Summary
Citometria de fluxo de imagem fornece uma abordagem ideal para detectar a alteração morfológica e funcional das células em níveis individuais e populacionais. Função endocítica interrompida para apresentação de antigénios de lipídios em células dendríticas humanas expostas ao poluente foi demonstrada com um combinado transcriptomic perfis de expressão genética e morfológica demonstração do tráfico de proteína.
Abstract
Análises populacionais da alteração morfológica e funcional de proteínas endocítica são um desafio devido à demanda de captura de imagem em uma análise de imagem de nível e estatística única célula em um nível populacional. Para superar esta dificuldade, usamos imagens citometria de fluxo e transcriptomic (RNA-seq) de criação de perfil para determinar a Localização subcellular alterada do cluster da proteína de 1D de diferenciação (CD1d) associada com expressão gênica endocítica prejudicada em humanos células dendríticas (DCs), que foram expostas à comum lipofílico ar poluente benzo [a] pireno. O colocalization de CD1d e endocítica marcador Lamp1 proteínas de milhares de células imagens capturadas com imaging citometria de fluxo foi analisada usando ideias e ImageJ-Fiji programas. Numerosas imagens celulares com proteínas CD1d e Lamp1 co manchadas foram visualizadas após retenção na CD1d+Lamp1+ DCs usando ideias. O colocalization CD1d e Lamp1 reforçada em cima BaP exposição demonstrou-se ainda mais usando thresholded scatterplots, testado com coeficientes de Mander para intensidade co localizada e plotados com base na porcentagem de áreas co localizadas usando o ImageJ-Fiji. Nossos dados fornecem uma abordagem instrumental e bioinformatic vantajosa para medir colocalization de proteína em níveis celulares único e populacionais, apoiando um resultado funcional prejudicado de transcriptomic alteração em humanos expostos a poluentes DCs.
Introduction
Apresentação de antigénios normalmente envolve proteínas intracelulares tráfico, que tem sido investigada frequentemente usando a caracterização morfológica e Caracterização fenotípica das apresentadoras de antígenos de células1,2,3 . Para integrar as vantagens da imagem latente e métodos de fenotipagem, descrevemos uma plataforma de análise de imagem em nível de população para demonstrar uma colocalization de proteína alterada em células dendríticas (DCs) e unicelulares. Na apresentação de antigénios do peptide, complexo de histocompatibilidade (MHC) classe I moléculas vincular um peptídeo curto (resíduos de 8-10) no retículo endoplasmático para ativar o CD8 convencional+ T células, enquanto moléculas de MHC classe II vincular um relativamente mais peptídeo (~ 20 resíduos) em compartimentos endocítica para ativar convencional CD4 células de+ T1,4. Em contraste, as células T de lipídios específicos são ativadas por proteínas CD1 com antígenos lipídicos carregados principalmente em compartimentos endocítica5,6. Apresentação de antigénios de lipídios requer o fornecimento de lipídios metabolitos produzidos no metabolismo lipídico7,8,9,de10 e o carregamento de metabólitos de lipídios funcionais para CD1 proteínas em compartimentos endocítica5,6. Neste contexto, diversos fatores celulares modulando a apresentação de antigénios de lipídios, especialmente na exposição ambiental de poluentes lipofílicos e distúrbios imunológicos, são essenciais para ser definido. Neste estudo, usamos transcriptomic análise, imagem de perfil e análise de imagens celular e populacional de DCs derivados de monócitos humanos para determinar a proteína endocítica tráfico contribuindo para apresentação de antigénios de lipídios na exposição de poluentes. Certamente, esta plataforma combinada pode ser aplicada para estudar proteínas subcellular tráfico e colocalization em diferentes processos biológicos.
