Summary
Qui presentiamo un metodo affidabile per riprogrammare i fibroblasti embrionali primari in cardiomiociti funzionali tramite sovraespressione di GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 e miR-133 (GHMT2m) al fianco di inibizione di segnalazione di TGF-β. Il nostro protocollo genera pestaggio cardiomyocytes fin dal post-traduzionali di 7 giorni con fino a 60% efficienza.
Abstract
Trans-differenziazione di cellule somatiche un tipo in un altro ha un enorme potenziale per modellare e trattare malattie umane. Studi precedenti hanno dimostrato che il mouse embrionali, fibroblasti cutanei e cardiaci possono essere riprogrammati in funzionale indotta-cardiomyocyte-come le cellule (iCMs) tramite sovraespressione di fattori di trascrizione cardiogeno compreso GATA4, Hand2, Mef2c, e TBX5 sia in vitro che in vivo. Tuttavia, questi studi precedenti hanno dimostrato relativamente bassa efficienza. Al fine di ripristinare la funzione del cuore dopo la lesione, meccanismi che governano la riprogrammazione cardiaco devono essere delucidate per aumentare l'efficienza e la maturazione degli iCMs.
Precedentemente abbiamo dimostrato che l'inibizione di segnalazione pro-fibrotici drammaticamente aumenta l'efficienza di riprogrammazione. Qui, abbiamo dettaglio metodi a raggiungere un'efficienza riprogramma fino al 60%. Inoltre, si descrivono diversi metodi tra cui citometria a flusso, formazione immagine immunofluorescente e calcio imaging per quantificare la riprogrammazione l'efficienza e la maturazione dei fibroblasti riprogrammati. Utilizzando il protocollo dettagliato qui, studi meccanicistici possono essere intrapreso per determinare regolatori positivi e negativi della riprogrammazione cardiaco. Questi studi possono identificare vie di segnalazione che possono essere mirate per promuovere l'efficienza riprogrammante e maturazione, che potrebbe portare a cell novel terapie per trattare la malattia di cuore umana.
Introduction
Cardiopatia ischemica è una causa principale di morte negli Stati Uniti1. Circa 800.000 americani esperienza un primo o ricorrente infarto miocardico (MI) per ogni anno1. In seguito MI, la morte dei cardiomiociti (CMs) e fibrosi cardiaca, depositati dai fibroblasti cardiaci attivati, compromettere cuore funzione2,3. Progressione dell'insufficienza cardiaca dopo MI è in gran parte irreversibile a causa la scarsa capacità rigenerativa di adulto CMs4,5. Mentre le terapie cliniche correnti rallentano la progressione di malattia e fare diminuire il rischio di eventi cardiaci futuri6,7,8,9, terapie non invertire la progressione della malattia dovuto l'incapacità di rigenerare il CMs post-infarto10. Terapie cellulari romanzo stanno emergendo per trattare pazienti che seguono MI. sembrto, sperimentazioni cliniche fornire cellule staminali nel cuore seguito finora MI hanno dimostrato inconcludente rigenerativa potenziali11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.
La generazione di cellule staminali pluripotenti indotte umano-derivato (hiPSCs) dai fibroblasti da sovraespressione di quattro fattori di trascrizione, in primo luogo ha dimostrato di Takahashi & Yamanaka, ha aperto la porta a nuovi progressi nella cella terapia19. Queste cellule possono differenziarsi in tutti i tre strati germinativi19, e diversi metodi altamente efficienti per la generazione di un numero elevato di CMs sono stati indicati in precedenza20,21. CMs HiPSC-derivato (fianchi-CMs) offre una potente piattaforma per lo studio cardiomiogenesi e può avere implicazioni importanti per la riparazione del cuore dopo la lesione. Tuttavia, fianchi-CMs attualmente affrontare ostacoli traslazionali dovuto le preoccupazioni di teratoma formazione22, e loro natura immaturo può essere pro-aritmogenica23. Riprogrammazione di fibroblasti in hiPSCs ha suscitato interesse direttamente riprogrammazione fibroblasti in altri tipi cellulari. Ieda et al hanno dimostrato che la sovraespressione di GATA4, Mef2c e Tbx5 (GMT) nei risultati di fibroblasti in riprogrammazione diretta per linea cardiaca, anche se a bassa efficienza24. Riprogrammazione di efficienza è stata migliorata con l'aggiunta di Hand2 (GHMT)25. Da questi primi studi, molte pubblicazioni hanno dimostrato che alterando il cocktail fattore riprogrammazione con trascrizione ulteriori fattori26,27,28,29, cromatina modificatori30,31, microRNA32,33o piccole molecole34 conduce ad una migliore riprogrammazione efficienza e/o maturazione indotta del cardiomyocyte-come delle cellule (iCMs ).
