Summary
Aquí presentamos un método robusto para reprogramar fibroblastos embrionarios primarios en cardiomiocitos funcionales a través de la sobreexpresión de GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 y miR-133 (GHMT2m) junto con la inhibición de la señalización de TGF-β. Nuestro protocolo genera cardiomiocitos paliza tan pronto como transducción después de 7 días con hasta un 60% eficiencia.
Abstract
Trans-diferenciación del tipo de una célula somática en otro tiene un enorme potencial para modelar y tratar enfermedades humanas. Estudios anteriores han demostrado que ratón embrionario, fibroblastos cutáneos y cardíacos pueden ser reprogramados en células similares de cardiomiocitos inducida funcionales (iCMs) a través de la sobreexpresión de factores de transcripción cardiogénico como GATA4, Hand2, Mef2c, y TBX5 in vitro e in vivo. Sin embargo, estos estudios previos han demostrado la eficacia relativamente baja. Para restablecer la función del corazón después de lesiones, mecanismos que regulan la reprogramación cardiaca deben ser aclados para aumentar la eficiencia y la maduración del iCMs.
Previamente demostramos que la inhibición de la señalización pro-fibróticos dramáticamente aumenta la eficiencia de reprogramación. Aquí, se detallan métodos para alcanzar una eficiencia de reprogramación de hasta un 60%. Además, se describen varios métodos incluyendo la citometría de flujo, imagen inmunofluorescente y proyección de imagen de calcio para cuantificar la eficiencia de reprogramación y la maduración de reprogramado fibroblastos. Utilizando el protocolo detallado aquí, pueden realizarse estudios mecanísticos para determinar los reguladores positivos y negativos de reprogramación cardiaca. Estos estudios pueden identificar vías de señalización que pueden ser dirigidas para promover la eficiencia de reprogramación y la maduración, que podría conducir a terapias celulares nuevos para el tratamiento de enfermedades del corazón humano.
Introduction
Cardiopatía isquémica es la principal causa de muerte en los Estados Unidos1. Aproximadamente 800.000 estadounidenses experimentan un primera o recurrente infarto de miocardio (IM) por año1. Después de MI, la muerte de los cardiomiocitos (CMs) y la fibrosis cardiaca, depositado por los fibroblastos cardiacos activados, afectar corazón función2,3. Progresión de la insuficiencia cardíaca después de MI es en gran medida irreversible debido a la pobre capacidad de regeneración de adultos CMs4,5. Mientras que los tratamientos clínicos actuales lenta progresión de la enfermedad y disminuyen el riesgo de eventos cardíacos futuros6,7,8,9, no hay terapias revertir la progresión de la enfermedad debido a la incapacidad de regenerar el CMs postinfarto10. Terapias celulares nuevos están emergiendo para tratar pacientes con mi desgracia, entrega de células madre al corazón después de MI hasta ahora los ensayos clínicos han demostrado concluyente regenerativo potencial11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.
La generación de células pluripotentes inducidas derivadas de humanos (hiPSCs) de fibroblastos por la sobreexpresión de cuatro factores de transcripción, demostrada por primera vez por Takahashi & Yamanaka, abrió la puerta a nuevos avances en la terapia de la célula19. Estas células pueden distinguir en tres capas germinales todos19y varios métodos eficientes para la generación de grandes cantidades de CMs han demostrado previamente20,21. Derivados de HiPSC CMs (CMs-cadera) ofrece una poderosa plataforma para estudiar cardiomyogenesis y puede tener implicaciones importantes para reparar el corazón después de lesión. Sin embargo, CMs de caderas enfrentan actualmente aplicadas vallas debido a las preocupaciones de teratoma formación22, y su naturaleza inmadura puede ser pro-arritmogénico23. Reprogramación de fibroblastos en hiPSCs despertó interés en directamente reprogramar fibroblastos en otros tipos celulares. Ieda et al demostraron que la sobreexpresión de Mef2c y GATA4 y Tbx5 (GMT) en los resultados de fibroblastos en reprogramación directa al linaje cardíaco, aunque a bajo rendimiento24. Eficiencia de reprogramación fue mejorada con la adición de Hand2 (GHMT)25. Desde estos primeros estudios, numerosas publicaciones han demostrado que alterando el reprogramación factor cóctel con transcripción adicional factores26,27,28,29, modificadores de la cromatina30,31, microRNAs32,33o34 conduce a mejorar las moléculas pequeñas reprogramación eficiencia y maduración de células cardiomiocito inducidas (iCMs ).