Tecnicamente, a Localização subcellular da proteína geralmente foi demonstrada usando microscopia confocal e analisados estatisticamente em um número limitado de células detectado1,2,3,11. Além disso, citometria de fluxo tem sido amplamente aplicada a populações de células de portão com sinais co manchadas de múltiplas proteínas em um nível celular12; no entanto, este não possui uma visualização detalhada de colocalization Subcellular da proteína. Para realizar análises abrangentes e estatísticas de colocalization de proteína percentagem a nível celular e população, podemos incorporar imagens de perfis e análise de abordagens para determinar as características de colocalization de proteína com biológico relevância. Especificamente, nós usamos a citometria de fluxo de imagem para detectar o colocalization de CD1d e proteína de membrana lisossomal-associado 1 (Lamp1) proteínas neste estudo. Análise quantitativa de moléculas colocalized anteriormente era difícil a ser realizada em escala populacional. Neste estudo, adaptamos o programa ImageJ-Fiji para examinar a porcentagem de colocalization de proteína com um grande número de células coradas co nível populacional e individual celular. Especificamente, Nós medimos áreas co localizadas, intensidade e tamanho populacional para apoiar a conclusão de que a proteína CD1d em grande parte foi mantida em compartimentos endocítica atrasados do DCs humanas em exposição a um poluente lipofílicos benzo [a] pireno (BaP),13 . Este celular combinada e população de análise de imagem fornecidos resultados altamente reprodutíveis, abrangentes e estatisticamente significativos de CD1d-Lamp1 colocalization relevante para a apresentação de antigénios de lipídios inibida.
A transcriptoma do BaP-expostos DCs humanos fortemente apoiado a hipótese de que o metabolismo lipídico endocítica e CD1d endocítica tráfico foram prejudicadas em exposição BaP. Para testar esta hipótese, nós aplicamos a citometria de fluxo de imagem para o perfil de imagens da população de DC que co estavam manchadas com várias proteínas, incluindo CD1d, marcadores endocítica e marcadores de DC. Finalmente, as células co manchadas foram analisadas estatisticamente para demonstrar o percentual de intensidade e áreas de colocalization CD1d e Lamp1.
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Protocol
Protocolos humanos neste estudo foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional da Universidade de Cincinnati, e todos os métodos foram realizados em conformidade com as normas orientadoras aplicáveis e regulamentos. Amostras de sangue de doadores saudáveis foram obtidas do centro Hoxworth de sangue no centro médico da Universidade de Cincinnati.
1. Transcriptomic de criação de perfil de expostos a poluentes derivados de monócitos humanas DCs
- Extração de RNA total de DCs BaP-expostos
- Diferenciar humanos DCs usando citocinas GM-CSF e IL-4 e expor DCs para BaP para 4 dias13.
- Classificar o BaP-expostos DCs usando citometria de fluxo com base em marcadores de superfície expressadas (linhagem–HLA-DR.+), a maioria dos quais consiste em DCs convencionais (CD11c+CD1c+)13. Normalmente, classificar 10.000 DCs em meio de cultura contendo 10% FBS, centrifugar DCs a 600 x g e 4 ° C por 6 min e imediatamente remover o sobrenadante por aspiração usando uma ponta de pipeta de 1 mL.
- Uma vez que o sobrenadante é removido por aspiração, lyse o centrifugado adicionando 0,4 mL de tampão de Lise/ligação do kit de isolamento de RNA para armazenamento em-80 ° C antes de extração do RNA.
- Use o kit de isolamento de RNA com o protocolo de extração de RNA total para extrair o RNA total14. Medir a integridade do RNA usando um Bioanalyzer15.
- Transcriptomic análise de DCs classificadas (figura 1A)
- Preparamos a biblioteca usando um kit de preparação de biblioteca de RNA RNA-seq. Em suma, fragmentar o RNA poli-A isolada (~ 200 bp), reverso transcrever os fragmentos para o 1º strand do cDNA e siga pela síntese do cDNA segunda vertente rotulada com dUTP.
- Ligate cDNA fita dupla para o adaptador com uma estrutura de Hairpin loop após a purificação do grânulo, fim-reparação e dA-tailing. Retirar os resíduos de uracil em strand 2º do cDNA e adaptador loop com enzima usuário (Reagente de excisão Uracil específicos) para manter a especificidade de vertente e abrir o loop de adaptador para o PCR.
- Execute 13 ciclos de PCR utilizando primers universais e índice específico para enriquecer a biblioteca indexada. Limpar a biblioteca e executar em um chip Bioanalyzer DNA alta sensibilidade para verificar a qualidade da biblioteca e distribuição de tamanho.
- Utilize um kit de quantificação de biblioteca e um sistema PCR em tempo real combinadas com informações de tamanho biblioteca para calcular biblioteca concentração através de um método da curva padrão.
- Proporcionalmente piscina individualmente indexadas bibliotecas compatíveis e ajustar a concentração total final para 15 pM. Executar a geração de aglomerado de biblioteca e sequenciar biblioteca em uma configuração de leitura única 1 x 50 bp para gerar 25 milhões leituras por amostra.
