Summary
Nous présentons ici une méthode robuste pour reprogrammer les fibroblastes embryonnaires primaires dans les cardiomyocytes fonctionnelles par le biais de la surexpression de GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 et miR-133 (GHMT2m) aux côtés de l’inhibition de la signalisation TGF-β. Notre protocole génère des cardiomyocytes raclée dès transduction après 7 jours avec jusqu'à 60 % efficacité.
Abstract
TRANS-différenciation d’une cellule somatique type en un autre a un potentiel énorme à modéliser et à traiter des maladies humaines. Études antérieures ont montré que la souris embryonnaires, fibroblastes dermiques et cardiaques peuvent être reprogrammés dans fonctionnelles induites cardiomyocyte-cellules (SGIC) par le biais de la surexpression des facteurs cardiogénique transcription GATA4, Hand2, Mef2c, et Tbx5 in vitro et in vivo. Toutefois, ces études antérieures ont montré une efficacité relativement faible. Afin de rétablir la fonction cardiaque après une blessure, mécanismes qui régissent la reprogrammation cardiaque doivent être élucidés afin d’accroître l’efficacité et la maturation du SGCI.
Nous avons démontré précédemment que l’inhibition de la signalisation profibrotiques considérablement augmente l’efficacité de la reprogrammation. Nous détaillons ici, les méthodes pour atteindre une efficacité de reprogrammation de jusqu'à 60 %. En outre, nous décrire plusieurs méthodes dont la cytométrie en flux, imagerie par immunofluorescence et imagerie calcique pour quantifier l’efficacité et la maturation des fibroblastes reprogrammés reprogrammation. En utilisant le protocole détaillé ici, études mécanistes peuvent être menées pour déterminer les régulateurs positifs et négatifs de reprogrammation cardiaque. Ces études peuvent identifier des voies de signalisation qui peuvent être ciblés pour promouvoir la reprogrammation de l’efficacité et de maturation, ce qui pourrait mener à des thérapies nouvelles pour traiter les maladies du cœur humain.
Introduction
Cardiopathie ischémique est des principales causes de décès chez les États-Unis1. Environ 800 000 américains d’expérience un premier ou récurrente infarctus du myocarde (MI) par année1. Suite MI, la mort de cardiomyocytes (CMs) et la fibrose cardiaque, déposés par les fibroblastes cardiaques activés, atteinte cardiaque fonction2,3. Progression de l’insuffisance cardiaque suite MI est largement irréversible en raison de la mauvaise capacité de régénération des adultes CMs4,5. Alors que les traitements cliniques actuels ralentissent la progression de la maladie et diminuent le risque d’événements cardiaques futurs6,7,8,9, aucune thérapie n’inverse de progression de la maladie en raison de l’incapacité de régénérer le CMs après infarctus du myocarde10. Thérapies cellulaires nouvelles font leur apparition pour traiter les patients après mi décevant, essais cliniques offrant des cellules souches au cœur après MI jusqu'à présent ont montré peu concluantes régénératrice potentiels11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.
La génération de cellules souches pluripotentes induites anthropique (hiPSCs) les fibroblastes par la surexpression des quatre facteurs de transcription, d’abord démontrée par Takahashi & Yamanaka, a ouvert la porte à nouvelles percées dans cell therapy19. Ces cellules peuvent se différencier en tous les trois couches de germe19, et plusieurs méthodes très efficaces pour générer un grand nombre de CMs ont démontré antérieurement20,21. Dérivés de HiPSC CMs (hanches-CMs) offre une plate-forme puissante pour étudier cardiomyogénèse et peut avoir des implications importantes pour réparer le coeur après une blessure. Cependant, les hanches-CMs font actuellement face à des haies translationnelles en raison du risque de formation de tératome22, et leur nature immature peut être pro-arythmogène23. Reprogrammation des fibroblastes dans hiPSCs suscité l’intérêt en reprogrammation directement des fibroblastes en un autre type de cellule. IEDA et coll. ont démontré que la surexpression de GATA4, Mef2c et Tbx5 (GMT) dans les résultats de fibroblastes en reprogrammation directe à la lignée cardiaque, mais à faible efficacité24. Reprogrammation de l’efficacité a été améliorée avec l’ajout de Hand2 (GHMT)25. Depuis ces premières études, nombreuses publications ont démontré que des facteurs altérant la reprogrammation cocktail facteur avec transcription supplémentaire26,27,28,29, chromatine modificateurs30,31, microARN32,33ou petites molécules34 mène à une reprogrammation efficacité et/ou de la maturation des cellules semblables à des cardiomyocytes induites (SGIC ).
Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour générer du SGCI de fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) avec une grande efficacité. Nous avons montré précédemment que le GHMT cocktail est nettement améliorée avec l’ajout de miR-1 et miR-133 (GHMT2m) et est ensuite amélioré quand y compris transformant le facteur de croissance (TGF-β) de β signalisation de voies de signalisation pro-fibreuses ou associée à Rho voies de signalisation de protéine kinase (ROCK) sont inhibés35. En utilisant ce protocole, nous montrons qu’environ 60 % des cellules express cardiaque troponine T (cTnT), environ 50 % express α-actinine, et un nombre élevé de cellules de battements peut être observé dès 11 jour après transduction de reprogrammation des facteurs et traitement avec le TGF-β j’ai type inhibiteur du récepteur A-83-01. En outre, ces SGIC expriment des protéines des jonctions lacunaires dont la connexine 43 et pièce contraction spontanée et transitoires de calcium. Cette amélioration de l’efficacité par rapport aux études antérieures de la reprogrammation démontre le potentiel de régénération CMs de populations de cellules endogènes qui restent dans le post infarctus.
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Protocol
Toutes les expériences nécessitant des animaux ont été approuvées par le Comité de l’urbanisme à la Campus médical d’Anschutz UC Denver et d’institutionnels animalier.
1. isolement de MEFs
- Acheter enceintes souris C57BL/6, à E13. Navire du jour au lendemain.
- Euthanasier la mère selon les protocoles IACUC approuvés (ex : ~1.3 L/min CO2 jusqu'à ce que l’animal apparaît mort suivie de dislocation cervicale)
- La mère de pulvérisation avec l’éthanol à 70 % et ouvrir la cavité abdominale. Enlever la corne utérine contenant des embryons et placer dans un plat de 10 cm avec du PBS stérile.
- Faites une incision dans le sac embryonnaire pour libérer l’embryon. Transfert d’embryon pour nettoyer le plat de 10 cm avec du PBS stérile. Rincer à fond.
- Couper le corps sous le foie et jeter la tête et le haut du corps. Enlever les organes internes et jeter. Le tissu reste dans un plat propre 10 cm avec du PBS stérile et du transfert de la plaque à un niveau de biosécurité 1 ou 2 du Cabinet. Combiner les tissus de tous les embryons dans un récipient propre et sec de 10 cm et émincer en fins morceaux.
- Ajouter 6 mL de 0,25 % trypsine/1 mM EDTA aux embryons hachées. Triturer plusieurs fois pour briser le tissu à l’aide d’une pipette. Incuber pendant 40 min à 37 ° c avec 5 % de CO2.
- Remettre en suspension les cellules dans un milieu de croissance (tableau 1). Le volume des médias est ajusté selon le nombre d’embryons récoltés. En général, utiliser un ratio d’environ les milieux de croissance 25 mL pour 1,2 embryons.
- Plaque de 25 mL de cellules resuspendues dans un plat de 15 cm. Après 24h, aspirer les médias et ajouter 25 mL de milieu de croissance fraîche à chaque assiette.
- Après 72 h, ajouter 2 mL de 0,25 % trypsine/1 mM EDTA à chaque plat de 15 cm. Lorsque les cellules se détachement de la boîte de Petri, inactiver la trypsine avec 15 mL de milieu de croissance et de prélever des cellules dans les tubes coniques en polystyrène de 50 mL. Centrifuger les cellules pendant 3 min à 160 x g à la température ambiante. Resuspendre le culot cellulaire dans le milieu de croissance et filtre à travers un tamis de cellule pore 70 µm.
- Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et congeler les MEFs en aliquotes de 2 millions de cellules dans un milieu de gel (10 % DMSO, 25 % FBS dans de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) / High glucose) à-80 ° C. Cellules de transfert d’azote liquide après 24h et magasin jusqu'à utilisation.
Remarque : L’expression des gènes Global en MEFs a été profilée isolé à l’aide de ce protocole par RNA-sequencing (RNA-seq) afin d’assurer l’authentification de la cellule. RNA-seq données de cellules Encoder MEF ont été téléchargées de NIH Gene Expression Omnibus (GEO) avec le numéro d’ordre GSE93454. Données d’expression génique de RNA-seq pour les MEFs nous utilisés ont été déposées au NIH GEO avec numéro d’ordre GSE71405. Ces deux ensembles de données ont été regroupés selon les symboles courants de gène. Les données d’expression ont été ensuite logarithme et un diagramme de dispersion des données expression pour notre MEFs et ENCODE MEFs ont été générés et dotée d’une ligne de régression linéaire (Figure 1 a). MEFs isolées à l’aide de ce protocole sont moléculairement semblables à ceux qui sont isolés par d’autres laboratoires.
