Summary
Akış Sitometresi Imaging hücreleri, bireysel ve populational düzeyde morfolojik ve fonksiyonel İLETİMLERİNİZE algılamak için ideal bir yaklaşım sağlar. Kirletici günese maruz kalan insan dendritik hücrelerinde lipid antijen sunumu için kesintiye endositik işlevi bir kombine transcriptomic gen ekspresyonu ve protein ticareti morfolojik gösteri profil oluşturma ile gösterilmiştir.
Abstract
Populational morfolojik ve fonksiyonel değişikliğin endositik proteinlerin populational düzeyde bir tek hücre düzeyi ve istatistiksel görüntü analizi, görüntü yakalama talebi nedeniyle zorlu analizlerdir. Bu zorluk üstesinden gelmek için biz görüntüleme akış sitometresi ve transcriptomic (RNA-seq) profil oluşturma ilişkili değişmiş hücre altı yerelleştirme farklılaşma 1 d protein (CD1d) kümenin belirlemek için Engelli endositik gen ifade insan ile kullanılan ortak lipofilik sinin dendritik hücreler (DCs), kirletici benzo [a] dumanında hava. Colocalization CD1d ve endositik işaret Lamp1 proteinler akış sitometresi Imaging ile yakalanan hücre görüntüleri binlerce fikir ve ImageJ-Fiji kullanılarak analiz programları. Hücresel görüntülerle çok sayıda ortak lekeli CD1d ve Lamp1 proteinleri CD1d üzerinde Perdeleme sonra görüntülenir+Lamp1+ DCs fikirler kullanarak. Pozlama daha da thresholded scatterplots, kullanarak ortak yerelleştirilmiş yoğunluğu için Mander'ın katsayıları ile test edilmiş ve çizilen gösterilmiştir BaP üzerine geliştirilmiş CD1d ve Lamp1 colocalization ImageJ-Fiji kullanarak ortak lokalize alanlarda yüzde tabanlı. Protein colocalization, kirletici günese maruz kalan insan transcriptomic değişiklik Engelli fonksiyonel sonuç destekleyen tek ve populational hücresel düzeyde ölçmek için avantajlı bir enstrümantal ve bioinformatic yaklaşım bizim veri sağlamak DCs.
Introduction
Antijen sunumu genelde kez morfolojik karakterizasyonu ve fenotipik antijen sunan hücreler1,2,3 profil oluşturma kullanarak soruşturma kaçakçılığı, hücre içi protein içerir . Görüntüleme ve fenotipleme yöntemleri avantajları birleştirmek için bir görüntüleme analizi platform tek hücre ve bir değişmiş protein colocalization insan dendritik hücreler (DC) olarak göstermek için nüfus düzeyleri açıklanmaktadır. Peptid antijen sunumu, MHC kompleksi (MHC) sınıf ı molekülleri kısa peptid (8-10 artıkları) endoplazmik geleneksel CD8 etkinleştirmek için bağlamak+ T hücreleri, MHC sınıf II moleküller nispeten daha uzun bağlamak iken peptid (~ 20 artıkları) geleneksel CD4 etkinleştirmek için endositik bölmeleri içinde+ T hücreleri1,4. Buna ek olarak, lipid özgü T hücreleri CD1 proteinler tarafından ağırlıklı olarak endositik bölmeleri5,6' yüklü lipid antijenleri ile aktif hale gelir. Lipid antijen sunumu lipid metabolizma7,8,9,10 ve fonksiyonel lipid metabolitleri CD1 proteinler için yüklenmesini üretilen lipid metabolitleri temini gerektirir endositik bölmeleri5,6. Bu bağlamda, özellikle de lipofilik kirleticiler ve bağışıklık bozuklukları, çevresel maruz lipid antijen sunumu oransal çeşitli hücresel tanımlanması için kritik faktörlerdir. Bu çalışmada, biz transcriptomic analizi, görüntü profil oluşturma ve insan monosit kaynaklı DCs hücresel ve populational görüntüleme analizi lipid antijen sunumu kirletici maruz katkıda endositik protein kaçakçılığı belirlemek için kullanılır. Kesinlikle, bu Birleşik platform hücre altı protein trafiği ve colocalization farklı biyolojik süreçlerin, eğitim için uygulanabilir.
