Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la generación de pluripotentes inducidas (iPSCs) de células de fibroblastos derivados pacientes de síndrome de Li-Fraumeni (LFS), diferenciación de iPSCs a través de las células madre mesenquimales (MSCs) y osteoblastos, modelado en vivo tumorigenesis con osteoblastos derivados de paciente LFS.
Abstract
Síndrome de Li-Fraumeni (LFS) es un desorden autosómico dominante del cáncer hereditario. Pacientes con LFS están predispuestos a varios tipos de tumores, incluyendo osteosarcoma--una de las malignidades no hematológica primarias más frecuentes en la niñez y adolescencia. Por lo tanto, LFS ofrece un modelo ideal para estudiar esta malignidad. Aprovechando metodologías de iPSC, osteosarcoma LFS-asociada se puede modelar con éxito distinguiendo LFS iPSCs paciente a las células madre mesenquimales (MSCs) y luego a osteoblastos, las células de origen de los osteosarcomas. Estos osteoblastos LFS recapitulan propiedades oncogénicas del osteosarcoma, proporcionando un sistema atractivo modelo para delinear la patogenesia del osteosarcoma. Este manuscrito demuestra un protocolo para la generación de iPSCs de fibroblastos pacientes del LFS, diferenciación de iPSCs para MSCs, diferenciación de MSCs y osteoblastos, en vivo tumorigenesis con osteoblastos LFS. Este modelo de enfermedad de iPSC puede ampliarse para identificar biomarcadores potenciales o dianas terapéuticas para el osteosarcoma LFS-asociado.
Introduction
Entre 2006 y 2007, varios resultados de avance de los laboratorios de los doctores Shinya Yamanaka y James A. Thomson condujeron al desarrollo de pluripotentes inducidas (iPSCs) de las células de vástago1,2,3. Por reprogramación de células somáticas con factores transcripcionales definidas forma iPSCs, los investigadores fueron capaces de generar células con características a saber, pluripotencia y auto-renovación, que anteriormente se pensaba que sólo existen en células madre embrionarias humanas (hESCs). iPSCs podría generarse de cualquier individuo o paciente y no tuvo que ser derivado de embriones, ampliando enormemente el repertorio de enfermedades disponibles y fondos para el estudio. Desde entonces, se han utilizado derivados del paciente iPSCs recapitular el fenotipo de varias enfermedades humanas, de la enfermedad de Alzheimer4 y esclerosis lateral amiotrófica5 a largo QT síndrome6,7, 8.
Estos avances en la investigación de iPSC también han abierto nuevas avenidas para la investigación de cáncer. Varios grupos han utilizado recientemente iPSCs paciente al desarrollo de modelos de cáncer en un fondo genético susceptible9,10,11, con aplicación exitosa demostrada hasta la fecha en el osteosarcoma9, leucemia10,11,12y13de cáncer colorrectal. Aunque los modelos de cáncer derivados de iPSC son todavía en su infancia, han demostrado gran potencial en malignidades asociadas a enfermedad phenocopying, elucidar los mecanismos patológicos y la identificación de compuestos terapéuticos14.
El síndrome de Li-Fraumeni (LFS) es un desorden autosómico dominante del cáncer hereditario causado por de mutación de línea germinal TP53 15. Pacientes con LFS están predispuestos a varios tipos de neoplasias malignas como el osteosarcoma, hacer particularmente bien adaptado al estudio de esta malignidad16iPSCs LFS y sus células derivadas. Un modelo basado en iPSC osteosarcoma se estableció en 2015 usando LFS iPSCs derivados del paciente9 posteriormente diferenciadas en células madre mesenquimales (MSCs) y luego a osteoblastos, el que origina las células del osteosarcoma. Estos osteoblastos LFS recapitulan Diferenciación osteogénica osteosarcoma asociado defectos y propiedades oncogénicas, demostrando el modelo potencial como una plataforma de "tumor de hueso en un plato". Curiosamente, los análisis de genoma transcriptoma revelaron aspectos de una firma de gene de osteosarcoma en osteoblastos LFS y que características de este perfil de expresión génica LFS se correlacionan con mal pronóstico en el osteosarcoma9, indicando la potencial de los modelos de enfermedad de iPSCs LFS para revelar características de relevancia clínica.
Este manuscrito ofrece una descripción detallada de cómo utilizar LFS iPSCs paciente derivado al osteosarcoma de modelo. Detalles de la generación de LFS iPSCs, diferenciación de iPSCs MSCs y luego en osteoblastos y el uso de un modelo de xenoinjerto en vivo utilizando osteoblastos LFS. El modelo de enfermedad LFS cuenta con varias ventajas, en particular la capacidad de generar células ilimitadas en todas las etapas de desarrollo de osteosarcoma de estudios mecanísticos, identificación de biomarcadores y9,14, de detección de drogas 16.
En Resumen, el modelo de base de iPSC osteosarcoma LFS ofrece un atractivo sistema complementario para el avance de la investigación de osteosarcoma. Esta plataforma también proporciona una prueba de concepto para modelado de Cáncer utilizando iPSCs derivados del paciente. Esta estrategia que se describe a continuación puede ampliarse fácilmente a malignidades de modelo asociadas a otros trastornos genéticos con predisposición de cáncer.