2. production de rétrovirus et Transduction de MEFs
Remarque : Toutes les étapes de cette section doivent être effectuées dans une armoire de 2 de niveau de biosécurité. Étant donné que ce protocole utilise transduction rétrovirale, veiller à ce que des précautions sont prises, y compris le traitement de que tous les déchets contenant des médias virales avec eau de Javel 10 % pendant au moins 20 min. Voir la Figure 1 b pour qu’une chronologie pour la reprogrammation de la sécurité.
-
Production de rétrovirus à l’aide de la lignée cellulaire de platine E (PE)
- Maintenir les cellules disponibles dans le commerce de PE PE moyen (tableau 1) contenant blasticidine et puromycine sélection des marqueurs afin d’assurer l’expression de gag-pol et env gènes pour la production de particules rétrovirales efficace36 . Cellules de passage au 1:4 ou 1:5 tous les deux jours. Prendre soin d’éviter le surpeuplement des cellules, car cela pourrait réduire les rendements de production rétrovirale.
- Le jour -1, graines environ 5 x 106 cellules / plat de 10 cm dans le milieu de croissance (tableau 1), 16-20 h avant la transfection (voir le tableau 2 pour les densités pour les autres tailles de plat de culture cellulaire standard de placage). Balançant doucement des plats en arrière à plusieurs reprises et placez-la dans un 37 ° C, 5 % CO2 incubateur afin d’assurer la répartition égale de placage (voir Figure 1 pour densité placage optimal avant la transfection).
Remarque : prendre soin de cellules PE plaque dans le milieu libre de marqueurs de sélection avant la transfection d’assurer un milieu contenant des particules rétrovirales générés ne tue pas les MEFs. - Le jour 0, préparer l’ADN pour la transfection. Pour la transfection de plat de 10 cm, ajouter 2 µg de chaque facteur reprogrammation — GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 et miR-133 (GHMT2m) — dans un tube de 1,5 mL.
Remarque : Reportez-vous au tableau 2 , à l’échelle de la quantité d’ADN nécessaire à transfecter autres tailles de plat de culture cellulaire standard. - Dans un tube séparé de 1,5 mL, ajouter 360 µL sérum réduit médias. Puis ajouter 36 µL de réactif de transfection directement aux médias de sérum réduit. Doucement effleurer le tube et laisser incuber à température ambiante pendant 5 min.
Remarque : Pour éviter l’efficacité réduite de transfection, ajouter avec précaution réactif de transfection directement sur le support de sérum réduit. - Ajouter sérum réduit médias/transfection réactif mélange d’ADN de GHMT2m cocktail. Doucement, mettez le tube et incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Ne pas vortexer.
- Le mélange réactionnel, ajouter quelques gouttes de cellules PE, doucement agiter les médias pour 10-15 s et placer dans un 37 ° C, 5 % CO2 incubateur.
Remarque : Selon le fabricant, les cellules PE génèrent un titre moyen de 106 107 infectieuses unités/ml. Ce protocole génère environ 2 x 106 infections unités/mL par 24h et 6 x 106 infections unités/mL de 48 h pour MOI de 4 en moyenne. Transfection de GFP/DsRed peut aussi servir comme un substitut pour l’efficacité de transfection/transduction si vous le souhaitez ; efficacité de transfection devrait dépasser 90 % en 48 h (Figure 1).
-
Transduction de MEFs
- Le jour 0, enduire les plats avec le collagène et les place dans un 37 ° C, 5 % CO2 incubateur pendant au moins 2 h.
- Retirez les MEFs de dégel et de l’azote liquide. Plaque de 0,2 x 106 cellules / plat de 60 mm dans le milieu de croissance. Doucement plaques de roche pour assurer même distribution de placage et placer dans un incubateur (voir Figure 1 pour la densité optimale de placage et le tableau 2 pour placage densités pour les autres tailles de plat de culture cellulaire standard).
Remarque : Ces densités d’ensemencement ont été testées sur plusieurs lots de MEFs isolés ; à moins que l’affichage MEFs compromise sensiblement la viabilité, réglage des cellules des densités de semis n’est pas nécessaire. - Le jour 1, transfection après 24 h, utiliser une seringue de 30 mL pour recueillir les rétroviraux moyen généré par les cellules de PE. Passez le milieu à travers un filtre à pores de 0,45 µm dans un tube conique de 50 mL. Ajoute une concentration finale de 6 µg/mL de réactif de transfection de bromure de hexadimethrine. Ajouter avec précaution 10 mL de milieu de croissance fraîche aux cellules de PE par pipetage géloses sur la paroi de la boîte de Pétri pour empêcher le déplacement des cellules.
- Aspirer le milieu de MEFs et ajouter 4 mL de milieu retroviral fraîchement récolté à chaque plat. Remettez les MEFs dans l’incubateur. Ajouter 10 % eau de Javel à tous les matériaux en contact avec le fluide viral pour neutraliser des particules rétrovirales.
