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Developmental Biology

समर्थक-fibrotic संकेतन Potentiates फैक्टर के दमन-प्रेरित Cardiomyocytes में माउस भ्रूण Fibroblasts की मध्यस्थता reprogramming

Published: June 3, 2018 doi: 10.3791/57687
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Population Health Sciences, Medical College of Georgia, Augusta University

Summary

यहां हम GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, मीर-1, और मीर-१३३ (GHMT2m) TGF के अवरोध के साथ-β संकेतन के माध्यम से कार्यात्मक cardiomyocytes में प्राथमिक भ्रूण fibroblasts reprogram करने के लिए एक मजबूत विधि वर्तमान । हमारे प्रोटोकॉल के रूप में 7 दिनों के बाद ६०% दक्षता के साथ transduction के रूप में जल्दी cardiomyocytes धड़कन उत्पंन करता है ।

Abstract

ट्रांस एक दूसरे में शारीरिक कोशिका प्रकार के भेदभाव मॉडल और मानव रोगों के इलाज के लिए भारी क्षमता है । पिछले अध्ययनों से पता चला है कि माउस भ्रूण, चमड़े का, और कार्डियक fibroblasts कार्यात्मक प्रेरित-cardiomyocyte की तरह कोशिकाओं (iCMs) फुलाव प्रतिलेखन कारकों में से GATA4, Hand2, Mef2c सहित के माध्यम से पुनर्निर्मित किया जा सकता है, और Tbx5 दोनों इन विट्रो में और vivo में। हालांकि, इन पिछले अध्ययनों अपेक्षाकृत कम दक्षता दिखाया गया है । आदेश में चोट के बाद दिल समारोह को बहाल करने के लिए, हृदय reprogramming शासी तंत्र दक्षता और iCMs की परिपक्वता को बढ़ाने के लिए आविर्भाव किया जाना चाहिए ।

हम पहले से प्रदर्शन किया है कि प्रो के निषेध-fibrotic नाटकीय रूप से reprogramming दक्षता बढ़ संकेतन । यहां, हम विस्तार तरीकों को ६०% तक की एक reprogramming दक्षता प्राप्त करने के लिए । इसके अलावा, हम प्रवाह cytometry, immunofluorescent इमेजिंग, और कैल्शियम इमेजिंग सहित कई तरीकों का वर्णन reprogramming दक्षता और fibroblasts की परिपक्वता को बढ़ाता है । यहां विस्तृत प्रोटोकॉल का प्रयोग, यंत्रवत अध्ययन के लिए हृदय reprogramming के सकारात्मक और नकारात्मक नियामकों निर्धारित किया जा सकता है । इन अध्ययनों से संकेतन रास्ते कि reprogramming दक्षता और परिपक्वता, जो उपंयास कोशिका उपचार के लिए मानव हृदय रोग के इलाज के लिए ले जा सकता को बढ़ावा देने के लिए लक्षित किया जा सकता है की पहचान कर सकते हैं ।

Introduction

कोरोनरी हृदय रोग संयुक्त राज्य अमेरिका में मौत का एक प्रमुख कारण है1. लगभग ८००,००० अमेरिकियों एक पहले या आवर्तक रोधगलन (MI) प्रति वर्ष1अनुभव । एमआई के बाद, cardiomyocytes (सीएमएस) और हृदय फाइब्रोसिस, सक्रिय कार्डियक fibroblasts द्वारा जमा की मौत, दिल समारोह2,3ख़राब । दिल की विफलता के बाद आई एम सी की प्रगति मोटे तौर पर वयस्क सीएमएस4,5के गरीब पुनर्उत्पादक क्षमता के कारण अपरिवर्तनीय है । जबकि वर्तमान नैदानिक चिकित्सा धीमी रोग प्रगति और भविष्य के हृदय की घटनाओं की कमी जोखिम6,7,8,9, कोई उपचार रिवर्स रोग प्रगति करने के लिए असमर्थता के कारण 10सेमी पोस्ट-रोधगलन पुनर्जीवित । उपंयास सेल चिकित्सा एमआई के बाद रोगियों का इलाज करने के लिए उभर रहे हैं । निराशाजनक, नैदानिक परीक्षण दिल के लिए स्टेम सेल वितरित इस प्रकार अब तक अनिर्णायक पुनर्जन्म संभावित11,12दिखाया गया है, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.

मानव की पीढ़ी से प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) fibroblasts से चार प्रतिलेखन कारकों के व्यक्त द्वारा, पहले ताकाहाशी और यामानाका द्वारा प्रदर्शन किया, सेल थेरेपी में नई सफलताओं के लिए दरवाजा खोला19। इन कोशिकाओं को सभी तीन रोगाणु परतें19में अंतर कर सकते हैं, और सीएमएस की बड़ी संख्या में पैदा करने के लिए कई अत्यधिक कुशल तरीके पहले20,21दिखाया गया है । HiPSC-व्युत्पन्न सीएमएस (कूल्हों-सीएमएस) cardiomyogenesis अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मंच प्रदान करता है और चोट के बाद दिल की मरंमत के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हो सकता है । हालांकि, कूल्हों-सीएमएस वर्तमान में teratoma गठन22की चिंताओं के कारण अनुवाद बाधाओं का सामना करना पड़ता है, और उनके अपरिपक्व प्रकृति समर्थक arrhythmogenic23हो सकता है । hiPSCs में reprogramming fibroblasts सीधे reprogramming अंय प्रकार के कक्ष में fibroblasts में रुचि छिड़ । Ieda एट अल. का प्रदर्शन किया है कि GATA4, Mef2c, और Tbx5 (जीएमटी) के fibroblasts परिणामों में हृदय वंश को सीधे reprogramming में, हालांकि कम दक्षता24पर व्यक्त । reprogramming दक्षता Hand2 के अलावा के साथ सुधार किया गया था (GHMT)25। इन प्रारंभिक अध्ययन के बाद से, कई प्रकाशनों का प्रदर्शन किया है कि अतिरिक्त प्रतिलेखन कारकों के साथ reprogramming फैक्टर कॉकटेल में फेरबदल26,27,28,29, क्रोमेटिन संशोधक30,31, microRNAs३२,३३, या छोटे अणुओं३४ को बेहतर reprogramming दक्षता और/या प्रेरित cardiomyocyte की तरह कोशिकाओं की परिपक्वता की ओर जाता है (iCMs ).

