEJECT y conectar el ordenador a una unidad de red.
- Ejecute el software de control del secuenciador.
- Preparar 2 L de solución de lavado de mantenimiento que contiene 0,5% de Tween 20 y 0.03% ProClin 300 grado laboratorio en agua.
- En el estante el reactivo SBS, añadir ~ 100 mL de solución de lavado mantenimiento a cada una de las 8 botellas, embudo de tapones a las botellas. En el estante el reactivo PE, añadir ~ 12 mL de solución de lavado mantenimiento a cada uno de los diez tubos cónicos de 15 mL y desechar los tapones.
- Racks de carga los dos con la solución llenaron de botellas y tubos para el secuenciador.
- En el software de control del secuenciador, elija la lavado de mantenimiento; Siga las instrucciones en pantalla para limpiar el sistema secuenciador del líquido hasta que se complete el proceso.
- Iniciar un nuevo funcionamiento en la pestaña de "Secuencia" del software; directa de los datos de salida a una unidad de red. Seleccione parámetros para leer solo 1 x 50 bp con bibliotecas de índice único multiplexado.
- Opcionalmente, inicie sesión en el centro de la secuencia de BaseSpace para que el estado de la secuencia puede controlarse remotamente a través de un ordenador o teléfono inteligente.
- Subir una hoja de muestra para demultiplexar y proporcionar información de reactivo según el requisito de software.
- Carga de reactivos SBS y del PE para el secuenciador. Cebe el sistema con una celda de flujo utilizado (~ 15 min).
- Una vez completada la generación del cluster (~4.5 h), sacar la celda de flujo, rocíe ligeramente la celda de flujo con agua y limpie lo seque con papel de lente. Ligeramente rocíe la celda de flujo con etanol al 95% y limpíelo seco. Cotejar con una luz para asegurarse de que la superficie esté limpia sin restos o residuos de sal.
- Después de que el primer paso es completa, la célula de flujo agrupado de carga y comenzar la secuenciación. Automáticamente se iniciará el software visor de análisis de secuencia.
- Monitorear la calidad de datos de secuenciación mediante SAV incluyendo densidad de cluster, Lee filtro, cluster pase filtro %, % ≥Q30, % de fase/profase de legado, indexación, control de calidad, etc. que esto ayuda a entender la calidad de los datos y solucionar problemas.
- Cambiar la Junta de la célula de flujo y realizar un lavado de mantenimiento después de completa la secuencia. El secuenciador está listo para la siguiente ejecución.
- Análisis Bioinformático
- Realizar bioinformática RNA-seq datos análisis13.
2. vía análisis de los perfiles transcriptómicos (figura 1B)
- Utilizar bordeadora Bioconductor para comparar cuentas de intensidad de expresión gen resultante entre DCs BaP expuestos y no expuestos de tres donantes. Luego, identificar genes diferencialmente expresados entre DCs BaP expuestos y no expuestos, basados en el cambio de doble absoluta (> 2 pliegues) y el descubrimiento de falsos valores (FDR) - ajustado p- la tarifa (< 0.05).
- Para predecir los grupos funcionales de diferencialmente expresados genes, utilice el paquete de software ToppCluster para buscar los genes alterados contra varias bases de datos incluyendo KEGG y REACTOME y generar datos de clustering. ToppCluster utiliza la prueba hipergeométrica para obtener enriquecimiento funcional mediante el gen lista enriquecimiento análisis16.
- Entrada adicional de los resultados de estos grupos de función a Cytoscape17,18 versión 3.3.0, una plataforma de software de código abierto ampliamente utilizado para la visualización de redes complejas. Así, los genes implicados en diferentes grupos o vías, incluyendo clusters endocíticas y metabolismo de los lípidos, se muestran en una red con anotación de color del doblez medio cambio de gene expresión (figura 1B)13.
3. proyección de imagen de citometría de flujo de CD1d y colocalización Lamp1
- Anticuerpo etiquetado de DCs BaP-expuesto
- Exponer 0.5 x 106 DCs humanos 5,94 mM BaP durante 4 días a 37 ° C en 2 mL de completa Dulbecco medio modificado Eagle. La cosecha DCs por centrifugación a 400 x g durante 10 min bloque DCs diferenciadas por incubar las células con bloqueador de suero humano y anticuerpos anti-humanos Fc durante 10 min en hielo, incluyendo anticuerpos CD16, CD32 y CD64 humanos.