- Le jour 2, transfection après 48 h, répétez les étapes 2.2.2 et 2.2.3. Cellules de PE sont éliminés suite à la collection de 2nd du milieu rétrovirale.
NOTE : Ajouter 10 % eau de Javel aux cellules de PE au rebut pendant au moins 20 min neutraliser les rétrovirus indésirables. - Le jour 3, aspirer moyen de MEFs et reconstituer avec 4 mL de milieu d’iCM (tableau 1) contenant 0,5 µM A-83-01, un TGF-β j’ai type inhibiteur du récepteur. Reconstituer l’iCM milieu contenant A-83-01 tous les 2 jours.
NOTE : Si vous utilisez GFP comme un contrôle de transduction, l’expression devrait dépasser 90 % de ce point dans le temps (Figure 1).
3. cytométrie de flux pour les marqueurs cardiaques
- Moyen d’aspiration du jour 9 reprogrammé MEFs et lavage (1 x) avec du PBS 1 x pour enlever les débris et les cellules mortes.
- Ajouter 1 mL de 0,25 % trypsine/EDTA pendant 5 min à 37 ° c. Vérifier les cellules à l’aide d’un microscope optique et secouez le plat ; Si les cellules restent attachées, incuber 5 min de plus à 37 ° c jusqu'à ce que les cellules se détachement.
- Laver les cellules dans du PBS 1 x contenant 5 % FBS et filtre à travers un tamis de cellule pore 70 µm.
- Centrifuger à 160 g pendant 3 min à température ambiante et aspiration liquide de la pastille.
Remarque : Pour augmenter le rendement de la cellule, laisse reposer environ 50 µL liquide au-dessus le culot cellulaire. - Laver les cellules avec 500 µL 1 x PBS contenant 1 % de BSA.
- Difficulté de 0,2 mL/1 millions de cellules solution de fixation pendant 20 min sur la glace.
- Ajouter 1 mL de tampon de glacee perm/lavage 1 x.
Remarque : La solution du fabricant est 10 x. - Centrifuger à 160 x g pendant 5 min à 4 ° C, les cellules et aspirer le surnageant.
- Répétez les étapes 3.7 et 3.8 un délai supplémentaire. Après le lavage 2nd , passez directement à l’étape suivante ou garder les cellules à 4 ° C durant la nuit.
- Bloc avec 100 µL de sérum d’âne dans 1 x tampon de perm/lavage pendant 30 min à température ambiante et de 5 % de sérum de chèvre.
- Ajouter 100 µL d’anticorps primaire dilué.
Remarque : Pour ce protocole, les cellules sont marquées avec souris troponine T (1 : 200) et souris α-actinine (1 : 200) afin de quantifier le pourcentage de cellules positives pour les composants clés de la sarcomères cardiaque. Incuber les anticorps primaire pendant 1 h à température ambiante. - Centrifuger à 160 x g pendant 5 m à 4 ° C, les cellules, aspirer le surnageant et laver 2 x avec tampon glacee perm/cycle de lavage.
- Ajouter 100 µL d’anticorps secondaire dilué.
Remarque : Pour ce protocole, les cellules sont marquées avec de 647 nm secondaires anticorps anti-souris (1 : 200). Incuber les anticorps secondaire pendant 45 min à température ambiante sur une coiffe de tube plus fin. Protéger les cellules de lumière en encapsulant des tubes en aluminium. - Centrifuger à 160 x g pendant 5 min à 4 ° C, les cellules, aspirer le surnageant et laver 2 x avec tampon glacee perm/cycle de lavage.
- Ajouter 1 mL de 1 % de BSA dans du PBS et effectuer immédiatement des FACS.
NOTE : Générer un diagramme de dispersion avant dispersion vs côté à la porte des cellules viables tout d’abord lors de l’exécution des FACS. Alternativement, utiliser une tache disponibles dans le commerce en direct/dead cell avant de fixer les cellules pour identifier direct et mort cellulaire des populations.
4. Immunostaining des MEFs reprogrammés
- Moyen d’aspiration du 14e reprogrammé MEFs et lavage (1 x) avec 1 mL 1 x PBS glacée.
Remarque : Pour immunostaining, reprogrammation a été effectuée en 12 assiettes bien pour minimiser les volumes de solution d’anticorps. 24 plats peuvent également être utilisés ; simplement la moitié de tous les volumes de suite. - Aspirer et fixer les cellules avec 500 µL 2 de paraformaldéhyde % pendant 10 min à température ambiante.
- Aspirer et laver les cellules 3 fois avec du PBS de 1 x 1 mL (5 min par lavage à température ambiante).
- Permeabilize cellules avec 500 µL 0,2 % perméabilisation de réactif en PBS pendant 15 min à température ambiante.