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Protocol
Este trabajo fue aprobado por la Universidad de Texas Health Science Center en Houston (UTHealth) Comité de Bienestar Animal. Los experimentos se realizan en estricta conformidad con las normas establecidas por el centro de UTHealth para la medicina del Animal de laboratorio y atención (CLAMC) que es acreditado por Asociación Americana para el cuidado de Animal y laboratorio (AAALAC International). Los seres humanos en este estudio caen bajo escenario un ("No temas investigaciones en humanos") como se define en la documentación de NIH SF424. Por lo tanto, no necesita ninguna aprobación por Comité de ética de investigación UTHealth.
1. generación de LFS iPSCs (figura 1A)
- Día -2 placa de fibroblastos pacientes del LFS de4 2 x 10 en un pocillo de una placa de 6 pozos y la cultura de las células con medio de fibroblastos (tabla 1) a 37 ° C en un 5% humidificado incubadora de CO2 . Asegurarnos que los fibroblastos alcanzan confluencia de 50-60% en el día de transducción (día 0).
- Realizar virus Sendai transducción en el día 0. Para ello, reemplace el medio gastado con medio precalentado del fibroblasto. Descongelar el comercial Sendai virus reprogramación kit (véase Tabla de materiales) en el hielo. Infectar fibroblastos LFS con virus de Sendai mezclados según las instrucciones del fabricante.
- Mantenimiento de células transduced en medio del fibroblasto (día 1-6):
- El día 1, 24 h después de la transducción de señales, eliminar el medio de fibroblastos con virus Sendai restantes y sustituirla por medio de frescos del fibroblasto 2 mL. Cultura los fibroblastos transduced en 37 ° C en un 5% humidificado incubadora de CO2 .
- Cambiar el medio con el medio del fibroblasto cada día desde el día 2-6.
- Mantenimiento de células transduced en la condición de la cultura de alimentador (día 7-28):
- Preparar irradiado CF1 ratón fibroblasto embrionario (MEF) cultura platos el día 6. Para hacer esta capa seis platos de cultivo de tejidos de 100 mm añadiendo 5 mL de 0.1% gelatina a cada placa a temperatura ambiente durante 30 min aspiración la gelatina 0.1% después de la capa.
- Quite la MEFs del recipiente de nitrógeno líquido. Descongele la MEFs usando el sistema de descongelación disponible en el mercado siguiendo las instrucciones del fabricante. Placa las células en las placas de gelatina cubierto con medio de cultivo MEF/MSC (tabla 1) en una densidad de siembra de alrededor de 6.7 x 105 células por placa de cultivo de tejido de 100 mm.
- Inocular las células transduced en placas MEF (día 7): Trypsinize las células transduced usando 1 mL de 0.25% tripsina-EDTA por plato 100 mm para 2-4 min a temperatura ambiente. Neutralizar la tripsina con 9 mL de medio de fibroblastos. Células de transferencia a tubos cónicos y centrífuga a 230 x g a 37 ° C durante 4 minutos los fibroblastos transduced en los seis platos MEF preparados el día 6 de la placa y cultura en 8 mL de medio de fibroblastos por plato.
Nota: La confluencia de MEFs es alrededor 20% antes de sembrar células transduced en placas MEF. - El día 8, deseche el medio del fibroblasto y reemplazar por medio de células (tabla 1).
- Esperar la aparición de clones de iPS de días 9-28 (figura 1C). Cambiar el medio de hESCs gastado cada día y controlar la aparición de clones de iPS bajo el microscopio. Espere iPSCs clones suficientemente grandes como para ser observado a simple vista y luego proceder a ampliar iPS clones en condición de cultura libre de alimentador.
- Expansión de los pueblos indígenas surgió clones en condición de cultura libre de alimentador (día 29 79 ~ 99):
- Para preparar la placa revestida de matriz, recubrir una placa de 48 pozos con 120 μl de la solución de la capa del matriz de la membrana del sótano (tabla 1) por pozo. Asegúrese de que la solución de recubrimiento de matriz de la membrana del sótano cubre el pozo y cubre la superficie del plato de cultura. Dejar a temperatura ambiente durante 1 h. Aspire la solución de recubrimiento inmediatamente antes del uso y añadir 250 μl de medio de células por pocillo con inhibidor de roca de 2 μm Thiazovivin.
- El día 28, el medio de hESCs gastado de aspirar y lavar los clones de iPS con 1 x DPBS. Recoger iPS visible clones con una pipeta de 1 mL y transferencia en un pozo de una placa de 48 pozos tratado (paso 1.4.1). Una colonia por pozo de placa de 48 pozos de la semilla.
- Centrifugar la placa a 230 x g durante 4 min facilitar la fijación de la célula. Cultura iPS clones a 37 ° C en un 5% humidificado incubadora de CO2 .
- Al día siguiente (día 29), eliminar el medio de hESCs gastado y añadir 250 μl de medio de iPSC comercialmente disponible en cada pozo.
- Mantener clones de iPS a 37 ° C en un 5% humidificado incubadora de CO2 y cambio el iPSC medio día.
- Cuando iPS clones alcanzan el 85% de confluencia, subcultivo de las células en un 1:10 relación de área de la cultura. Añadir 60 μL de la solución comercial de passaging para separar las células e incubar a 37 ° C por 3 min.
