Summary
Her vil vi præsentere en robust metode til at omprogrammere primære embryonale fibroblaster til funktionel cardiomyocytes gennem overekspression af GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 og miR-133 (GHMT2m) sammen med hæmning af TGF-β signalering. Vores protokol genererer bankende cardiomyocytes så tidligt som 7 dage efter transduktion med op til 60% effektivitet.
Abstract
Trans-differentiering af en somatisk celletype til en anden har et enormt potentiale til at modellere og behandling af sygdomme hos mennesker. Tidligere undersøgelser har vist, at mus embryonale, dermal, og cardiac fibroblaster kan omprogrammeres til funktionel induceret-cardiomyocyte-lignende celler (iCMs) gennem overekspression af kardiogent transskriptionsfaktorer, herunder GATA4, Hand2, Mef2c, og Tbx5 både in vitro- og in vivo. Disse tidligere undersøgelser har dog vist relativt lav effektivitet. For at gendanne hjertefunktion efter skade, skal blive belyst mekanismer for kardiale omprogrammering for at øge effektiviteten og modning af iCMs.
Vi viste tidligere, at hæmning af pro-fibrotisk signalering dramatisk øger omprogrammering effektivitet. Her, detalje vi metoder til at opnå en omprogrammering effektivitet på op til 60%. Derudover beskriver vi flere metoder herunder flowcytometri, immunfluorescent imaging og calcium imaging til at kvantificere omprogrammering effektivitet og modning af omprogrammeret fibroblaster. Ved hjælp af protokollen detaljeret her, kan Mekanistiske undersøgelser gennemføres til at bestemme positive og negative regulatorer af cardiac omprogrammering. Disse undersøgelser kan identificere signaling veje, der kan målrettes for at fremme omprogrammering effektivitet og modning, som kan føre til nye celle terapier til behandling af menneskelige hjertesygdom.
Introduction
Iskæmisk hjertesygdom er en førende dødsårsag i USA1. Ca 800.000 amerikanere opleve en første eller tilbagevendende myokardieinfarkt (MI) pr. år1. Efter MI, død cardiomyocytes (CMs) og hjerte fibrose, deponeret af aktiverede hjerte fibroblaster, forringe hjertet funktion2,3. Progression af hjertesvigt efter MI er i vid udstrækning irreversibel på grund af den dårlige regenerationsevne voksen CMs4,5. Mens aktuelle kliniske behandlinger langsom sygdomsprogression og mindske risikoen for fremtidige kardiale hændelser6,7,8,9, reverse ingen behandlinger sygdomsprogression på grund af manglende evne til at regenerere CMs post infarkt10. Roman celle behandlingsformer er på vej til behandling af patienter efter MI. skuffende, kliniske forsøg leverer stamceller til hjertet efter MI hidtil har vist ufyldestgørende regenerativ potentielle11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.
Generation af menneske-afledte inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs) fra fibroblaster af overekspression af fire transkriptionsfaktorer, første gang demonstreret af Takahashi & Yamanaka, åbnede døren til nye gennembrud i celle terapi19. Disse celler kan differentiere til alle tre Kim lag19, og flere yderst effektive metoder til at generere store mængder af CMs har tidligere vist20,21. HiPSC-afledte CMs (hofter-CMs) tilbyder en kraftfuld platform for at studere cardiomyogenesis og kan have stor betydning for reparation af hjertet efter skade. Men hofter-CMs står translationel forhindringer på grund af bekymringer, teratom dannelse22, og deres umodne natur kan være pro-arrhythmogenic23. Omprogrammering fibroblaster i hiPSCs udløste interesse i direkte omprogrammering fibroblaster til andre celletyper. Ieda et al. demonstreret at overekspression af GATA4, Mef2c og Tbx5 (GMT) i fibroblaster medfører direkte omprogrammering til hjerte afstamning, omend på lav effektivitet24. Omprogrammering effektivitet er blevet forbedret med tilføjelse af Hand2 (GHMT)25. Siden disse tidlige studier, har mange publikationer vist, at ændre den omprogrammering faktor cocktail med yderligere transskription faktorer26,27,28,29, kromatin modifikatorer30,31, MicroRNA32,33, eller små molekyler34 fører til forbedret omprogrammering effektivitet og/eller modning af inducerede cardiomyocyte-lignende celler (iCMs ).