- Sequenciamento
- Carrega o sequenciamento e indexação reagentes para racks de reagente o SBS e PE, respectivamente. Coloque os reagentes num banho de água da série laboratório por 1h até todo o gelo derreteu e os reagentes em cada frasco/tubo são misturados adequadamente.
- Preparar a mistura ICB, adicionando a enzima descongelada de tintura e -20 ° C para a garrafa e misture. Prepare uma solução de NaOH de acordo com as instruções de sequenciamento. Coloque todos os reagentes a 4 ° C até que esteja pronto para usar.
- Durante a 1 h, período, esperando poder sobre o sequencer. Espere que a unidade DONOTEJECT para aparecer e conecte o computador a uma unidade de rede.
- Inicie o software de controle de sequenciador.
- Prepare-se 2 L de solução que contém 0,5% de Tween 20 e 0,03% manutenção de água de 300 no laboratório-grau ProClin.
- O rack de reagente SBS, adicione ~ 100 mL da solução de lavagem de manutenção a cada um dos 8 garrafas e tampas de funil para as garrafas. O rack de reagente de PE, adicionar ~ 12 mL da solução de lavagem de manutenção a cada um dos dez tubos 15ml cónico e descartar as tampas.
- Carrega os dois racks com os solução enchido garrafas/tubos para o sequencer.
- O software de controle de sequenciador, escolha a lavagem de manutenção; Siga as instruções na tela para limpar o sistema sequenciador de fluido até que o processo seja concluído.
- Iniciar um novo executado na guia "Sequência" de software; Direcione a saída de dados para uma unidade de rede. Escolha os parâmetros para leitura única 1 x 50 bp com bibliotecas de índice único multiplexado.
- Opcionalmente, logar o Hub de sequência de BaseSpace, para que o status de sequenciamento pode ser monitorado remotamente através de um computador ou telefone inteligente.
- Carregar uma folha de amostra para demultiplexação e fornecer informações de reagente de acordo com a exigência do software.
- Carregar os reagentes SBS e PE para o sequencer. Encha o sistema com uma célula de fluxo usado (~ 15 min).
- Uma vez concluída a geração de cluster (~4.5 h), tirar a célula de fluxo, Borrife levemente a célula de fluxo com água e limpe seco usando papel de lente. Levemente pulverizar a célula de fluxo com etanol a 95% e limpá-lo seco. Verifique contra a luz para certificar-se que a superfície esteja limpa sem detritos ou resíduos de sal.
- Depois de concluída a etapa Prime, a célula de fluxo em cluster de carga e iniciar o sequenciamento. O software visualizador de análise de sequência será automaticamente iniciado.
- Monitore a qualidade de dados de sequenciamento através de SAV incluindo densidade do aglomerado, filtro de passagem de leituras, cluster pass filtro %, ≥Q30%, legado fase/prófase %, QC, etc , o que ajuda a compreender a qualidade de dados e solucionar problemas de indexação.
- Alterar a vedação da célula de fluxo e realizar uma lavagem de manutenção após a conclusão do sequenciamento. O sequencer está pronto para a próxima corrida.
- Análise de Bioinformatic
- Execute a bioinformática de análise de dados de RNA-seq13.
2. via análise de perfis de Transcriptomic (figura 1B)
- Use um edgeR Bioconductor comparar contagens de intensidade de expressão de gene resultante entre DCs BaP-expostos e não-expostos de três doadores. Em seguida, identificar genes diferencialmente expressos entre DCs BaP-expostos e não-expostos, baseados na mudança da dobra absoluto (> 2 dobras) e a descoberta de falsa valores (FDR) - ajustado p- a taxa (< 0,05).
- Para prever os clusters funcionais de diferencialmente expressos genes, usar o pacote de software ToppCluster para pesquisar os genes alterados contra vários bancos de dados, incluindo KEGG e REACTOME e gerar dados de clusters. ToppCluster usa o teste hipergeométrica para obter enriquecimento funcional através de de análise do gene lista enriquecimento16.
- Entrada mais os resultados destes clusters de função para Cytoscape17,18 versão 3.3.0, uma plataforma de software de código aberto amplamente utilizado para a visualização de redes complexas. Assim, os genes envolvidos em diferentes clusters ou caminhos, incluindo clusters endocítica e metabolismo de lipídios, são mostrados em uma rede com anotação de cor de dobra em média a alteração de gene expressão (figura 1B)13.