- La semilla de la mitad de las iPSCs separadas en una placa de 12-bien recubiertos por la matriz de la membrana del sótano en 1 mL de medio de hESC con inhibidor de roca de 2 μm Thiazovivin. Clones de iPS en una placa de 12 pozos con 1 mL del medio de iPSC disponible comercialmente por iPSCs bien y subcultura de la cultura en un 1:10 ratio hasta llegar a paso 10.
Nota: iPSCs son cultivada cada 5-7 días en un 1:10 sub cociente. Toma hasta 10 semanas para los clones de iPS llegar a paso 10. caracterizaciones de iPSC incluyendo morfología celular, actividad de la fosfatasa alcalina (AP) y la expresión de factores de pluripotencia y marcadores de células, pueden ser examinadas después de confirmar la eliminación del virus Sendai en iPSCs (demostrado generalmente después de alrededor de 10 pasajes) (figura 1B-E). Anticuerpo y cartilla de información para la caracterización de iPSC se incluyen en la tabla 2 y 4.
2. diferenciación de LFS iPSCs a las células madre mesenquimales (MSCs) (figura 2A)
- Cultura iPSC clones en placas MEF durante al menos 2 semanas (día ~ 0 -14): el MEF platos (platos de cultivo de tejidos de 100 mm) como se describió anteriormente (1.3.1 - 1.3.2). Mantener iPSCs en medio células y cambiar el medio cada día. Cuando iPSCs alcanzar 90% de confluencia, subcultura iPSCs por 1:10 dilución.
- Retiro de MEFs de iPSCs (día 0):
- Después de mantener iPSCs en MEFs durante 2 semanas, cultura iPSCs en platos de cultivo de tejidos de 100 mm hasta las células a 80-90% de confluencia. El medio de hESCs gastado Lave y iPSCs con 5 mL de 1 x DPBS. Añadir 1 mL de la solución de separación celular para separar las células e incubar a temperatura ambiente durante 3 minutos.
- Añadir 9 mL de medio de cultivo MEF/MSC a la placa para neutralizar la actividad de solución de separación celular y transferir las células separadas a un plato de cultivo de tejidos de 100 mm nuevo sin ningún recubrimiento.
- Incube las células a temperatura ambiente durante 30 min permitir las MEFs fijar a la placa.
- Recoger cuidadosamente el sobrenadante que contiene iPSCs suelto y centrifugue a 230 x g a 4 ° C durante 4 min.
Nota: Limpiar la placa inferior conduce a desprendimiento de MEFs.
- Diferenciación de iPSCs hacia MSCs (día 0 - 28):
- Capa tres pocillos de una placa de la pozo de 6 con 1 mL de 0.1% gelatina por bien a temperatura ambiente durante 30 minutos.
- Retire el sobrenadante de iPSCs recogidos de 2.2.4.
- Resuspender iPSCs en 6 mL de medio de diferenciación de MSC (tabla 1) y las células de la semilla en los tres pocillos recubiertos con 2 mL por pozo (día 0).
- Cambiar el medio de diferenciación de MSC cada dos días para eliminar las células sueltas o muertas (día 1 - 28).
- Maduración de MSCs derivados de iPSC (día 28-45):
- Retire el medio de diferenciación pasó de MSC y lavar las células con 1 mL de 1 x DPBS.
- Trypsinize MSCs con 0,5 mL de 0.25% tripsina-EDTA por bien a temperatura ambiente durante 3 minutos.
- Neutralizar la tripsina por 1,5 mL de medio de cultivo MEF/MSC y recoger MSCs de tres pozos en un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar a 230 x g a 4 ° C durante 4 minutos.
- Quite el sobrenadante y resuspender MSCs en 3 mL de medio de cultivo MEF/MSC y la placa en un 60 mm 0.1% gelatina placa revestida (día 28).
- Cultura de MSCs en medio de cultivo MEF/MSC y cambiar el medio cada dos días. Cuando las células alcanzan 100% de confluencia, MSCs subcultivo en una proporción de 1:3 usando 0.25% tripsina-EDTA.
Nota: Las MSCs muestran una morfología de fibroblasto-como (figura 2B). Cuando MSCs crecen en una alta densidad, MSCs alargadas pueden formarse un remolino-como patrón (figura 2B). - Realizar la tinción inmunofluorescente para evaluar derivado de iPSC MSCs mediante el examen de marcadores de superficie MSC CD44, CD73, CD105 y CD166 (figura 2).
Nota: La dilución de anticuerpos se muestran en la tabla 2. Tinción inmunofluorescente de células vivas se realiza según las instrucciones del fabricante. - Después de la confirmación, expanda MSCs en una proporción de 1:3 en platos de cultivo de tejidos de 100 mm. Congelación de ampollas (3 frascos por caja de cultivo de tejidos de 100 mm) utilizando el medio de congelación que contengan 10% DMSO y el 90% FBS.
Nota: Para enriquecer la población MSC, MSCs pueden ordenarse con CD105+, CD24-criterios por flujo citometría9,17. MSCs derivados de iPSC diferenciadas utilizando el método basado en el PDGF-AB comúnmente se pueden mantener durante 2-3 meses en cultura sin pérdida de identidad MSC9. Congelación de MSCs de un número de paso temprano después de confirmar las características MSC.