Teknik olarak, hücre altı protein yerelleştirme genellikle confocal mikroskobu kullanarak ve istatistiksel analiz algılanan hücreleri1,2,3,11sınırlı sayıda içinde gösterilmiştir. Ayrıca, akış sitometresi geniş bir hücresel düzeyde12birden çok proteinlerin Co lekeli sinyallerle kapısı hücre popülasyonlarının uygulandı; Ancak, bu hücre altı protein colocalization detaylı bir görselleştirme eksik. Yüzde protein colocalization, hücresel ve nüfus düzeyde kapsamlı ve istatistiksel analizlerini elde etmek için protein colocalization ile biyolojik özelliklerini belirlemek için profil oluşturma ve çözümleme yaklaşımlar görüntüleme dahil alaka. Özellikle, colocalization, CD1d ve ilişkili lizozomal membran proteini 1 (Lamp1) algılamak için görüntüleme akış sitometresi kullanır Bu çalışmada proteinler. Kantitatif analiz colocalized moleküllerin daha önce populational bir ölçekte yapılması zordu. Bu çalışmada, ImageJ-Fiji program protein colocalization ile çok sayıda populational ve bireysel hücresel düzeyde işbirliği lekeli hücre yüzdesi incelemek için uyarlanmış. Özellikle, biz birlikte lokalize alanlarda, yoğunluk ve CD1d protein büyük ölçüde insan DC'lerin lipofilik kirletici benzo [a] dumanında (BaP)13 maruz geç endositik bölmeleri içinde muhafaza edildi sonuç desteklemek için populational boyutu ölçülür . Bu kombine cep ve analiz görüntüleme nüfus CD1d-Lamp1 colocalization Inhibe lipid antijen sunumu için ilgili son derece tekrarlanabilir, kapsamlı ve istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar sağladı.
İnsan DCs BaP maruz transcriptome endositik lipid metabolizması ve CD1d endositik kaçakçılığı BaP pozlama Engelli hipotez kuvvetle desteklediler. Bu hipotezi test etmek için biz CD1d, endositik işaretleri ve DC işaretleri de dahil olmak üzere birden çok proteinler ile birlikte lekeli görüntüleri DC nüfusunun profil görüntüleme akış sitometresi uygulanır. Son olarak, ortak lekeli hücreleri istatistiksel olarak yoğunluk yüzdesi ve CD1d ve Lamp1 colocalization alanları göstermek için analiz edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmanın insan iletişim kuralları Cincinnati Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulca kabul edildi ve tüm yöntemleri ilgili kurallara ve düzenlemelere uygun şekilde gerçekleştirilmiştir. Kan örnekleri sağlıklı bağışçılardan Cincinnati Üniversitesi Tıp Merkezi'nde Hoxworth kan merkezinden elde edilmiştir.
1. Transcriptomic kirletici günese maruz kalan insan monosit kaynaklı DCs profil oluşturma
- BaP maruz DCs toplam RNA çıkarımı
- İnsan DCs sitokinler GM-CSF ve Il-4 kullanarak ayırt etmek ve DC için BaP 6 gün13için maruz.
- Sıralama BaP maruz DCs yüzey ifade işaretleri (Lineage-HLA-DR+), temel akış sitometresi çoğunluğu oluşur geleneksel DCs kullanarak (CD11c+CD1c+)13. Tipik olarak, 10.000 DCs kültür orta % 10 içeren sıralamak FBS, DCs 600 x g ve 4 ° C 6 dk santrifüj kapasitesi ve hemen süpernatant tarafından aspirasyon 1 mL pipet ucu kullanarak kaldırın.
- Bir kez süpernatant aspirasyon tarafından kaldırılır, hücre Pelet RNA izolasyon kiti-80 ° C daha önce RNA çıkarma depolamada için 0.4 mL lizis/bağlama arabelleği ekleyerek parçalayıcı.
- RNA izolasyon kiti toplam RNA ayıklama protokolü ile toplam RNA14ayıklamak için kullanın. Bioanalyzer15kullanarak RNA bütünlük ölçmek.
- Transcriptomic analiz sıralanmış DC'lerin (Şekil 1A)
- Kütüphane için RNA-seq RNA Kütüphane hazırlık seti kullanarak hazırlayın. Kısacası, izole poli-bir RNA parçası (~ 200 bp), geriye doğru parçaları cDNA 1 iplikçik için uyarlamak ve dUTP ile etiketlenmiş ikinci strand cDNA sentezi tarafından izleyin.
- Çift Kişilik strand cDNA bağdaştırıcısına bir sap-ilmik yapısı ile son onarım ve dA-takip boncuk arıtma sonra ligate. CDNA ve bağdaştırıcı döngünün strand özgüllük korumak ve bağdaştırıcı döngü PCR için açmak için Kullanıcı (urasil özgü eksizyon reaktif) enzim ile 2 iplikçik urasil kalıntılarında tüketim.
- Dizin oluşturulmuş Kütüphane zenginleştirmek için evrensel ve Dizin özgü primerler kullanılarak PCR 13 döngüleri gerçekleştirin. Kitaplığı temizlemek ve Kütüphane kalite kontrol ve dağıtım boyutlandırmak için Bioanalyzer DNA yüksek hassasiyet yonga üzerinde çalıştırın.
- Bir kütüphane miktar setini kullanın ve bir gerçek zamanlı PCR sistemi ile Kütüphane boyutu bilgileri toplama Kütüphane üzerinden hesaplamak için bir standart eğri yöntemi kombine.
- Orantılı olarak havuz tek tek dizin oluşturulmuş uyumlu kütüphaneler ve son toplam konsantrasyonu 15'e ayarlamak am. Kütüphane küme üretimi gerçekleştirmek ve ~ 25 milyon okuma örnek başına oluşturmak için bir ayarı tek oku 1 x 50 BP kütüphanede sıra.