- Incubar violeta brillante 421-anti-CD1c (L161), ficoeritrina/Cianina tinte 7 (PE/Cy7) - anti - HLA-DR y PE/Cy5-anti-CD11c con DCs por 20 min en hielo. La tabla 1 muestra esta lista de anticuerpos.
- Fijar DCs con paraformaldehído al 4% en PBS y permeabilizar con tampón de lavado de permeabilización. Realizar la tinción intracelular con una mezcla de PE con la etiqueta purificada humana CD1d (51.1) y Alexa Fluor 647-labeled anti-Lamp1 (CD107a) (H4A3).
- Medida de la citometría de flujo (figura 2) la proyección de imagen
- Analizar las muestras teñidas utilizando un citómetro de flujo de imágenes en la base de cytometry del flujo del Hospital infantil de Cincinnati con un objetivo de X 40 a 300 píxeles para una celda con alrededor de 10 mm de diámetro. Tamaño de un píxel es aproximadamente de 0,5 mm por 0.5mm del objeto.
- Adquirir 10.000 imágenes celulares de una manera imparcial según las instrucciones del fabricante.
4. proyección de imagen de análisis de imágenes de citometría de flujo
- Análisis de colocalización utilizando el software de IDEAS (figura 2)
- Realizar la compensación con teñido solo versus muestras no manchado por ajuste de la intensidad de fluorescencia de las muestras no manchado por debajo del umbral, incluyendo manchado no expuestos al BaP DCs con autofluorescencia BaP, como datos de citometría de flujo rutinario Análisis.
- Puerta de tinción de células para obtener los conjuntos de HLA-DR-+CD11c+CD1d+Lamp1+ las células (figura 2A) y mostrar imágenes celulares en los subconjuntos cerrados (figura 2B).
- Guardar celular imágenes en png formato basado en dos criterios de inclusión técnica, la presencia visual de señales Co manchas fuertes y localización subcelular de las proteínas de CD1d y Lamp1, para el análisis de colocalización con ImageJ-Fiji (figura 2B).
- Utilice el software ImageJ-Fiji para realizar análisis de colocalización (figura 3).
- Prepare los archivos de imagen de entrada por la fusión de las 100 imágenes de celulares guardados para DCs humanos no expuestos y expuestos al BaP, respectivamente (Figura 3A).
- Analizar CD1d (rojo) y Lamp1 colocalización (verde) utilizando un diagrama de dispersión.
- Ejecute el programa ImageJ-Fiji. Abra el archivo .png con 100 imágenes de la célula ( Figura 4Ayfigura 3B ): "archivo | Abrir".
- Dividir la imagen con los canales rojos y verdes combinados en dos imágenes con un rojo o un canal verde: "imagen | Color | Dividir canales".
- Dibujar un diagrama de dispersión usando los comandos "analizar | Colocalization | Umbral de colocalización". Guardar el diagrama de dispersión con la tecla "ImprPant" .
- Calcular coeficientes de colocalización de Mander para cada imagen de celular solo (n = 100) (Figura 4B)
- Seleccionar una imagen de célula en el archivo de imagen con canales de split con el "Oval" herramienta de selección.
- Utilice los comandos "analizar | Colocalization | Umbral de colocalización". Seleccione el "Canal 1" en el cuadro de diálogo de la región de interés (ROI). Mantener todas las opciones de cálculo incluyendo "Mander utilizando umbrales" para cada imagen de la célula.
- Repetir este cálculo para todas las imágenes de 100 células.
- Guardar y abrir los resultados utilizando una hoja de cálculo.
- Parcela el promedio y error estándar para los "Coeficientes de Mander thresholded" (n = 100, 0 significa no colocalización y 1 colocalization perfecto). Utilizar la prueba t de Student para calcular el valor de p para la comparación entre grupos BaP expuestos y no expuestos (Figura 4B).