Her giver vi en detaljeret protokol for at generere iCMs fra mus embryonale fibroblaster (MEFs) med høj effektivitet. Vi tidligere viste at GHMT cocktail er væsentligt forbedret med tilføjelse af miR-1 og miR-133 (GHMT2m) og er yderligere forbedret, når pro-fibrotisk signalering veje herunder omdanne vækst faktor β (TGF-β) signalering eller Rho-associerede protein kinase (ROCK) signaling veje er hæmmet35. Bruger denne protokol, viser vi, at ca 60% af cellerne udtrykke hjerte Troponin T (cTnT), ca. 50% express α-actinin, og et stort antal slå celler kan observeres allerede i dag 11 efter transduktion af omprogrammering faktorer og behandling med TGF-β type I receptor hæmmer A-83-01. Desuden, disse iCMs express gap junction proteiner herunder connexin 43 og udstille spontan sammentrækning og calcium transienter. Dette markerede forbedring i omprogrammering effektivitet i forhold til tidligere undersøgelser viser potentiale til at regenerere CMs fra endogene cellepopulationer, der forbliver i hjertet efter infarkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter der kræver dyr blev godkendt af det institutionelle Animal Care og brug udvalg på UC Denver Anschutz Medical Campus.
1. isolering af MEFs
- Køb C57BL/6 gravide mus på E13. Skibet natten over.
- Aflive mor efter godkendte IACUC protokoller (ex: ~1.3 L/min CO2 indtil dyr vises død efterfulgt af cervikal dislokation)
- Spray moderen med 70% ethanol og åbne bughulen. Fjerne den uterine horn der indeholder embryoner og sted i en 10 cm parabol med steril PBS.
- Gøre et snit i embryo sac at frigive embryo. Overføre embryonet til at rense 10 cm parabol med steril PBS. Skyl grundigt.
- Skære kroppen under leveren og kassér hovedet og overkroppen. Fjern indre organer og kassér. Overføre de resterende væv til en ren 10 cm parabol med steril PBS og overføre pladen til en biosikkerhed niveau 1 eller 2 kabinet. Kombinere væv fra alle embryoner i en ren, tør 10 cm parabol og hakkekød i fine stykker.
- 6 mL 0,25% trypsin/1 mM EDTA tilsættes hakket embryoner. Hakkede flere gange med pipette til at bryde op væv. Inkuber i 40 min. ved 37 ˚C med 5% CO2.
- Resuspend celler i vækstmediet (tabel 1). Mængden af medier er justeret baseret på antallet af embryoner høstet. Generelt brug et forhold på ca 25 mL vækst medier pr. 1.2 embryoner.
- Plade 25 mL resuspenderet celler i en 15 cm parabol. Efter 24 h, Aspirér medierne og tilsættes 25 mL frisk vækstmedium til hver plade.
- Efter 72 h, 2 mL 0,25% trypsin/1 mM EDTA tilsættes til hver 15 cm parabol. Når celler løsnes fra kultur parabol, inaktivere trypsin med 15 mL vækstmediet og indsamle celler i 50 mL polystyren koniske rør. Der centrifugeres celler til 3 min. ved 160 x g ved stuetemperatur. Resuspenderes celle i vækstmediet og filter gennem en 70 µm pore celle si.
- Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer og fryse MEFs i 2 millioner celler delprøver i fryse medium (10% DMSO, 25% FBS i Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) / høje glukose) ved-80 ° C. Overfør celler til flydende kvælstof efter 24 h og butikken indtil klar til brug.
Bemærk: Global genekspression i MEFs blev profileret isoleret ved hjælp af denne protokol af RNA-sekventering (RNA-FF.) at sikre celle godkendelse. RNA-seq data fra INDKODE MEF celler blev hentet fra NIH gen Expression Omnibus (GEO) med tiltrædelse nummer GSE93454. RNA-seq genekspression data for MEFs bruges af os blev deponeret i NIH GEO med tiltrædelse nummer GSE71405. Disse to datasæt blev fusioneret efter fælles gen symboler. Udtrykket data blev derefter log omdannet og en scatterplot udtryk data til vores MEFs og INDKODE MEFs blev genereret og passer med en lineær regressionslinje (figur 1A). MEFs isoleres ved hjælp af denne protokol er molekylært ligner dem isoleret af andre laboratorier.
2. produktion af Retrovirus og transduktion af MEFs
Bemærk: Alle trinnene i dette afsnit skal der foretages i en biosikkerhed niveau 2 kabinet. Da denne protokol udnytter retroviral transduktion, sikre, at sikkerheden er truffet forholdsregler, herunder behandling af alt affald, der indeholder virale medier med 10% blegemiddel i mindst 20 min. henvises til figur 1B for en tidslinje for omprogrammering.
-
Produktion af Retrovirus bruger cellelinie Platinum E (PE)
- Vedligeholde kommercielt tilgængelige PE celler i PE medium (tabel 1) indeholdende blasticidin og puromycin udvalg markører til at sikre ytringsfriheden gag-pol og env gener for effektive retroviral partikel produktion36 . Passage celler på 1:4 eller 1:5 hver to dage. Sørge for at forhindre overbelægning af celler, da dette kan reducere retroviral produktionsudbytte.