- Sıralama
- Nasıl yapılacağını ve sırasıyla reaktifler SBS ve PE reaktif rafları için dizin oluşturma yük. Kadar tüm buz erimiş vardır ve her şişe/tüp reaktifler düzgün karışık 1 h için bir laboratuvar-grade su banyosunda reaktifleri koyun.
- ICB mix biberondan çözdürülen boya ve -20 ° C enzim ekleyerek hazırlamak ve karıştırın. NaOH çözüm sıralama talimatlara göre hazırlayın. Tüm reaktifler 4 ° C'de kullanıma hazır kadar yerleştirin.
- 1 h sırasında dönem, sequencer'ın gücüyle bekliyor. DONOTEJECT sürücü görünür ve bilgisayar bir ağ sürücüsüne bağlanmak için bekleyin.
- Sequencer'ı kontrol yazılımını başlatın.
- %0.5 ara 20 ve % 0.03 içeren bakım yıkama çözüm 2 L ProClin 300 içinde laboratuvar-grade su hazırlamak.
- SBS reaktif rafa her 8 şişe ve şişe vidalı huni kapakları ~ 100 mL bakım yıkama çözeltisi ekleyin. PE reaktif rafa her on 15 mL konik tüpler için ~ 12 mL bakım yıkama çözeltisi ekleyin ve kapaklar atın.
- İki rafları çözüm dolu şişe/tüpler için sequencer yükleyin.
- Sequencer'ı kontrol yazılımı bakım yıkama seçin; işlem tamamlanana kadar sequencer sıvı sistemi temizlemek için yönergeleri izleyin.
- Yeni koşmak belgili tanımlık bilgisayar yazılımı "SEQUENCE" sekmesinden başlatın; bir ağ sürücüsüne çıktı verilerini doğrudan. Tek okuma 1 x 50 bp tek dizin multiplexed kitaplıklarla parametrelerini seçin.
- İsteğe bağlı olarak, sıralama durumu, uzaktan bir bilgisayar veya akıllı telefon izlenebilir BaseSpace sıra Hub'ına oturum.
- Bir örnek sayfası azaltma için upload ve reaktif bilgilere göre yazılım gereksinimi sağlamak.
- SBS ve PE reaktifler için sequencer yükleyin. Kullanılan akış hücre (~ 15 dk) sistemiyle Başbakan.
- Küme oluşturma işlemi tamamlandıktan sonra (~4.5 h), akış hücre çıkar, akış hücre su ve kuru objektif kağıt kullanarak silme ile hafifçe sprey. Hafifçe akışı hücre % 95 etanol ile sprey ve kuru silin. Yüzey enkaz veya tuz kalıntı temiz olduğundan emin olmak için bir ışık karşı kontrol edin.
- Başbakan adım tamamlandıktan sonra kümelenmiş akışı hücre yüklemek ve nasıl yapılacağını başlar. Sıra analiz Görüntüleyici yazılım otomatik olarak başlatılır.
- Sıralama veri kalitesi dahil olmak üzere küme yoğunluğu, okuma geçiş filtresi, küme pass filtre %, % ≥Q30, eski faz/profaz %, SAV dizin oluşturma QC, bu veri kalitesi anlamak ve sorun giderme yardımcı olur vb üzerinden izlemek.
- Akış hücre conta değiştirme ve sıralama tamamlandıktan sonra bir bakım yıkama gerçekleştirin. Sequencer'ı sonraki saldırı için hazırdır.
- Bioinformatic Analizi
- Biyoinformatik RNA-seq veri analizi13gerçekleştirin.
2. yol analiz Transcriptomic profilleri (Şekil 1B)
- Bir edgeR Bioconductor sonuç gen ifade yoğunluğu sayıları üç bağışçılardan BaP maruz kalan ve sigara maruz DCs arasında karşılaştırmak için kullanın. O zaman, BaP maruz kalan ve sigara maruz DCs mutlak kat değişiminde temel arasında differentially ifade gen tanımlamak (> 2 kıvrımları) ve (FDR) - ayarlanan p- değerleri oranı yanlış keşif (< 0,05).
- İşlev kümelerini differentially tahmin etmek için genlerin ifade, ToppCluster yazılım paketi KEGG ve REACTOME de dahil olmak üzere çeşitli veritabanları karşı değiştirilmiş genler aramak ve küme verileri oluşturmak için kullanın. ToppCluster hipergeometrik test fonksiyonel zenginleştirme gen liste zenginleştirme analiz16üzerinden elde etmek için kullanır.
- Daha fazla bu işlev kümeleri sonuçlarından Cytoscape17,18 yorum 3.3.0, karmaşık ağları görüntülenmesi için genel olarak kullanılan açık kaynak yazılım platformu için giriş. Böylece, farklı kümeleri veya yollar, endositik kümeleri ve lipid metabolizması, dahil olmak üzere dahil genler gen ifade (Şekil 1B)13ortalama kat değişim renk ek açıklama ile bir ağ gösterilmektedir.