- Aspirer et bloquer dans 500 µL 10 % de sérum de cheval dans du PBS pendant 30 min à température ambiante.
- Aspirer et incuber avec 500 µL de l’anticorps primaire dilué pendant 1 h à température ambiante.
Remarque : Pour ce protocole, les cellules ont été marqués avec souris troponine T ou α-actinine (chaque 1 : 400) et co marquées avec la connexine 43 (1 : 400) ou de la troponine I (1 : 400). - Aspirer l’anticorps primaire et laver trois fois avec du PBS de 1 x 1 mL (5 min par lavage à température ambiante).
- Aspirer et incuber avec anticorps secondaire dilué de 500 µL pendant 1 heure à température ambiante.
Remarque : Pour ce protocole, les cellules sont marquées avec l’anti-souris 555 nm anticorps secondaire (1:800) de reconnaître la troponine T ou α-actinine et anti-lapin 488 nm anticorps secondaire (1:800) de reconnaître la connexine 43 ou troponine I. en outre, les noyaux ont été colorés avec Hoechst (01:10, 000). Protéger les cellules de lumière en incubant dans l’obscurité. - Aspirer l’anticorps secondaire et laver trois fois avec du PBS de 1 x 1 mL (5 min par lavage à température ambiante). Enrouler la plaque en aluminium pour protéger les cellules contre la lumière et conserver à 4 ° C.
- Image à l’aide de la microscopie à épifluorescence trois canaux.
5. imagerie calcique
Remarque : Si l’image à un grossissement de 10 X, assiettes et plats de culture cellulaire standard conviennent à imagerie calcique. Imagerie à un grossissement supérieur requiert que les cellules être plaqué sur couvre-objet en verre ou verre fond plats.
- Aspirez le milieu et ajouter 2 mL (pour un 6 bien de plaque) modifié solution Tyrode (140 mM NaCl, KCl, 1,8 mM CaCl2, 5 mM 1 mM MgCl2, de 10 mM de glucose, de 10 mM HEPES, BSA de 0,1 % et 1 % de pyruvate, pH 7,4) contenant 5 µM Fura-2 AM et 0,1 % Pluronique F-127 à battre (D14 t SGCI o D20). Incuber pendant 30 minutes à 37 ° C.
NOTE : Protéger les cellules de lumière afin d’éviter la désactivation de l’indicateur fluorescent. - Laver les cellules dans une solution de 2 mL Tyrode pendant 30 min à température ambiante pour permettre dé-estérification du Fura-2 AM.
- Image avec filature microscopie confocale disque à 340 nm et 380 nm à l’aide de Slidebook 5.5 Ca2 + logiciel d’imagerie. Effectuer l’imagerie à la température ambiante.
- Transitoires de calcium sont calculés en utilisant le ratio d’intensité de fluorescence à 340 nm sur l’intensité de fluorescence à 380 nm.
- Si vous le souhaitez, traiter du SGCI avec 1 ou 2 µM isoprotérénol ou 10 µM nifédipine pour manipuler le calcium manipulation après imagerie transitoires de calcium de référence. Ajouter localement composés de cellules et de l’image.
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Representative Results
À l’aide de la stratégie de reprogrammation décrite ci-dessus et dans la Figure 1 b, nous avons généré SGIC avec environ 70 % des cellules exprimant cardiaque troponine T et environ 55 % de cellules exprimant cardiaque α-actinine, quantifiée par cytométrie de flux à jour 9 suite à la transduction du GHMT2m (Figure 2 a et B). En outre, la majorité des cellules expriment cardiaque troponine T, troponine I et α-actinine cardiaque ainsi que le marqueur de jonction gap Connexin 43 à J14 après transduction (Figure 2 et D). Imagerie, avec un grossissement supérieur révèle la formation des structures bien définies sarcomère et jonctions entre les cellules voisines (pointes de flèches blanches, Figure 2D). En outre, contraction spontanée et transitoires de calcium indiquent des fonctionnalités du SGCI (Figure 3 a-C et 1 film).