Aquí proporcionamos un protocolo detallado para generar iCMs de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) con alta eficiencia. Demostramos previamente que la GHMT cóctel se mejoró significativamente con la adición de los miR 1 y miR-133 (GHMT2m) y es mejorado cuando pro-fibróticos como transformación de factor de crecimiento β (TGF-β) señalización de rutas de señalización o Rho-associated vías de señalización de la proteína quinasa (ROCK) son inhibidos35. Mediante este protocolo, nos muestran que aproximadamente el 60% de las células express troponina T cardiaca (cTnT), aproximadamente el 50% expresan α-actinina, y un alto número de células de golpeo puede observarse tan pronto como el día 11 después de transducción de reprogramación factores y tratamiento con el TGF-β del tipo I inhibidor del receptor de A-83-01. Además, estos iCMs expresar proteínas de ensambladura de gap incluyendo connexin 43 y exhiben oscilaciones de calcio y la contracción espontánea. Esta marcada mejora en la eficiencia en comparación con estudios anteriores de reprogramación demuestra el potencial para regenerar CMs de poblaciones celulares endógenos que permanecen en el postinfarto de corazón.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los experimentos que requieren animales fueron aprobados por el cuidado institucional de animales y uso en la UC Denver Anschutz Medical Campus.
1. aislamiento de MEFs
- Comprar ratones C57BL/6 embarazadas E13. Nave durante la noche.
- Eutanasia a la madre según protocolos aprobados de IACUC (ex: ~1.3 CO L/min2 hasta que el animal aparece muerto seguido por dislocación cervical)
- La madre del aerosol con etanol al 70% y abrir la cavidad abdominal. El cuerno uterino que contiene embriones de Quite y coloque en un plato de 10 cm con PBS estéril.
- Hacer una incisión en el saco del embrión para liberar el embrión. Transferencia de embrión para limpiar plato de 10 cm con PBS estéril. Enjuague bien.
- Cortar el cuerpo por debajo del hígado y descartar la cabeza y parte superior del cuerpo. Retirar vísceras y desechar. Transferir el tejido restante en un plato limpio 10 cm con PBS estéril y transferir la placa a un nivel de bioseguridad 1 o 2 del gabinete. Combinar los tejidos de todos los embriones en un recipiente limpio y seco de 10 cm y pique en trozos finos.
- Añadir 6 mL de 0.25% tripsina/1 mM EDTA a embriones picaditos. Triturate varias veces con la pipeta para romper el tejido. Incubar durante 40 min a 37 ° c con 5% CO2.
- Resuspender las células en un medio (tabla 1). El volumen de los medios de comunicación se ajusta en base al número de embriones que se cosechan. En general, utilizan una relación de medios de crecimiento de aproximadamente 25 mL por cada 1,2 embriones.
- 25 mL de células resuspendidas en un plato de 15 cm de la placa. Después de 24 h, Aspire los medios de comunicación y añadir 25 mL de medio de cultivo fresco a cada plato.
- Después de 72 h, añadir 2 mL de 0.25% tripsina/1 mM EDTA a cada plato de 15 cm. Cuando las células se separan de la placa de cultivo, inactivación de la tripsina con medio de cultivo de 15 mL y recoger las células en tubos cónicos de poliestireno de 50 mL. Centrifugar las células por 3 min a 160 x g a temperatura ambiente. Resuspender el precipitado de células en medio del crecimiento y el filtro a través de un tamiz de celular poro 70 μm.
- Contar las células usando un hemocitómetro y la congelación de MEFs en alícuotas de 2 millones de células en el medio de congelación (10% DMSO, 25% FBS en de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) / alta glucosa) a-80 ° C. Transferir las células a nitrógeno líquido después de 24 horas y tienda hasta que esté listo para usar.
Nota: Expresión génica Global en MEFs se perfila aislados usando este protocolo por secuenciación del RNA (RNA-seq) para asegurar la autenticación de la célula. Datos de RNA-seq de células MEF codifica se descargaron de NIH Gene expresión Omnibus (GEO) con número GSE93454. Datos de expresión genética RNA-seq para las MEFs utilizados por nosotros fueron depositados en NIH GEO con número GSE71405. Estos dos conjuntos de datos fueron combinados según símbolos comunes del gene. Los datos de la expresión entonces se ha transformado en registro y un diagrama de dispersión de los datos de expresión de nuestro MEFs y ENCODE MEFs generaron y en forma con una línea de regresión lineal (figura 1A). MEFs aislados usando este protocolo son molecularmente similares a los aislados por otros laboratorios.
2. producción de Retrovirus y transducción de MEFs
Nota: Todos los pasos de esta sección deben llevarse a cabo en un gabinete de bioseguridad nivel 2. Puesto que este protocolo utiliza transducción retroviral, seguridad se toman las precauciones, incluyendo tratamiento de residuos que contienen medios virales con 10% de lejía durante al menos 20 min ver figura 1B para una línea de tiempo de reprogramación.
-
Producción de Retrovirus utilizando la línea celular de platino E (PE)
- Mantener disponibles comercialmente células PE PE medio (tabla 1) que contiene blasticidin y puromicina marcadores para expresión de gag-pol y env genes para la producción eficiente de partícula retroviral36 . Celdas de paso de 1:4 o 1:5 cada dos días. Tenga cuidado de evitar el hacinamiento de las células, esto puede reducir rendimientos retroviral.