Qui forniamo un protocollo dettagliato per generare iCMs da fibroblasti embrionali del mouse (MEFs) con alta efficienza. Precedentemente abbiamo indicato che il GHMT cocktail è notevolmente migliorata con l'aggiunta di miR-1 e miR-133 (GHMT2m) ed è stata ulteriormente migliorata quando vie tra cui trasformando la segnalazione di fattore di crescita β (TGF-β) di segnalazione pro-fibrotici o Rho-associati vie di segnalazione della proteina chinasi (ROCK) sono inibiti35. Usando questo protocollo, ci mostrano che circa il 60% delle cellule express cardiaco troponina T (cTnT), circa il 50% express α-actinina, e un elevato numero di celle di battitura può essere osservato più presto il giorno 11 dopo trasduzione di riprogrammazione fattori e trattamento con il TGF-β tipo inibitore del recettore A-83-01. Inoltre, questi iCMs esprimono proteine di giunzione divario tra cui connexin 43 ed esibiscono contrazione spontanea e transitori di calcio. Questo netto miglioramento nella riprogrammazione efficienza rispetto agli studi precedenti dimostra il potenziale per rigenerare CMs da popolazioni di cellule endogene che rimangono post-nell'infarto cuore.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti gli esperimenti che richiedono gli animali sono stati approvati dal comitato di utilizzo presso la UC Denver Anschutz Medical Campus e istituzionali Animal Care.
1. isolamento di MEFs
- Acquistare C57BL/6 topi incinto a E13. Nave durante la notte.
- Eutanasia della madre secondo protocolli approvati IACUC (ex: ~1.3 L/min CO2 fino a quando l'animale appare morto seguita da dislocazione cervicale)
- Spruzzare la madre con etanolo al 70% e aprire la cavità addominale. Rimuovere il corno uterino contenenti embrioni e mettere in un piatto di 10 cm con PBS sterile.
- Praticare un'incisione nel sac di rilasciare embrione embrione. Trasferimento dell'embrione per pulire il piatto di 10 cm con PBS sterile. Sciacquare abbondantemente.
- Tagliare il corpo sotto il fegato e scartare la testa e la parte superiore del corpo. Rimuovere gli organi interni e scartare. Trasferire il tessuto restante ad un piatto pulito 10cm con PBS sterile e trasferire la piastra a un livello di biosicurezza 1 o 2 mobile. Combinare tessuti da tutti gli embrioni in un piatto pulito e asciutto 10cm e tritare in pezzi pregiati.
- Aggiungere 6 mL di 0,25% tripsina/1 mM EDTA agli embrioni macinati. Triturare più volte mediante pipetta per rompere il tessuto. Incubare per 40 min a 37 ˚ c con 5% CO2.
- Risospendere le cellule in coltura (tabella 1). Il volume dei media viene regolato in base al numero di embrioni raccolti. In generale, utilizzare un rapporto di media di sviluppo di circa 25 mL per 1,2 embrioni.
- Piastra 25 mL di sedimento cellule in un piatto di 15 cm. Dopo 24 h, aspirare i media e aggiungere 25 mL di terreno di coltura fresco a ogni piatto.
- Dopo 72 h, aggiungere 2 mL di 0,25% tripsina/1 mM EDTA ad ogni piatto di 15 cm. Quando le cellule si staccano dalla piastra di coltura, inattivare tripsina con 15 mL di terreno di crescita e raccogliere le cellule in provette coniche da 50 mL in polistirolo. Centrifugare le cellule per 3 min a 160 x g a temperatura ambiente. Risospendere il pellet cellulare in crescita media e filtro attraverso un colino di cella poro 70 µm.
- Contare le celle utilizzando un emocitometro e congelare MEFs in aliquote di 2 milioni di cellule nel mezzo di congelamento (10% DMSO, 25% FBS in di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) / alto glucosio) a-80 ° C. Trasferire le cellule a azoto liquido dopo 24 h e negozio fino all'uso.
Nota: Espressione genica globale in MEFs è stata profilata isolato usando questo protocollo mediante sequenziamento di RNA (RNA-seq) per garantire l'autenticazione delle cellule. RNA-seq dati dalle celle di codificare MEF sono stati scaricati da NIH Gene Expression Omnibus (GEO) con numero di accessione GSE93454. Dati di espressione genica di RNA-seq per MEFs da noi utilizzati sono stati depositati in NIH GEO con numero di accessione GSE71405. Questi due insiemi di dati sono state fuse secondo simboli comuni di gene. I dati di espressione quindi registro-sono stati trasformati ed un scatterplot dei dati di espressione per i nostri MEFs ed ENCODE MEFs erano generati e misura con una retta di regressione lineare (Figura 1A). MEFs isolati utilizzando questo protocollo sono molecolarmente simili a quelli isolati da altri laboratori.
2. produzione di Retrovirus e trasduzione di MEFs
Nota: Tutti i passaggi in questa sezione devono essere effettuati in un armadio di 2 livello di biosicurezza. Poiché questo protocollo utilizza trasduzione retrovirale, garantire che la sicurezza Precauzioni tra cui trattare che tutti i rifiuti contenenti mezzi di comunicazione virale con candeggina al 10% per almeno 20 min. fare riferimento alla Figura 1B per un diario per la riprogrammazione.