यहाँ हम उच्च दक्षता के साथ माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs) से iCMs उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । हम पहले से पता चला है कि GHMT कॉकटेल मीर के अलावा के साथ काफी सुधार हुआ है-1 और मीर-१३३ (GHMT2m) और आगे सुधार हुआ है जब प्रो-fibrotic संकेतन वृद्धि कारक β (TGF-β) संकेतन या Rho-जुड़े सहित रास्ते प्रोटीन कळेनासे (रॉक) संकेत रास्ते३५हिचक रहे हैं । इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, हम बताते है कि लगभग ६०% कोशिकाओं के हृदय ट्रोपोनिन टी (cTnT) एक्सप्रेस, लगभग ५०% एक्सप्रेस α-actinin, और धड़कन कोशिकाओं की एक उच्च संख्या के रूप में जल्दी मनाया जा सकता है 11 दिन के रूप में reprogramming कारकों और उपचार के transduction निंनलिखित TGF-β प्रकार I रिसेप्टर अवरोधक एक-83-01 के साथ. इसके अलावा, इन iCMs एक्सप्रेस connexin ४३ और प्रदर्शन सहज संकुचन और कैल्शियम यात्रियों सहित अंतर जंक्शन प्रोटीन । यह पहले के अध्ययनों की तुलना में दक्षता reprogramming में सुधार के रूप में चिह्नित अंतर्जात कोशिका आबादी है कि दिल के बाद रोधगलन में रहने से सीएमएस पुनर्जंम की क्षमता को दर्शाता है ।

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Protocol

पशुओं की आवश्यकता वाले सभी प्रयोगों को यूसी डेनवर Anschutz मेडिकल कैंपस में संस्थागत पशु देखभाल एवं उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. MEFs का अलगाव

  1. E13 पर 6 गर्भवती चूहों खरीद C57BL/ रात भर जहाज ।
  2. अनुमोदित IACUC प्रोटोकॉल के अनुसार मां को Euthanize (उदा: ~ १.३ L/2 जब तक पशु गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन के बाद मरा हुआ दिखाई देता है)
  3. ७०% इथेनॉल और खुले उदर गुहा के साथ मां स्प्रे । गर्भाशय भ्रूण और बाँझ पंजाबियों के साथ एक 10 सेमी डिश में जगह से युक्त सींग निकालें ।
  4. भ्रूण थैली में एक चीरा बनाओ भ्रूण जारी करने के लिए । स्थानांतरण भ्रूण साफ करने के लिए बाँझ पंजाबियों के साथ 10 सेमी डिश । अच्छी तरह कुल्ला ।
  5. लिवर के नीचे का शरीर काटें और सिर व ऊपरी शरीर को त्यागें । आंतरिक अंगों को हटा दें और छोड़ें । शेष ऊतक बाँझ पंजाबियों के साथ एक साफ 10 सेमी डिश के लिए स्थानांतरण और एक सुरक्षा स्तर 1 या 2 कैबिनेट के लिए प्लेट हस्तांतरण । एक साफ, सूखी 10 सेमी पकवान और ठीक टुकड़ों में कीमा में सभी भ्रूण से ऊतकों का मिश्रण ।
  6. ०.२५% trypsin/1 मिमी के 6 मिलीलीटर जोड़ें EDTA भ्रूण भरती करने के लिए । ऊतक को तोड़ने के लिए पिपेट द्वारा कई बार Triturate । 5% CO2के साथ ३७ ˚ C पर ४० मिनट के लिए मशीन ।
  7. वृद्धि मध्यम (तालिका 1) में कक्षों को पुनर्निलंबित करना । मीडिया की मात्रा काटा भ्रूण की संख्या के आधार पर समायोजित किया जाता है । सामांय में, १.२ भ्रूण प्रति लगभग 25 मिलीलीटर विकास मीडिया के अनुपात का उपयोग करें ।
  8. एक 15 सेमी डिश में reसस्पैंड कोशिकाओं की थाली 25 मिलीलीटर । 24 घंटे के बाद, मीडिया महाप्राण और प्रत्येक थाली के लिए ताजा विकास के माध्यम से 25 मिलीलीटर जोड़ें ।
  9. ७२ एच के बाद, प्रत्येक 15 सेमी डिश के लिए ०.२५% trypsin/ जब कोशिकाओं संस्कृति पकवान से अलग, 15 मिलीलीटर विकास माध्यम के साथ trypsin निष्क्रिय और ५० मिलीलीटर polystyrene शंकु ट्यूबों में कोशिकाओं को इकट्ठा । कमरे के तापमान पर १६० x g पर 3 मिनट के लिए कोशिकाओं को केंद्रापसारक । एक ७० µm ताकना सेल छलनी के माध्यम से विकास मध्यम और फिल्टर में सेल गोली reसस्पेंड ।
  10. एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना और फ्रीज मध्यम में aliquots २,०००,००० कोशिकाओं में MEFs फ्रीज (10% DMSO, FBS के संशोधित ईगल मध्यम (Dulbecco) DMEM ग्लूकोज में 25%/High)-८० ° c. 24 घंटे के बाद तरल नाइट्रोजन के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण और उपयोग करने के लिए तैयार जब तक स्टोर ।
    नोट: MEFs में वैश्विक जीन अभिव्यक्ति कोशिका प्रमाणीकरण सुनिश्चित करने के लिए आरएनए-sequencing (आरएनए-seq) द्वारा इस प्रोटोकॉल का उपयोग अलग किया गया था । आरएनए-seq डेटा सांकेतिक शब्दों में बदलना MEF कोशिकाओं से NIH जीन अभिव्यक्ति सर्वग्राही (भू) से डाउनलोड किया गया था के साथ प्रवेश संख्या GSE93454 । आरएनए-seq जीन अभिव्यक्ति डेटा हमारे द्वारा प्रयुक्त MEFs के लिए NIH भू में प्रवेश संख्या GSE71405 के साथ जमा किए गए थे. इन दो डेटा सेट आम जीन प्रतीकों के अनुसार विलय कर दिया गया । अभिव्यक्ति डेटा फिर लॉग-रूपांतरित किया गया और हमारे MEFs और एन्कोड MEFs के लिए व्यंजक डेटा का एक scatterplot जनरेट किया गया और एक रेखीय प्रतीपगमन रेखा (चित्र 1a) के साथ फ़िट करें । MEFs इस प्रोटोकॉल का उपयोग अलग आणविक अंय प्रयोगशालाओं द्वारा अलग उन लोगों के समान हैं ।