3. diferenciación de MSCs LFS a osteoblastos (Figura 3A)
- Preparación de MSCs para la diferenciación osteogénica (día -1)
- Para asegurar una cantidad adecuada de completar el protocolo de la diferenciación osteogénica de las células, comienzan con MSCs cultivadas en platos de cultivo de tejidos de 100 mm a 95% de confluencia. Retire el medio de cultivo gastado y MSCs de lavado con 5 mL de 1 x DPBS.
- Trypsinize MSCs con 1 mL de tripsina-EDTA de 0.25% por caja de 100 mm a temperatura ambiente durante 3 minutos. Para asegurar que las células no se tripsinizaron más, deje de tripsinización cuando 50% de la separación de la célula se observa bajo el microscopio.
- Neutralizar la tripsina por 9 mL de medio de cultivo MEF/MSC y recoger MSCs de 3 pozos en un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar a 230 x g a 4 ° C durante 4 minutos.
- Aspirar el sobrenadante, resuspender MSCs en 5 mL de medio MSC y contar el número de células por un hemocitómetro.
- Número correcto de la placa de MSCs en una placa de cultivo.
Nota: El detalle del número de células de la placa de 12 pozos, 6 placa de pocillos y platos de cultivo de tejidos de 100 mm se resumen en la tabla 3.
- Inducción de la diferenciación osteogénica por medio de la diferenciación de osteoblastos (ODM) (tabla 1) (día 0 - 24):
- Aspirar el medio de cultivo MEF/MSC y reemplácelo con el volumen apropiado de ODM (1 mL, 2 mL y 8 mL para cada pocillo de la placa de 12 pozos, cada pozo de placa de 6 pozos y cultivo de tejidos de 100 mm plato, respectivamente) para diferenciar MSCs a osteoblastos (día 0).
- Aspire el ODM gastado y reemplazar con el volumen apropiado de ODM cada dos días durante el proceso de diferenciación osteogénica.
- Realizar la fosfatasa alcalina (AP) y la alizarina roja S (ARS) de tinción para la detección de fosfatasa alcalina hueso-asociado producido por preosteoblasts y producido por la deposición mineral madura osteoblastos, respectivamente, el día 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 y 24 ( Figura 3B).
Nota: AP coloración y tinción de ARS se realizan utilizando el kit disponible comercialmente siguiendo el protocolo del fabricante. - Examinar los niveles de expresión de marcadores de osteoblastos maduros y preosteoblast (ALPL y COL1A1 para preosteoblasts; PTH1R y BGLAP para maduran osteoblastos) por qRT-PCR (figura 3).
Nota: La coloración positiva AP se espera después de 9 días de diferenciación osteogénica y coloración positiva de ARS puede esperarse después de 21 día de diferenciación osteogénica. El MSCs en medio de cultivo MEF/MSC pueden servir como un control negativo de la AP coloración y tinción de ARS.
4. el modelo de xenoinjerto para estudiar In Vivo la tumorigénesis de los osteoblastos derivados de LFS MSC (Figura 4A)
- Diferenciación de MSCs LFS a los osteoblastos:
- Semillas 3-4.5 x 105 MSCs en plato de cultivo de tejidos de 100 mm. Preparar cinco platos para una inyección subcutánea.
- Cultura de MSCs en ODM distinguir MSCs a osteoblastos como se describe en 3.2 hasta el día 14.
- Preparación de los osteoblastos diferenciados para inyección subcutánea:
- Para preparar la solución de la separación de osteoblastos (tabla 1), disolver colagenasa II tipo de 1 g en 1000 mL de medio αMEM a la colagenasa II solución (1 mg/mL). Mantener la solución II de colagenasa a-20 ° C. Mezclar 0.25% tripsina-EDTA y la solución de colagenasa II en una proporción 1:1 que los osteoblastos solución de separación.
- Lo ODM gastado Lave y osteoblastos diferenciados con 5 mL de 1 x DPBS por plato 100 mm.
- Añadir 1,5 mL de solución de la separación de osteoblastos por plato de 100 mm e incubar placas a 37 ° C durante 30 minutos Examine y garantizar la separación de osteoblastos por microscopia.
- Neutralizar la solución de la separación de osteoblastos por ODM y recoger los osteoblastos separados en un tubo cónico de 50 mL. Centrifugar a 230 x g a 4 ° C durante 5 minutos.
- Quite el sobrenadante y resuspender las células en 25 mL de medio ODM. Pasar las células a través de un tamiz de celular μm 70 para remover agregadas células. Contar el número de células usando un hemocitómetro.
- Preparar 1 x 107 osteoblastos por inyección subcutánea y centrifugar las células a 230 x g a 4 ° C durante 4 minutos.
- Resuspender los osteoblastos de7 1 x 10 en 50 μL 1 helado x DPBS. Mix diferenciado osteoblastos con 50 μl de la matriz de la membrana basal gratis de rojo de fenol (osteoblastos matriz suspensión y membrana del sótano fueron mezclados en una proporción 1:1) y mantener osteoblastos en el hielo antes de la inyección.