- Calcular el porcentaje de intensidad de pixel thresholded Co localizado entre CD1d y Lamp1 para varias imágenes de la célula (n = 100) (figura 4).
- Utilice el mismo protocolo de análisis en 4.2.3 y además seleccionar la opción resultado del "% de intensidad por encima del umbral colocalized".
- Realizar este análisis junto con coeficientes de colocalización de Mander.
- Parcela del mismo modo el promedio y error estándar para la intensidad % colocalized entre CD1d y Lamp1. Utilizar la prueba t de Student para calcular el valor de p para la comparación entre grupos BaP expuestos y no expuestos (figura 4).
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Representative Results
Los contaminantes lipofílicos BaP alteran racimos gene endocíticas en humanos DCs. humanos derivados de monocitos DCs de cada donante (n = 3) fueron incubadas con BaP y ordenados para DCs convencionales, que además fueron utilizadas para extracción y transcriptómicos análisis del ARN como se describe . Sobre la normalización de la expresión génica, genes alterados entre los grupos BaP expuestos y no expuestos fueron agrupados según la correlación funcional de genes diferencialmente expresados. Entrada de la lista del gen alterado al Toppcluster programa16 para el análisis de las vías celulares y realizar la prueba estadística utilizando una corrección de tasa (FDR) falso descubrimiento de los valores de p (figura 1B). Varios clusters de gen mayor alteración, incluyendo el metabolismo de los lípidos y las funciones endocíticas, identificaron en DCs expuestos al BaP. En este estudio, nos específicamente centrado en el examen funcional de tráfico endocíticas, porque presentación del antígeno CD1-mediada ha sido altamente dependiente de antígeno lípido carga en las vías endocíticas5,19, 20,21.
CD1d tráfico endocíticas se demuestra mediante citometría de flujo de imágenes. Al obtener una gran cantidad de imágenes de células mediante citometría de flujo de imágenes, que empezamos a utilizar el programa de IDEAS para visualizar imágenes celulares individuales a través de la compuerta convenientemente poblaciones celulares Co teñidas con anticuerpos múltiples (figura 2A). En concreto, hemos sido capaces de puerta la importante población de DC Co teñida con HLA-DR y CD11c más mostrar los controladores de dominio con coexpresión CD1d y Lamp1 (figura 2A). Co teñidas señales pueden ser enriquecidas a través de la compuerta de la población de células con doble tinción de CD1d y Lamp1 (figura 2A). Primero mostramos el no expuesto normales DCs con mínima colocalización de proteínas CD1d y Lamp1, indicando el nivel basal de CD1d endocíticas tráfico y alto nivel de expresión superficial en condiciones fisiológicas (figura 2B)5, 19,20,21. Para medir la colocalización de proteínas CD1d y Lamp1, inicialmente utilizamos IDEAS para mostrar un ligero aumento de detalle brillante similitud CD1d y Lamp1 proteínas con BaP exposición13. La semejanza de detalle brillante se calculó con base en el coeficiente de correlación de Pearson para la correlación de dos factores, la prueba proteínas CD1d y Lamp1 eran poco probable que altamente comprometidos en condiciones fisiológicas, lo que indica que CD1d es capaz de transitorio tráfico a través de compartimentos endocíticos finales para obtener antígenos de lípidos funcionales. Por lo tanto, es biológicamente más significativo para probar si la proteína CD1d en exposición de BaP conserva más en los compartimentos endocíticos finales tal y como refleja el aumento del porcentaje de proteínas superpuestas de CD1d y Lamp1 usando la proyección de imagen Fiji de software de análisis en el Paquete de ImageJ. Por último, retención de la proteína de CD1d en compartimentos endocíticos finales puede utilizarse para confirmar funcionalmente alterados gen endocíticas perfiles en exposición de BaP.