-
Produzione di Retrovirus utilizzando la linea cellulare Platinum E (PE)
- Mantenere commercialmente disponibile PE le cellule in PE medio (tabella 1) contenenti Consciousness con puromicina Selezione indicatori e per garantire l'espressione della gag-pol ed env geni per la produzione efficiente delle particelle retrovirali36 . Cellule del passaggio 1:4 o 1:5 ogni due giorni. Fare attenzione a evitare il sovraffollamento delle cellule in quanto questo può ridurre le rese di produzione retrovirali.
- Il giorno -1, circa 5 x 106 cellule per ogni piatto di 10 cm nel terreno di crescita (tabella 1), h 16-20 di semi prima della trasfezione (Vedi tabella 2 per la placcatura di densità per altri formati di cella standard cultura piatto). Scuotere delicatamente piatti avanti e indietro diverse volte e posizionare con cura in un 37 ° C, 5% CO2 incubatore per garantire anche la distribuzione di placcatura (per densità di placcatura ottimale prima della trasfezione, vedere Figura 1 ).
Nota: fare attenzione alle cellule di PE piatto nel mezzo libero di marcatori di selezione prima di transfezione per garantire supporto contenente particelle retrovirali generate non uccide MEFs. - Il giorno 0, preparare il DNA per la transfezione. Per la transfezione di piatto di 10 cm, aggiungere 2 µ g di ogni fattore di riprogrammazione — GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 e miR-133 (GHMT2m) — in una provetta da 1,5 mL.
Nota: Fare riferimento alla tabella 2 per scalare la quantità di DNA necessaria a transfect altre dimensioni piatto cultura standard. - In un tubo separato da 1,5 mL, aggiungere 360 µ l siero riduttore media. Quindi aggiungere 36 µ l di reagente di transfezione direttamente ai media di siero ridotto. Delicatamente flick il tubo e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
Nota: Per evitare di transfezione ridotta efficienza, attentamente aggiungere Reagente di transfezione direttamente ai media riduttori del siero. - Aggiungere siero riduttore media/transfezione reagente misto al DNA GHMT2m cocktail. Delicatamente flick il tubo e incubare a temperatura ambiente per 15 min. Non centrifugare.
- Aggiungere goccia a goccia la miscela di reazione alle celle di PE, delicatamente turbinio media per 10-15 s e posto in un 37 ° C, 5% CO2 incubator.
Nota: Secondo il produttore, PE le cellule generano un titolo medio di 106 107 infettive unità/ml. Questo protocollo genera circa6 infezioni unità/mL da 24 h a 2 x 10 e 6 x 106 infezioni unità/mL di 48 h per una media MOI di 4. Transfezione di GFP/DsRed può essere utilizzata anche come un surrogato per efficienza di trasfezione/trasduzione se lo si desidera; efficienza di trasfezione dovrebbe superare il 90% di 48 h (Figura 1).
-
Trasduzione di MEFs
- Il giorno 0, cappotto piatti a base di collagene e posto in un 37 ° C, 5% CO2 incubatore per almeno 2 h.
- Rimuovere MEFs dal disgelo e azoto liquido. Cellule di piastra 0.2 x 106 per ogni piatto di 60 mm nel mezzo di crescita. Delicatamente piastre di roccia per garantire anche la distribuzione di placcatura e collocare nell'incubatrice (Vedi Figura 1 per densità di placcatura ottimale e la tabella 2 per la placcatura di densità per altri formati di cella standard cultura piatto).
Nota: Queste densità di placcatura sono state testate su più batch di isolato MEFs; a meno che MEFs display significativamente compromessa redditività, non è necessario regolare la densità di semina cellulare. - Il giorno 1, post-trasfezione 24 h, è necessario utilizzare una siringa da 30 mL per raccogliere retrovirale medio generato dalle cellule di PE. Passare il mezzo attraverso un filtro di dimensioni dei pori 0,45 µm in una provetta conica da 50 mL. Aggiungere il reagente di transfezione di bromuro di hexadimethrine ad una concentrazione finale di 6 µ g/mL. Con attenzione aggiungere 10 mL di terreno di crescita fresco alle celle di PE da pipettaggio media sulla parete della piastra di coltura per impedire lo spostamento delle cellule.
- Aspirare il mezzo da MEFs e aggiungere 4 mL di terreno retrovirale appena raccolte ad ogni piatto. Ritorno MEFs nell'incubatore. Aggiungere candeggina al 10% a tutti i materiali a contatto con il fluido virale per neutralizzare le particelle retrovirali.
- Il giorno 2, post-trasfezione 48h, ripetere i passaggi da 2.2.2 e 2.2.3. Le cellule PE vengono scartate dopo la raccolta di 2nd del mezzo retrovirale.
Nota: Aggiungere candeggina al 10% alle scartati PE celle per almeno 20 min neutralizzare i retrovirus indesiderati. - Il giorno 3, aspirare medio da MEFs e ricostituire con 4 mL di terreno di iCM (tabella 1) contenente 0,5 µM A-83-01, un TGF-β tipo inibitore del recettore. Ricostituire il supporto di iCM che contiene A-83-01 ogni 2 giorni.
Nota: Se usando GFP come un controllo di trasduzione, l'espressione è previsto per superare il 90% da questo punto di tempo (Figura 1).