3. citometria de fluxo de CD1d e Lamp1 Colocalization de imagem
- Anticorpo de rotulagem de DCs BaP-expostos
- Expor 0,5 x 106 humanos DCs para 5,94 mM de BaP de 4 dias a 37 ° C em 2 mL de Dulbecco completa meio modificado da águia. Colheita DCs por centrifugação a 400 x g durante 10 min. bloco as DCs diferenciadas incubando células com bloqueador de soro humano e anticorpos do receptor Fc anti-humanos por 10 min no gelo, incluindo anticorpos CD16, CD32 e CD64 anti-humanos.
- Incubar a violeta brilhante 421-anti-CD1c (L161), ficoeritrina/cianina tingir 7 (PE/Cy7) - anti - HLA-DR e PE/Cy5-anti-CD11c com DCs por 20 min no gelo. A tabela 1 mostra esta lista de anticorpos.
- Conserto DCs com paraformaldeído 4% em PBS e permeabilize-los com permeabilização de tampão de lavagem. Executar a coloracao intracelular com uma mistura de PE-rotulado purificada anti-humano CD1d (51,1) e Alexa Fluor 647-rotulado anti-Lamp1 (CD107a) (H4A3).
- Medição de citometria de fluxo (Figura 2) de imagem
- Analise as amostras coradas utilizando um citômetro de fluxo da imagem latente para o núcleo de citometria de fluxo do Hospital infantil de Cincinnati, usando um objectivo X 40 para produzir 300 pixels para uma cela com cerca de 10 mm de diâmetro. Tamanho de um pixel é aproximadamente 0, 5mm por 0,5 mm do objeto.
- Adquirir 10.000 imagens celulares de forma imparcial, de acordo com as instruções do fabricante.
4. análises de imagens de citometria de fluxo de imagem.
- Análise de colocalization usando software de ideias (Figura 2)
- Realizar a compensação com single-manchado contra amostras não manchadas, definindo a intensidade de fluorescência das amostras não coradas abaixo do limiar, incluindo não-coradas DCs BaP-expostos com autofluorescência de BaP, como dados de citometria de fluxo rotina análise.
- Portão, corado células para obter os subconjuntos de HLA-DR+CD11c+CD1d+Lamp1+ células (Figura 2A) e mostrar imagens de celular em subconjuntos fechados (Figura 2B).
- Salve imagens de celular em formato png com base em dois critérios técnicos de inclusão, a presença visual de sinais fortes co manchadas e Localização subcellular das proteínas CD1d e Lamp1, para as análises de colocalization usando o ImageJ-Fiji (Figura 2B).
- Use o software ImageJ-Fiji para executar análise colocalization (Figura 3).
- Prepare os arquivos de imagem de entrada mesclando as 100 imagens de célula salvo para DCs humanos não-expostos e BaP-expostos, respectivamente (Figura 3A).
- Analisar CD1d (vermelho) e Lamp1 colocalization (verde), usando um gráfico de dispersão.
- Execute programa ImageJ-Fiji. Abra o arquivo. png com 100 imagens de célula (Figura 3B e Figura 4A): "arquivo | Abra".
- Dividir a imagem com canais de vermelho e verdes mesclados em duas imagens com um vermelho ou um canal verde: "imagem | Cor | Dividir canais".
- Desenhar um gráfico de dispersão usando os comandos "Analyze | Colocalization | Limiar de colocalization". Salve o gráfico de dispersão usando a tecla "PrintScreen" .
- Calcular os coeficientes de colocalization do Mander para cada imagem de celular única (n = 100) (Figura 4B)
- Selecione uma imagem única célula no arquivo de imagem com separação de canais usando o "Oval" ferramenta de seleção.
- Use os comandos "Analyze | Colocalization | Limiar de colocalization". Selecione "Canal 1" da caixa de diálogo da região de interesse (ROI). Manter todas as opções de cálculo, incluindo "Mander usando limiares" para cada imagem de célula.
- Repita esse cálculo para todas as imagens de 100 células.
- Salvar e abrir os resultados usando uma folha de cálculo.
- Plotar a média e erros-padrão para "Coeficientes de Mattos thresholded" (n = 100, 0 significa nenhum colocalization e 1 significa colocalization perfeito). Use o teste t de Student para calcular o valor de p para a comparação entre grupos BaP-expostos e não-expostos (Figura 4B).