-
En vivo xenoinjerto tumoral modelo de osteoblastos derivados de MSC de LFS:
- Anestesiar ratones immunocompromised del NU/NU de la mujer de 8 semanas de edad en una cámara de abastecimiento 5% (v/v) inhalado isoflurano en 1 L/min de oxígeno (proporcionado por CLAMC). Después de que el animal se convierte en decúbito, cambiar el sistema de anestesia para el cono de nariz, suministrando 2% (v/v) inhalado isoflurano en 200mL/min de oxígeno (proporcionado por CLAMC). Controlar la profundidad de la anestesia al comprobar los reflejos corneales y pedal para hacer los ratones son lo suficientemente anestesiados y no sufren molestias durante el procedimiento.
- Desinfectar la zona a inyectar con alternas esponjas de clorhexidina y el 70% isopropanol. Utilizar aguja de 26 G para realizar la inyección subcutánea de osteoblastos matriz mixta de LFS de membrana del sótano en un lado de las patas traseras de los ratones NU/NU immunocompromised de 8 semanas de edad (Figura 4A).
- Monitor ratones realizando palpación semanal en sitios de inyección para el crecimiento de las densidades nodulares subcutáneas. Formación de un tumor puede observarse alrededor de 6-10 semanas después de la inyección (Figura 4B).
- Eutanasia a los ratones por dióxido de carbono método de asfixia seguido por dislocación cervical. Diseccionar los tumores desarrollados. Determinar el grado del tumor y el índice de diferenciación preosteoblasts y osteoblastos maduros por diversos métodos de tinción (por ejemplo hematoxilina y eosina (H & E) de tinción, tinción de Picro Sirius rojo y respectivamente la coloración de von Kossa).
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Representative Results
Este protocolo presenta los procedimientos incluyendo LFS generación de iPSC, MSC la diferenciación, diferenciación de osteoblastos y en vivo ensayo tumorigenesis con osteoblastos derivados de MSC de LFS.
Esquema para la generación de iPSCs LFS de fibroblastos mediante el uso de un virus de Sendai comercialmente disponible kit de reprogramación se muestra en la figura 1A. Entrega basada en el virus de Sendai de los Yamanaka cuatro factores es un método de reprogramación no integración. Por lo tanto, clones de iPSC LFS estables deben estar libres de genoma del virus Sendai y pérdida de exógeno OCT4, SOX2, KLF4 y los transgenes de c-MYC, que puede ser examinados por RT-PCR usando las cartillas específicas (figura 1B). Como se sugiere en las instrucciones del fabricante, generación de iPSCs libre de Sendai virus depende de condiciones de cultura y de paso. Bajo las condiciones de cultivo se describe en este protocolo, eliminación de virus Sendai en iPSCs generalmente puede detectarse después de 10 pasos (figura 1B). Los clones de iPSC LFS establecidos deben presentan la morfología típica de hESCs y mostrar la actividad positiva de AP (figura 1). LFS iPSCs altamente express pluripotencia factor mRNAs (NANOG, OCT4, SOX2, DPPA4y REX1), comparable a la línea de hESCs H1 y mucho más alto que los padres fibroblastos (figura 1). La expresión de factores de pluripotencia (NANOG, OCT4) y marcadores de hESCs (SSEA4 y TRA-1-81) también puede ser examinada por coloración inmunofluorescente (Figura 1E).
iPSCs se mantienen en MEFs para por lo menos 14 días antes de iniciar la diferenciación de MSC (figura 2A). Aunque mucho de la muerte celular ocurre durante la diferenciación de MSC, masas de células diferenciadas son visibles en la placa de cultivo celular y fibroblasto-como MSCs en el borde de las masas de células se observan en el día 28. (Figura 2B). Después de sub cultivo distinguido células MEF/MSC medio de cultivo, MSCs diferenciados proliferan rápidamente muestran morfología de fibroblasto-como alrededor de 35 días y poco a poco representan una forma alargada y forman un patrón de remolino en el día 40 (figura 2B ). MSCs LFS diferenciadas expresan marcadores MSC, incluyendo CD44, CD73, CD105 y CD166 por inmunofluorescencia, tinción (figura 2).
Figura 3A describe la diferenciación osteoblástica. Cuando MSCs se sujetan a las señales de diferenciación osteogénica, las células diferenciadas comienzan a mostrar actividad fosfatasa alcalina positivas en el día 9 (figura 3B). Tinción de ARS puede utilizarse para detectar la deposición mineral producida por los osteoblastos maduros. El color rojo brillante coloración en lugar de manchas de color marrón indica el resultado positivo de tinción de ARS, que puede ser observado después de 21 días (figura 3B). Los diferenciación de osteoblastos muestran expresión creciente nivel de los genes preosteoblast (ALPL y COL1A1) y osteoblastos maduros genes (BGLAP y PTH1R) durante la diferenciación osteogénica.
En vivo el modelo de xenoinjerto puede establecerse mediante la inyección subcutánea de osteoblastos derivados de LFS MSC en ratones NU/NU (Figura 4A). Los tumores se observan 6-10 semanas después de la inyección subcutánea (Figura 4B). Los tumores derivados de osteoblastos LFS demostraron características de osteoblastos inmaduros, actividad positiva AP (AP tinción), deposición de la matriz de colágeno positiva (tinción de Picrosirio rojo) pero negativo mineralización (von Kossa tinción) (figura 4) .