Figure 1 : chronologie de la reprogrammation et le placage Optimal des cellules. (A) diagramme de dispersion des données log-transformées de RNA-seq pour MEFs générées dans notre laboratoire versus ENCODE MEFs. La valeur2 R et la droite de régression linéaire sont représentés. (B) représentation schématique du tout critique intervient la médiation GHMT2m reprogrammation de MEFs. (C) les cellules de PE à 70-80 % confluence avant la transfection (rangée du haut, panneau latéral gauche) et GFP signal 48 heures après la transfection pour indiquer l’efficacité de transfection (rangée du haut, panneaux de milieu et de droite). MEFs graines peu avant l’infection afin d’éviter la surpopulation sur la période de reprogrammation (rangée du bas, panneau latéral gauche) et GFP signal 48 heures après l’infection pour indiquer l’efficacité de l’infection (rangée du bas, panneaux de milieu et de droite). Echelle = 400 µM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Quantification et caractérisation d’Expression de protéine cardiaque dans le SGCI. (A et B). Cytométrie en flux représentatif pour cardiaques troponine T (A) et α-actinine (B) à 9 jours après GHMT2m transduction, n = 3. (C) ICC coloration pour marqueurs cardiaques à J14 après GHMT2m transduction. Vert : troponine cardiaque I, rouge : cardiaques troponine T (panneau central) et α-actinine (panneau de droite) et bleu : Hoechst coloration des noyaux. Images représentatives (n = 3). Echelle = 200 µM (D) fort grossissement s’imagine de la structure du sarcomère (rouge : α-actinine cardiaque (rangée du haut) et cardiaques troponine T (rangée du bas)) et l’expression des protéines de jonction gap Connexin 43 (vert). Les flèches blanches indiquent forment de jonctions entre les cellules voisines. Images représentatives (n = 3). Echelle = 100 µM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Quantification fonctionnelle du SGCI. (A) évolution temporelle de battre numération cellulaire, transduction de GHMT2m la suite. Battre les cellules ont été dénombrées par les yeux et les numérations de 10 champs par plat 3 plats par expérience ont été en moyenne et inclus dans le groupe d’experts A. (B et C) enregistré transitoires de calcium du SGCI. Fréquence transitoire de calcium est altérée dans le SGCI après traitement avec 1 µM isoprotérénol ou 10 µM nifédipine. F340/F380, le ratio d’intensité de fluorescence à 340 et 380 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Movie 1 : battre le SGIC. Film montrant iCMs raclée au jour 12 in vitro. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
| iCM Media | ||
| Nom du réactif | Volume (mL) | Concentration finale |
| Taux de glycémie élevé DMEM | 320 | |
| Milieu 199 | 80 | |
| Sérum de veau fœtal | 50 | 10 % |
| Sérum de cheval de donateurs | 25 | 5 % |
| MEM les acides aminés essentiels, x 50 | 10 | 1 x |
| Solution de Pyruvate de sodium, x 100 | 5 | 1 x |
| MEM des acides aminés Non essentiels, x 100 | 5 | 1 x |
| Solution de vitamines MEM, x 100 | 5 | 1 x |
| Insuline-transferrine-sélénium, 100 x | 5 | 1 x |
| B27, x 50 | 10 | 1 x |
| Penicilin-streptomycine | 5.5 | 1,1 % |
| Supplément de L-Glutamine | 5.5 | 1,1 % |
| Médias de PE | ||
| Nom du réactif | Volume (mL) | Concentration finale |
| Taux de glycémie élevé DMEM | 450 | |
| Sérum de veau fœtal | 50 | 10 % |
| Penicilin-streptomycine | 5.5 | 1,1 % |
| Supplément de L-Glutamine | 5.5 | 1,1 % |
| Blasticidine-HCl - 10mg/mL | 0,5 | 10 µg/mL |
| Dichlorhydrate de puromycine | 0.05 | 1 µg/mL |
| Milieux de culture | ||
| Nom du réactif / équipement | Volume (mL) | Concentration finale |
| Taux de glycémie élevé DMEM | 450 | |
| Sérum de veau fœtal | 50 | 10 % |
| Penicilin-streptomycine | 5.5 | 1,1 % |
| Supplément de L-Glutamine | 5.5 | 1,1 % |
Tableau 1 : Milieux de Culture. Recettes pour le milieu de culture utilisé dans le présent protocole.
| Cellules de PE | ||||||
| Boîte de Petri de cellule | Superficie (cm2) | Densité de semis (cellules) | Médias Volume (mL) | ADN total par transfection (µg) | Réactif de transfection (µL) | Opti-MEM (µL) |
| 15 cm | 176,7 | 11,25 x 106 | 20 | 36 | 108 | 1080 |
| 10 cm | 78,5 | 5 x 106 | 10 | 12 | 36 | 360 |
| 60 mm | 28.2 | 1,7 x 106 | 4 | 4 | 12 | 120 |
| 6 plaque de puits | 9 | 0,54 x 106 | 2 | 1.3 | 3.9 | 39 |
| 12 plaque de puits | 4 | 0,24 x 106 | 1 | 0,6 | 1.8 | 18 |
| 24 bien sur plaque | 2 | 0,12 x 106 | 0,5 | 0,3 | 0,9 | 9 |
| MEFs | ||||||
| Boîte de Petri de cellule | Superficie (cm2) | Densité de semis (cellules) | Médias Volume (mL) | Bromure de HEXADIMETHRINE (µL) | ||
| 15 cm | 176,7 | 1,35 x 106 | 20 | 12 | ||
| 10 cm | 78,5 | 0,6 x 106 | 10 | 6 | ||
| 60 mm | 28.2 | 0,2 x 106 | 4 | 2.4 | ||
| 6 plaque de puits | 9 | 0,1 x 106 | 2 | 1.2 | ||
| 12 plaque de puits | 4 | 0,4 x 105 | 1 | 0,6 | ||
| 24 bien sur plaque | 2 | 0,2 x 105 | 0,5 | 0,3 | ||
Tableau 2 : ensemencement des densités pour la reprogrammation. Tableau des semis, densité de cellules PE et MEFs pour les formats courants cell culture plat.