- En el día -1, semilla de aproximadamente 5 x 106 células por plato 10 cm en el medio de crecimiento (tabla 1) 16-20 h antes de la transfección (ver tabla 2 para platear las densidades para otros tamaños de plato de cultura de célula estándar). Platos de rock suavemente hacia adelante y hacia atrás varias veces y cuidadosamente en a 37 ° C, 5% CO2 incubadora para asegurar incluso la distribución del revestimiento (ver figura 1 para la densidad de placas óptima antes de transfección).
Nota: tenga cuidado a las células de PE de placa en el medio libre de marcadores de selección antes de transfección para medio que contiene partículas retrovirales generadas no mata MEFs. - En el día 0, preparar DNA transfección. Para transfección de plato de 10 cm, añadir 2 μg de cada factor de reprogramación, GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 y miR-133 (GHMT2m) — a un tubo de 1,5 mL.
Nota: Consulte la tabla 2 para ampliar la cantidad de ADN necesaria para transfectar otros tamaños de plato de cultura de célula estándar. - En un tubo separado 1,5 mL, añadir 360 μl suero reducido los medios de comunicación. Luego agregue 36 μl de reactivo de transfección directamente en suero reducido los medios de comunicación. Suavemente el tubo de la película e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
Nota: Para evitar la eficiencia de transfección reducido, agregue cuidadosamente reactivo de transfección directamente a los medios de comunicación de suero reducido. - Añadir suero reducido los medios de comunicación de la transfección reactivo mezcla coctel de ADN de GHMT2m. Suavemente el tubo de la película e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. No no agitar con vortex.
- Añadir gota a gota la mezcla de reacción a las células PE, Remolino medios de 10-15 s suavemente y coloque en a 37 ° C, 5% CO2 incubadora.
Nota: Según el fabricante, las células PE generan un título promedio de 106 a 10 unidades de infecciosas 7/mL. Este protocolo genera aproximadamente 2 x 106 infecciones unidades/mL por 24 h y 6 x 106 infecciones unidades/mL por 48 h para un promedio MOI de 4. Transfección de GFP/DsRed puede usarse como un sustituto para la eficiencia de la transducción de la transfección si así lo desea; eficiencia de la transfección se espera que supere el 90% por 48 h (figura 1).
-
Transducción de MEFs
- En el día 0, la capa con colágeno y lugar a 37 ° C, 5% CO2 incubadora durante al menos 2 h.
- Retire la MEFs de deshielo y nitrógeno líquido. Células de6 placa de 0.2 x 10 por plato 60 mm en el medio de crecimiento. Suavemente rock placas para asegurar incluso la distribución de placas y colocar en la incubadora (ver figura 1 para la densidad de placas óptima y la tabla 2 para platear las densidades para otros tamaños de plato de cultura de célula estándar).
Nota: Estas densidades de placas han sido probadas en múltiples lotes de MEFs aislados; a menos que la pantalla de MEFs significativamente había comprometido viabilidad, ajustando las densidades de siembra de la célula no es necesario. - El día 1, transfección después de 24 h, utilice una jeringa de 30 mL para recoger retroviral medio generado por las células de la PE. Pasar el medio a través de un filtro de tamaño de poro 0.45 μm en un tubo cónico de 50 mL. Añadir el reactivo de transfección de bromuro de hexadimethrine a una concentración final de 6 μg/mL. Cuidadosamente añadir medio fresco 10 mL células PE por medios de pipeteado en la pared de la placa de cultivo para evitar desplazamiento de las células.
- Aspire el medio de MEFs y añadir 4 mL de medio de retroviral recién cosechado a cada plato. Vuelva MEFs a la incubadora. Añadir lejía 10% a todos los materiales en contacto con el medio viral para neutralizar partículas retrovirales.
- El día 2, transfección después de 48 h, repita los pasos 2.2.2 y 2.2.3. Las células PE se descartan después de la colección 2nd del medio retroviral.
Nota: Agregue blanqueador 10% células de PE desechados por al menos 20 min neutralizar retrovirus no deseados. - El día 3, aspirar el medio de MEFs y llenar con medio de iCM de 4 mL (tabla 1) que contiene 0,5 μm A-83-01, un TGF-β tipo I inhibidor del receptor. Reponer el iCM medio que contiene A-83-01 cada 2 días.
Nota: Si utiliza GFP como un control de transducción de señales, la expresión se espera que supere el 90% por este punto del tiempo (figura 1).
3. citometría de flujo para marcadores cardiacos
- Medio de aspirado de día 9 reprogramado MEFs y lavado (1 x) con 1 x PBS para eliminar los residuos y células muertas.