Figura 1 : generación de iPSC de fibroblastos pacientes del LFS. (A) diagrama esquemático de generación de iPSC. ()B) detección de RT-PCR del genoma del virus Sendai y los transgenes (KOS (KLF4, OCT4, y SOX2), KLF4, y c-MYC) en el clon de iPSC reprogramado después de 10 pasajes (izquierdas) y la infección posterior del fibroblasto día 11 (a la derecha, control positivo). LFS iPSC clone está libre de virus Sendai después de 10 pasajes. Se muestra GAPDH como control interno. (C) morfología de iPSCs LFS y AP la coloración de la célula. Barra de escala 50 μm (D) qRT-PCR de NANOG, SOX2, OCT4, DPPA4y la expresión del mRNA de REX1 en LFS iPSCs. línea de hESCs H1 y fibroblastos LFS parentales se utilizan como un positivo y un control negativo, respectivamente. La expresión del mRNA se normaliza a la expresión de la GAPDH . La expresión relativa de ARNm se ajusta a hESCs H1 línea 1. (E) Immunostaining de factores de transcripción células pluripotentes (NANOG y OCT4) y marcadores superficiales de hESCs (SSEA4 y TRA-1-81) en LFS iPSCs. Barra de escala 50 μm. La dilución de los anticuerpos utilizados en este estudio se muestran en la tabla 2. Las secuencias de la cartilla se muestran en la tabla 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Diferenciación de iPSCs LFS para MSCs. (A) esquema de la diferenciación de PDGF-AB-inducido de la MSC. (B) morfología de LFS derivados de iPSC MSCs en diferenciación día 28, día 36 y el día 40 + de la célula. Barra de escala, 100 μm. (C) inmunofluorescencia tinción demuestra que MSCs LFS diferenciados exhiben CD44+, CD73+, CD105+, CD166+y CD24 firma– . Barra de escala, 30 μm. La dilución de los anticuerpos utilizados en este estudio se muestran en la tabla 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : La diferenciación de MSCs de LFS a osteoblastos. (A) esquema de diferenciación osteogénica. AP (B) y ARS coloración se realizan en diferentes puntos temporales (día 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 y 24). Se espera que la diferenciación osteoblástica de osteoblastos derivados de LFS MSC conducen a AP positiva tinción alrededor de 9 días y ARS positiva tinción en el día 21. (C) la qRT-PCR análisis demuestra el aumento de la expresión de los osteoblastos (ALPL y COL1A1) y osteoblastos maduros (PTH1R y BGLAP) de genes durante la diferenciación osteogénica. La expresión del mRNA se normaliza a la expresión de la GAPDH . Niveles de expresión fueron en relación con las células en diferenciación día 0. Las secuencias de la cartilla se muestran en la tabla 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : En vivo tumorigenesis de osteoblastos derivados de LFS MSC. (A) diagrama esquemático del xenoinjerto tumoral de los osteoblastos LFS. (B) ratones NU/NU tener tumores derivan de osteoblastos LFS después de 10 semanas de la inyección subcutánea. (C) LFS derivadas de osteoblastos tumores fueron examinados por H & E, AP, rojo Picrosirio y von Kossa tinción para morfología, hueso habían asociada AP, colágeno y depósitos de mineral, respectivamente. Los tumores derivados de LFS representan características de osteoblastos inmaduros mostrando actividad positiva AP, colágeno positiva y negativa mineral mineralización. Barra de escala, 1 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Medio del fibroblasto (500 mL) | |
| DMEM | 440 mL |
| SFB inactivado con calor | 50 mL |
| Antibiotics(Pen/Strep) (x 100) | 5 mL |
| Aminoácido no esencial (100 x) | 5 mL |
| 2-Mercaptoetanol | 3.5 ΜL |
| Medio de cultivo MEF/MSC (500 mL) | |
| DMEM | 440 mL |
| SFB inactivado con calor | 50 mL |
| Antibiotics(Pen/Strep) (x 100) | 5 mL |
| L-glutamina (100 x) | 5 mL |
| hESC mediano (500 mL) | |
| DMEM/F-12 | 384,5 mL |
| Reemplazo de suero de nocaut | 100 mL (total: 20%) |
| Aminoácido no esencial (100 x) | 5 mL |
| Antibióticos (Pen/Strep) (100 x) | 5 mL |
| L-glutamina (100 x) | 5 mL |
| bFGF (10 μg/mL) | 500 ΜL |
| 2-Mercaptoetanol | 3.5 ΜL |
| Medio de diferenciación de MSC (500 mL) | |
| Nocaut en DMEM/F-12 o DMEM/F-12 | 445 mL |
| Reemplazo de suero de nocaut | 50 mL |
| bFGF (10 μg/mL) | 500 μl (10 ng/mL) |
| PDGF-AB (25 μg/mL) | 200 μl (10 ng/mL) |
| Aminoácido no esencial (100 x) | 5 mL |
| 2-Mercaptoetanol | 3.5 ΜL |
| Medio de diferenciación de osteoblastos (ODM) (500 mL) | |
| ΑMEM | 395 mL |
| SFB inactivado con calor | 50 mL |
| Glicerofosfato-β de 10 mM | 50 mL (1,08 g en 50 mL αMEM) |
| Dexametasona 0.1 μm (sensible a la luz) | 10 μl de dexametasona de 5 mM |
| 200 μm ácido ascórbico (sensible a la luz) | 100 μl de ácido ascórbico de 1 mM |
| Antibióticos (Pen/Strep) (100 x) | 5 mL |
| Solución de revestimiento de Matrigel (50 mL) | |
| Matriz de la membrana del sótano | 2 mL |
| DMEM/F-12 (previamente frío 4 ° C) | 48 mL |
| Solución de la separación de osteoblastos (50 mL) | |
| 0.25% tripsina-EDTA | 25 mL |
| Colagenasa II solución (1 mg/mL) | 25 mL |
| Nota: Preparar derecho fresco de solución de la separación de osteoblastos antes de usar. Solución II de colagenasa se almacena a-20 ° C hasta por 6 meses. | |
Tabla 1: Composición de medio del fibroblasto, MEF/MSC medio de cultivo, medio de hESC, medio de diferenciación de MSC, ODM y osteoblastos desprendimiento solución.