Se midió la intensidad Co localizada y entre proteínas de CD1d y Lamp1. Para obtener un umbral reproducible y porcentajes de áreas localizadas Co e intensidad, se aplicaron ImageJ-Fiji22, que también se ha utilizado en varios otros estudios23,24,25. Seleccionamos al azar CD1d+Lamp1+ las células con la mancha Co fuerte y claro subcelular localización de CD1d y Lamp1 proteínas como imágenes de entrada (figura 2B). Imágenes celulares individuales se pueden combinar en un archivo de imagen para un análisis consistente (Figura 3A). En nuestro estudio, combinado 100 imágenes de la célula y abierto en el programa a analizar mediante el establecimiento de "umbrales de colocalisation" (figura 3B). La colocalización de intensidad del píxel entre dos canales (CD1d marcado con PE y AF647-labeled Lamp1) mostró total con un diagrama de dispersión mediante la detección de los píxeles localizados Co de estas imágenes de 100 células (Figura 4A). En este terreno, líneas horizontales y verticales representan los umbrales de Costes y las líneas diagonales representan la relación de intensidad de pixel total entre dos canales. Umbral de Costes proporciona un entorno visible para quitar pixeles débiles de dos canales superpuestos. El diagrama de dispersión resultante muestra un aumento colocalización de proteínas CD1d y Lamp1 en exposición de BaP. Además, cuantificó el grado de colocalización entre proteínas CD1d y Lamp1 utilizando coeficientes de Mander (Figura 4B). En consecuencia, coeficientes de Mander demuestran mayor colocalización entre CD1d y Lamp1 en compartimentos endocíticos finales de DCs BaP expuesto comparando con DCs no expuestos, como estadísticamente compatibles del estudiante t-pruebas (Figura 4B). Sin embargo, si la intensidad de la proteína es heterogénea entre las zonas colocalized y no colocalized, intensidad colocalized será sin precedentes a las áreas colocalized. Por lo tanto, también es necesario otro examen el colocalization basada en intensidad (figura 4). Como resultado, cada columna representa un cálculo promedio de porcentaje de intensidad colocalized de imágenes múltiples de la célula (n = 100) entre condiciones BaP expuestos y no expuestos para un par de proteínas Co localizadas. T-pruebas del estudiante también muestran significación estadística (n = 100, p< 0.001) entre grupos BaP expuestos y no expuestos con errores estándar indicados. En conjunto, nuestros datos demuestran que el CD1d proteína se mantuvo en endosomas finales en exposición de BaP, apoyando esa expresión del gene alterado BaP más conduce para el deterioro de la función endocíticos y trata de CD1d.
En Resumen, colocalización de CD1d-Lamp1 aumenta con la exposición de BaP. Múltiples parámetros basados en imágenes de la célula (figura 2B), incluyendo diagramas de dispersión con intensidad de píxeles superpuestos (Figura 4A), mejorado coeficientes de Mander (Figura 4B) y aumentaron el porcentaje de intensidad superpuesta ( Figura 4), soporte retención endocíticas CD1d en exposición de BaP. Este análisis de colocalización de imágenes celulares es un enfoque exacto para determinar el grado de colocalización de la proteína y demostrar mecanismos biológicos de las funciones de la célula, por ejemplo, endocíticas función constante con alteración gen endocíticas expresión, contribuyendo más a la inhibición activación de T CD1d restringido células13.
