यहां, हम प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) से ली-Fraumeni सिंड्रोम (LFS) रोगी व्युत्पंन fibroblasts, iPSCs के माध्यम से mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) osteoblasts के भेदभाव, और vivo में मॉडलिंग की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद LFS रोगी-प्राप्त osteoblasts का उपयोग tumorigenesis.
ली-Fraumeni सिंड्रोम (LFS) एक autosomal प्रमुख वंशानुगत कैंसर विकार है । LFS के साथ रोगियों ऑस्टियो–बचपन और किशोरावस्था में सबसे लगातार प्राथमिक गैर hematologic द्रोह में से एक सहित ट्यूमर के एक विभिन्न प्रकार के लिए संवेदनशील हैं । इसलिए, LFS इस द्रोह का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल प्रदान करता है । iPSC के तरीके का लाभ उठाते हुए, LFS-एसोसिएटेड ऑस्टियो सफलतापूर्वक iPSCs स्टेम सेल (mesenchymal) के लिए LFS रोगी MSCs अंतर द्वारा मॉडलिंग की जा सकती है, और फिर osteoblasts के लिए-osteosarcomas के लिए मूल की कोशिकाओं । ये LFS osteoblasts दोहराऊंगा के oncogenic गुण ऑस्टियो, delineating के रोगजनन के लिए एक आकर्षक मॉडल प्रणाली प्रदान करते हैं. इस पांडुलिपि LFS रोगी fibroblasts से iPSCs की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल को दर्शाता है, iPSCs के भेदभाव MSCs करने के लिए, MSCs को osteoblasts के भेदभाव, और vivo tumorigenesis में LFS osteoblasts का उपयोग कर । यह iPSC रोग मॉडल LFS-संबद्ध ऑस्टियो के लिए संभावित उपचिह्न या चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है ।
२००६ और २००७ के बीच, डीआरएस की प्रयोगशालाओं से कई सफलता निष्कर्षों । Shinya यामानाका और जेंस ए थॉमसन प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs)1,2,3के विकास के लिए नेतृत्व किया । परिभाषित transcriptional कारकों के साथ दैहिक कोशिकाओं reprogramming द्वारा iPSCs फार्म के लिए, शोधकर्ताओं ने प्रमुख विशेषताओं अर्थात्, pluripotency, और आत्म नवीकरण, जो पहले ही मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं में मौजूद करने के लिए सोचा था के साथ कोशिकाओं को उत्पंन कर रहे थे (hESCs) । iPSCs किसी भी व्यक्ति या रोगी से उत्पंन किया जा सकता है और करने के लिए भ्रूण से प्राप्त होने की नहीं है, काफी अध्ययन के लिए उपलब्ध रोगों और पृष्ठभूमि की प्रदर्शनों की मांगें का विस्तार । तब से रोगी-व्युत्पन्न iPSCs विभिन्न मानव रोगों के phenotype को दोहराऊंगा करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, अल्जाइमर रोग से4 और पेशीशोषी पार्श्वस्केलेरोसिस 5 से लांग क्यूटी सिंड्रोम6,7, 8.
iPSC अनुसंधान में इन अग्रिमों ने भी कैंसर अनुसंधान के लिए नए रास्ते खोले हैं । कई समूहों ने हाल ही में एक अतिसंवेदनशील आनुवंशिक पृष्ठभूमि9,10,11के तहत रोगी iPSCs मॉडल कैंसर के विकास के लिए इस्तेमाल किया है, सफल आवेदन के साथ9ऑस्टियो में तारीख को प्रदर्शित, ल्यूकेमिया10,11,12, और कोलोरेक्टल कैंसर13. हालांकि iPSC-व्युत्पंन कैंसर मॉडल अपनी प्रारंभिक अवस्था में अब भी कर रहे हैं, वे phenocopying रोग में महान क्षमता-संबद्ध द्रोह, elucidating रोग तंत्र का प्रदर्शन किया है, और चिकित्सीय यौगिकों14की पहचान ।
ली-Fraumeni सिंड्रोम (LFS) एक autosomal प्रमुख वंशानुगत कैंसर TP53 germline उत्परिवर्तन15की वजह से विकार है । LFS के साथ रोगियों ऑस्टियो सहित द्रोह के एक विभिन्न प्रकार के लिए संवेदनशील हैं, LFS iPSCs बनाने और उनके व्युत्पंन कोशिकाओं को विशेष रूप से अच्छी तरह से इस द्रोह16का अध्ययन करने के लिए अनुकूल. एक iPSC आधारित ऑस्टियो मॉडल पहले २०१५ में स्थापित किया गया था LFS रोगी व्युत्पंन iPSCs9 बाद में mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) में विभेदित और फिर osteoblasts, ऑस्टियो की उत्पत्ति कोशिकाओं । ये LFS osteoblasts दोहराऊंगा ऑस्टियो-जुड़े osteogenic विभेदक दोषों और oncogenic गुण, एक डिश में एक “अस्थि ट्यूमर” मंच के रूप में मॉडल क्षमता का प्रदर्शन । दिलचस्प है, जीनोम चौड़ा transcriptome विश्लेषण LFS osteoblasts में एक ऑस्टियो जीन हस्ताक्षर के पहलुओं को उजागर और यह LFS जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल की विशेषताएं9ऑस्टियो में गरीब पूर्वानुमान के साथ संबंधित हैं, का संकेत नैदानिक प्रासंगिकता की विशेषताएं प्रकट करने के लिए LFS iPSCs रोग मॉडल की क्षमता ।
यह पांडुलिपि कैसे LFS रोगी-व्युत्पंन iPSCs मॉडल ऑस्टियो का उपयोग करने के लिए का एक विस्तृत वर्णन प्रदान करता है । यह LFS iPSCs की पीढ़ी, iPSCs के भेदभाव MSCs के लिए और फिर osteoblasts करने के लिए, और xenograft LFS का उपयोग कर vivo osteoblasts मॉडल में एक का उपयोग विवरण । LFS रोग मॉडल कई फायदे शामिल हैं, सबसे विशेष रूप से यंत्रवत अध्ययन, के लिए ऑस्टियो विकास के सभी चरणों में असीमित कोशिकाओं को उत्पन्न करने की क्षमता, अगोचर पहचान, और दवा स्क्रीनिंग9,14, 16.