| Nombre de anticuerpo | Dilución |
| NANOG | 1: 500 |
| OCT4 | 1:300 |
| SSEA-4 conjugado con PE | 1: 600 |
| TRI-1-81 | 1: 600 |
| Burro de anti-cabra IgG | 1: 500 |
| IgG de cabra anti-conejo | 1: 500 |
| CD105 | 1: 500 |
| CD44 | 1: 500 |
| CD73 | 1: 500 |
| CD166 | 1: 500 |
| CD24 | 1: 500 |
Tabla 2: Dilución del anticuerpo.
| Placa de cultivo | Densidad de siembra | Ensayo |
| Placa de 12 pozos | 0.67x104 células por pozo | Fosfatasa alcalina tinción (tinción de AP) |
| Rojo de alizarina S tinción (tinción en ARS) | ||
| Placa de 6 pozos | 2 x 104 células por pozo | Detección de RT-PCR |
| Marcadores preosteoblast: ALPL, COL1A1 | ||
| Marcadores de osteoblastos para degustar: PTH1R, BGLAP | ||
| 100 mm plato | 3 - 4.5x105 células por placa | Tumorigenesis en vivo |
Tabla 3: Siembra densidad de MSCs para la diferenciación osteoblástica.
| Virus Sendai cartillas | |
| Blanco | Sistemas de primer |
| SeV | Adelante: GGATCACTAGGTGATATCGAGC |
| Inversa: ACCAGACAAGAGTTTAAGAGATATGTATC | |
| KOS (KLF4/OCT4/SOX2) | Adelante: ATGCACCGCTACGACGTGAGCGC |
| Inversa: ACCTTGACAATCCTGATGTGG | |
| KLF4 | Adelante: TTCCTGCATGCCAGAGGAGCCC |
| Inversa: AATGTATCGAAGGTGCTCAA | |
| c-MYC | Adelante: TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG |
| Inversa: TCCACATACAGTCCTGGATGATGATG | |
| RT-PCR Primers | |
| Blanco | Sistemas de primer |
| NANOG | Adelante: TTTGTGGGCCTGAAGAAAACT |
| Inversa: AGGGCTGTCCTGAATAAGCAG | |
| SOX2 | Adelante: AGAAGAGGAGAGAGAAAGAAAGGGAGAGA |
| Inversa: GAGAGAGGCAAACTGGAATCAGGATCAAA | |
| OCT4 | Adelante: AACCTGGAGTTTGTGCCAGGGTTT |
| Inversa: TGAACTTCACCTTCCCTCCAACCA | |
| DPPA4 | Adelante: GACCTCCACAGAGAAGTCGAG |
| Inversa: TGCCTTTTTCTTAGGGCAGAG | |
| REX1 | Adelante: GCCTTATGTGATGGCTATGTGT |
| Inversa: ACCCCTTATGACGCATTCTATGT | |
| ALPL | Adelante: GGGACTGGTACTCAGACAACG |
| Inversa: GTAGGCGATGTCCTTACAGCC | |
| COL1A1 | Adelante: GTGCGATGACGTGATCTGTGA |
| Inversa: CGGTGGTTTCTTGGTCGGT | |
| PTH1R | Adelante: AGTGCGAAAAACGGCTCAAG |
| Inversa: GATGCCTTATCTTTCCTGGGC | |
| BGLAP | Adelante: GGCGCTACCTGTATCAATGG |
| Inversa: GGCGCTACCTGTATCAATGG |
Cuadro 4: Información de la cartilla.
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Discussion
Para lograr una mayor eficiencia de la diferenciación de MSC, varios aspectos son críticos. Uno es la condición de la cultura de iPSCs antes de iniciar la diferenciación de MSC. El protocolo presentado en el manuscrito se basa en estudios previos 9,17. iPSCs deben ser cultivadas en MEFs durante al menos 2 semanas. Mantenimiento de iPSCs en buenas condiciones en MEFs son críticas para las células a conectar en la placa de cubierta de gelatina para la diferenciación de MSC. Otro aspecto importante es la densidad de iPSCs en MEFs antes de diferenciación. 80 - 90% de confluencia de iPSCs es preferido para iniciar la diferenciación de MSC. El crecimiento excesivo de iPSCs afectará la supervivencia de la célula durante el proceso de diferenciación. El último punto de crítica es la densidad de siembra cuando se inicia la diferenciación de MSC. En nuestras manos, alta densidad celular promueve el apego de iPSC a la placa recubierta de gelatina. Un 100 mm plato iPSCs pueden ser sembradas en tres pocillos de la placa de 6 pozos. Iniciación de la diferenciación de MSC por directamente resuspender y galjanoplastia iPSCs en medio de la diferenciación de MSC produce gran estrés en iPSCs, por lo tanto de vez en cuando dando por resultado muerte severa de la célula después de la siembra. Alta densidad de iPSCs aumenta la tasa de éxito de la diferenciación de MSC.