- På dag -1, frø ca 5 x 106 celler pr. 10 cm parabol i vækstmediet (tabel 1) 16-20 h før Transfektion (Se tabel 2 for plating tætheder for andre standard celle kultur parabol størrelser). Forsigtigt rock retter frem og tilbage flere gange og omhyggeligt placere i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator selv plating fordeling (Se figur 1 c for optimal plating tæthed før Transfektion).
Bemærk: sørge for at pladen PE celler på mellemlang og frie valg markører før Transfektion at sikre medium indeholdende genererede retroviral partikler ikke dræber MEFs. - På dag 0, forberede DNA Transfektion. Tilføj 2 µg for hver omprogrammering faktor for 10 cm parabol Transfektion, — GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 og miR-133 (GHMT2m) — til en 1,5 mL tube.
Bemærk: Se tabel 2 at skalere størrelsen af DNA, der kræves for at transfect andre standard celle kultur parabol størrelser. - I en separat 1,5 mL tube, tilføje 360 µL nedsat serum medier. Derefter tilføje 36 µL Transfektion reagens direkte til nedsat serum medier. Forsigtigt svirp røret og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
Bemærk: For at undgå nedsat Transfektion effektivitet, omhyggeligt tilføje Transfektion reagens direkte til nedsat serum medier. - Tilføje nedsat serum medier/Transfektion reagens blanding til GHMT2m DNA cocktail. Forsigtigt svirp røret og inkuberes ved stuetemperatur i 15 min. Gør ikke vortex.
- Tilføje reaktionsmiljøet dråbevis til PE celler, forsigtigt swirl medier for 10-15 s, og sted i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
Bemærk: Ifølge producenten, PE celler generere en gennemsnitlig titer af 106 107 smitsomme enheder/ml. Denne protokol genererer ca 2 x 106 infektioner enheder/mL af 24 timer og 6 x 106 infektioner enheder/mL af 48 h i gennemsnit MOI af 4. Transfektion af normal god landbrugspraksis/DsRed kan også bruges som et surrogat for Transfektion/transduktion effektivitet hvis det ønskes; Transfektion effektivitet forventes at overstige 90% af 48 h (figur 1 c).
-
Transduktion af MEFs
- På dag 0, pels retter med kollagen og sted i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator i mindst 2 timer.
- Fjern MEFs fra flydende kvælstof og tø. Plade 0,2 x 106 celler pr. 60 mm parabol i vækstmediet. Forsigtigt rock plader at sikre selv plating distribution og placere i rugemaskinen (Se figur 1 c for optimal plating tæthed og tabel 2 for plating tætheder for andre standard celle kultur parabol størrelser).
Bemærk: Disse plating tætheder er blevet testet over flere partier af isolerede MEFs; medmindre MEFs display kompromitteret betydeligt levedygtighed, er justere celle såning tætheder ikke nødvendigt. - På dag 1, 24 h efter Transfektion, skal du bruge en 30 mL sprøjte til at indsamle retroviral medium genereret af PE celler. Passere medium gennem et 0,45 µm porestørrelse filter i en 50 mL konisk slange. Tilføje hexadimethrine bromid Transfektion reagens til en endelig koncentration på 6 µg/mL. Forsigtigt tilføje 10 mL frisk vækstmedium til PE celler af pipettering medier på væggen af kultur parabol til forhindre fortrængning af celler.
- Opsug medium fra MEFs og tilsættes 4 mL friskhøstede retroviral medium til hver tallerken. Tilbage MEFs til rugemaskine. Tilføje 10% blegemiddel til alle materialer i kontakt med den virale medium til at neutralisere retroviral partikler.
- På dag 2, 48 timer efter Transfektion, Gentag trin 2.2.2 og 2.2.3. PE celler kasseres efter samlingen 2nd af retroviral medium.
Bemærk: Tilføje 10% blegemiddel til kasserede PE celler i mindst 20 min. til at neutralisere uønskede retrovirus. - På dag 3, Aspirér medium fra MEFs og genopbygge med 4 mL iCM medium (tabel 1) indeholdende 0,5 µM A-83-01, en TGF-β type I receptor inhibitor. Genopbygge iCM medium der indeholder A-83-01 hver 2 dage.
Bemærk: Hvis du bruger normal god landbrugspraksis som et transduktion kontrol, udtrykket forventes at overstige 90% af dette tidspunkt (figur 1 c).
3. flowcytometri for kardiale markører
- Aspirat medium fra dag 9 omprogrammeres MEFs og vask (1 x) med 1 x PBS til at fjerne døde celler og debris.
- Tilføj 1 mL 0,25% Trypsin/EDTA i 5 min på 37 ˚C. Kontrollere celler ved hjælp af et lysmikroskop og ryst fadet; Hvis celler blive siddende, Inkuber 5 mere min på 37 ˚C indtil celler frigøre.