- Calcular a porcentagem da intensidade thresholded pixel co localizada entre CD1d e Lamp1 para várias imagens de célula (n = 100) (Figura 4).
- Usar o mesmo protocolo de análise em 4.2.3 e além disso, selecione a opção de resultado "% intensidade limiar colocalized".
- Realizar esta análise juntamente com coeficientes de colocalization do Mattos.
- Da mesma forma, traça a média e erros-padrão para a intensidade de % colocalized entre CD1d e Lamp1. Use o teste t de Student para calcular o valor de p para comparação entre grupos BaP-expostos e não-expostos (Figura 4).
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Representative Results
Os poluentes lipofílicos BaP altera aglomerados endocítica gene humano DCs. humanos derivados de monócitos DCs de cada doador (n = 3) foram incubadas com BaP e classificados para DCs convencionais, que foram mais utilizados para a análise do RNA extração e transcriptomic conforme descrito . Após a normalização da expressão gênica, genes alterados entre grupos BaP-expostos e não-expostos foram agrupados de acordo com a correlação funcional de genes diferencialmente expressos. Nós de entrada na lista de gene alterado para o programa Toppcluster16 para as análises das vias celulares relevantes e realizar o teste estatístico usando uma correção de taxa (FDR) falsa descoberta dos valores de p (figura 1B). Vários clusters principais gene alterado, incluindo o metabolismo lipídico e endocítica funções, foram identificados em DCs BaP-expostos. Neste estudo, especificamente enfocamos o teste funcional de tráfico endocítica, porque a apresentação de antigénios mediada por CD1 tem sido altamente dependente do antígeno de lipídios carregando em5,a via endocítica,19, 20,21.
CD1d endocítica tráfico é demonstrado usando citometria de fluxo de imagem. Mediante a obtenção de um grande número de imagens de célula usando citometria de fluxo da imagem latente, nós começamos a usar o programa ideias para visualizar imagens celulares individuais através de gating convenientemente populações de células co manchadas com múltiplos anticorpos (Figura 2A). Especificamente, fomos capazes de portão grande população DC co manchada com HLA-DR e CD11c para mostrar ainda mais os DCs com expressão co CD1d e Lamp1 (Figura 2A). Sinais co manchados podem ser enriquecidos pela retenção de população celular com dupla mancha de CD1d e Lamp1 (Figura 2A). Primeiro mostramos os não-expostos normais DCs com mínimo colocalization de proteínas CD1d e Lamp1, indicando o nível basal de CD1d tráfico endocítica e alto nível de expressão de superfície em condições fisiológicas (Figura 2B)5, 19,20,21. Para medir o colocalization de proteínas CD1d e Lamp1, usávamos inicialmente ideias para mostrar um ligeiro aumento de semelhança de detalhes brilhantes entre proteínas CD1d e Lamp1 com BaP exposição13. A similaridade de detalhe brilhante foi calculada com base no coeficiente de correlação de Pearson para o teste de correlação de dois fatores, enquanto proteínas CD1d e Lamp1 foram improváveis altamente sobreposto em condições fisiológicas, indicando que CD1d é capaz de transitoriamente o tráfego por compartimentos endocítica atrasados para obter antígenos lipídicos funcional. Assim, é mais biologicamente significativa para testar se a proteína CD1d em exposição BaP retém mais nos compartimentos endocítica atrasados como refletido pela porcentagem aumentada de proteínas de CD1d e Lamp1 sobrepostas usando o Fiji de software análise de imagens na Pacote do ImageJ. Finalmente, retenção da proteína CD1d em compartimentos endocítica atrasados pode ser usada para confirmar funcionalmente alterada gene endocítica perfis em exposição de BaP.