संक्षेप में, LFS iPSC आधारित ऑस्टियो मॉडल ऑस्टियो अनुसंधान को आगे बढ़ाने के लिए एक आकर्षक पूरक प्रणाली प्रदान करता है । इस मंच भी रोगी व्युत्पंन iPSCs का उपयोग कर कैंसर मॉडलिंग के लिए एक सबूत की अवधारणा प्रदान करता है । इस रणनीति के नीचे वर्णित आसानी से मॉडल कैंसर की गड़बड़ी के साथ अंय आनुवंशिक विकारों के साथ जुड़े दुष्टों को बढ़ाया जा सकता है ।
उच्च एमएससी विभेदक दक्षता प्राप्त करने के लिए, कई पहलुओं महत्वपूर्ण हैं । एक एमएससी विभेद शुरू करने से पहले iPSCs की संस्कृति की स्थिति है । पांडुलिपि में प्रस्तुत प्रोटोकॉल पिछली पढ़ाई 9,<sup clas…
The authors have nothing to disclose.
आर. जेड. कैंसर की रोकथाम के लिए UTHealth नवाचार द्वारा समर्थित है अनुसंधान प्रशिक्षण कार्यक्रम पूर्व डॉक्टरेट फैलोशिप (कैंसर की रोकथाम और अनुसंधान टेक्सास अनुदान RP160015 संस्थान) । J.T. सूर्य यत्-सेन विश्वविद्यालय के पहले संबद्ध अस्पताल के Ke लिन कार्यक्रम द्वारा समर्थित है । डी.-F.L. कैंसर अनुसंधान में CPRIT विद्वान है और NIH मार्ग द्वारा स्वतंत्रता पुरस्कार R00 CA181496 और CPRIT पुरस्कार RR160019 द्वारा समर्थित है.
Plastic ware | |||
100 mm Dish | Corning | 430107 | |
60 mm Dish | Corning | 430166 | |
6-well Plate | Falcon | 353046 | |
12-well Plate | Falcon | 353043 | |
48-well Plate | Falcon | 353078 | |
1 mL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-2721 | |
200 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-0706 | |
10 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
5 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
10 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
25 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
50 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
15 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
Culture materials and Reagents | |||
CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Invitrogen | A16517 | Commercial Sendai virus reprogramming kit |
Corning hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Basement membrane matrix |
CF1 MEFs, irradiated | ThermoFisher | A34180 | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV | |
αMEM | Corning | 10-022-CV | |
StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Commercial iPSC medium |
KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | A3181502 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
L-Glutamine Solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Human FGF-basic (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
Recombinant Human PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | A4902 | |
Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
StemMACS Passaging Solution XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Commercial passaging solution |
Accutatse Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution |
Thiazovivin (ROCK Inhibitor) | Calbiochem | 420220 | |
0.25% Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Collagenase, Type II | ThermoFisher | 17101015 | |
Human NANOG Antibody | R&D System | AF1997 | |
OCT4 Antibody (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody | R&D System | FAB1435P | |
Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen | DB Biosciences | 560123 | |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
PE Mouse Anti-Human CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
FITC Mouse Anti-Human CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
PE Mouse Anti-Human CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
PE Mouse Anti-Human CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
FITC Mouse Anti-Human CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | |
Chloroform | ThermoFisher | C298-500 | |
2-Propanol | ThermoFisher | A416-4 | |
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | ThermoFisher | BP28184 | |
DNase I, RNase-free (1 U/µL) | ThermoFisher | EN0521 | |
iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891BUN | |
iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free | Corning | 354262 | |
1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch | DB Biosciences | 309597 |