A diferencia de la diferenciación de la MSC, es más sencillo el proceso de diferenciación osteoblástica. Para lograr resultados reproducibles de la diferenciación, garantiza los iniciación números MSC. Resultados de la diferenciación osteoblástica de la misma línea celular pueden variar de lote a lote, por lo tanto, establecer la diferenciación de diferentes líneas al mismo tiempo dará más resultados comparativos entre grupos. El aumento de números MSC de acortar el proceso de diferenciación indicado por AP y ARS coloración positiva en un momento anterior. También, asegúrese de que el cambio de medio ODM se maneja de una manera suave y poderoso sistema de succión de vacío no se recomienda en la última etapa de diferenciación (día 18 - 24) debido a la potencial separación de osteoblastos agregados durante el proceso de la cultura.
Los osteoblastos diferenciados usados para experimento de xenoinjerto en vivo son osteoblastos en el momento de diferenciación día 14. Los osteoblastos más adelante que el día 14 pueden agregar y ser difícil de disociar debido a las enormes acumulaciones de colágenos y otros materiales de matriz ósea producidas por los osteoblastos. Para evitar la dificultad de la disociación de osteoblastos, LFS MSCs pueden ser sembradas en 2 - 3-fold mayor densidad en el paso de la iniciación de la diferenciación osteoblástica para facilitar la diferenciación de osteoblastos. Osteoblastos derivados de LFS MSC pueden ser disociados y recogidos en el día 6-10 momento de diferenciación para la tumorigénesis en vivo ensayo en el día 6 - momento de diferenciación 7. El modelo LFS xenoinjerto tumoral muestra osteoblastos derivados de LFS MSC recapitulan en vivo la capacidad tumorigénica, que proporciona una plataforma alternativa para el estudio de osteosarcoma LFS-asociado.
En Resumen, un modelo de base de iPSC osteosarcoma LFS ofrece un valioso recurso para la investigación de osteosarcoma. Además de osteosarcoma, LFS pacientes sufren de otros tipos de cánceres como el sarcoma de tejidos blandos, cáncer de mama y tumor cerebral. Por lo tanto, modelos de la enfermedad basada en iPSC LFS pueden ser extendidos modelar otros LFS relacionadas con malignidades. Combinación de LFS iPSCs derivados del paciente y diseñado mutante p53 (mutp53) hESCs18, modelo de enfermedad LFS también tiene un gran valor en delinear la patogenesia de tumores malignos mutp53 asociados y el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a oncogénicos p5316.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
R. Z. es apoyado por UTHealth innovación para cáncer prevención formación programa recibió beca de investigación (prevención del cáncer y Research Institute of Texas grant RP160015). J.T. es apoyado por el programa de Ke Lin de la Universidad primera afiliada Hospital de Sun Yat-sen. D. F.L. es el erudito CPRIT en la investigación del cáncer y apoyo de NIH vía independencia Premio R00 CA181496 y CPRIT Premio RR160019.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic ware | |||
| 100 mm Dish | Corning | 430107 | |
| 60 mm Dish | Corning | 430166 | |
| 6-well Plate | Falcon | 353046 | |
| 12-well Plate | Falcon | 353043 | |
| 48-well Plate | Falcon | 353078 | |
| 1 mL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-2721 | |
| 200 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-0706 | |
| 10 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
| 5 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
| 10 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
| 25 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
| 50 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
| 15 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
| Culture materials and Reagents | |||
| CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Invitrogen | A16517 | Commercial Sendai virus reprogramming kit |
| Corning hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Basement membrane matrix |
| CF1 MEFs, irradiated | ThermoFisher | A34180 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV | |
| αMEM | Corning | 10-022-CV | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Commercial iPSC medium |
| KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
| FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | A3181502 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| L-Glutamine Solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Human FGF-basic (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Recombinant Human PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
| β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | A4902 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
| StemMACS Passaging Solution XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Commercial passaging solution |
| Accutatse Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution |
| Thiazovivin (ROCK Inhibitor) | Calbiochem | 420220 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Collagenase, Type II | ThermoFisher | 17101015 | |
| Human NANOG Antibody | R&D System | AF1997 | |
| OCT4 Antibody (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
| Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody | R&D System | FAB1435P | |
| Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen | DB Biosciences | 560123 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
| PE Mouse Anti-Human CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
| PE Mouse Anti-Human CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
| PE Mouse Anti-Human CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
| Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | |
| Chloroform | ThermoFisher | C298-500 | |
| 2-Propanol | ThermoFisher | A416-4 | |
| Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | ThermoFisher | BP28184 | |
| DNase I, RNase-free (1 U/µL) | ThermoFisher | EN0521 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891BUN | |
| iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
| Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free | Corning | 354262 | |
| 1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch | DB Biosciences | 309597 |
References
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