3. flusso Cytometry per marcatori cardiaci
- Mezzo di aspirato da giorno 9 riprogrammato MEFs e lavaggio (1x) con PBS 1X per rimuovere i detriti e le cellule morte.
- Aggiungere 1 mL 0,25% tripsina/EDTA per 5 min a 37 ˚ c. Verifica celle utilizzando un microscopio chiaro e agitare piatto; Se le cellule rimangono attaccate, incubi più 5 min a 37 ° c fino a staccano le cellule.
- Lavare le cellule in 1X PBS contenente 5% di FBS e filtro attraverso un colino di cella poro 70 µm.
- Centrifugare a 160 x g per 3 min a temperatura ambiente e liquido aspirato dal pellet.
Nota: Per aumentare il rendimento delle celle, lasciare liquido circa 50 µ l sopra il pellet cellulare. - Lavare le cellule con 500 µ l 1X PBS contenente BSA 1%.
- Difficoltà cellule con 0,2 mL 1 milione cellule soluzione di fissaggio per 20 min sul ghiaccio.
- Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio/perm ghiacciata di 1x.
Nota: La soluzione del produttore è 10x. - Centrifugare le cellule a 160 x g per 5 min a 4 ° C e aspirare il surnatante.
- Ripetere i passaggi da 3.7 e 3.8 un tempo supplementare. Dopo il lavaggio 2nd , procedere direttamente al passo successivo o mantenere le cellule a 4 ° C durante la notte.
- Bloccare con 100 µ l di siero di capra del 5% e siero di asino in perm/lavaggio 1X per 30 min a temperatura ambiente.
- Aggiungere 100 µ l di anticorpo primario diluito.
Nota: Per questo protocollo, le celle sono state etichettate con mouse troponina T (1: 200) e del mouse α-actinina (1: 200) per quantificare la percentuale di cellule positive per componenti chiave del sarcomero cardiaco. Incubare anticorpo primario per 1 h a temperatura ambiente. - Centrifugare le cellule a 160 x g per 5 m a 4 ° C, aspirare il surnatante e lavare 2x con tampone di lavaggio/Perm ' ghiacciata.
- Aggiungere 100 µ l di anticorpo secondario diluito.
Nota: Per questo protocollo, le celle sono state etichettate con anti-topo 647 nm secondaria dell'anticorpo (1: 200). Incubare anticorpo secondario per 45 min a temperatura ambiente su un rotatore di over-fine tubo. Proteggere le cellule dalla luce avvolgendo i tubi in un foglio. - Centrifugare le cellule a 160 x g per 5 min a 4 ° C, aspirare il surnatante e lavare 2x con tampone di lavaggio/Perm ' ghiacciata.
- Aggiungere 1 mL di 1% BSA in PBS ed eseguire FACS immediatamente.
Nota: Generare un grafico a dispersione di forward scatter vs lato al cancello prima cellule vitali durante l'esecuzione di FACS. In alternativa, utilizzare una macchia delle cellule vive/morte commercialmente disponibile prima della posa di cellule per identificare dal vivo e morto popolazioni cellulari.
4. Immunostaining del MEFs riprogrammate
- Mezzo di aspirato da giorno 14 riprogrammato MEFs e lavaggio (1x) con 1 mL 1 x PBS ghiacciata.
Nota: Per l'immunocolorazione, riprogrammazione è stato effettuato in 12 piastre a pozzetti per ridurre al minimo i volumi di soluzione di anticorpo. 24 piatti ben possono anche essere utilizzati; semplicemente metà tutto seguendo i volumi. - Aspirare e fissare le cellule con 500 µ l 2% paraformaldeide per 10 min a temperatura ambiente.
- Aspirare e lavare le cellule 3 volte con 1 mL di PBS + 1X (5 min a lavaggio a temperatura ambiente).
- Permeabilize le cellule con 500 µ l 0,2% permeabilizzazione reagente in PBS per 15 min a temperatura ambiente.
- Aspirare e bloccare in 500 µ l 10% di siero equino in PBS per 30 min a temperatura ambiente.
- Aspirare e incubare con 500 µ l di anticorpo primario diluito per 1 h a temperatura ambiente.
Nota: Per questo protocollo, le cellule erano etichettate con mouse troponina T o α-actinina (ogni 1: 400) e co-etichettate con Connexin 43 (1: 400) o della troponina I (1: 400). - Anticorpo primario di aspirare e lavare tre volte con 1 mL di PBS + 1X (5 min a lavaggio a temperatura ambiente).
- Aspirare e incubare con anticorpo secondario diluito di 500 µ l per 1 ora a temperatura ambiente.
Nota: Per questo protocollo, le celle sono state etichettate con anticorpo anti-topo 555 nm secondario (1: 800) riconoscere troponina T o α-actinina e anti-coniglio 488 nm anticorpo secondario (1: 800) riconoscere Connexin 43 o troponina I. Inoltre, i nuclei sono stati macchiati con Hoechst (01:10, 000). Proteggere le cellule dalla luce incubando nel buio. - L'anticorpo secondario di aspirare e lavare tre volte con 1 mL di PBS + 1X (5 min a lavaggio a temperatura ambiente). Avvolgere la piastra in un foglio per proteggere le cellule dalla luce e conservare a 4 ° C.