Figura 1 : Perturbación de transcriptomas de DC en la exposición de BaP (A) diagrama de flujo de RNA-seq. En primer lugar, se realizó análisis de control de calidad (QC) para examinar la calidad del RNA total. Usando un sistema automatizado y ARN total de alta calidad como entrada, poly-A RNA fue aislado, que demostró empobrecido rRNA en análisis de control de calidad de RNA poly-A. El ARN poli-A fue sometido luego a biblioteca automatizada preparación e indexación a través de PCR. A continuación, la biblioteca amplificada fue analizada por un equipo Bioanalyzer para control de calidad con rendimiento esperado y la distribución de tamaño. Después de la cuantificación de la qPCR, indexadas bibliotecas fueron agrupadas y agrupadas en la celda de flujo para la secuencia, y la calidad de los datos de la secuencia era en tiempo real seguimiento. El eje representa la cuenta relativa de citometría de flujo, las señales de la coloración. (B) los genes alterados fueron agrupados en diferentes grupos funcionales y se muestran los grupos gene asociados endocíticos función y metabolismo lipídico. Rojo: CD1d; Verde: Lamp1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Análisis de imágenes celulares usando el programa IDEAS. (A) derivados de monocitos DCs de sanos donantes fueron en primer lugar gated en HLA-DR + CD11c + células y más cerrada de CD1d+Lamp1+ las células mediante el programa de IDEAS. Imágenes celular (B) se extrajeron del HLA-DR+CD11c+CD1d+Lamp1+ población para visualización de la imagen celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Análisis de imágenes celulares usando el programa ImageJ Fiji. Células con tinción fuerte Co de CD1d y Lamp1 proteínas se seleccionaron al azar para el análisis de imagen con ImageJ de Fiji, pero las células * invisible o débil tinción para la proteína CD1d o Lamp1 fue excluido como en la figura 2B. (A) estos celulares seleccionados al azar imágenes fueron montadas en un archivo de imagen como una imagen de entrada. (B) la colocalización de análisis se realizó a través del ajuste de los umbrales de la colocalización de los canales verdes y rojos. Los diagramas de dispersión se obtuvieron con el cálculo del umbral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Colocalización de proteínas CD1d y lámpara de 1. Utilizando conjuntos de datos similares registrados en Sharma et al. 13, intensidad de pixel Co localizada entre proteínas CD1d y Lamp1 de DCs en condiciones BaP expuestos y no expuestos fue recalculado y se muestra con diagramas de dispersión (A). Coeficientes de Mander de CD1d y Lamp1 colocalización se calcularon y se muestran con un promedio de imágenes (B) de la celda seleccionada. El porcentaje de intensidad de pixel Co localizada fue también calculado (C). Significación estadística (n = 100, p < 0.001) se obtuvo con las t-pruebas del estudiante en comparación con el grupo no expuesto. Errores estándar fueron indicados. Los datos son de un ensayo con células de un donante sano. Se realizaron dos ensayos independientes con resultados similares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Anticuerpos | Fluoróforos o anticuerpo secundario | Clon |
| HLA-DR | Ficoeritrina/Cianina 7 (PE/Cy7) | L243 |
| CD11c | Ficoeritrina/Cianina 5 (PE/Cy5) | 3.9 |
| CD1c | Violeta brillante 421 | L161 |
| Humana purificada CD1d | PE-anti-mouse IgG2b | 51.1 |
| Lamp1 | Alexa Fluor 647 (AF647) | CD107a(H4A3) |
Tabla 1: anticuerpos utilizados en este estudio. Debido a la excitación compartida y longitudes de onda de emisión, fluoróforos PE/Cy5 y AF647 parcialmente solaparon en las señales de la coloración. Utilizamos estos fluoróforos etiquetar una proteína superficial (CD11c) y una proteína intracelular (Lamp1) respectivamente, para evitar la duplicación de su señal a nivel subcelular. También utilizamos una óptima valoración y compensación para minimizar las señales superpuestas entre ambos fluoróforos.
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Discussion
Funcional confirmación de un camino del gene alterado es un reto, debido a la expresión de genes ampliamente afectado con múltiples vías y la dificultad para integrar actividades celulares individuales y poblacionales. Empleamos imágenes flujo cytometry específicamente prueba CD1d trata de compartimentos endocíticos. Citometría de flujo de imágenes integra la medición poblacional de las células y la demostración individual de colocalización subcelular de proteínas múltiples. La microscopia confocal ha proporcionado previamente de alta resolución en la medición de la colocalización de la proteína, y citometría de flujo es capaz de proporcionar completa phenotyping de diferentes poblaciones celulares. Citometría de flujo de imagen combina las ventajas de la microscopia confocal y citometría de flujo con resolución de imagen aceptable para analizar colocalización de proteínas en forma de alto perfil para confirmación funcional de transcriptómicos alteración ambiental contaminantes.