2. MEFs के Retrovirus और Transduction का उत्पादन

नोट: इस खंड में सभी चरणों को एक सुरक्षा स्तर 2 कैबिनेट में किया जाना चाहिए । चूंकि इस प्रोटोकॉल retroviral transduction का उपयोग करता है, यह सुनिश्चित करें कि सुरक्षा सावधानियों के साथ वायरल मीडिया युक्त सभी अपशिष्ट का इलाज सहित ले लिया जाता है 10% ब्लीच के लिए reprogramming के लिए एक समय रेखा आंकड़ा 1b ।

  1. प्लैटिनम ई (पीई) सेल लाइन का उपयोग कर Retrovirus का उत्पादन
    1. कुशल retroviral कण उत्पादन के लिए ढकोसला-पोल और env जीन की अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए पीई मध्यम (तालिका 1) युक्त blasticidin और puromycin चयन मार्कर में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीई कोशिकाओं को बनाए रखने . 1:4 या 1:5 हर दो दिन में पारित सेल । इस retroviral उत्पादन पैदावार को कम कर सकते है के रूप में कोशिकाओं की भीड़ को रोकने के लिए ध्यान रखना ।
    2. दिन-1, बीज लगभग 5 x 106 कोशिकाओं के प्रति 10 सेमी डिश में वृद्धि मध्यम (तालिका 1) 16-20 अभिकर्मक से पहले एच (देखें 2 अंय मानक सेल संस्कृति डिश आकार के लिए घनत्व चढ़ाना के लिए) । धीरे रॉक व्यंजन आगे पीछे कई बार और ध्यान से एक ३७ ° c, 5% सह2 मशीन में भी चढ़ाना वितरण सुनिश्चित करने के लिए जगह (अभिकर्मक करने से पहले इष्टतम चढ़ाना घनत्व के लिए चित्रा 1C देखें) ।
      नोट: चयन मार्करों के माध्यम से मुक्त माध्यम में प्लेट पीई कोशिकाओं के लिए ध्यान रखना अभिकर्मक से पहले मध्यम युक्त उत्पन्न retroviral कणों को सुनिश्चित करने के लिए MEFs मार नहीं करता है.
    3. दिन 0 पर, अभिकर्मक के लिए डीएनए तैयार करें । 10 सेमी डिश अभिकर्मक के लिए, प्रत्येक reprogramming कारक के 2 µ g जोड़ें — GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, मीर-1, और मीर-१३३ (GHMT2m) — को १.५ मिलीलीटर ट्यूब ।
      नोट: अन्य मानक सेल कल्चर डिश आकारों को transfect करने के लिए आवश्यक डीएनए की मात्रा को स्केल करने के लिए तालिका 2 देखें ।
    4. एक अलग १.५ मिलीलीटर ट्यूब में, जोड़ें ३६० µ एल कम सीरम मीडिया । फिर कम सीरम मीडिया को सीधे ३६ µ एल अभिकर्मक रिएजेंट जोड़ें । धीरे ट्यूब झटका और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
      नोट: कम अभिकर्मक दक्षता से बचने के लिए, सावधानीपूर्वक अभिकर्मक एजेंट सीधे कम सीरम मीडिया के लिए जोड़ें ।
    5. GHMT2m डीएनए कॉकटेल के लिए कम सीरम मीडिया/अभिकर्मक एजेंट मिश्रण जोड़ें । धीरे से झटका ट्यूब और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए मशीन । भंवर मत करो ।
    6. पीई कोशिकाओं के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण dropwise जोड़ें, धीरे 10-15 एस के लिए भंवर मीडिया, और एक ३७ ° c, 5% CO2 मशीन में जगह है ।
      नोट: निर्माता के अनुसार, पीई कोशिकाओं 106 से 107 संक्रामक इकाइयों/एमएल के एक औसत titer उत्पंन करते हैं । इस प्रोटोकॉल लगभग 2 x 106 संक्रमण इकाइयों/एमएल द्वारा 24 एच और 6 एक्स 106 संक्रमण इकाइयों/एमएल ४८ एच द्वारा 4 के एक औसत MOI के लिए उत्पंन करता है । GFP/DsRed के अभिकर्मक भी अभिकर्मक/transduction दक्षता के लिए एक किराए के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है अगर वांछित; अभिकर्मक दक्षता ४८ एच (चित्रा 1C) द्वारा ९०% से अधिक होने की उंमीद है ।
  2. Transduction ऑफ MEFs
    1. 0 दिन पर, एक ३७ डिग्री सेल्सियस में कोलेजन और जगह के साथ कोट बर्तन, 5% सह के लिए कम से 2 मशीन2 एच ।
    2. तरल नाइट्रोजन और गल से MEFs निकालें । प्लेट ०.२ x 106 कोशिकाओं के विकास के माध्यम में ६० mm डिश प्रति । धीरे रॉक प्लेटें भी चढ़ाना वितरण और मशीन में जगह सुनिश्चित करने के लिए ( चित्रा 1C इष्टतम चढ़ाना घनत्व और अंय मानक सेल संस्कृति डिश आकार के लिए घनत्व चढ़ाना के लिए 2 तालिका के लिए देखें) ।
      नोट: इन चढ़ाना घनत्व अलग MEFs के कई बैचों पर परीक्षण किया गया है; जब तक MEFs उल्लेखनीयतया समझौता व्यवहार्यता प्रदर्शन, सेल सीडिंग घनत्व समायोजन आवश्यक नहीं है ।
    3. दिन 1, 24 ज पोस्ट-अभिकर्मक, पीई कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न retroviral माध्यम इकट्ठा करने के लिए एक 30 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें । एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में एक ०.४५ µm ताकना-आकार फिल्टर के माध्यम से माध्यम से गुजारें । 6 µ g/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए hexadimethrine ब्रोमाइड अभिकर्मक रिएजेंट जोड़ें । ध्यान से कोशिकाओं के विस्थापन को रोकने के लिए संस्कृति डिश की दीवार पर pipetting मीडिया द्वारा पीई कोशिकाओं के लिए 10 मिलीलीटर ताजा विकास माध्यम जोड़ें ।
    4. MEFs से मध्यम महाप्राण और प्रत्येक डिश के लिए नए सिरे से काटा retroviral माध्यम के 4 मिलीलीटर जोड़ें । वापस MEFs मशीन के लिए । retroviral कणों बेअसर करने के लिए वायरल माध्यम के साथ संपर्क में सभी सामग्री के लिए 10% ब्लीच जोड़ें ।
    5. दिन पर 2, ४८ ज पोस्ट-अभिकर्मक, दोहराएँ चरण -8 और 2.2.3. पीई कोशिकाओं retroviral माध्यम के 2एन डी संग्रह के बाद छोड़ दिया जाता है ।
      नोट: अवांछित retrovirus को बेअसर करने के लिए कम से 20 मिनट के लिए छोड़े गए पीई कोशिकाओं के लिए 10% ब्लीच जोड़ें ।
    6. 3 दिन, महाप्राण मध्यम MEFs से और 4 मिलीलीटर आईसीएम मध्यम (तालिका 1) जिसमें ०.५ µ m a-83-01, एक TGF-β प्रकार मैं रिसेप्टर अवरोध करनेवाला से भरना । एक-83-01 हर 2 दिन युक्त आईसीएम मध्यम भरपाई ।
      नोट: GFP एक transduction नियंत्रण के रूप में उपयोग करते हैं, तो व्यंजक ९०% इस समय बिंदु (आरेख 1C) से अधिक करने के लिए अपेक्षित है ।