3. akış sitometresi CD1d ve Lamp1 Colocalization görüntüleme
- Antikor BaP maruz DCs etiketleme
- Maruz 0.5 x 106 insan DCs 5,94 mm BaP 2 ml tam Dulbecco'nın 37 ° C'de 4 gün için modifiye kartal orta. DCs Santrifüjü 400 x g 10 dk. blok için de tarafından hücreleri insan serumu engelleyici ve anti-insan Fc reseptör antikorları buz anti-insan CD16, CD32 ve CD64 antikorları da dahil olmak üzere, 10 min için kuluçka tarafından farklılaştırılmış DCs hasat.
- Kuluçkaya parlak mor 421-anti-CD1c (L161), phycoerythrin/siyanür boya 7 (PE/Cy7) - anti - HLA-DR ve PE/Cy5-anti-CD11c buz içinde 20 dk için DCs ile. Tablo 1 antikorlar listesini gösterir.
- DCs PBS %4 paraformaldehyde ile düzeltin ve onları Permeabilization yıkama arabellek ile permeabilize. Bir PE etiketli arıtılmış anti-insan CD1d (51,1) karışımı ve Alexa Fluor 647 etiketli anti-Lamp1 (CD107a) ile hücre içi boyama gerçekleştirmek (H4A3).
- Akış Sitometresi ölçüm (Şekil 2) görüntüleme
- Cincinnati Çocuk Hastanesi 40 X amacı ile yaklaşık 10 mm çapında bir hücre için 300 piksel vermeye kullanarak akış sitometresi temel görüntüleme bir akış sitometresi kullanarak lekeli örnekleri analiz. Bir piksel boyutu yaklaşık 0,5 mm adımlarla nesne 0,5 mm dir.
- 10.000 hücresel görüntüleri üreticinin yönerge göre tarafsız bir şekilde elde etmek.
4. analizleri akış sitometresi görüntülerin görüntüleme
- FİKİRLER yazılım (Şekil 2) kullanarak colocalization Analizi
- Tek sigara lekeli örnekleri karşı sigara lekeli örnekleri sigara lekeli BaP maruz DCs olduğu gibi rutin akış sitometresi veri BaP autofluorescence ile de dahil olmak üzere eşiğin floresan yoğunluğu ayarlayarak lekeli tazminat ile gerçekleştirmek analiz.
- Kapı alt kümelerine HLA-DR+CD11c+CD1d elde etmek için hücreleri lekeli+Lamp1+ hücreleri (Şekil 2A) ve göstermek hücresel Albümdeki kapı alt kümeleri (2B rakam).
- İki teknik dahil kriterlere göre bir png biçiminde güçlü işbirliği lekeli sinyaller görsel varlığı ve ImageJ-Fiji (2B rakam) kullanarak colocalization analizleri için CD1d ve Lamp1 proteinlerin hücre altı yerelleştirme hücre görüntüleri kaydetmek.
- Yazılım ImageJ-Fiji colocalization Analizi (Şekil 3) gerçekleştirmek için kullanın.
- Sigara maruz ve BaP günese maruz kalan insan DCs için sırasıyla 100 kaydedilen hücre görüntüleri birleştirerek girdi görüntüsü dosyaları hazırlayın (Şekil 3A).
- CD1d analiz (kırmızı) ve Lamp1 (yeşil) colocalization bir scatterplot kullanarak.
- ImageJ-Fiji programını çalıştırın. 100 hücre görüntüleri (Şekil 3B ve Şekil 4A) .png dosyasını açın: "dosya | Açık".
- İki resim bir kırmızı veya yeşil bir kanal ile birleştirilmiş kırmızı ve yeşil kanallarını görüntüsüyle ayrılmıştır: "görüntü | Renk | Kanalları Böl".
- Komutları kullanarak bir scatterplot çizmek "Analyze | Colocalization | Colocalization eşik". İstimal belgili tanımlık "PrintScreen" anahtar scatterplot kaydedin.
- Mander'ın colocalization katsayıları her tekli hücresel resim hesaplamak (n = 100) (Şekil 4B)
- Bir tek hücre görüntü görüntü dosyası üzerinde kullanarak split kanallı seçin "Oval" seçim aracı.
- Kullanma belgili tanımlık buyurmak "Analyze | Colocalization | Colocalization eşik". "Kanal 1" bölge (ROI) ilgi diyalog kutusundan seçin. Her hücre görüntüsü için "Mander'ın eşikleri kullanarak" de dahil olmak üzere tüm hesaplama seçenekleri tutmak.
- Bu hesaplama tüm 100 hücre resimler için yineleyin.
- Kaydedin ve bir elektronik tablo kullanarak sonuçları açın.
- Ortalama ve standart hataları "Thresholded Mander'ın katsayıları" için arsa (n = 100, 0 anlamına gelir yok colocalization 1 anlamına gelir ve mükemmel colocalization). Öğrenci t-testi BaP maruz kalan ve sigara günese maruz kalan gruplar (Şekil 4B) arasında karşılaştırma p değerini hesaplamak için kullanın.
- CD1d ve Lamp1 arasında işbirliği için birden çok hücre resim lokalize thresholded piksel yoğunluğu yüzdesini hesaplamak (n = 100) (Şekil 4 c).