- Añadir 1 mL 0.25% tripsina/EDTA por 5 min a 37 ° c. Compruebe las células mediante un microscopio de luz y agite el plato; Si las células permanecen conectadas, incubar 5 minutos más a 37 ° c hasta que se desprenda de las células.
- Lavar las células en PBS 1 x con un 5% FBS y filtro a través de un tamiz de celular poro 70 μm.
- Centrifugue a 160 x g durante 3 min a temperatura ambiente y el líquido aspirado de la pelotilla.
Nota: Para aumentar el rendimiento de la célula, dejar líquido aproximadamente 50 μl sobre el precipitado de células. - Lavar las células con 500 μL 1 x PBS con 1% de BSA.
- Fijar las células con 0,2 mL/1 millones de células solución de fijación por 20 min en hielo.
- Añadir 1 mL de tampón de lavado de ondulación permanente fría 1 x.
Nota: La solución del fabricante es 10 x. - Centrifugar las células a 160 x g durante 5 min a 4 ° C y aspirar el sobrenadante.
- Repita los pasos 3.7 y 3.8 un tiempo adicional. Después del lavado 2nd , vaya directamente al paso siguiente o mantener a las células a 4 ° C durante la noche.
- Block con 100 μl de suero de burro en el 1 x de tampón de perm/lavado durante 30 min a temperatura ambiente y 5% de suero de cabra.
- Añada 100 μl del anticuerpo primario diluido.
Nota: Para este protocolo, las células fueron etiquetadas con ratón troponina T (1: 200) y ratón α-actinina (1: 200) para cuantificar el porcentaje de células positivas para los componentes claves de la sarcómera cardiaca. Incubar anticuerpo primario por 1 h a temperatura ambiente. - Centrifugar las células a 160 x g por 5 m a 4 ° C, aspirar el sobrenadante y lavar x 2 con tampón de lavado de ondulación permanente fría.
- Añada 100 μl del anticuerpo secundario diluido.
Nota: Para este protocolo, las células fueron etiquetadas con anti-ratón 647 nm de anticuerpo secundario (1: 200). Incubar anticuerpo secundario por 45 min a temperatura ambiente en un rotador de tubo de extremo a extremo. Proteger a las células de la luz envolviendo los tubos en papel de aluminio. - Centrifugar las células a 160 x g durante 5 min a 4 ° C, aspirar el sobrenadante y lavar x 2 con tampón de lavado de ondulación permanente fría.
- Añadir 1 mL de 1% de BSA en PBS y realizar inmediatamente la FACS.
Nota: Generar una dispersión hacia delante vs lado dispersión parcela a puerta primero células viables cuando realice FACS. Alternativamente, usar una mancha comercialmente disponibles celular vivo o muertos antes de la fijación de las células para identificar vivo y muerto de la célula las poblaciones.
4. el Immunostaining de MEFs reprogramadas
- Medio de aspirado desde el día 14 había reprogramado MEFs y lavado (1 x) con 1 mL 1 x PBS helado.
Nota: Para la inmunotinción, reprogramación fue realizada en 12 placas bien para minimizar los volúmenes de solución de anticuerpo. también se pueden utilizar placas de 24 pozos; simplemente medio todo siguiendo volúmenes. - Aspirar y fijar las células con paraformaldehido de 2% de 500 μl 10 min a temperatura ambiente.
- Aspirar y lavar las células 3 veces con 1 mL 1 x PBS (5 min por lavado a temperatura ambiente).
- Permeabilizar las células con 500 μl 0.2% permeabilización reactivo en PBS durante 15 min a temperatura ambiente.
- Aspire y bloquear en 500 μl 10% suero de caballo en PBS durante 30 min a temperatura ambiente.
- Aspirar e incubar con 500 μl del anticuerpo primario diluido por 1 h a temperatura ambiente.
Nota: Para este protocolo, células eran marcadas con ratón Troponin T o α-actinina (cada 1: 400) y co marcadas conexina 43 (1: 400) o la troponina I (1: 400). - Anticuerpo primario de aspirar y lavar tres veces con 1 mL 1 x PBS (5 min por lavado a temperatura ambiente).
- Aspirar e incubar con el anticuerpo secundario diluido de 500 μl durante 1 hora a temperatura ambiente.
Nota: Para este protocolo, las células fueron etiquetadas con anti-ratón 555 nm secundaria (1: 800) reconocer Troponin T o α-actinina y el anticuerpo anti-conejo 488 nm secundaria (1: 800) reconocer conexina 43 o troponina I. Adicionalmente, los núcleos fueron teñidos con Hoechst (1:10, 000). Proteger a las células de la luz por la incubación en la oscuridad. - El anticuerpo secundario de aspirar y lavar tres veces con 1 mL 1 x PBS (5 min por lavado a temperatura ambiente). Envolver la placa en papel de aluminio para proteger las células de la luz y almacenar a 4 ° C.
- Imagen mediante microscopía de epifluorescencia de tres canales.