Foi medida a intensidade co localizada e área entre proteínas CD1d e Lamp1. Para obter uma configuração de limiar pode ser reproduzido e percentagens de áreas localizadas co e intensidade, aplicamos ImageJ-Fiji,22, que também tem sido usado em vários outros estudos23,24,25. Escolher aleatoriamente CD1d+Lamp1+ células com mancha co forte e clara subcellular da localização de proteínas CD1d e Lamp1 como imagens de entrada (Figura 2B). Imagens de celulares individuais podem ser mescladas para um único arquivo de imagem para uma análise consistente (Figura 3A). Em nosso estudo, nós mesclados 100 imagens de célula e abriu o programa para analisar, definindo "limiares de colocalisation" (Figura 3B). O colocalization de intensidade de pixel entre dois canais (CD1d PE-etiquetadas e AF647-rotulado Lamp1) foi mostrado global com um gráfico de dispersão, detectando os pixels co localizados por essas imagens de 100 células (Figura 4A). Nesta trama, linhas horizontais e verticais representam os limites do Costes e as linhas diagonais representam a relação de intensidade global de pixel entre dois canais. Limiar do Costes oferece um cenário visível para remover pixels fracos de dois canais sobrepostos. O resultado gráfico de dispersão mostra um aumento colocalization de proteínas CD1d e Lamp1 na exposição de BaP. Além disso, podemos quantificar o grau de colocalization entre CD1d e Lamp1 proteínas usando coeficientes de Mander (Figura 4B). Por conseguinte, coeficientes de Mander demonstram aumento colocalization entre CD1d e Lamp1 em compartimentos endocítica atrasados do BaP-expostos DCs comparando com DCs não-expostos, como estatisticamente suportados pelo t-testes Student (Figura 4B). No entanto, se a intensidade de proteína é heterogênea entre áreas de colocalized e não colocalized, colocalized intensidade será incomparável para áreas colocalized. Portanto, é também necessário exame mais o colocalization com base na intensidade (Figura 4). Como resultado, cada coluna representa um cálculo da percentagem de intensidade colocalized em média de várias imagens de célula (n = 100) entre condições BaP-expostos e não-expostos por um par de proteínas co localizadas. Testes t de Student também mostraram significância estatística (n = 100, p< 0,001) entre grupos BaP-expostos e não-expostos com erros-padrão indicados. No total, nossos dados demonstram que o CD1d proteína foi mantida na tarde endossomos em exposição de BaP, apoiar essa expressão de gene BaP-alterado mais leva à insuficiência endocítica e CD1d tráfico.
Em resumo, CD1d-Lamp1 colocalization melhora após a exposição de BaP. Vários parâmetros com base em imagens de célula (Figura 2B), incluindo scatterplots com intensidade pixel sobreposta (Figura 4A), reforçada coeficientes de Mander (Figura 4B) e aumentaram o percentual de intensidade sobreposta ( Figura 4), suporte CD1d endocítica retenção na exposição de BaP. Esta análise colocalization de imagens celulares é uma abordagem exata para determinar o grau de colocalization de proteína e demonstrar os mecanismos biológicos das funções celulares, por exemplo, endocítica função consistente com gene endocítica interrompido expressão, ainda mais, contribuindo para a ativação inibida de CD1d restrito T células13.
Figura 1 : Perturbação de transcriptomes DC na BaP exposição () Fluxograma de RNA-Seq Primeiro, a análise de controle de qualidade (QC) foi realizada para examinar a qualidade do RNA total. Usando um sistema automatizado e o RNA total de alta qualidade, como entrada, poli-A RNA foi isolado, que demonstrou empobrecido rRNA em análise de RNA QC de poli-A. O RNA poli-A então foi submetido a biblioteca automatizada preparação e indexação através de PCR. Em seguida, a biblioteca amplificada foi analisada por um Bioanalyzer para QC com rendimento previsto e distribuição de tamanho. Após a quantificação de qPCR, indexadas bibliotecas foram pool agrupadas para célula de fluxo para o sequenciamento e a qualidade de dados de sequenciamento em tempo real monitorados. O eixo representa relativas contagens de citometria de fluxo, manchando os sinais. (B) os genes alterados foram agrupados em diferentes grupos funcionais e os clusters de gene associados com função endocítica metabolismo lipídico são mostrados. Vermelho: CD1d; Verde: Lamp1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Análise de imagens celulares usando o programa ideias. (A) DCs monócito-derivado de saudáveis doadores foram em primeiro lugar fechados em HLA-DR + CD11c + células e mais fechado na CD1d+Lamp1+ células usando o programa de ideias. (B) celular imagens foram extraídas do HLA-DR+CD11c+CD1d+Lamp1+ população para visualização de imagem de celular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Análise de imagens celulares usando o programa de