- Vaske cellerne i 1 x PBS indeholdende 5% FBS og filtreres gennem et 70 µm pore celle si.
- Der centrifugeres ved 160 x g i 3 min. ved stuetemperatur og aspirat væske fra toerstoffet.
Bemærk: For at øge celle udbyttet, lad ca 50 µL væske over celle pellet. - Vaske cellerne med 500 µL 1 x PBS indeholdende 1% BSA.
- Fix celler med 0,2 mL 1 millioner celler fiksering løsning i 20 min. på is.
- Der tilsættes 1 mL af 1 x iskold perm/wash buffer.
Bemærk: Producentens løsning er 10 x. - Centrifugeres celler ved 160 x g i 5 min. ved 4 ° C og Opsug supernatanten.
- Gentag trin 3.7 og 3.8 en ekstra gang. Efter vask 2nd fortsætte direkte til næste trin eller holde celler ved 4 ° C natten over.
- Blokere med 100 µL af 5% ged serum og æsel serum i 1 x perm/wash buffer i 30 min. ved stuetemperatur.
- Tilsæt 100 µL fortyndede primære antistof.
Bemærk: Til denne protokol, celler var mærket med musen Troponin T (1:200) og mus α-actinin (1:200) til at kvantificere procentdelen af celler positiv for centrale komponenter af den kardiale sarkomeret. Inkuber primære antistof i 1 time ved stuetemperatur. - Centrifugeres celler på 160 x g 5 m ved 4 ° C, Aspirér supernatanten og vaske 2 x med iskold perm/wash buffer.
- Tilsæt 100 µL fortyndede sekundær antistof.
Bemærk: Til denne protokol, celler var mærket med anti-mus 647 nm sekundær antistof (1:200). Inkuber sekundær antistof i 45 min ved stuetemperatur på en ende over ende tube rotator. Beskyt celler mod lys af indpakning rør i folie. - Centrifugeres celler ved 160 x g i 5 min. ved 4 ° C, Aspirér supernatanten og vaske 2 x med iskold perm/wash buffer.
- Der tilsættes 1 mL af 1% BSA i PBS og udføre FACS straks.
Bemærk: Generere en forward scatter vs side scatter plot til gate levedygtige celler først, når du udfører FACS. Alternativt, brug et kommercielt tilgængelige live/døde celle pletten forud for fastsættelse af celler til at identificere levende og døde celle populationer.
4. immunfarvning af omprogrammeret MEFs
- Aspirat medium fra dag 14 omprogrammeres MEFs og vask (1 x) med 1 mL 1 x iskold PBS.
Bemærk: For immunfarvning, omprogrammering blev udført i 12 godt plader til at minimere antistof løsning diskenheder. 24 godt plader kan også anvendes; blot halv alt efter diskenheder. - Opsug og løse celler med 500 µL 2% PARAFORMALDEHYD i 10 min ved stuetemperatur.
- Opsug og vaske cellerne 3 gange med 1 mL 1 x PBS (5 min pr. vask ved stuetemperatur).
- Permeabilize celler med 500 µL 0,2% permeabilization reagens i PBS for 15 min ved stuetemperatur.
- Opsug og blokere i 500 µL 10% hest serum i PBS i 30 min. ved stuetemperatur.
- Opsug og inkuberes med 500 µL af de fortyndede primære antistof i 1 time ved stuetemperatur.
Bemærk: Til denne protokol, celler blev mærket med musen Troponin T eller α-actinin (hver 1: 400) og co mærket med Connexin 43 (1: 400) eller Troponin jeg (1: 400). - Opsug primære antistof og vaskes tre gange med 1 mL 1 x PBS (5 min pr. vask ved stuetemperatur).
- Opsug og inkuberes med 500 µL fortyndede sekundær antistof i 1 time ved stuetemperatur.
Bemærk: Til denne protokol, celler var mærket med anti-mus 555 nm sekundær antistof (1:800) til at anerkende Troponin T eller α-actinin og anti-kanin 488 nm sekundær antistof (1:800) til at anerkende Connexin 43 eller Troponin I. Derudover, kerner var farves med Hoechst (1:10, 000). Beskytte celler fra lys ved at inkubere i mørke. - Opsug den sekundær antistof og vaskes tre gange med 1 mL 1 x PBS (5 min pr. vask ved stuetemperatur). Wrap pladen i folie for at beskytte celler mod lys og opbevares ved 4 ° C.
- Billedet ved hjælp af tre-kanal epifluorescensmikroskop mikroskopi.
5. calcium Imaging
Bemærk: Hvis imaging på 10 X forstørrelse, standard celle kultur retter og plader er velegnet til calcium billeddannelse. Billeddannelse på højere forstørrelse kræver, at celler være belagt på glas coverslips eller glas bund retter.