3. हृदय मार्करों के लिए फ्लो Cytometry

  1. महाप्राण मध्यम 9 दिन से reMEFs और धो (1x) 1x पंजाब के साथ मृत कोशिकाओं और मलबे को हटाने के लिए ।
  2. ३७ ˚ सी पर 5 मिनट के लिए 1 मिलीलीटर ०.२५% Trypsin/EDTA जोड़ें एक प्रकाश माइक्रोस्कोप और शेक डिश का उपयोग कर कोशिकाओं की जाँच करें; यदि कोशिकाओं संलग्न रहते हैं, ३७ ˚ सी पर 5 अधिक मिनट की मशीन जब तक कोशिकाओं को अलग ।
  3. 5% FBS और फिल्टर एक ७० µm ताकना सेल छलनी के माध्यम से युक्त 1x पंजाब में कोशिकाओं को धो लें ।
  4. १६० पर 3 मिन के लिए कमरे के तापमान और गोली से महाप्राण तरल पर जी केंद्रापसारक ।
    नोट: सेल यील्ड बढ़ाने के लिए, लगभग ५० µ एल सेल गोली के ऊपर तरल छोड़ दें ।
  5. 1% BSA युक्त ५०० µ l 1x पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
  6. ०.२ एमएल के साथ फिक्स कोशिकाओं/1 लाख कोशिकाओं बर्फ पर 20 मिनट के लिए निर्धारण समाधान ।
  7. 1x बर्फ के 1 मिलीलीटर जोड़ें-शीत पर्म/
    नोट: निर्माता के समाधान 10x है ।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस और महाप्राण supernatant पर 5 मिनट के लिए १६० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक ।
  9. चरण ३.७ और ३.८ एक अतिरिक्त समय दोहराएँ । 2एनडी वाश के बाद, अगले चरण पर सीधे आगे बढ़ें या रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को रखें ।
  10. के साथ ब्लॉक १०० µ एल के 5% बकरी सीरम और गधा सीरम 1x पर्म में/30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर धो बफर ।
  11. पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के १०० µ l को जोड़ें ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, कोशिकाओं माउस ट्रोपोनिन टी (1:200) और माउस α-actinin (1:200) के साथ हृदय sarcomere के प्रमुख घटकों के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत का हिसाब लगाने के लिए लेबल थे । गर्मी कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी ।
  12. 4 ° c, महाप्राण supernatant पर 5 मीटर के लिए १६० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक, और बर्फ के साथ धो 2x-शीत पर्म/
  13. पतला द्वितीयक एंटीबॉडी के १०० µ l को जोड़ें ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, कक्ष एंटी-माउस ६४७ एनएम द्वितीयक एंटीबॉडी (1:200) के साथ लेबल किए गए थे । एक अंत से अधिक अंत ट्यूब रोटेटर पर कमरे के तापमान पर ४५ मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी की मशीन । पंनी में ट्यूबों लपेटकर प्रकाश से कोशिकाओं को सुरक्षित रखें ।
  14. 4 ° c, महाप्राण supernatant पर 5 मिनट के लिए १६० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक, और बर्फ के साथ धो 2x-शीत पर्म/
  15. पंजाब में 1% BSA की 1 मिलीलीटर जोड़ें और तुरंत FACS प्रदर्शन करें ।
    नोट: एक आगे तितर बितर साइड तितर बितर साजिश बनाम गेट व्यवहार्य कोशिकाओं को पहले जब FACS प्रदर्शन उत्पंन करते हैं । वैकल्पिक रूप से, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लाइव/मृत सेल दाग का उपयोग करने के लिए जीवित और मृत कोशिका आबादी की पहचान कोशिकाओं फिक्सिंग से पहले ।