Fiji-ImageJ. Células com forte mancha co de proteínas CD1d e Lamp1 foram Selecionadodas aleatoriamente para a análise de imagem usando o ImageJ-Fiji, mas células * com invisível ou fraca coloração para proteína CD1d ou Lamp1 foi excluído como na Figura 2B. Imagens do (A), estes celulares selecionados aleatoriamente foram reunido em um único arquivo de imagem como uma imagem de entrada. (B) o colocalization análise foi realizada através de estabelecendo os colocalization limiares para os canais verdes e vermelhos. Os scatterplots foram gerados com o cálculo do limiar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Colocalization de proteínas CD1d e lâmpada 1. Usar o dataset semelhante relatado em Souza et al 13, intensidade do pixel Co localizadas entre proteínas CD1d e Lamp1 da DCs na BaP-expostos e não-expostos a condições foi recalculada e mostrado com scatterplots (A). Coeficientes de Mattos para colocalization CD1d e Lamp1 foram calculados e são mostrados com uma média de imagens da célula selecionada (B). A percentagem da intensidade do pixel Co localizadas também foi calculado (C). Significância estatística (n = 100, p < 0,001) foi obtido com os testes t de Student em comparação com o grupo de não-expostos. Erros-padrão foram indicados. Dados são de um ensaio com células de um doador saudável. Dois ensaios independentes foram realizados com resultados semelhantes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Anticorpos | Fluorophores ou anticorpo secundário | Clone |
| HLA-DR | Ficoeritrina/cianina 7 (PE/Cy7) | L243 |
| CD11c | Ficoeritrina/cianina 5 (Cy5/PE) | 3.9 |
| CD1c | Violeta brilhante 421 | L161 |
| Purificada anti-humano CD1d | PE-anti-mouse IgG2b | 51,1 |
| Lamp1 | Alexa Fluor 647 (AF647) | CD107a(H4A3) |
Tabela 1: anticorpos utilizados neste estudo. Devido à excitação compartilhada e comprimentos de onda de emissão, fluorophores PE/Cy5 e AF647 parcialmente sobrepostas em sinais de coloração. Nós usamos estas fluorophores para rotular uma proteína (CD11c) e uma proteína intracelular (Lamp1) respectivamente para evitar a sobreposição de sinal a um nível subcellular. Também utilizamos titulação ideal e compensação para minimizar os sinais sobrepostos entre os dois fluorophores.
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Discussion
Confirmação funcional do percurso gene alterado é um desafio, por causa da expressão do gene amplamente impactados envolvendo múltiplos caminhos e a dificuldade de integrar a actividade celular individual e populacional. Utilizamos a citometria de fluxo da imagem latente para especificamente teste CD1d tráfico de compartimentos endocítica. Citometria de fluxo de imagem integra a medição populacional das células e a demonstração individual da subcellular colocalization de várias proteínas. Microscopia confocal forneceu anteriormente em medir o colocalization de proteína de alta resolução e citometria de fluxo é capaz de fornecer abrangente fenotipagem para populações de células diferentes. Citometria de fluxo de imagem combina as vantagens da microscopia confocal e citometria de fluxo em resolução de imagem aceitável para analisar o colocalization de proteína em uma maneira de alto perfil para confirmação funcional da transcriptomic alteração pela ambiental poluentes.
Análises de colocalization de múltiplas proteínas em uma escala populacional são tecnicamente exigente, porque (i) detalhadas análises de várias células individuais são trabalhosas e relativamente tendenciosa; (ii) é difícil definir um limiar ideal para interpretar sobrepostas pixels com base na intensidade ou área de coloração positiva; e (iii) Observação equilibrada das células individuais e populacionais é crítica. Neste estudo, enfocamos realizando uma observação biologicamente significativa, um teste de significância estatística e uma demonstração de imagens de proteínas co localizadas. Para atingir este objetivo, primeiro obtivemos milhares de imagens de DCs humanas usando citometria de fluxo de imagem. Análises quantitativas de arquivos de imagem combinada a uma análise de similaridade de detalhe brilhante usando o software de ideias e uma análise colocalization estatisticamente testadas usando Fiji-ImageJ. O programa de ideias permite a retenção de população co manchada, cálculo colocalization de duas proteínas usando semelhança de detalhe brilhante baseada no coeficiente de correlação de Pearson, e selecionando aleatoriamente co manchado células com Localização subcellular de proteínas13. Para conseguir ainda mais a demonstração relevante biológica das proteínas co localizadas, usamos software ImageJ-Fiji e aplicado o coeficiente do Mander para calcular a porcentagem de áreas localizadas co e sobreposto a intensidade do pixel para demonstrar o grau de Localização de CD1d na via endocítica.