- Opsug medium og tilføje 2 mL (for en 6 godt plade) ændret Tyrodes løsning (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM glukose, 10 mM HEPES, 0,1% BSA, og 1% pyruvat, pH 7,4) indeholdende 5 µM Fura-2 AM og 0,1% Pluronic F-127 at slå (D14 t o D20) iCMs. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C.
Bemærk: Beskyt celler mod lys for at forhindre quenching af fluorescerende indikator. - Vaske cellerne i 2 mL Tyrode løsning i 30 min. ved stuetemperatur til at tillade de esterificering af Fura-2 AM.
- Billede med spinning disk Konfokal mikroskopi ved 340 nm og 380 nm med Slidebook 5.5 Ca2 + imaging software. Udføre billeddannelse ved stuetemperatur.
- Calcium transienter beregnes ved hjælp af forholdet mellem fluorescens intensitet ved 340 nm over fluorescens-intensiteten på 380 nm.
- Hvis det ønskes, behandle iCMs med 1 eller 2 µM isoprenalin eller 10 µM nifedipin at manipulere calcium håndtering efter imaging baseline calcium transienter. Tilføje forbindelser lokalt til celler og billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruger den omprogrammering strategi beskrevet ovenfor og i figur 1B, genereret vi iCMs med ca 70% af celler, der udtrykker hjerte Troponin T og ca. 55% af celler, der udtrykker hjerte α-actinin, kvantificeres ved flowcytometri på dag 9 efter transduktion af GHMT2m (figur 2A og B). Derudover fleste celler express hjerte Troponin T, Troponin, og cardiac α-actinin samt gap junction markør Connexin 43 på dag 14 efter transduktion (figur 2 c og D). Billedbehandling med højere forstørrelse afslører veldefinerede sarkomeret struktur dannelse og gap knudepunkter danner mellem tilstødende celler (hvide pilespidser, figur 2D). Derudover angiver spontan sammentrækning og calcium transienter funktionalitet af iCMs (figur 3A-C og film 1).
Figur 1: tidslinje for omprogrammering og Optimal Plating af celler. (A) Scatterplot af log-transformeret RNA-seq data for MEFs genereret i vores lab versus INDKODE MEFs. R2 værdi og lineær regressionslinje er vist. (B) skematisk af alle vigtige trin i en GHMT2m-medieret omprogrammering af MEFs. (C) PE celler på 70-80% confluence før Transfektion (øverste række, venstre panel) og normal god landbrugspraksis signal 48 timer efter Transfektion at angive Transfektion effektivitet (øverste række, midterste og højre paneler). MEFs seedet sparsomt før infektion at forhindre overbelægning i perioden af omprogrammering (nederste række, venstre panel) og normal god landbrugspraksis signal 48 timer efter infektionen til at angive infektion effektivitet (nederste række, midterste og højre paneler). Skalalinjen = 400 µM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: kvantificering og karakterisering af Cardiac Protein udtryk i iCMs. (A og B). Repræsentative flowcytometri for kardiale Troponin T (A) og α-actinin (B) på dag 9 efter GHMT2m transduktion, n = 3. (C) ICC farvning for kardiale markører på dag 14 efter GHMT2m transduktion. Grøn: hjertets Troponin I, Red: hjertets Troponin T (midterste panel) og α-actinin (højre panel) og blå: Hoechst farvning for kerner. Repræsentative billeder (n = 3). Skalalinjen = 200 µM (D) høj forstørrelse forestiller af sarkomeret struktur (Red: hjertets α-actinin (øverste række) og hjerte Troponin T (nederste række)) og udtryk for gap junction protein Connexin 43 (grøn). Hvid pilespidser angive gap vejkryds dannet mellem naboceller. Repræsentative billeder (n = 3). Skalalinjen = 100 µM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: funktionel kvantificering af iCMs. (A) tidsforløb for at slå celle tæller efter GHMT2m transduktion. Slå celler blev talt af øjet og celle tæller fra 10 felter pr. fad over 3 retter pr. eksperiment var i gennemsnit og inkluderet i panelet A. (B og C) registreret calcium transienter for iCMs. Calcium forbigående frekvens ændres i iCMs efter behandling med 1 µM isoprenalin eller 10 µM nifedipin. F340/F380, forholdet mellem fluorescens intensitet på 340 og 380 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1: slå iCMs. Filmen viser slå iCMs på dag 12 in vitro. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
| iCM medier | ||
| Navn af reagens | Volumen (mL) | Endelig koncentration |
| DMEM høje glukose | 320 | |
| Medium 199 | 80 | |
| Føtal bovint Serum | 50 | 10% |
| Donor hest Serum | 25 | 5% |
| MEM essentielle aminosyrer, 50 x | 10 | 1 x |
| Natrium pyruvat løsning, 100 x | 5 | 1 x |
| MEM ikke-essentielle aminosyrer, 100 x | 5 | 1 x |
| MEM Vitamin løsning, 100 x | 5 | 1 x |
| Insulin-Transferrin-selen, 100 x | 5 | 1 x |
| B27, 50 x | 10 | 1 x |
| Penicilin-Streptomycin | 5.5 | 1,1% |
| L-Glutamin supplement | 5.5 | 1,1% |
| PE-startmedie | ||
| Navn af reagens | Volumen (mL) | Endelig koncentration |
| DMEM høje glukose | 450 | |
| Føtal bovint Serum | 50 | 10% |
| Penicilin-Streptomycin | 5.5 | 1,1% |
| L-Glutamin supplement | 5.5 | 1,1% |
| Blasticidin-HCl - 10mg/mL | 0,5 | 10 µg/mL |
| Puromycin dihydrochlorid | 0,05 | 1 µg/mL |
| Vækst medier | ||
| Navnet på reagens / udstyr | Volumen (mL) | Endelig koncentration |
| DMEM høje glukose | 450 | |
| Føtal bovint Serum | 50 | 10% |
| Penicilin-Streptomycin | 5.5 | 1,1% |
| L-Glutamin supplement | 5.5 | 1,1% |
Tabel 1: Dyrkningsmedier. Opskrifter til dyrkningsmediet anvendes i denne protokol.