- 4.2.3 içinde aynı çözümleme iletişim kuralını kullanan ve ek olarak sonuç seçeneği "eşiğin colocalized % yoğunluğu"seçin.
- Mander'ın colocalization katsayıları ile birlikte bu çözümlemesi gerçekleştirin.
- Benzer şekilde ortalama ve standart hataları % yoğunluk CD1d ve Lamp1 arasında colocalized için arsa. Öğrenci t-testi BaP maruz kalan ve sigara günese maruz kalan gruplar (Şekil 4 c) arasında karşılaştırma p değerini hesaplamak için kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lipofilik kirletici BaP endositik gen kümelerden her donör insan DCs. insan DCs monosit kaynaklı olarak değiştirir (n = 3) BaP ile inkübe ve daha da açıklandığı gibi RNA çıkarma ve transcriptomic analiz için kullanılan geleneksel DCs için sıralanmış . Gen ifadesinin normalleştirme, BaP maruz kalan ve sigara günese maruz kalan gruplar arasında değişmiş gen göre differentially ifade genlerin korelasyon fonksiyonel kümelenmiş. Toppcluster program16 ilgili hücresel yolları analizleri için değiştirilmiş gen listesine giriş ve p değerleri (Şekil 1B) yanlış bulma oranı (FDR) düzeltmesi kullanarak istatistik testi gerçekleştirin. Lipid metabolizması ve endositik işlevleri de dahil olmak üzere birçok büyük değişmiş gen kümeleri BaP maruz DCs tespit edilmiştir. CD1-aracılı antijen sunumu son derece endositik yolu5,19', yükleme lipid antijen bağımlı olmuştur, çünkü bu çalışmada, endositik ticareti, fonksiyonel test üzerinde özellikle biz odaklı 20,21.
CD1d endositik kaçakçılığı görüntüleme akış sitometresi kullanarak gösterilmiştir. Çok sayıda hücre görüntüleri görüntüleme akış sitometresi kullanarak elde etme üzerine uygun birden fazla antikor (Şekil 2A) ile birlikte lekeli hücre popülasyonlarının perdeleme yoluyla bireysel hücresel görüntüleri görselleştirmek için fikirler programı kullanmaya başladı. Özellikle, biz büyük DC nüfus HLA-DR ve CD11c daha da CD1d ve Lamp1 ortak ifade ile (Şekil 2A) DCs göstermek için ortak lekeli Gate başardık. Co lekeli sinyalleri zenginleştirilmiş CD1d ve Lamp1 Çift Kişilik leke ile hücre nüfus çoğunluğuna aracılığıyla (Şekil 2A). İlk CD1d endositik kaçakçılığı bazal ve yüksek düzeyini fizyolojik şartlarda (Şekil 2B)5yüzey ifade gösteren sigara maruz normal DCs proteinlerin, CD1d ve Lamp1 en az colocalization ile gösterdi, 19,20,21. Colocalization CD1d ve Lamp1 proteinlerin ölçmek için Biz başlangıçta fikirler parlak ayrıntı benzerlik BaP pozlama13ile CD1d ve Lamp1 proteinler arasında hafif bir artış göstermek için kullanılır. Parlak ayrıntı benzerlik CD1d ve Lamp1 proteinleri yüksek CD1d mümkün olduğunu belirten fizyolojik durumda üst üste olası iken iki faktör, korelasyon testleri için Pearson korelasyon katsayısı üzerinde hesaplanan yapıldı. geçici trafik-den geçerek fonksiyonel lipid antijenleri elde etmek için geç endositik bölmeleri. Böylece, BaP pozlama CD1d protein daha geç endositik bölmeleri görüntüleme Analizi Yazılım Fiji'de kullanarak çakışan CD1d ve Lamp1 proteinler artış yüzdesi tarafından yansıtıldığı gibi korur olup olmadığını sınamak için daha biyolojik olarak anlamlıdır ImageJ paket. Son olarak, saklama geç endositik bölmeleri CD1d proteinin işlevsel olarak değiştirilmiş endositik gen profilleri BaP maruz onaylamak için kullanılabilir.