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Discussion
La présente étude décrit une stratégie hautement efficace pour reprogrammer directement des fibroblastes dans le SGCI fonctionnel via la livraison de GHMT2m reprogrammation facteurs combinés avec la suppression des voies de signalisation pro-fibreuses. À l’aide de la cytométrie en flux, imagerie par immunofluorescence, calcium d’imagerie et battant les globules, nous montrons la majorité des cellules dans le présent protocole subissent une reprogrammation réussie et adopter sort de lignée CM. Nous avons déjà montré que l’ajout de l’anti-fibrosants en composés y compris le type de TGF-β I inhibiteur du récepteur une augmentation d’environ 6 fois le nombre de battements du SGCI comparativement à transduction avec GHMT2m seul, ce qui indique que les rendements A-83-01 profibrotiques de signalisation est une forte barrière endogène à reprogrammation cardiaque. Ce système peut, par conséquent, être exploité pour le dépistage de drogues afin d’étudier les mécanismes qui régissent les cardiomyogénèse ; l’ajout d’une petite molécule aux côtés de l’A-83-01 pourrait dévoiler des régulateurs négatifs de cardiomyogénèse. À l’inverse, l’ajout d’une petite molécule de GHMT2m seul pourrait permettre d’élucider les régulateurs positifs de cardiomyogénèse. Éclaircir les mécanismes par lesquels ces régulateurs positifs et négatifs régissent la différenciation CM provoquera une meilleure compréhension des cardiomyogénèse et conduire à des protocoles de maturation et de reprogrammation encore plus efficace.
De nombreuses variables affectent efficacité de reprogrammation. Nous trouvons que la densité cellulaire placage impacts considérablement tant la production de particules rétrovirales dans le cas de cellules de PE et l’absorption efficace de tous les facteurs de reprogrammation dans le cas de MEFs. En outre, le nombre de passage peut affecter ces paramètres ainsi. Afin d’assurer une production optimale des particules virales, transfecter cellules PE avant passage 20. Pour assurer une absorption efficace des particules rétrovirales, ne pas le passage des MEFs après congélation.
Plusieurs études récentes ont également démontré la haute efficacité reprogrammation de MEFs en abattant PRC1 membres IMC ainsi que de l’expression de GMT30 ou en surexprimant Akt outre GHMT37. Ajout de ZFN281 à GHMT + Akt a entraîné une augmentation de 4 fois dans la troponine T des cellules positives dans les fibroblastes de pointe queue adulte, explique en partie par la suppression de gènes inflammatoires signatures38. En outre, la combinaison d’un inhibiteur de signalisation TGF-β et WNT signaling inhibiteur augmenté cardiaque induite par le GMT reprogrammation39. Ce qui est important, les voies de signalisation impliquées dans ces études ne semblent pas se chevaucher. Par conséquent, il est probable que la diaphonie entre les multiples voies de signalisation pourrait renforcer encore la reprogrammation cardiaque.