| PE celler | ||||||
| Celle kultur parabol | Areal (cm2) | Såning tæthed (celler) | Media volumen (mL) | Samlede DNA pr. Transfektion (µg) | Transfektion reagens (µL) | Opti-MEM (µL) |
| 15 cm | 176.7 | 11.25 x 106 | 20 | 36 | 108 | 1080 |
| 10 cm | 78.5 | 5 x 106 | 10 | 12 | 36 | 360 |
| 60 mm | 28.2 | 1.7 x 106 | 4 | 4 | 12 | 120 |
| 6 godt plade | 9 | 0,54 x 106 | 2 | 1.3 | 3.9 | 39 |
| 12 godt plade | 4 | 0,24 x 106 | 1 | 0,6 | 1.8 | 18 |
| 24 godt plade | 2 | 0,12 x 106 | 0,5 | 0,3 | 0,9 | 9 |
| MEFs | ||||||
| Celle kultur parabol | Areal (cm2) | Såning tæthed (celler) | Media volumen (mL) | Hexadimethrine bromid (µL) | ||
| 15 cm | 176.7 | 1,35 x 106 | 20 | 12 | ||
| 10 cm | 78.5 | 0,6 x 106 | 10 | 6 | ||
| 60 mm | 28.2 | 0,2 x 106 | 4 | 2.4 | ||
| 6 godt plade | 9 | 0,1 x 106 | 2 | 1.2 | ||
| 12 godt plade | 4 | 0,4 x 105 | 1 | 0,6 | ||
| 24 godt plade | 2 | 0,2 x 105 | 0,5 | 0,3 | ||
Tabel 2: såning tætheder for omprogrammering. Tabel over såning tætheder for PE celler og MEFs for fælles celleformater kultur parabol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nuværende undersøgelse skitserer en højeffektiv strategi til direkte at omprogrammere fibroblaster til funktionel iCMs via levering af GHMT2m omprogrammering faktorer kombineret med undertrykkelse af pro-fibrotisk signaling veje. Ved hjælp af flowcytometri, immunfluorescent imaging, calcium imaging, og slå celletal, viser vi fleste celler i denne protokol gennemgå vellykket omprogrammering og vedtage CM lineage skæbne. Vi har tidligere vist, at tilsætning af anti-fibrotisk phenolforbindelser, herunder typen TGF-β jeg receptor hæmmer A-83-01 udbytter en ca 6-fold stigning i antallet af slå iCMs sammenlignet med transduktion med GHMT2m alene, der angiver, at Pro-fibrotisk signalering er en stærk endogene barriere for kardiale omprogrammering. Dette system kan derfor udnyttes til stof screening for at undersøge mekanismerne for cardiomyogenesis; tilføjelse af en lille molekyle sammen med A-83-01 kunne afdække negative regulatorer af cardiomyogenesis. Omvendt, tilføjelsen af et lille molekyle til GHMT2m alene kunne belyse positive regulatorer af cardiomyogenesis. Optrævling de mekanismer, hvorigennem disse positive og negative tilsynsmyndigheder styrer CM differentiering vil resultere i en bedre forståelse af cardiomyogenesis og føre til endnu mere effektive omprogrammering og modning protokoller.