Análisis de colocalización de proteínas múltiples en una escala poblacional son técnicamente exigentes, porque () detallado análisis de múltiples células individuales son mano de obra intensiva y relativamente sesgada; (ii) es difícil de definir un umbral óptimo para interpretar los píxeles superpuestos basados en la intensidad o zona de coloración positiva; y (iii) observación equilibrado de células individuales y poblacionales es fundamental. En este estudio, nos centramos en realizar una observación biológicamente significativa, una prueba de significación estadística y una demostración de imágenes de proteínas Co localizadas. Para lograr este objetivo, primero obtuvimos miles de imágenes de DCs humanos utilizando imágenes de citometría de flujo. Análisis cuantitativos de los archivos de imagen habían combinado con un análisis de similitud de detalle brillante usando el software IDEAS y un análisis de colocalización estadísticamente probado con ImageJ Fiji. El programa de IDEAS permite bloquear la población Co manchada, cálculo de colocalización de dos proteínas usando semejanza de detalle brillante basado en el coeficiente de correlación de Pearson, y seleccionando al azar teñido Co células con localización subcelular de proteínas13. A fin de promover la manifestación relevante biológica de proteínas Co localizadas, utiliza software ImageJ-Fiji y aplicamos coeficiente de Mander para calcular el porcentaje de áreas localizadas Co y comprometido por la intensidad de píxel para demostrar el grado de Localización de CD1d en vías endocíticas.
El paso crítico para con el programa ImageJ-Fiji es realizar sola celda de análisis. Variación de porcentaje colocalización de proteínas de las células individuales puede controlarse en comparación con colores visualmente combinados de imágenes de la célula. Promediando la colocalización de proteínas porcentaje de todas las células de 100, los medios y los errores estándar se puede calcular para demostrar la colocalización de la proteína y correlación funcional a nivel poblacional. Este análisis bioinformática es simple y sencilla sin importar resultados ambiguos, porque este análisis ofrece un cálculo umbral reproducible método de Costes para producir el mismo resultado umbrales para los mismos conjuntos de datos y umbrales similares para conjuntos de datos similares26. La limitación de esta técnica es la entrada manual intensiva de imágenes de la célula y potencialmente subjetiva selección de visualmente Co células utilizando el software de IDEAs. En nuestro estudio, analizamos 100 imágenes de células de cada grupo y establecer criterios reproducibles, incluyendo señales Co teñidas fuertes y claro la localización subcelular de las proteínas de CD1d y Lamp1. Superar estas limitaciones requiere mejora técnica del software de análisis para permitir análisis de lote y objetiva selección de células individuales basados en las características morfológicas más allá de la intensidad de la tinción proporcionados por citometría de flujo. En Resumen, combinado celular y población imágenes análisis proporcionará resultados altamente reproducibles, integrales, estadísticamente probados y biológicamente relevantes de colocalización de proteínas porcentaje. Creemos que este análisis de colocalización de CD1d-Lamp1 pueden servir como un ejemplo exitoso de alto perfil análisis de imágenes celulares para responder a cuestiones más amplias en la alteración morfológica y funcional de proteínas celulares.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar
Acknowledgments
Los autores agradecen a Roberto Giulitto (centro de sangre de centro) para las muestras de sangre humana y Lee Dr. Liang Niu para la normalización de la expresión génica. También agradecemos a Beca apoyo del nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental (ES006096), centro ambiental genética (CEG) un proyecto piloto (S.H.), Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas (AI115358) (S.H.), Universidad de Premio del Consejo de investigación de la Universidad de Cincinnati (S.H.) y Universidad de Cincinnati College de medicina mejora financiación básica (X. Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transcriptomics | Illumina | HiSeq 2500 v4 | Illumina HiSeq system |
| ImagingStream X | Millipore | 100220 | Imaging flow cytometry |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fisher | Total RNA extraction | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent | Total RNA QC analysis | |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher | PCR, enzyme reaction | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England Biolab | PolyA RNA purification | |
| Automated SMARTer Apollo system | Takara | PolyA RNA purification | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolab | Library preparation | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | DNA purification | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) | Thermo Fisher | Library quantification | |
| NEBNext Library Quant Kit | New England Biolab | Library quantification | |
| cBot | Illumina | Library cluster generation | |
| TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot – HS | Illumina | Library cluster generation | |
| HiSeq 1000 | Illumina | Sequencing | |
| TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles) | Illumina | Sequencing | |
| Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | Bio Legend | L243 | |
| Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | Bio Legend | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | Bio Legend | L161 | |
| PE-anti-mouse IgG2b | Bio Legend | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) | Bio Legend | CD107a(H4A3) |
References
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