4. Immunostaining का पुनर्कार्यक्रम MEFs

  1. 1 एमएल 1x आइस-कोल्ड पंजाबन के साथ 14 reमहाप्राण MEFs और वॉश (1x) से मध्यम ।
    नोट: immunostaining के लिए, reprogramming 12 अच्छी तरह से एंटीबॉडी समाधान वॉल्यूम को कम करने के लिए प्लेटों में किया गया था । 24 अच्छी तरह से प्लेटें भी इस्तेमाल किया जा सकता; बस आधा निंनलिखित संस्करणों ।
  2. महाप्राण और फिक्स कोशिकाओं के साथ ५०० µ l 2% paraformaldehyde कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए.
  3. महाप्राण और कोशिकाओं धो 1 मिलीलीटर 1x पंजाबियों के साथ 3 बार (कमरे के तापमान पर धो प्रति 5 मिनट) ।
  4. ५०० µ एल ०.२% के साथ Permeabilize कोशिकाओं 15 मिनट के लिए पंजाब में कमरे के तापमान पर permeabilization रिएजेंट ।
  5. महाप्राण और ब्लॉक में ५०० µ एल 10% पंजाब में घोड़ा सीरम 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ।
  6. कमरे के तापमान पर 1 ज के लिए पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के ५०० µ एल के साथ महाप्राण और मशीन ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, कक्ष माउस ट्रोपोनिन T या α-actinin (प्रत्येक 1:400) और Connexin ४३ (1:400) या ट्रोपोनिन I (1:400) के साथ सह-लेबल के साथ लेबल किए गए थे ।
  7. महाप्राण प्राथमिक एंटीबॉडी और 1 मिलीलीटर 1x पंजाबियों (कमरे के तापमान पर धो प्रति 5 मिनट) के साथ तीन बार धो लें ।
  8. महाप्राण और ५०० µ एल के साथ मशीन कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी पतला ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, कक्षों के साथ लेबल किए गए एंटी-माउस ५५५ एनएम माध्यमिक एंटीबॉडी (1:800) पहचान करने के लिए ट्रोपोनिन T या α-actinin और विरोधी खरगोश ४८८ एनएम माध्यमिक एंटीबॉडी (1:800) पहचान करने के लिए Connexin ४३ या ट्रोपोनिन I. साथ ही, नाभिक दाग थे Hoechst (1:10000) । अंधेरे में मशीन द्वारा प्रकाश से कोशिकाओं को सुरक्षित रखें ।
  9. द्वितीयक एंटीबॉडी को महाप्राण करें और 1 मिलीलीटर 1x पंजाबियों (कमरे के तापमान पर 5 मिनट प्रति वाश) के साथ तीन बार धोएं । 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश और दुकान से कोशिकाओं की रक्षा के लिए पन्ना में थाली लपेटें ।
  10. तीन चैनल epifluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर छवि.

5. कैल्शियम इमेजिंग

नोट: यदि इमेजिंग पर 10x बढ़ाई, मानक सेल संस्कृति व्यंजन और प्लेटें कैल्शियम इमेजिंग के लिए उपयुक्त हैं । उच्च आवर्धन पर इमेजिंग की आवश्यकता है कि कोशिकाओं को कांच coverslips या ग्लास नीचे व्यंजन पर चढ़ाया ।

  1. महाप्राण मध्यम और (एक 6 अच्छी प्लेट के लिए) 2 मिलीलीटर जोड़ें संशोधित Tyrode समाधान (१४० mM NaCl, 5 एमएम KCl, १.८ एमएम CaCl2, 1 एमएम MgCl2, 10 एमएम ग्लूकोज, 10 एमएम HEPES, ०.१% BSA, और 1% पाइरूवेट, पीएच ७.४) युक्त 5 µ एम फ्रा-2 एएम और ०.१% Pluronic एफ-१२७ से धड़कन (D14 टी हे D20) iCMs. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
    नोट: फ्लोरोसेंट संकेतक के शमन को रोकने के लिए प्रकाश से कोशिकाओं की रक्षा ।
  2. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 2 मिलीलीटर Tyrode के समाधान में कोशिकाओं को धो फ्रा-2 के de-esterification अनुमति देने के लिए ।
  3. ३४० एनएम और ३८० एनएम Slidebook ५.५ Ca2 + इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग पर कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ छवि । कमरे के तापमान पर इमेजिंग प्रदर्शन ।
  4. कैल्शियम यात्रियों की गणना कर रहे हैं प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुपात में ३४० एनएम पर प्रतिदीप्ति तीव्रता से ३८० एनएम पर ।
  5. यदि वांछित, 1 या 2 µ एम isoproterenol या 10 µ एम निफेडिपैन के साथ iCMs इलाज के लिए इमेजिंग आधारभूत कैल्शियम यात्रियों के बाद कैल्शियम से निपटने में हेरफेर । यौगिकों स्थानीय रूप से कोशिकाओं और छवि के लिए जोड़ें ।

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Representative Results

reprogramming रणनीति के ऊपर और आंकड़ा 1bमें उल्लिखित का उपयोग करना, हम लगभग ७०% के साथ iCMs उत्पंन कोशिकाओं के कार्डियक ट्रोपोनिन टी और लगभग ५५% की कोशिकाओं के हृदय α व्यक्त-actinin, quantified प्रवाह cytometry द्वारा दिन में 9 GHMT2m (चित्रा 2a और बी) के transduction के बाद । इसके अतिरिक्त, कोशिकाओं के बहुमत कार्डियक ट्रोपोनिन टी, ट्रोपोनिन मैं, और कार्डियक α-actinin के रूप में के रूप में अच्छी तरह से गैप जंक्शन मार्कर Connexin ४३ दिन में 14 निम्नलिखित transduction (चित्रा 2c और डी) एक्सप्रेस. उच्च आवर्धन के साथ इमेजिंग अच्छी तरह से परिभाषित sarcomere संरचना गठन और अंतर पड़ोसी कोशिकाओं (सफेद ऐरोहेड, चित्रा 2d) के बीच बनाने के जंक्शनों को पता चलता है । इसके अलावा, सहज संकुचन और कैल्शियम यात्रियों iCMs की कार्यक्षमता का संकेत (चित्र 3ए-सी और फिल्म 1).