Mange variabler påvirker omprogrammering effektivitet. Vi finder, at celle plating tæthed høj grad påvirker både produktion retroviral Partikelstørrelsesfordelingen PE celler og effektive optagelse af alle omprogrammering faktorer i forbindelse med MEFs. Derudover kan passage antallet påvirke disse parametre. For at sikre en optimal produktion af virale partikler, transfect PE celler før passage 20. For at sikre effektiv udbredelse af retroviral partikler, ikke passage MEFs efter frysning.
Flere nyere undersøgelser har også vist højeffektiv omprogrammering af MEFs ved at banke ned PRC1 medlem Bmi sammen med udtryk for GMT30 eller overekspression Akt ud over GHMT37. Tilsætning af ZFN281 til GHMT + Akt førte til en 4-fold stigning i troponin T positive celler i voksen Hale spids fibroblaster, delvis tilskrives undertrykkelse af inflammatoriske gen signaturer38. Derudover øget kombination af TGF-β signaling inhibitor og WNT signalering hæmmer GMT-medieret hjerte omprogrammering39. Vigtigere, synes signaling veje involveret i disse undersøgelser ikke at overlappe hinanden. Derfor er det sandsynligt at cross-talk mellem flere signaling veje kunne yderligere forbedre hjerte omprogrammering.
En række undersøgelser påvist omprogrammering i vivo gennem levering af omprogrammering faktorer i mus efter venstre forreste faldende (Lund) arterie ligatur25,32,39,40 ,41. Disse undersøgelser viste beskeden forbedring i ventrikel funktion efter MI, hvilket understreger det terapeutiske potentiale i hjerte omprogrammering på hjertet regeneration efter skade. Vores protokol omprogrammerer MEFs med den højeste effektivitet i vitro til dato. Det vil derfor være interessant at se, om omprogrammering af høj effektivitet er i stand til fuldt ud at genoprette hjertet funktion efter skade in vivo. Disse undersøgelser kunne tjene som grundlag for omsætte denne metode til romanen celle terapier for patienternes efter infarkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af midler fra instituttets Boettcher Webb-Waring Biomedical Research Program, American Heart Association videnskabsmand udvikling Grant (13SDG17400031), University of Colorado Institut for medicin udestående tidlige karriere Scholar Program, University of Colorado Division af kardiologi Barlow Stigs begavelse og NIH R01HL133230 (til KS). A.S.R blev støttet af NIH/NCATS Colorado CTSA Grant nummer TL1TR001081 og et præ ph.d.-stipendium fra University of Colorado konsortium for fibrose forskning & oversættelse (CFReT). Denne forskning blev også støttet af kræft Center støtte Grant (P30CA046934), hud sygdomme forskning kerner Grant (P30AR057212) og Flow flowcytometri Core på University of Colorado Anschutz Medical Campus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 Mice | Charles River's Laboratory | 027 | For MEF isolation |
| Platinum E (PE) Cells | Cell Biolabs, INC | RV-101 | For retrovirus production |
| DMEM High Glucose | Gibco | SH30022.FS | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150-059 | Component of iCM media |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100106 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Donor Horse Serum | Gemini | 100508 500 | Component of iCM media |
| MEM Essential Amino Acids, 50X | Life Technologies | 11130051 | Component of iCM media |
| Sodium Pyruvate Solution, 100X | Life Technologies | 11360070 | Component of iCM media and for calcium imaging |
| MEM Non-Essential Amino Acids, 100X | Life Technologies | 11140050 | Component of iCM media |
| MEM Vitamin Solution, 100X | Life Technologies | 11120-052 | Component of iCM media |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 41400045 | Component of iCM media |
| B27 | Gibco | 17504-044 | Component of iCM media |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| GlutaMAX (L-Glutamine Supplement) | Gibco | 35050-061 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Blasticidin-HCl | Life Technologies | A11139-03 | Component of PE media |
| Puromycin dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Component of PE media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | For detaching cells from culture dishes |
| A-83-01 | R&D Systems - Tocris | 2939/10 | Treat cells to inhibit TGF-β signaling - promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM |
| DMSO | Thermo Scientific | 85190 | For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium |
| SureCoat | Cellutron | SC-9035 | For coating dishes to plate MEFs |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection Reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 11058-021 | Transfection Reagent |
| pBabe-X Myc-GATA4 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Hand2 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Mef2c | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Tbx5 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-1 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-133 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X GFP | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268-5G | For viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL |
| Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores) | Nalgene | 569-0020 | For filtering media |
| Syringes | Bd Vacutainer Labware | 309654 | For viral filtration |
| 0.45 µm Filters | Celltreat | 229749 | For viral filtration |
| 70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | For MEF isolation and Flow Cytometry |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry |
| perm/wash buffer | BD | 554723 | For washing cells for flow cytometry |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-250 | For washing cells |
| Bovine Serum Albumin | VWR | 0332-100g | For flow cytometry and calcium imaging |
| Goat Serum | Sigma | G9023 | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Donkey Serum | Sigma | D9663-10mg | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Mouse Troponin T | Thermo Scientific | ms-295-p | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Mouse α-actinin | Sigma | A7811L | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Rabbit Connexin 43 | Sigma | C6219 | 1:400 IF |