O passo crítico para usar o programa ImageJ-Fiji é realizar a única célula de análise de imagem. Variação de porcentagem colocalization de proteína de células individuais pode ser monitorada em comparação com cores visualmente mescladas de imagens de célula única. Calculando o colocalization de proteína de porcentagem de todas as 100 células, os meios e erros-padrão pode ser calculados para demonstrar o colocalization de proteína e correlação funcional a um nível populacional. Esta análise bioinformática é simples e direta sem sobre resultados ambíguos, porque essa análise oferece um cálculo do limiar pode ser reproduzido usar método do Costes para produzir a mesma resultou limiares para os mesmos conjuntos de dados e limiares de semelhantes para semelhante datasets26. A limitação desta técnica é a entrada manual trabalho intensiva de imagens única célula e potencialmente subjetiva seleção de células visualmente co manchadas usando o software de ideias. Em nosso estudo, analisamos 100 imagens de células de cada grupo e definir critérios de seleção podem ser reproduzidos, incluindo sinais fortes co manchados e clara Localização subcellular das proteínas CD1d e Lamp1. Superar essas limitações exige melhoria técnica do software analítico para permitir a análise de lote e seleção objetiva de células única baseada em características morfológicas, além da intensidade de coloração fornecida por citometria de fluxo. Na população e celular Resumo, combinado de imagem análise fornecerá resultados altamente reprodutíveis, abrangentes, estatisticamente testados e biologicamente relevantes de percentagem colocalization de proteína. Acreditamos que esta análise de colocalization CD1d-Lamp1 pode servir como um exemplo bem sucedido de alto perfil celular análises de imagem para responder a questões mais amplas na alteração morfológica e funcional de proteínas celulares.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar
Acknowledgments
Os autores agradecer Robert Giulitto (centro de sangue de Hoxworth) para amostras de sangue humano e Dr. Liang Niu para a normalização da expressão do gene lê. Agradecemos também a concessão de apoio do nacional Instituto de Ciências de saúde ambiental (ES006096), centro de genética ambiental (CEG) projecto-piloto (S.H.), Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas (AI115358) (Samba), Universidade de Prêmio de Cincinnati University Research Council (S.H.) e Universidade de Cincinnati College de medicina núcleo realce do financiamento (X. Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transcriptomics | Illumina | HiSeq 2500 v4 | Illumina HiSeq system |
| ImagingStream X | Millipore | 100220 | Imaging flow cytometry |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fisher | Total RNA extraction | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent | Total RNA QC analysis | |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher | PCR, enzyme reaction | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England Biolab | PolyA RNA purification | |
| Automated SMARTer Apollo system | Takara | PolyA RNA purification | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolab | Library preparation | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | DNA purification | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) | Thermo Fisher | Library quantification | |
| NEBNext Library Quant Kit | New England Biolab | Library quantification | |
| cBot | Illumina | Library cluster generation | |
| TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot – HS | Illumina | Library cluster generation | |
| HiSeq 1000 | Illumina | Sequencing | |
| TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles) | Illumina | Sequencing | |
| Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | Bio Legend | L243 | |
| Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | Bio Legend | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | Bio Legend | L161 | |
| PE-anti-mouse IgG2b | Bio Legend | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) | Bio Legend | CD107a(H4A3) |
References
- Roche, P. A., Cresswell, P. Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells. Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).
- Huang, S., et al. MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells. The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).
- Nakamura, N., et al. Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling. Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).
- Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P.
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Zajonc, D. M., Kronenberg, M. CD1 mediated T cell recognition of glycolipids. Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).
- Cox, D., et al. Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules. PloS one. 4 (5), e5325 (2009).
- Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments. Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).
- Huang, S., et al. Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).
- de Jong, A., et al. CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens. Nature. 15 (2), 177-185 (2014).
- Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Sharma, M., et al. Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants. Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).
- Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).
- Nachamkin, I., et al. Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene. Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).
- Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems. Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).
- Bauer-Mehren, A. Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape). Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).
- Cline, M. S., et al. Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape. Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).
- Huang, S., Moody, D. B. Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system. Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).
- Huang, S. Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis. Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).
- Moody, D. B., Porcelli, S. A. Intracellular pathways of CD1 antigen presentation. Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9 (7), 676-682 (2012).
- Diard, M., et al. Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype. Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Eliceiri, K. W., et al.
- Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).