- Immagine utilizzando tre canali epifluorescenza.
5. il calcio Imaging
Nota: Se imaging presso ingrandimento 10x, piastre e piastre di coltura cellulare standard sono adatti per l'imaging del calcio. La formazione immagine a maggiore ingrandimento richiede che le cellule piastrate su vetrini coprioggetti o piatti di vetro inferiore.
- Medio di aspirare e aggiungere 2 mL (per un 6 piastra bene) per volta soluzione di Tyrode (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1mm MgCl2, glucosio di 10 mM, 10 mM HEPES, BSA 0.1% e 1% piruvato, a pH 7,4) contenente 5 µM Fura-2 AM e 0,1% Pluronic F-127 a battere (D14 t iCMs o D20). Incubare per 30 minuti a 37 ° C.
Nota: Proteggono le cellule dalla luce per evitare l'estinzione dell'indicatore fluorescente. - Lavare le cellule in soluzione di Tyrode 2ml per 30 min a temperatura ambiente per permettere de-esterificazione del Fura-2 AM.
- Immagine con filatura la microscopia confocale disco a 340 nm e 380 nm utilizzando Slidebook 5.5 Ca2 + software di imaging. Eseguire l'imaging a temperatura ambiente.
- Transitori di calcio sono calcolati utilizzando il rapporto di intensità di fluorescenza a 340 nm sopra l'intensità di fluorescenza a 380 nm.
- Se lo si desidera, trattare iCMs con isoproterenolo µM 1 o 2 o 10 µM nifedipina per manipolare dopo formazione immagine transitori di calcio della linea di base di calcio. Aggiungere composti localmente alle cellule ed immagine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utilizzando la riprogrammazione strategia delineata sopra e in Figura 1B, abbiamo generato iCMs con circa 70% delle cellule che esprimono cardiaco troponina T e circa il 55% delle cellule che esprimono cardiaco α-actinina, quantificato tramite flusso cytometry al giorno 9 seguito di trasduzione di GHMT2m (Figura 2A e B). Inoltre, la maggior parte delle cellule esprime troponina cardiaca T, troponina I e cardiaca α-actinina, nonché il marcatore di giunzione di spacco Connexin 43 al giorno 14 dopo la trasduzione (Figura 2 e D). Imaging con maggiore ingrandimento rivela la formazione della struttura ben definita sarcomero e giunzioni di gap formando tra le cellule vicine (punte di freccia bianche, Figura 2D). Inoltre, contrazione spontanea e transitori di calcio indicano la funzionalità di iCMs (Figura 3A-C e Movie 1).
Figura 1: sequenza temporale della riprogrammazione e placcatura ottima delle cellule. (A) Scatterplot dei dati di RNA-seq registro-trasformate per MEFs generati nel nostro laboratorio contro ENCODE MEFs. Il valore di R2 e la retta di regressione lineare vengono visualizzati. (B) schema di tutti i critici passaggi la riprogrammazione di GHMT2m-mediata di MEFs. (C) le cellule PE alla confluenza di 70-80% prima di transfezione (riga superiore, pannello sinistro) e la GFP segnale 48 ore post-transfezione per indicare l'efficienza di trasfezione (riga superiore, centrali e destro pannelli). MEFs scarsamente seminato prima dell'infezione per evitare sovraffollamento nel periodo di tempo di riprogrammazione (riga inferiore, pannello sinistro) e di GFP segnale 48 ore post-infezione per indicare l'efficienza di infezione (riga inferiore, centrali e destro pannelli). Barra della scala = 400 µM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: quantificazione e caratterizzazione dell'espressione della proteina cardiaca in iCMs. (A e B). Citometria a flusso rappresentativo per la troponina cardiaca T (A) e α-actinina (B) al giorno 9 seguendo trasduzione del GHMT2m, n = 3. (C) ICC macchiatura per marcatori cardiaci al giorno 14 dopo trasduzione del GHMT2m. Verde: troponina I, Red: cardiaco troponina T (pannello centrale) e α-actinina (pannello di destra) e blu: Hoechst macchiatura per nuclei. Immagini rappresentative (n = 3). Barra della scala = 200 immagina di alto ingrandimento (D) µM della struttura del sarcomero (rosso: cardiaco α-actinina (riga superiore) e troponina cardiaca T (riga inferiore)) e l'espressione della proteina della giunzione di spacco Connexin 43 (verde). Le frecce bianche indicano giunzioni gap formano tra cellule vicine. Immagini rappresentative (n = 3). Barra della scala = 100 µM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: quantificazione funzionale di iCMs. (A) corso di tempo di battere i conteggi delle cellule dopo trasduzione del GHMT2m. Battendo le cellule sono state contate dall'occhio e conteggi delle cellule da 10 campi per ogni piatto oltre 3 piatti ogni esperimento erano una media e incluso nel pannello A. (B e C) registrato transienti di calcio di iCMs. Frequenza transitoria del calcio è alterata in iCMs dopo il trattamento con 1 µM isoproterenolo o 10 µM nifedipina. F340/F380, il rapporto di intensità di fluorescenza a 340 e 380 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Movie 1: battendo iCMs. Filmato che mostra il pestaggio iCMs al giorno 12 in vitro. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