5. proyección de imagen de calcio
Nota: Si la proyección de imagen con 10 aumentos, platos y platos de la cultura de célula estándar son adecuados para la proyección de imagen de calcio. Imagen a mayor aumento requiere platear las células sobre cubreobjetos de cristal o vidrio platos de fondo.
- Aspire el medio y añadir 2 mL (para placa bien un 6) modificada solución de Tyrode (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, glucosa 10 mM, 10 mM HEPES, BSA 0.1% y 1% piruvato, pH 7.4) que contiene 5 μm estoy Fura-2 y 0,1% Pluronic F-127 a batir (D14 t o D20) iCMs. Incubar durante 30 minutos a 37 ° C.
Nota: Proteger las células de la luz para evitar el enfriamiento de indicador fluorescente. - Lavar las células en solución de Tyrode 2 mL durante 30 min a temperatura ambiente para permitir que la esterificación de Fura-2 AM.
- Imagen con spinning microscopia confocal de disco a 340 nm y 380 nm utilizando Slidebook 5.5 Ca2 + software de imágenes. Realizar la proyección de imagen a temperatura ambiente.
- Oscilaciones de calcio se calculan utilizando la relación de intensidad de la fluorescencia a 340 nm sobre la intensidad de fluorescencia en 380 nm.
- Si lo desea, tratar iCMs con isoproterenol de 1 ó 2 μm o 10 μm nifedipina para manipular el manejo después de oscilaciones de calcio base la proyección de imagen del calcio. Añadir compuestos localmente a las células y la imagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Usando la estrategia de reprogramación descrita anteriormente y en la figura 1B, generamos iCMs con aproximadamente 70% de las células cardiacas de troponina T y aproximadamente 55% de las células cardiaca α-actinina, cuantificado por citometría de flujo en el día 9 después de transducción de GHMT2m (figura 2A y B). Además, la mayoría de las células expresa cardiaca troponina T, troponina I y α-actinina cardiaca así como el marcador de ensambladura de gap conexina 43 en el día 14 después de transducción de señales (figura 2 y D). Proyección de imagen con mayor ampliación revela formación de la estructura bien definida de la sarcómera y ensambladuras de gap formando entre células vecinas (puntas de flecha blancas, Figura 2D). Además, contracción espontánea y transitorios del calcio indican funcionalidad de iCMs (Figura 3A-C y 1 película).
Figura 1: línea de tiempo de reprogramación y óptima de las células. (A) diagrama de dispersión de datos de RNA-seq registro-transformada para MEFs generados en nuestro laboratorio versus ENCODE MEFs. Se muestran el valor de R2 y la recta de regresión lineal. (B) esquema de todo críticos pasos en la reprogramación GHMT2m-mediada de MEFs. (C) células PE en confluencia de 70-80% antes de la transfección (fila superior, panel de la izquierda) y GFP señal 48 horas después de la transfección para indicar la eficiencia de transfección (fila superior, medio y derecho). MEFs sembradas poco antes de la infección para prevenir el hacinamiento en el período de reprogramación (fila inferior, el panel de la izquierda) y GFP señal 48 horas post-infección para indicar la eficiencia de la infección (fila inferior, central y derecho). Barra de escala = 400 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: cuantificación y caracterización de la expresión de proteínas cardíacas en iCMs. (A y B). Citometría de flujo representativo de troponina cardíaca T (A) y α-actinina (B) en el día 9 después de la transducción de GHMT2m, n = 3. (C) ICC coloración para marcadores cardiacos en el día 14 después de transducción de señales GHMT2m. Verde: troponina I, rojo: cardiaco Troponin T (panel central) y α-actinina (panel derecho) y azul: Hoechst tinción de núcleos. Imágenes representativas (n = 3). Barra de escala = 200 μm (D) alta magnificación se imagina de la estructura del sarcómero (rojo: cardiaca α-actinina (fila superior) y troponina cardíaca T (fila inferior)) y la expresión de la proteína de Unión gap conexina 43 (verde). Puntas de flecha blancas indican comunicantes forman entre células vecinas. Imágenes representativas (n = 3). Barra de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: cuantificación funcional de iCMs. Curso del tiempo (A) de vencer a un recuento después de transducción de señales GHMT2m. Paliza las células fueron contadas por el ojo y recuentos celulares de 10 campos por plato 3 platos por experimento fueron promediados e incluidos en panel de A. (B y C) registró oscilaciones de calcio de iCMs. Frecuencia transitoria del calcio se altera en iCMs después del tratamiento con 1 μm Isoproterenol o nifedipina μm 10. F340/F380, la relación de intensidad de la fluorescencia a 340 y 380 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película 1: vencer a iCMs. Película mostrando iCMs de paliza en el día 12 en vitro. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