Figure 1
चित्रा 1: reprogramming और कोशिकाओं के इष्टतम चढ़ाना के समयरेखा । (क) लॉग-रूपांतरित आरएनए-seq डेटा का Scatterplot हमारी लैब में उत्पन्न MEFs के लिए सांकेतिक शब्दों में बदलना MEFs. R2 मान और रेखीय प्रतीपगमन रेखा दिखाई जाती हैं । (ख) MEFs के GHMT2m-मध्यस्थता reprogramming में सभी महत्वपूर्ण चरणों की योजनाबद्ध । (ग) 70-80% संगम पर पीई कोशिकाओं अभिकर्मक करने से पहले (शीर्ष पंक्ति, बाएँ पैनल) और GFP संकेत ४८ घंटे के बाद अभिकर्मक अभिकर्मक दक्षता (शीर्ष पंक्ति, मध्य और सही पैनलों) इंगित करने के लिए । MEFs से पहले reprogramming (नीचे पंक्ति, बाएँ पैनल) और GFP संकेत ४८ घंटे के बाद संक्रमण की समय अवधि पर भीड़ को रोकने के लिए संक्रमण के लिए संक्रमण दक्षता (नीचे पंक्ति, मध्य और सही पैनलों) से संकेत मिलता है । स्केल बार = ४०० µ m. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ठहराव और iCMs में कार्डियक प्रोटीन अभिव्यक्ति का लक्षण वर्णन. (A और B). कार्डिएक ट्रोपोनिन टी के लिए प्रतिनिधि प्रवाह cytometry (A) और α-actinin (B) दिन 9 पर निंन GHMT2m transduction, n = 3 । (ग) आईसीसी दिन में कार्डिएक मार्करों के लिए धुंधला 14 म् GHMT2m transduction. ग्रीन: कार्डिएक ट्रोपोनिन मैं, लाल: कार्डिएक ट्रोपोनिन टी (मध्य पैनल) और α-actinin (सही पैनल), और नीला: Hoechst के लिए धुंधला हो जाना नाभिक । प्रतिनिधि छवियां (n = 3) । स्केल पट्टी = २०० µ m (D) उच्च आवर्धन sarcomere संरचना (लाल: कार्डियक α-actinin (शीर्ष पंक्ति) और कार्डियक ट्रोपोनिन T (नीचे पंक्ति)) और अंतर जंक्शन प्रोटीन Connexin ४३ (हरा) की अभिव्यक्ति की कल्पनाओं । सफेद ऐरोहेड पड़ोसी कोशिकाओं के बीच गठित अंतर जंक्शनों का संकेत है । प्रतिनिधि छवियां (n = 3) । स्केल बार = १०० µ m. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: iCMs का कार्यात्मक ठहराव । (क) पिटाई सेल गिनती के समय पाठ्यक्रम निंनलिखित GHMT2m transduction । धड़कन कोशिकाओं आंख और सेल से गिना रहे थे 10 प्रयोग प्रति व्यंजन पर डिश प्रति क्षेत्रों से औसत और पैनल में शामिल ए. (बी और सी) iCMs के कैल्शियम यात्रियों दर्ज की गई । कैल्शियम क्षणिक आवृत्ति 1 µ एम Isoproterenol या 10 µ एम निफेडिपैन के साथ उपचार के बाद iCMs में बदल दिया है । F340/प्रिंटर f380, प्रतिदीप्ति तीव्रता का अनुपात ३४० और ३८० एनएम पर रहा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Movie 1
Movie 1: धड़कन iCMs । विट्रो में12 दिन में मार iCMs दिखा फिल्म । इस वीडियो को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

आईसीएम मिडिया
रिएजेंट का नाम वॉल्यूम (mL) अंतिम एकाग्रता
DMEM उच्च ग्लूकोज ३२०
मीडियम १९९ ८०
भ्रूण गोजातीय सीरम ५० 10
दाता हार्स सीरम 25 5
मेम आवश्यक अमीनो अम्ल, 50x 10 1x
सोडियम पाइरूवेट समाधान, 100x 5 1x
मेम गैर जरूरी अमीनो अम्ल, 100x 5 1x
मेम विटामिन सॉल्यूशन, 100x 5 1x
इंसुलिन-कैल्सीटोनिन-सेलेनियम, 100x 5 1x
B27, 50x 10 1x
Penicilin-Streptomycin ५.५ १.१%
एल-Glutamine अनुपूरक ५.५ १.१%
पीई मीडिया
रिएजेंट का नाम वॉल्यूम (mL) अंतिम एकाग्रता
DMEM उच्च ग्लूकोज ४५०
भ्रूण गोजातीय सीरम ५० 10
Penicilin-Streptomycin ५.५ १.१%
एल-Glutamine अनुपूरक ५.५ १.१%
Blasticidin-एचसीएल-10mg/एमएल ०.५ 10 µ g/mL
Puromycin dihydrochloride ०.०५ 1 µ g/mL
विकास मीडिया
रिएजेंट के नाम/ वॉल्यूम (mL) अंतिम एकाग्रता
DMEM उच्च ग्लूकोज ४५०
भ्रूण गोजातीय सीरम ५० 10
Penicilin-Streptomycin ५.५ १.१%
एल-Glutamine अनुपूरक ५.५ १.१%

तालिका 1: संस्कृति मीडिया. इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त संस्कृति माध्यम के लिए व्यंजनों ।

पीई कोशिकाओं
सेल कल्चर डिश सतह क्षेत्र (cm2) सीडिंग घनत्व (कोशिकाएँ) मीडिया वॉल्यूम (mL) कुल डीएनए प्रति अभिकर्मक (µ g) अभिकर्मक रिएजेंट (µ l) Opti-मेम (µ l)
15 सेमी १७६.७ ११.२५ एक्स 106 20 ३६ १०८ १०८०
10 सेमी ७८.५ 5 x 106 10 12 ३६ ३६०
६० एमएम २८.२ १.७ एक्स 106 4 4 12 १२०
6 वेल प्लेट 9 ०.५४ एक्स 106 2 १.३ ३.९ ३९
12 वेल प्लेट 4 ०.२४ एक्स 106 1 ०.६ १.८ 18
24 वेल प्लेट 2 ०.१२ एक्स 106 ०.५ ०.३ ०.९ 9
MEFs
सेल कल्चर डिश सतह क्षेत्र (cm2) सीडिंग घनत्व (कोशिकाएँ) मीडिया वॉल्यूम (mL) Hexadimethrine ब्रोमाइड (µ l)
15 सेमी १७६.७ १.३५ एक्स 106 20 12
10 सेमी ७८.५ ०.६ एक्स 106 10 6
६० एमएम २८.२ ०.२ एक्स 106 4 २.४
6 वेल प्लेट 9 ०.१ एक्स 106 2 १.२
12 वेल प्लेट 4 ०.४ एक्स 105 1 ०.६
24 वेल प्लेट 2 ०.२ एक्स 105 ०.५ ०.३