| iCM Media | ||
| Nome del reagente | Volume (mL) | Concentrazione finale |
| DMEM alto glucosio | 320 | |
| Medium 199 | 80 | |
| Siero bovino fetale | 50 | 10% |
| Donatore di siero equino | 25 | 5% |
| Gli aminoacidi essenziali di MEM, 50 x | 10 | 1 x |
| Soluzione di sodio piruvato, x 100 | 5 | 1 x |
| MEM Non essenziali aminoacidi, x 100 | 5 | 1 x |
| Soluzione di vitamine MEM, x 100 | 5 | 1 x |
| Insulina-transferrina-selenio, x 100 | 5 | 1 x |
| B27, 50 x | 10 | 1 x |
| Penicilin-streptomicina | 5.5 | 1,1% |
| Integratore di L-Glutammina | 5.5 | 1,1% |
| PE Media | ||
| Nome del reagente | Volume (mL) | Concentrazione finale |
| DMEM alto glucosio | 450 | |
| Siero bovino fetale | 50 | 10% |
| Penicilin-streptomicina | 5.5 | 1,1% |
| Integratore di L-Glutammina | 5.5 | 1,1% |
| Dyfed-HCl - 10mg/mL | 0,5 | 10 µ g/mL |
| Con puromicina dicloridrato | 0.05 | 1 µ g/mL |
| Crescita Media | ||
| Nome del reagente / attrezzature | Volume (mL) | Concentrazione finale |
| DMEM alto glucosio | 450 | |
| Siero bovino fetale | 50 | 10% |
| Penicilin-streptomicina | 5.5 | 1,1% |
| Integratore di L-Glutammina | 5.5 | 1,1% |
Tabella 1: Cultura Media. Ricette per il terreno di coltura utilizzato in questo protocollo.
| Cellule PE | ||||||
| Piastra di coltura delle cellule | Superficie (cm2) | Densità di semina (celle) | Media Volume (mL) | DNA totale per trasfezione (µ g) | Reagente di transfezione (µ l) | Opti-MEM (µ l) |
| 15 cm | 176,7 | 11,25 x 106 | 20 | 36 | 108 | 1080 |
| 10 cm | 78,5 | 5 x 106 | 10 | 12 | 36 | 360 |
| 60 mm | 28.2 | 1.7 x 106 | 4 | 4 | 12 | 120 |
| 6 piastra ben | 9 | 0.54 x 106 | 2 | 1.3 | 3.9 | 39 |
| piastra di ben 12 | 4 | 0.24 x 106 | 1 | 0.6 | 1.8 | 18 |
| piastra di ben 24 | 2 | 0.12 x 106 | 0,5 | 0.3 | 0.9 | 9 |
| MEFs | ||||||
| Piastra di coltura delle cellule | Superficie (cm2) | Densità di semina (celle) | Media Volume (mL) | Bromuro di Hexadimethrine (µ l) | ||
| 15 cm | 176,7 | 1,35 x 106 | 20 | 12 | ||
| 10 cm | 78,5 | 0,6 x 106 | 10 | 6 | ||
| 60 mm | 28.2 | 0.2 x 106 | 4 | 2.4 | ||
| 6 piastra ben | 9 | 0,1 x 106 | 2 | 1.2 | ||
| piastra di ben 12 | 4 | 0,4 x 105 | 1 | 0.6 | ||
| piastra di ben 24 | 2 | 0.2 x 105 | 0,5 | 0.3 | ||
Tabella 2: densità di semina per la riprogrammazione. Tabella di semina densità per le cellule PE e MEFs per formati comuni di piatto cultura cellulare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il presente studio delinea una strategia ad alto rendimento per riprogrammare direttamente fibroblasti in iCMs funzionale tramite consegna di GHMT2m riprogrammazione fattori combinati con soppressione delle vie di segnalazione pro-fibrotici. Mediante citometria a flusso, imaging immunofluorescenti, calcio imaging e battendo i conteggi delle cellule, mostriamo la maggior parte delle cellule in questo protocollo subiscono successo riprogrammazione e adottare il destino del lignaggio di CM. Precedentemente abbiamo indicato che l'aggiunta di anti-fibrotico composti tra cui il tipo TGF-β I inibitore del recettore A-83-01 produce un aumento di circa 6 volte del numero di pestaggio iCMs rispetto alla trasduzione con GHMT2m da solo, che indica che pro-fibrotici segnalazione è una forte barriera endogena di riprogrammazione cardiaco. Questo sistema può, pertanto, essere imbrigliato per lo screening di droga per studiare i meccanismi che regolano cardiomiogenesi; l'aggiunta di una piccola molecola a fianco A-83-01 potrebbe scoprire regolatori negativi della cardiomiogenesi. Al contrario, l'aggiunta di una piccola molecola di GHMT2m da solo potrebbe delucidare regolatori positivi della cardiomiogenesi. Dipanare i meccanismi attraverso cui questi regolatori positivi e negativi regolano la differenziazione CM si tradurrà in una migliore comprensione della cardiomiogenesi e portare a riprogrammazione ancora più efficiente e protocolli di maturazione.