| iCM Media | ||
| Nombre del reactivo | Volumen (mL) | Concentración final |
| Glucosa alta DMEM | 320 | |
| Medio 199 | 80 | |
| Suero bovino fetal | 50 | 10% |
| Suero de caballo de donantes | 25 | 5% |
| Aminoácidos esenciales de MEM, x 50 | 10 | 1 x |
| Solución de piruvato de sodio, 100 x | 5 | 1 x |
| MEM no esenciales aminoácidos, 100 x | 5 | 1 x |
| Solución de vitamina MEM, 100 x | 5 | 1 x |
| Insulina-transferrina-selenio, 100 x | 5 | 1 x |
| B27, x 50 | 10 | 1 x |
| Penicilin-estreptomicina | 5.5 | 1.1% |
| Suplemento de L-glutamina | 5.5 | 1.1% |
| Medio de PE | ||
| Nombre del reactivo | Volumen (mL) | Concentración final |
| Glucosa alta DMEM | 450 | |
| Suero bovino fetal | 50 | 10% |
| Penicilin-estreptomicina | 5.5 | 1.1% |
| Suplemento de L-glutamina | 5.5 | 1.1% |
| Blasticidin-HCl - 10mg/mL | 0.5 | 10 μg/mL |
| Diclorhidrato de puromicina | 0.05 | 1 μg/mL |
| Medios de cultivo | ||
| Nombre del reactivo / equipo | Volumen (mL) | Concentración final |
| Glucosa alta DMEM | 450 | |
| Suero bovino fetal | 50 | 10% |
| Penicilin-estreptomicina | 5.5 | 1.1% |
| Suplemento de L-glutamina | 5.5 | 1.1% |
Tabla 1: Medios de cultivo. Recetas para medio de cultivo utilizado en el presente Protocolo.
| Células PE | ||||||
| Placa de cultivo celular | Superficie (cm2) | Densidad siembra (células) | Medio volumen (mL) | ADN total por transfección (μg) | Reactivo de transfección (μL) | Opti-MEM (μL) |
| 15 cm | 176.7 | 11.25 x 106 | 20 | 36 | 108 | 1080 |
| 10 cm | 78.5 | 5 x 106 | 10 | 12 | 36 | 360 |
| 60 mm | 28.2 | 1.7 x 106 | 4 | 4 | 12 | 120 |
| placa de la pozo 6 | 9 | 0.54 x 106 | 2 | 1.3 | 3.9 | 39 |
| placa de la pozo 12 | 4 | 0.24 x 106 | 1 | 0.6 | 1.8 | 18 |
| 24 placa bien | 2 | 0.12 x 106 | 0.5 | 0.3 | 0,9 | 9 |
| MEFs | ||||||
| Placa de cultivo celular | Superficie (cm2) | Densidad siembra (células) | Medio volumen (mL) | Bromuro de Hexadimethrine (μL) | ||
| 15 cm | 176.7 | 1.35 x 106 | 20 | 12 | ||
| 10 cm | 78.5 | 0.6 x 106 | 10 | 6 | ||
| 60 mm | 28.2 | 0,2 x 106 | 4 | 2.4 | ||
| placa de la pozo 6 | 9 | 0.1 x 106 | 2 | 1.2 | ||
| placa de la pozo 12 | 4 | 0.4 x 105 | 1 | 0.6 | ||
| 24 placa bien | 2 | 0,2 x 105 | 0.5 | 0.3 | ||
Tabla 2: densidades de siembra para reprogramación. Mesa de siembra, densidades de células PE y de MEFs para formatos comunes de plato de la cultura del celular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El presente estudio esboza una estrategia de alta eficiencia para directamente reprogramar fibroblastos en iCMs funcional vía entrega de GHMT2m reprogramación factores combinados con la supresión de vías de señalización pro-fibróticos. Mediante citometría de flujo, la proyección de imagen inmunofluorescente, calcio imaging y superando a un recuento, nos muestran la mayoría de las células en este protocolo se someten a reprogramación exitosa y adoptar sino del linaje de CM. Previamente hemos demostrado que la adición de anti-fibrótico compuestos incluyendo el tipo de TGF-β inhibidor del receptor de A-83-01 produce un aumento de aproximadamente 6-fold en el número de golpes iCMs comparado con transducción de señales con GHMT2m solo, lo que indica que señal Pro-fibróticos es una fuerte barrera endógena a reprogramación cardiaca. Por lo tanto, se puede, aprovechar este sistema para la detección de drogas para investigar los mecanismos que regulan la cardiomyogenesis; la adición de una molécula pequeña junto a-83-01 podría descubrir los reguladores negativos de la cardiomyogenesis. Por el contrario, la adición de una molécula pequeña a GHMT2m solo podría dilucidar los reguladores positivos de cardiomyogenesis. Desentrañar los mecanismos a través del cual estos reguladores positivos y negativos rigen diferenciación CM resultan en una mejor comprensión de cardiomyogenesis y llevar a más eficiente reprogramación y protocolos de maduración.