| Rabbit Troponin I | PhosphoSolutions | 2010-TNI | 1:400 IF |
| Hoechst | Life Technologies | 62249 | 1:10000 IF |
| Alexa 488, rabbit | Life Technologies | A-11034 | 1:800 IF |
| Alexa 555, mouse | Life Technologies | A-21422 | 1:800 IF |
| Alexa 647, mouse | Life Technologies | A-31571 | 1:200 Flow Cytometry |
| 27-color ZE5 Flow Cytometer | Bio-RAD | For FACS | |
| Paraformaldehyde | sigma | P6148-500mg | For fixing cells for IF |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | For permeabilization of cells for IF |
| EVOS™ FL Color Imaging System | Thermo Scientific | AMEFC4300 | For IF |
| NaCl | RPI | S23020-5000 | For calcium imaging |
| KCl | VWR | 395 | For calcium imaging |
| CaCl2 | Fisher | C614-500 | For calcium imaging |
| MgCl2 | VWR | 97061-352 | For calcium imaging |
| glucose | sigma | G7528-250g | For calcium imaging |
| HEPES | sigma | H4034-500g | For calcium imaging |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F1221 | For calcium imaging |
| Fluronic F-127 | Sigma | P2443-250g | For calcium imaging |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | For disruption calcium transients in iCMs - use at 10 µM |
| Isoproterenol | sigma | I6504-1g | For increasing number of calcium transients in iCMs - use at 1-2 µM |
| Marianas Spinning Disk Confocal microscope | 3i | For calcium imaging | |
| ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| bleach | Clorox | ||
| 50 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 227261 | |
| 15 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 188271 | |
| 15 cm cell culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 10 cm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 60 mm cell culture dishes | GREINER BIO-ONE | 628160 | |
| 6 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| 12 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 665180 | |
| 24 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 662160 |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
- Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D. Cardiac muscle regeneration: lessons from development. Genes & Development. 25 (4), 299-309 (2011).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Nabel, E. G., Braunwald, E. A tale of coronary artery disease and myocardial infarction. N Engl J Med. 366 (1), 54-63 (2012).
- Packer, M., et al. Effect of carvedilol on the morbidity of patients with severe chronic heart failure: results of the carvedilol prospective randomized cumulative survival (COPERNICUS) study. Circulation. 106 (17), 2194-2199 (2002).
- The CAPRICORN Investigators. Effect of carvedilol on outcome after myocardial infarction in patients with left-ventricular dysfunction: the CAPRICORN randomized trial. The Lancet. 357 (9266), 1385-1390 (2001).
- Marangou, J., Paul, V. Current attitudes on cardiac devices in heart failure: a review. Clin Ther. 37 (10), 2206-2214 (2015).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Bio. 14 (8), 529-541 (2013).
- Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomized controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
- Schachinger, V., et al. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1210-1221 (2006).
- Huikuri, H. V., et al. Effects of intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells on left ventricular function, arrhythmia risk profile, and restenosis after thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. Eur. Heart J. 29 (22), 2723-2732 (2008).
- Janssens, S., et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 367 (9505), 113-121 (2006).
- Lunde, K., et al. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1199-1209 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial - a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart J. 152 (3), 434-441 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
- Karantalis, V., et al. Autologous mesenchymal stem cells produce concordant improvements in regional function, tissue perfusion, and fibrotic burden when administered to patients undergoing coronary artery bypass grafting: The Prospective Randomized Study of Mesenchymal Stem Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (PROMETHEUS) trial. Circ Res. 114 (8), 1302-1310 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: A source of cardiac regeneration. J. Mol. Cell. Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
- Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 357-386 (2010).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
- Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100 (1), 105-113 (2013).
- Qian, L., Berry, E. C., Fu, J., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
- Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
- Ifkovitz, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. Inhibition of TGFβ signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes. PLoS One. 9 (2), e89678 (2014).
- Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
- Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8 (5), e63577 (2013).
- Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA induced cardiac reprogramming in vivo: evidence for mature cardiac myocytes and improved cardiac function. Circ Res. 116 (3), 418-424 (2015).
- Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110 (11), 1465-1473 (2012).
- Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), 1216-1220 (2016).
- Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nature Communications. 6, 1-15 (2015).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7, 1063-1066 (2000).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Zhou, H., et al. ZFN281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression. Genes & Dev. 31, 1770-1783 (2017).
- Mohamed, T. M., et al. Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming. Circulation. 135, 978-995 (2017).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
- Mathison, M., et al. In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration. J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).