Molte variabili influenzano l'efficienza riprogramma. Troviamo che la densità di placcatura di cella impatti notevolmente sia la produzione di particelle retrovirali nel caso di cellule PE l'assorbimento efficiente di tutti i fattori di riprogrammazione nel caso MEFs. Inoltre, il numero di passaggio possa influenzare questi parametri pure. Per garantire una produzione ottimale di particelle virali, transfect cellule PE prima passaggio 20. Per garantire l'assorbimento efficiente delle particelle retrovirali, non passaggio MEFs dopo il congelamento.
Parecchi studi recenti hanno anche dimostrato ad alta efficienza riprogrammazione di MEFs da abbattere PRC1 membro Bmi con l'espressione di GMT30 o overexpressing Akt oltre a GHMT37. Aggiunta di ZFN281 a GHMT + Akt ha portato ad un aumento di 4 volte in troponina T cellule positive nei fibroblasti di punta coda adulto, attribuiti in parte alla soppressione del gene infiammatorio firme38. Inoltre, la combinazione di un inibitore di segnalazione di TGF-β e WNT segnalazione inibitore aumentato GMT-mediata cardiaco riprogrammazione39. D'importanza, le vie di segnalazione coinvolte in questi studi non sembrano sovrapporsi. Pertanto, è probabile che cross-talk tra vie multiple di segnalazione potrebbe migliorare ulteriormente la riprogrammazione cardiaco.
Una serie di studi hanno dimostrato che riprogramma in vivo attraverso la consegna di riprogrammazione fattori nei topi dopo sinistra anteriore discendente (LAD) dell'arteria legatura25,32,39,40 ,41. Questi studi hanno mostrato miglioramento modesto nella funzione ventricolare in seguito MI, sottolineando il potenziale terapeutico della riprogrammazione cardiaco sulla rigenerazione del cuore dopo la lesione. Il nostro protocollo riprogramma MEFs con la massima efficienza in vitro fino ad oggi. Di conseguenza, sarà interessante vedere se riprogrammazione ad alta efficienza è in grado di ripristinare completamente la post-lesione cuore funzione in vivo. Questi studi potrebbero servire come base per la traduzione di questo metodo in terapie cellulari romanzo per post-infarto dei pazienti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dai fondi da programma della Fondazione Webb-Waring Boettcher Biomedical Research, American Heart Association scienziato Development Grant (13SDG17400031), Università del Colorado, dipartimento di medicina eccezionale carriera iniziale Programma di studioso, Università del Colorado divisione di cardiologia Barlow Nyle endowment e NIH R01HL133230 (di k. s). ASR è stata sostenuta da NIH/NCATS Colorado CTSA Grant numero TL1TR001081 e una borsa di studio pre-dottorato del Consorzio di Università del Colorado per fibrosi ricerca e traduzione (CFReT). Questa ricerca è stata sostenuta anche dal cancro centro supporto Grant (P30CA046934), la pelle malattie ricerca Core Grant (P30AR057212) e il nucleo di citometria a flusso presso l'Università del Colorado, Anschutz Medical Campus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 Mice | Charles River's Laboratory | 027 | For MEF isolation |
| Platinum E (PE) Cells | Cell Biolabs, INC | RV-101 | For retrovirus production |
| DMEM High Glucose | Gibco | SH30022.FS | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150-059 | Component of iCM media |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100106 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Donor Horse Serum | Gemini | 100508 500 | Component of iCM media |
| MEM Essential Amino Acids, 50X | Life Technologies | 11130051 | Component of iCM media |
| Sodium Pyruvate Solution, 100X | Life Technologies | 11360070 | Component of iCM media and for calcium imaging |
| MEM Non-Essential Amino Acids, 100X | Life Technologies | 11140050 | Component of iCM media |
| MEM Vitamin Solution, 100X | Life Technologies | 11120-052 | Component of iCM media |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 41400045 | Component of iCM media |
| B27 | Gibco | 17504-044 | Component of iCM media |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| GlutaMAX (L-Glutamine Supplement) | Gibco | 35050-061 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Blasticidin-HCl | Life Technologies | A11139-03 | Component of PE media |
| Puromycin dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Component of PE media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | For detaching cells from culture dishes |
| A-83-01 | R&D Systems - Tocris | 2939/10 | Treat cells to inhibit TGF-β signaling - promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM |
| DMSO | Thermo Scientific | 85190 | For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium |
| SureCoat | Cellutron | SC-9035 | For coating dishes to plate MEFs |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection Reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 11058-021 | Transfection Reagent |
| pBabe-X Myc-GATA4 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Hand2 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Mef2c | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Tbx5 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-1 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-133 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X GFP | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268-5G | For viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL |
| Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores) | Nalgene | 569-0020 | For filtering media |
| Syringes | Bd Vacutainer Labware | 309654 | For viral filtration |
| 0.45 µm Filters | Celltreat | 229749 | For viral filtration |
| 70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | For MEF isolation and Flow Cytometry |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry |
| perm/wash buffer | BD | 554723 | For washing cells for flow cytometry |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-250 | For washing cells |
| Bovine Serum Albumin | VWR | 0332-100g | For flow cytometry and calcium imaging |
| Goat Serum | Sigma | G9023 | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Donkey Serum | Sigma | D9663-10mg | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Mouse Troponin T | Thermo Scientific | ms-295-p | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Mouse α-actinin | Sigma | A7811L | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Rabbit Connexin 43 | Sigma | C6219 | 1:400 IF |