Muchas variables afectan la eficiencia de reprogramación. Nos encontramos con que densidad de placas de celulares impacta grandemente la producción de partículas retrovirales en el caso de las células de la PE y la absorción eficiente de todos los factores de reprogramación en el caso de MEFs. Además, el número de paso puede afectar estos parámetros así. Para asegurar una óptima producción de partículas virales, transfectar las células PE antes de paso 20. Para garantizar la eficiente absorción de las partículas retrovirales, no paso de MEFs después de congelar.
Varios estudios recientes también han demostrado alta eficiencia reprogramación de MEFs derribando PRC1 miembro IMC junto con expresión de GMT30 o overexpressing Akt además GHMT37. Adición de ZFN281 a GHMT + Akt llevó a un aumento de 4 veces en la troponina T las células positivas en los fibroblastos adultos cola punta, atribuidos en parte a la supresión de genes inflamatorios firmas38. Además, la combinación de un inhibidor de señalización de TGF-β y WNT signaling inhibidor aumento a cardiaco mediado GMT reprogramación39. Lo importante, las vías de señalización implicadas en estos estudios no parecen superponerse. Por lo tanto, es probable que la diafonía entre múltiples vías de señalización podría mejorar aún más la reprogramación cardiaca.
Varios estudios demostraron reprogramación en vivo a través de la entrega de reprogramación factores en los ratones después de la izquierda anterior descendente (CHAVAL) arteria ligadura25,32,39,40 ,41. Estos estudios mostraron mejoría moderada en la función ventricular tras MI, destacando el potencial terapéutico de reprogramación cardiaca sobre la regeneración de corazón tras lesión. Nuestro protocolo reprograma MEFs con la más alta eficiencia en vitro hasta la fecha. Por lo tanto, será interesante ver si reprogramación de alta eficiencia es capaz de restaurar completamente después de la lesión de la función de corazón en vivo. Estos estudios podrían servir como base para la traducción de este método en terapias con células madre nuevas de infarto posterior de pacientes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por fondos de la Fundación Boettcher Webb Waring biomédica investigación programa, americano corazón Asociación científico desarrollo Grant (13SDG17400031), Departamento de la Universidad de Colorado de destacada carrera medicina Programa, de la Universidad de Colorado División de Cardiología Barlow Nyle dotación y R01HL133230 de NIH (a K.S). ASR fue apoyado por NIH/NCATS Colorado CTSA concesión número TL1TR001081 y una beca predoctoral del consorcio Universidad de Colorado para la investigación de la Fibrosis y traducción (CFReT). Esta investigación fue apoyada también por la concesión de apoyo Centro de cáncer (P30CA046934), beca de núcleos de investigación de enfermedades de piel (P30AR057212) y la base de Cytometry del flujo en el Universidad de Colorado Anschutz Medical Campus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 Mice | Charles River's Laboratory | 027 | For MEF isolation |
| Platinum E (PE) Cells | Cell Biolabs, INC | RV-101 | For retrovirus production |
| DMEM High Glucose | Gibco | SH30022.FS | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150-059 | Component of iCM media |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100106 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Donor Horse Serum | Gemini | 100508 500 | Component of iCM media |
| MEM Essential Amino Acids, 50X | Life Technologies | 11130051 | Component of iCM media |
| Sodium Pyruvate Solution, 100X | Life Technologies | 11360070 | Component of iCM media and for calcium imaging |
| MEM Non-Essential Amino Acids, 100X | Life Technologies | 11140050 | Component of iCM media |
| MEM Vitamin Solution, 100X | Life Technologies | 11120-052 | Component of iCM media |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 41400045 | Component of iCM media |
| B27 | Gibco | 17504-044 | Component of iCM media |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| GlutaMAX (L-Glutamine Supplement) | Gibco | 35050-061 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Blasticidin-HCl | Life Technologies | A11139-03 | Component of PE media |
| Puromycin dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Component of PE media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | For detaching cells from culture dishes |
| A-83-01 | R&D Systems - Tocris | 2939/10 | Treat cells to inhibit TGF-β signaling - promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM |
| DMSO | Thermo Scientific | 85190 | For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium |
| SureCoat | Cellutron | SC-9035 | For coating dishes to plate MEFs |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection Reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 11058-021 | Transfection Reagent |
| pBabe-X Myc-GATA4 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Hand2 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Mef2c | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Tbx5 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-1 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-133 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X GFP | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268-5G | For viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL |
| Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores) | Nalgene | 569-0020 | For filtering media |
| Syringes | Bd Vacutainer Labware | 309654 | For viral filtration |
| 0.45 µm Filters | Celltreat | 229749 | For viral filtration |
| 70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | For MEF isolation and Flow Cytometry |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry |
| perm/wash buffer | BD | 554723 | For washing cells for flow cytometry |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-250 | For washing cells |
| Bovine Serum Albumin | VWR | 0332-100g | For flow cytometry and calcium imaging |
| Goat Serum | Sigma | G9023 | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Donkey Serum | Sigma | D9663-10mg | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Mouse Troponin T | Thermo Scientific | ms-295-p | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Mouse α-actinin | Sigma | A7811L | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Rabbit Connexin 43 | Sigma | C6219 | 1:400 IF |