Co yerelleştirilmiş yoğunluk ve CD1d ve Lamp1 proteinler arasındaki alanı ölçülür. Bir tekrarlanabilir eşik ayarı ve yüzdeler CO yerelleştirilmiş alanları ve yoğunluğu elde etmek için biz ImageJ-Fiji22da birkaç diğer çalışmalar23,24,25kullanılmıştır, uygulanır. Rastgele CD1d seçin+Lamp1+ hücreleri ile güçlü eş leke ve CD1d ve Lamp1 proteinleri açık hücre altı yerelleştirme girdi görüntüsü (2B rakam) olarak. Bireysel hücresel görüntüleri tek bir görüntü dosyası için bir tutarlı Analizi (Şekil 3A) için birleştirilebilir. Bizim çalışmada 100 cep fotoğraf birleştirilmiş ve "colocalisation eşikleri" ayarlayarak çözümlenecek programında açılabilir (Şekil 3B). Piksel yoğunluğu arasında iki kanal (PE etiketli CD1d ve AF647 etiketli Lamp1) colocalization bu 100 hücre görüntüler (Şekil 4A) Co yerelleştirilmiş piksellerden algılayarak scatterplot ile genel gösterildi. Bu arsa, yatay ve dikey çizgiler Costes'ın eşikleri temsil ve çapraz çizgiler iki kanal arasında genel piksel yoğunluğu oranı temsil eder. Costes'ın eşik iki örtüşen kanallar zayıf piksel kaldırmak için görünür bir mekandır. Neden scatterplot artan bir colocalization CD1d ve Lamp1 proteinlerin BaP pozlama gösterir. Ayrıca, colocalization CD1d ve Lamp1 proteinleri Mander'ın katsayıları (Şekil 4B) kullanarak arasında derecesini sayılabilir. Sonuç olarak, CD1d ve Lamp1 BaP maruz DC'lerin karşılaştırma istatistiksel olarak bir öğrenci t-testleri (Şekil 4B) tarafından desteklenen olarak sigara maruz DCs ile geç endositik bölmeleri arasında artan colocalization Mander'ın katsayıları göstermektedir. Ancak, protein yoğunluk colocalized ve sigara colocalized alanları arasında türdeş olmayan ise, colocalized yoğunluk colocalized alanlarına benzersiz olacaktır. Bu nedenle, bu da colocalization yoğunluğu (Şekil 4 c) göre daha fazla sınav için gereklidir. Sonuç olarak, birden çok hücre resmi colocalized yoğunluk yüzdesi ortalama bir hesaplama her sütun temsil eder (n = 100) Co yerelleştirilmiş proteinlerin bir çifti için BaP maruz kalan ve maruz olmayan koşullar arasında. Öğrenci t-testleri de istatistiksel anlamlılık göstermek (n = 100, p< 0.001) belirtilen standart hataları ile BaP maruz kalan ve sigara günese maruz kalan gruplar arasında. Özet olarak, bizim veri protein BaP pozda geç endosomes içinde muhafaza edildi CD1d, o BaP değişmiş gen ekspresyonu daha fazla destek Engelli endositik işlevi ve CD1d kaçakçılığı yol göstermek.
Özet olarak, CD1d-Lamp1 colocalization BaP pozlama geliştirir. Hücre resimleri (Şekil 2B), scatterplots (Şekil 4A), örtüşen piksel yoğunluğu ile dahil temel alan birden çok parametre Mander'ın katsayıları (Şekil 4B) gelişmiş ve çakışan yoğunluğu ( yüzdesi arttı Şekil 4 c), CD1d endositik saklama BaP pozda destek. Bu colocalization hücresel görüntüleri protein colocalization derecesini belirlemek ve hücre fonksiyonları, biyolojik mekanizmaları göstermek için doğru bir yaklaşım Örneğin, endositik işlevini kesintiye endositik gen ile tutarlı analizidir ifade, CD1d tarafından kısıtlanmış T Inhibe harekete geçirmek için daha fazla katkıda13hücreleri.
Resim 1 : DC transcriptomes BaP maruz pertürbasyon (A) akış çizelgesi RNA-devamı. İlk olarak, kalite kontrol (QC) analizi toplam RNA kalitesini incelemek için gerçekleştirildi. Giriş, poli-A RNA izole olduğu gibi bir otomatik sistem ve yüksek kaliteli toplam RNA kullanarak, hangi gösterdi rRNA poli-bir RNA QC analizde tükenmiş. Poli-bir RNA sonra otomatik Kitaplığı'na tabi hazırlık ve PCR dizin oluşturma. Ardından, güçlendirilmiş kitaplığı tarafından bir Bioanalyzer QC için beklenen verim ve boyut dağılımı ile analiz edildi. QPCR miktar sonra Dizin oluşturulmuş kitaplıklar havuza alınmış ve sıralama için akış hücre üzerine kümelenmiş ve sıralama veri kalite gerçek zamanlı olarak izlenir. Eksen sinyalleri boyama akış sitometresi göreli sayıları temsil eder. (B) Altered genlerin farklı fonksiyonel grupları halinde gruplandırılmış ve endositik işlevi ve lipid metabolizması ile ilişkili gen kümeleri gösterilir. Kırmızı: CD1d; Yeşil: Lamp1. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Fikirler programı kullanarak hücresel görüntüleri analizini. (A) DCs dan sağlıklı monosit elde edilen bağış öncelikle geçişli HLA-DR + CD11c + hücreler ve daha fazla kapı üzerinde CD1d+Lamp1+ fikirler programı kullanarak hücreleri. (B) hücresel görüntüleri HLA-DR+CD11c elde+CD1d+Lamp1+ nüfus hücresel görüntü görüntüleme için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Fiji-ImageJ programı kullanarak hücresel görüntüleri analizini. CD1d ve Lamp1 proteinlerin güçlü eş leke hücrelerle Fiji-ImageJ kullanarak görüntü analizi için rastgele seçilmiştir ama görünmez veya zayıf için ya CD1d ya da Lamp1 protein boyama ile hücreleri * Şekil 2Bolduğu gibi hariç. (A) Bu rasgele seçilen cep görüntüleri tek bir görüntü dosyası olarak bir giriş görüntüsünü içine monte. (B) colocalization Analizi yeşil ve kırmızı kanalları colocalization eşikler ayarlama ile gerçekleştirildi. Scatterplots eşik hesaplama ile üretildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Colocalization CD1d ve lamba 1 proteinlerin. Benzer veri kümesi kullanarak rapor içinde Sharma vd. 13, BaP maruz kalan ve maruz olmayan koşullar, DCs gelen CD1d ve Lamp1 proteinler arasında ortak yerelleştirilmiş piksel yoğunluğu yeniden hesaplanır ve scatterplots(a)ile gösterilen. Mander'ın katsayıları CD1d ve Lamp1 colocalization için hesaplanan ve ortalama seçili hücre görüntüleri (B) ile gösterilir. Co yerelleştirilmiş piksel yoğunluğu yüzdesi aynı zamanda hesaplanan (C) oldu. İstatistiksel anlamlılık (n = 100, p < 0.001) öğrencinin t-testleri ile karşılaştırıldığında sigara maruz grup ile elde edildi. Standart hataları işaret. Veri hücreleri sağlıklı bir donörden ile bir tahlil vardır. İki bağımsız deneyleri benzer sonuçlar veren gerçekleştirilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Antikorlar | Fluorophores veya ikincil antikor | Klon |
| HLA-DR | Phycoerythrin/siyanür 7 (PE/Cy7) | L243 |
| CD11c | Phycoerythrin/siyanür 5 (PE/Cy5) | 3.9 |
| CD1c | Parlak mor 421 | L161 |
| Saf anti-insan CD1d | PE-anti-fare Igg2b | 51,1 |
| Lamp1 | Alexa Fluor 647 (AF647) | CD107a(H4A3) |
Tablo 1: antikor kullanılan bu çalışmada. Paylaşılan uyarma ve emisyon dalga boylarında nedeniyle, fluorophores PE/Cy5 ve AF647 kısmen sinyalleri boyama üst üste. Bu fluorophores yüzey proteini (CD11c) ve hücre içi bir protein (Lamp1) sırasıyla onların sinyal örtüşen önlemek için bir hücre altı düzeyde etiketlemek için kullanın. Ayrıca en iyi titrasyon ve tazminat her iki fluorophores arasında örtüşen sinyalleri en aza indirmek için kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fonksiyonel onay döngüsünün bir değişmiş gen içeren birden çok yolları ve bireysel ve populational hücresel aktiviteler tümleştirmek için zorluk yaygın olarak etkilenen gen ekspresyonu nedeniyle meydan okuyor. Özellikle test CD1d endositik bölmeleri kaçakçılığı görüntüleme akış sitometresi çalıştırmaya başladık. Akış Sitometresi Imaging hücre populational ölçüm ve birden çok proteinlerin hücre altı colocalization bireysel gösterimi bütünleştirir. Confocal mikroskobu daha önce yüksek çözünürlüklü protein colocalization ölçüm sağlamıştır ve akış sitometresi farklı hücre popülasyonlarının için kapsamlı fenotipleme sağlamak mümkün. Akış Sitometresi Imaging confocal mikroskobu ve akış sitometresi transcriptomic değişikliğin fonksiyonel onay için bir yüksek profilli şekilde protein colocalization çevre tarafından çözümlenecek kabul edilebilir resim çözünürlükte avantajlarını birleştirir kirleticiler.
Çünkü (ı) birden çok tek tek hücreler analizleri ayrıntılı analizlerini populational ölçek birden çok proteinlerin colocalization Teknik olarak talep ediyorlar, emek yoğun ve nispeten önyargılı vardır; (ii) bu örtüşen piksel yoğunluğu veya alan pozitif boyama göre yorumlamak için en uygun bir eşik tanımlamak zordur; ve (iii) bireysel ve populational hücrelerinin dengeli gözlem önemlidir. Bu çalışmada, biyolojik olarak anlamlı bir gözlem, istatistiksel anlamlılık testi ve ortak yerelleştirilmiş proteinlerin görüntüleme bir gösteri performans odaklı. Bu hedefe ulaşmak için biz ilk insan DCs görüntüleri binlerce görüntüleme akış sitometresi kullanarak elde. Kantitatif analizleri dosyaları görüntüleme yazılımı fikirler kullanarak parlak ayrıntı benzerlik Analizi ve Fiji-ImageJ kullanarak bir istatistiksel olarak test edilmiş colocalization analiz kombine. Colocalization iki proteinlerin Pearson korelasyon katsayısı tabanlı parlak ayrıntı benzerlik, kullanarak hesaplama Co lekeli nüfus çoğunluğuna fikirler program sağlar ve rasgele seçme hücreleri hücre altı lokalizasyonu ile birlikte lekeli proteinler13. Daha fazla Co yerelleştirilmiş proteinlerin biyolojik ilgili gösteri sağlamak için biz ImageJ-Fiji yazılım kullanılan ve birlikte lokalize alanlarda yüzdesini hesaplamak için Mander'ın katsayısı ve derecesini göstermek için piksel yoğunluğu üst üste Endositik yolu CD1d lokalizasyonu.