| Rabbit Troponin I | PhosphoSolutions | 2010-TNI | 1:400 IF |
| Hoechst | Life Technologies | 62249 | 1:10000 IF |
| Alexa 488, rabbit | Life Technologies | A-11034 | 1:800 IF |
| Alexa 555, mouse | Life Technologies | A-21422 | 1:800 IF |
| Alexa 647, mouse | Life Technologies | A-31571 | 1:200 Flow Cytometry |
| 27-color ZE5 Flow Cytometer | Bio-RAD | For FACS | |
| Paraformaldehyde | sigma | P6148-500mg | For fixing cells for IF |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | For permeabilization of cells for IF |
| EVOS™ FL Color Imaging System | Thermo Scientific | AMEFC4300 | For IF |
| NaCl | RPI | S23020-5000 | For calcium imaging |
| KCl | VWR | 395 | For calcium imaging |
| CaCl2 | Fisher | C614-500 | For calcium imaging |
| MgCl2 | VWR | 97061-352 | For calcium imaging |
| glucose | sigma | G7528-250g | For calcium imaging |
| HEPES | sigma | H4034-500g | For calcium imaging |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F1221 | For calcium imaging |
| Fluronic F-127 | Sigma | P2443-250g | For calcium imaging |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | For disruption calcium transients in iCMs - use at 10 µM |
| Isoproterenol | sigma | I6504-1g | For increasing number of calcium transients in iCMs - use at 1-2 µM |
| Marianas Spinning Disk Confocal microscope | 3i | For calcium imaging | |
| ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| bleach | Clorox | ||
| 50 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 227261 | |
| 15 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 188271 | |
| 15 cm cell culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 10 cm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 60 mm cell culture dishes | GREINER BIO-ONE | 628160 | |
| 6 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| 12 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 665180 | |
| 24 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 662160 |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
- Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D. Cardiac muscle regeneration: lessons from development. Genes & Development. 25 (4), 299-309 (2011).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Nabel, E. G., Braunwald, E. A tale of coronary artery disease and myocardial infarction. N Engl J Med. 366 (1), 54-63 (2012).
- Packer, M., et al. Effect of carvedilol on the morbidity of patients with severe chronic heart failure: results of the carvedilol prospective randomized cumulative survival (COPERNICUS) study. Circulation. 106 (17), 2194-2199 (2002).
- The CAPRICORN Investigators. Effect of carvedilol on outcome after myocardial infarction in patients with left-ventricular dysfunction: the CAPRICORN randomized trial. The Lancet. 357 (9266), 1385-1390 (2001).
- Marangou, J., Paul, V. Current attitudes on cardiac devices in heart failure: a review. Clin Ther. 37 (10), 2206-2214 (2015).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Bio. 14 (8), 529-541 (2013).
- Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomized controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
- Schachinger, V., et al. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1210-1221 (2006).
- Huikuri, H. V., et al. Effects of intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells on left ventricular function, arrhythmia risk profile, and restenosis after thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. Eur. Heart J. 29 (22), 2723-2732 (2008).
- Janssens, S., et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 367 (9505), 113-121 (2006).
- Lunde, K., et al. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1199-1209 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial - a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart J. 152 (3), 434-441 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
- Karantalis, V., et al. Autologous mesenchymal stem cells produce concordant improvements in regional function, tissue perfusion, and fibrotic burden when administered to patients undergoing coronary artery bypass grafting: The Prospective Randomized Study of Mesenchymal Stem Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (PROMETHEUS) trial. Circ Res. 114 (8), 1302-1310 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: A source of cardiac regeneration. J. Mol. Cell. Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
- Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 357-386 (2010).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
- Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100 (1), 105-113 (2013).
- Qian, L., Berry, E. C., Fu, J., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
- Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
- Ifkovitz, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. Inhibition of TGFβ signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes. PLoS One. 9 (2), e89678 (2014).
- Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
- Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8 (5), e63577 (2013).
- Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA induced cardiac reprogramming in vivo: evidence for mature cardiac myocytes and improved cardiac function. Circ Res. 116 (3), 418-424 (2015).
- Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110 (11), 1465-1473 (2012).
- Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), 1216-1220 (2016).
- Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nature Communications. 6, 1-15 (2015).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7, 1063-1066 (2000).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Zhou, H., et al. ZFN281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression. Genes & Dev. 31, 1770-1783 (2017).
- Mohamed, T. M., et al. Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming. Circulation. 135, 978-995 (2017).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
- Mathison, M., et al. In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration. J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).