| Rabbit Troponin I | PhosphoSolutions | 2010-TNI | 1:400 IF |
| Hoechst | Life Technologies | 62249 | 1:10000 IF |
| Alexa 488, rabbit | Life Technologies | A-11034 | 1:800 IF |
| Alexa 555, mouse | Life Technologies | A-21422 | 1:800 IF |
| Alexa 647, mouse | Life Technologies | A-31571 | 1:200 Flow Cytometry |
| 27-color ZE5 Flow Cytometer | Bio-RAD | For FACS | |
| Paraformaldehyde | sigma | P6148-500mg | For fixing cells for IF |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | For permeabilization of cells for IF |
| EVOS™ FL Color Imaging System | Thermo Scientific | AMEFC4300 | For IF |
| NaCl | RPI | S23020-5000 | For calcium imaging |
| KCl | VWR | 395 | For calcium imaging |
| CaCl2 | Fisher | C614-500 | For calcium imaging |
| MgCl2 | VWR | 97061-352 | For calcium imaging |
| glucose | sigma | G7528-250g | For calcium imaging |
| HEPES | sigma | H4034-500g | For calcium imaging |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F1221 | For calcium imaging |
| Fluronic F-127 | Sigma | P2443-250g | For calcium imaging |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | For disruption calcium transients in iCMs - use at 10 µM |
| Isoproterenol | sigma | I6504-1g | For increasing number of calcium transients in iCMs - use at 1-2 µM |
| Marianas Spinning Disk Confocal microscope | 3i | For calcium imaging | |
| ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| bleach | Clorox | ||
| 50 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 227261 | |
| 15 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 188271 | |
| 15 cm cell culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 10 cm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 60 mm cell culture dishes | GREINER BIO-ONE | 628160 | |
| 6 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| 12 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 665180 | |
| 24 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 662160 |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
- Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D. Cardiac muscle regeneration: lessons from development. Genes & Development. 25 (4), 299-309 (2011).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Nabel, E. G., Braunwald, E. A tale of coronary artery disease and myocardial infarction. N Engl J Med. 366 (1), 54-63 (2012).
- Packer, M., et al. Effect of carvedilol on the morbidity of patients with severe chronic heart failure: results of the carvedilol prospective randomized cumulative survival (COPERNICUS) study. Circulation. 106 (17), 2194-2199 (2002).
- The CAPRICORN Investigators. Effect of carvedilol on outcome after myocardial infarction in patients with left-ventricular dysfunction: the CAPRICORN randomized trial. The Lancet. 357 (9266), 1385-1390 (2001).
- Marangou, J., Paul, V. Current attitudes on cardiac devices in heart failure: a review. Clin Ther. 37 (10), 2206-2214 (2015).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Bio. 14 (8), 529-541 (2013).
- Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomized controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
- Schachinger, V., et al. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1210-1221 (2006).
- Huikuri, H. V., et al. Effects of intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells on left ventricular function, arrhythmia risk profile, and restenosis after thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. Eur. Heart J. 29 (22), 2723-2732 (2008).
- Janssens, S., et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 367 (9505), 113-121 (2006).
- Lunde, K., et al. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1199-1209 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial - a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart J. 152 (3), 434-441 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
- Karantalis, V., et al. Autologous mesenchymal stem cells produce concordant improvements in regional function, tissue perfusion, and fibrotic burden when administered to patients undergoing coronary artery bypass grafting: The Prospective Randomized Study of Mesenchymal Stem Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (PROMETHEUS) trial. Circ Res. 114 (8), 1302-1310 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: A source of cardiac regeneration. J. Mol. Cell. Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
- Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 357-386 (2010).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
- Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100 (1), 105-113 (2013).
- Qian, L., Berry, E. C., Fu, J., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
- Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
- Ifkovitz, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. Inhibition of TGFβ signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes. PLoS One. 9 (2), e89678 (2014).
- Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
- Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8 (5), e63577 (2013).
- Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA induced cardiac reprogramming in vivo: evidence for mature cardiac myocytes and improved cardiac function. Circ Res. 116 (3), 418-424 (2015).
- Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110 (11), 1465-1473 (2012).
- Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), 1216-1220 (2016).
- Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nature Communications. 6, 1-15 (2015).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7, 1063-1066 (2000).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Zhou, H., et al. ZFN281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression. Genes & Dev. 31, 1770-1783 (2017).
- Mohamed, T. M., et al. Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming. Circulation. 135, 978-995 (2017).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
- Mathison, M., et al. In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration. J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).