तालिका 2: reprogramming के लिए सीडिंग घनत्व. कॉमन सेल कल्चर डिश फार्मेट के लिए पीई सेल और MEFs के लिए सीडिंग घनत्व की टेबल ।

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Discussion

वर्तमान अध्ययन GHMT2m reprogramming कारकों के दमन के साथ संयुक्त प्रो fibrotic संकेत रास्ते के वितरण के माध्यम से कार्यात्मक iCMs में fibroblasts सीधे reprogram करने के लिए एक उच्च दक्षता रणनीति की रूपरेखा । प्रवाह cytometry, immunofluorescent इमेजिंग, कैल्शियम इमेजिंग, और पिटाई सेल गिनती का उपयोग करना, हम इस प्रोटोकॉल में कोशिकाओं के बहुमत दिखाने के सफल reprogramming से गुजरना और मुख्यमंत्री वंश भाग्य को अपनाने । हम पहले से पता चला है कि इसके अलावा विरोधी fibrotic यौगिकों सहित TGF-β प्रकार मैं रिसेप्टर अवरोध करनेवाला एक-83-01 पैदावार एक लगभग 6 धड़कन की संख्या में वृद्धि गुना GHMT2m के साथ transduction की तुलना में अकेले, यह दर्शाता है कि प्रो-fibrotic संकेतन कार्डियक reprogramming के लिए एक मजबूत अंतर्जात बाधा है । इस प्रणाली, इसलिए कर सकते हैं, दवा स्क्रीनिंग के लिए दोहन के लिए cardiomyogenesis शासी तंत्र की जांच; एक-83-01 के साथ एक छोटे अणु के अलावा cardiomyogenesis के नकारात्मक नियामकों को उजागर कर सकता है । इसके विपरीत, एक छोटे से अणु के अलावा GHMT2m अकेले cardiomyogenesis के सकारात्मक नियामकों स्पष्ट सकता है । तंत्र है जिसके माध्यम से इन सकारात्मक और नकारात्मक नियामकों शासन मुख्यमंत्री भेदभाव cardiomyogenesis की एक बेहतर समझ में परिणाम और भी अधिक कुशल reprogramming और परिपक्वता प्रोटोकॉल के लिए नेतृत्व करेंगे सुलझाना ।

कई चर reprogramming दक्षता को प्रभावित । हम पाते है कि सेल चढ़ाना घनत्व बहुत पीई कोशिकाओं के मामले में retroviral कणों के उत्पादन दोनों प्रभावों, और MEFs के मामले में सभी reprogramming कारकों के कुशल । इसके अलावा, बीतने संख्या के रूप में अच्छी तरह से इन मापदंडों को प्रभावित कर सकते हैं । 20 बीतने से पहले वायरल कणों, transfect पीई कोशिकाओं के इष्टतम उत्पादन सुनिश्चित करने के लिए । retroviral कणों के कुशल लेने के लिए सुनिश्चित करने के लिए, ठंड के बाद MEFs पारित नहीं है ।

हाल के अध्ययनों से भी MEFs की उच्च दक्षता reprogramming नीचे दस्तक PRC1 सदस्य बीएमआई के साथ GMT30 की अभिव्यक्ति के साथ या GHMT३७के अलावा में एकेटी व्यक्त द्वारा प्रदर्शन किया है । ZFN281 के अलावा GHMT के लिए + एकेटी वयस्क पूंछ टिप fibroblasts में ट्रोपोनिन टी सकारात्मक कोशिकाओं में एक 4 गुना वृद्धि करने के लिए नेतृत्व, भड़काऊ जीन हस्ताक्षर के दमन के लिए भाग में जिंमेदार ठहराया३८। इसके अलावा, एक TGF का संयोजन-β संकेतन अवरोध करनेवाला और WNT सिग्नलिंग अवरोधक GMT-मध्यस्थता कार्डियक reprogramming३९वृद्धि हुई । महत्वपूर्ण बात, इन अध्ययनों में शामिल संकेत मार्ग ओवरलैप करने के लिए दिखाई नहीं देते. इसलिए, यह संभावना है कि कई संकेतन रास्ते के बीच पार बात आगे हृदय reprogramming को बढ़ाने सकता है ।