ImageJ-Fiji programı kullanmak için kritik adım tek hücre Analizi Imaging gerçekleştirmektir. Varyasyon yüzde protein colocalization tek tek hücreleri tek hücre görüntülerden görsel olarak birleştirilmiş renkleri ile karşılaştırıldığında izlenebilir. Yüzde protein colocalization tüm 100 hücrelerden sayı ortalaması alınarak anlamına gelir ve standart hataları protein colocalization ve populational bir düzeyde işlevsel korelasyon göstermek için hesaplanabilir. Bu Biyoinformatik Analizi basit ve basit bir tekrarlanabilir eşik hesaplama bu analiz sunuyor çünkü belirsiz sonuçları ile ilgili olmadan aynı üretmek için Costes'ın yöntemini kullanarak aynı veri kümeleri için eşikler sonuçlandı ve benzer eşikleri benzer veri kümeleri26. Bu tekniği tek hücre görüntülerin emek yoğun el ile giriş ve görsel olarak ortak lekeli hücre fikirler yazılımını kullanarak potansiyel olarak öznel seçim kısıtlamadır. Çalışma, biz her grup 100 hücre görüntüleri analiz ve tekrarlanabilir seçim ölçütü, güçlü işbirliği lekeli sinyalleri dahil olmak üzere ayarlayın ve CD1d ve Lamp1 proteinlerin hücre altı yerelleştirme temizleyin. Bu sınırlamalar üstesinden teknik iyileştirme toplu iş çözümlemesi sağlamak için analitik yazılım ve tek hücre akış sitometresi tarafından sağlanan boyama yoğunluğunu ötesinde morfolojik özelliklere bağlı olarak objektif seçimi gerektirir. Özet, kombine cep ve nüfus analiz görüntüleme yüzde protein colocalization son derece tekrarlanabilir, kapsamlı, istatistiksel olarak test edilmiş ve biyolojik olarak ilgili sonuçlarını sağlayacaktır. Biz bu CD1d-Lamp1 colocalization Analizi yüksek profilli hücresel görüntüleme analizler proteinlerin işlevsel ve morfolojik değişiklik daha geniş sorulara cevap için başarılı bir örnek olarak hizmet verebilir inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa yoktur
Acknowledgments
Yazarlar Robert Giulitto (Hoxworth kan Merkezi) insan kan örnekleri için teşekkür ederiz ve Dr Liang Niu gen ekspresyonu normalleştirme için okur. Biz de teşekkür hibe destek üzerinden Ulusal Çevre Sağlık Bilimler Enstitüsü (ES006096), Merkez çevre genetik (CEG) pilot proje için (S.H.), Ulusal Enstitüsü alerji ve enfeksiyon hastalıkları (AI115358) (S.H.), University of Cincinnati Üniversitesi Araştırma Konseyi Ödülü (S.H.) ve University of Cincinnati üniversite tıp çekirdek geliştirme fon (X. Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transcriptomics | Illumina | HiSeq 2500 v4 | Illumina HiSeq system |
| ImagingStream X | Millipore | 100220 | Imaging flow cytometry |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fisher | Total RNA extraction | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent | Total RNA QC analysis | |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher | PCR, enzyme reaction | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England Biolab | PolyA RNA purification | |
| Automated SMARTer Apollo system | Takara | PolyA RNA purification | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolab | Library preparation | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | DNA purification | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) | Thermo Fisher | Library quantification | |
| NEBNext Library Quant Kit | New England Biolab | Library quantification | |
| cBot | Illumina | Library cluster generation | |
| TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot – HS | Illumina | Library cluster generation | |
| HiSeq 1000 | Illumina | Sequencing | |
| TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles) | Illumina | Sequencing | |
| Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | Bio Legend | L243 | |
| Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | Bio Legend | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | Bio Legend | L161 | |
| PE-anti-mouse IgG2b | Bio Legend | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) | Bio Legend | CD107a(H4A3) |
References
- Roche, P. A., Cresswell, P. Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells. Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).
- Huang, S., et al. MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells. The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).
- Nakamura, N., et al. Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling. Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).
- Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Zajonc, D. M., Kronenberg, M. CD1 mediated T cell recognition of glycolipids. Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).
- Cox, D., et al. Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules. PloS one. 4 (5), e5325 (2009).
- Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments. Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).
- Huang, S., et al. Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).
- de Jong, A., et al. CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens. Nature. 15 (2), 177-185 (2014).
- Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Sharma, M., et al. Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants. Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).
- Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).
- Nachamkin, I., et al. Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene. Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).
- Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems. Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).
- Bauer-Mehren, A. Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape). Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).
- Cline, M. S., et al. Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape. Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).
- Huang, S., Moody, D. B. Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system. Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).
- Huang, S. Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis. Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).
- Moody, D. B., Porcelli, S. A. Intracellular pathways of CD1 antigen presentation. Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9 (7), 676-682 (2012).
- Diard, M., et al. Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype. Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature. 9 (7), 697-710 (2012).
- Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).