Un certain nombre d’études ont démontré reprogrammation in vivo par le biais de la reprogrammation des facteurs chez des souris gauche antérieure descendante (LAD) artère ligature25,32,39,40 ,,41. Ces études n’ont montré une amélioration modeste dans la fonction ventriculaire après MI, soulignant le potentiel thérapeutique de reprogrammation cardiaque sur la régénération cardiaque après une blessure. Notre protocole reprogramme MEFs avec la plus haute efficacité in vitro à ce jour. Par conséquent, il sera intéressant de voir si la reprogrammation de haute efficacité est capable de rétablir pleinement post-traumatique de la fonction cardiaque in vivo. Ces études pourraient servir de base pour traduire cette méthode en thérapies nouvelles pour infarctus du myocarde après des patients.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par des fonds de programme de la Fondation Webb-Waring Boettcher Biomedical Research, American Heart Association scientifique Development Grant (13SDG17400031), Université du Colorado et la médecine remarquable début de carrière Scholar Program, University of Colorado Division de cardiologie Nyle de Barlow endowment et R01HL133230 NIH (à kaki). A.S.R était soutenue par les NIH/NCATS Colorado CSTC Grant nombre TL1TR001081 et une bourse pré-doctorale auprès du Consortium de l’Université du Colorado pour la recherche sur la fibrose & traduction (CFReT). Cette recherche a été également pris en charge par la subvention de soutien Cancer Center (P30CA046934), la subvention du noyaux de la recherche des maladies peau (P30AR057212) et le Flow Cytometry Core à l’Université du Colorado Campus médical d’Anschutz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 Mice | Charles River's Laboratory | 027 | For MEF isolation |
| Platinum E (PE) Cells | Cell Biolabs, INC | RV-101 | For retrovirus production |
| DMEM High Glucose | Gibco | SH30022.FS | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150-059 | Component of iCM media |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100106 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Donor Horse Serum | Gemini | 100508 500 | Component of iCM media |
| MEM Essential Amino Acids, 50X | Life Technologies | 11130051 | Component of iCM media |
| Sodium Pyruvate Solution, 100X | Life Technologies | 11360070 | Component of iCM media and for calcium imaging |
| MEM Non-Essential Amino Acids, 100X | Life Technologies | 11140050 | Component of iCM media |
| MEM Vitamin Solution, 100X | Life Technologies | 11120-052 | Component of iCM media |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 41400045 | Component of iCM media |
| B27 | Gibco | 17504-044 | Component of iCM media |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| GlutaMAX (L-Glutamine Supplement) | Gibco | 35050-061 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Blasticidin-HCl | Life Technologies | A11139-03 | Component of PE media |
| Puromycin dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Component of PE media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | For detaching cells from culture dishes |
| A-83-01 | R&D Systems - Tocris | 2939/10 | Treat cells to inhibit TGF-β signaling - promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM |
| DMSO | Thermo Scientific | 85190 | For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium |
| SureCoat | Cellutron | SC-9035 | For coating dishes to plate MEFs |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection Reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 11058-021 | Transfection Reagent |
| pBabe-X Myc-GATA4 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Hand2 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Mef2c | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Tbx5 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-1 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-133 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X GFP | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268-5G | For viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL |
| Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores) | Nalgene | 569-0020 | For filtering media |
| Syringes | Bd Vacutainer Labware | 309654 | For viral filtration |
| 0.45 µm Filters | Celltreat | 229749 | For viral filtration |
| 70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | For MEF isolation and Flow Cytometry |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry |
| perm/wash buffer | BD | 554723 | For washing cells for flow cytometry |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-250 | For washing cells |
| Bovine Serum Albumin | VWR | 0332-100g | For flow cytometry and calcium imaging |
| Goat Serum | Sigma | G9023 | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Donkey Serum | Sigma | D9663-10mg | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Mouse Troponin T | Thermo Scientific | ms-295-p | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Mouse α-actinin | Sigma | A7811L | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Rabbit Connexin 43 | Sigma | C6219 | 1:400 IF |
| Rabbit Troponin I | PhosphoSolutions | 2010-TNI | 1:400 IF |
| Hoechst | Life Technologies | 62249 | 1:10000 IF |
| Alexa 488, rabbit | Life Technologies | A-11034 | 1:800 IF |
| Alexa 555, mouse | Life Technologies | A-21422 | 1:800 IF |
| Alexa 647, mouse | Life Technologies | A-31571 | 1:200 Flow Cytometry |
| 27-color ZE5 Flow Cytometer | Bio-RAD | For FACS | |
| Paraformaldehyde | sigma | P6148-500mg | For fixing cells for IF |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | For permeabilization of cells for IF |
| EVOS™ FL Color Imaging System | Thermo Scientific | AMEFC4300 | For IF |
| NaCl | RPI | S23020-5000 | For calcium imaging |
| KCl | VWR | 395 | For calcium imaging |
| CaCl2 | Fisher | C614-500 | For calcium imaging |
| MgCl2 | VWR | 97061-352 | For calcium imaging |
| glucose | sigma | G7528-250g | For calcium imaging |
| HEPES | sigma | H4034-500g | For calcium imaging |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F1221 | For calcium imaging |
| Fluronic F-127 | Sigma | P2443-250g | For calcium imaging |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | For disruption calcium transients in iCMs - use at 10 µM |
| Isoproterenol | sigma | I6504-1g | For increasing number of calcium transients in iCMs - use at 1-2 µM |
| Marianas Spinning Disk Confocal microscope | 3i | For calcium imaging | |
| ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| bleach | Clorox | ||
| 50 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 227261 | |
| 15 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 188271 | |
| 15 cm cell culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 10 cm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 60 mm cell culture dishes | GREINER BIO-ONE | 628160 | |
| 6 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| 12 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 665180 | |
| 24 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 662160 |
References
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