अध्ययन के एक नंबर vivo में चूहों में reprogramming कारकों के वितरण के माध्यम से reprogramming के बाद छोड़ दिया पूर्वकाल अवरोही (बालक) धमनी बंधाव25,३२,३९,४० ,४१. इन अध्ययनों से वेंट्रिकुलर समारोह में मामूली सुधार दिखा एमआई निंनलिखित था, दिल पुनर्जनन पर हृदय reprogramming की चिकित्सीय क्षमता निंनलिखित चोट के नीचे । हमारे प्रोटोकॉल तिथि करने के लिए इन विट्रो में उच्चतम दक्षता के साथ MEFs reprograms । इसलिए, यह देखने के लिए अगर उच्च दक्षता reprogramming पूरी तरह से vivo में दिल समारोह पोस्ट-चोट बहाल करने में सक्षम है देखना दिलचस्प होगा । ये अध्ययन रोगियों के पद-रोधगलन के लिए इस विधि को उपन्यास कोशिका उपचारों में अनुवाद करने के लिए एक आधार के रूप में परोस सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अनुसंधान Boettcher है फाउंडेशन वेब से धन द्वारा समर्थित था-Waring बायोमेडिकल रिसर्च प्रोग्राम, अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन वैज्ञानिक विकास अनुदान (13SDG17400031), चिकित्सा बकाया जल्दी कैरियर के कोलोराडो विश्वविद्यालय विभाग विद्वान कार्यक्रम, कार्डियोलोजी बारलो Nyle बंदोबस्ती के कोलोराडो डिवीजन के विश्वविद्यालय, और NIH R01HL133230 (के लिए के. एस.) । ए. एस. आर NIH/NCATS कोलोराडो CTSA अनुदान संख्या TL1TR001081 और एक पूर्व डॉक्टरेट फैलोशिप यूनिवर्सिटी ऑफ कोलोराडो कंसोर्टियम फॉर फाइब्रोसिस रिसर्च एंड ट्रांसलेशन (CFReT) द्वारा समर्थित किया गया था । यह शोध भी कैंसर केंद्र सहायता अनुदान (P30CA046934), त्वचा रोग अनुसंधान कोर अनुदान (P30AR057212), और कोलोराडो Anschutz चिकित्सा परिसर में विश्वविद्यालय में प्रवाह Cytometry कोर द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6 Mice Charles River's Laboratory 027 For MEF isolation
Platinum E (PE) Cells Cell Biolabs, INC RV-101 For retrovirus production
DMEM High Glucose Gibco SH30022.FS Component of iCM, PE, and Growth media
Medium 199 Life Technologies 11150-059 Component of iCM media
Fetal Bovine Serum Gemini 100106 Component of iCM, PE, and Growth media
Donor Horse Serum Gemini 100508 500 Component of iCM media
MEM Essential Amino Acids, 50X Life Technologies 11130051 Component of iCM media
Sodium Pyruvate Solution, 100X Life Technologies 11360070 Component of iCM media and for calcium imaging
MEM Non-Essential Amino Acids, 100X Life Technologies 11140050 Component of iCM media
MEM Vitamin Solution, 100X Life Technologies 11120-052 Component of iCM media
Insulin-Transferrin-Selenium Gibco 41400045 Component of iCM media
B27 Gibco 17504-044 Component of iCM media
Penicilin-Streptomycin Gibco 15140-122 Component of iCM, PE, and Growth media
GlutaMAX (L-Glutamine Supplement) Gibco 35050-061 Component of iCM, PE, and Growth media
Blasticidin-HCl Life Technologies A11139-03 Component of PE media
Puromycin dihydrochloride Life Technologies A11138-03 Component of PE media
0.25% Trypsin/EDTA Gibco 25200-056 For detaching cells from culture dishes
A-83-01 R&D Systems - Tocris 2939/10 Treat cells to inhibit TGF-β signaling - promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM
DMSO Thermo Scientific 85190 For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium
SureCoat Cellutron SC-9035 For coating dishes to plate MEFs
FuGENE 6 Transfection Reagent Promega E2692 Transfection Reagent
Opti-MEM Reduced Serum Media Gibco 11058-021 Transfection Reagent
pBabe-X Myc-GATA4 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Hand2 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Mef2c Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Tbx5 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X miR-1 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X miR-133 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X GFP Plasmid containing reprogramming factor
Polybrene (Hexadimethrine bromide) Sigma H9268-5G For viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL
Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores) Nalgene  569-0020  For filtering media
Syringes Bd Vacutainer Labware  309654 For viral filtration
0.45 µm Filters Celltreat 229749 For viral filtration
70 µm cell strainers Falcon  352350 For MEF isolation and Flow Cytometry
Cytofix/Cytoperm Solution BD 554722 For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry
perm/wash buffer  BD 554723 For washing cells for flow cytometry
DPBS 1X Gibco 14190-250 For washing cells
Bovine Serum Albumin VWR 0332-100g For flow cytometry and calcium imaging
Goat Serum Sigma  G9023 For blocking cells for Flow Cytometry
Donkey Serum Sigma D9663-10mg For blocking cells for Flow Cytometry
Mouse Troponin T Thermo Scientific ms-295-p 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry
Mouse α-actinin Sigma A7811L 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry
Rabbit Connexin 43 Sigma  C6219 1:400 IF
Rabbit Troponin I PhosphoSolutions 2010-TNI 1:400 IF
Hoechst Life Technologies 62249 1:10000 IF
Alexa 488, rabbit Life Technologies A-11034 1:800 IF
Alexa 555, mouse Life Technologies A-21422 1:800 IF
Alexa 647, mouse Life Technologies A-31571 1:200 Flow Cytometry
27-color ZE5 Flow Cytometer  Bio-RAD For FACS
Paraformaldehyde sigma P6148-500mg For fixing cells for IF
Triton X-100 Promega H5142 For permeabilization of cells for IF
EVOS™ FL Color Imaging System Thermo Scientific AMEFC4300 For IF
NaCl RPI S23020-5000 For calcium imaging
KCl VWR 395 For calcium imaging
CaCl2 Fisher C614-500 For calcium imaging
MgCl2 VWR 97061-352 For calcium imaging
glucose sigma G7528-250g For calcium imaging
HEPES sigma H4034-500g For calcium imaging
Fura-2 AM Life Technologies F1221 For calcium imaging
Fluronic F-127 Sigma P2443-250g For calcium imaging
Nifedipine Sigma N7634-1G For disruption calcium transients in iCMs - use at 10 µM
Isoproterenol sigma I6504-1g For increasing number of calcium transients in iCMs - use at 1-2 µM
Marianas Spinning Disk Confocal microscope 3i For calcium imaging
ethanol Decon Laboratories 2801
bleach Clorox
50 mL conical tubes GREINER BIO-ONE 227261
15 mL conical tubes GREINER BIO-ONE 188271
15 cm cell culture dishes Falcon 353025
10 cm cell culture dishes Falcon 353003
60 mm cell culture dishes GREINER BIO-ONE 628160
6 well cell culture plates GREINER BIO-ONE 657160 
12 well cell culture plates GREINER BIO-ONE 665180 
24 well cell culture plates GREINER BIO-ONE 662160 

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक १३६ कार्डिएक reprogramming प्रतिलेखन कारकों microRNAs प्रो fibrotic संकेतन यौगिक TGF-β रिसेप्टर 1 अवरोध करनेवाला
समर्थक-fibrotic संकेतन Potentiates फैक्टर के दमन-प्रेरित Cardiomyocytes में माउस भ्रूण Fibroblasts की मध्यस्थता reprogramming
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Riching, A. S., Zhao, Y., Cao, Y., Londono, P., Xu, H., Song, K. Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (136), e57687, doi:10.3791/57687 (2018).

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