Summary
Aqui nós apresentamos um método robusto para reprogramar fibroblastos embrionários primários em cardiomyocytes funcional através de superexpressão de GATA4 Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 e miR-133 (GHMT2m) juntamente com a inibição da sinalização do TGF-β. Nosso protocolo gera cardiomyocytes bater tão cedo quanto pós-transdução de 7 dias com até 60% eficiência.
Abstract
Trans-diferenciação do tipo de uma célula somática em outro tem um enorme potencial para modelar e tratar doenças humanas. Estudos anteriores mostraram esse rato embrionárias, fibroblastos dérmicos e cardíacos podem ser reprogramados em células-induzida-casos-como funcionais (iCMs) pela superexpressão de fatores de transcrição cardiogênico incluindo GATA4, Hand2, Mef2c, e Tbx5 tanto in vitro e in vivo. No entanto, esses estudos anteriores têm mostrado eficiência relativamente baixa. A fim de restaurar a função cardíaca após lesão, os mecanismos que regem a reprogramação cardíaca devem ser elucidados para aumentar a eficiência e a maturação de iCMs.
Demonstramos anteriormente que a inibição da sinalização pró-fibróticos dramaticamente aumenta a eficiência de reprogramação. Aqui, detalhamos os métodos para alcançar uma eficiência de reprogramação de até 60%. Além disso, descrevemos vários métodos, incluindo citometria de fluxo, imunofluorescência imagem e imagem latente de cálcio para quantificar a reprogramação eficiência e maturação dos fibroblastos reprogramadas. Usando o protocolo detalhado aqui, podem ser realizados estudos mecanicistas para determinar os reguladores positivos e negativos de reprogramação cardíaca. Estes estudos podem identificar caminhos de sinalização que podem ser direcionados para promover a reprogramação eficiência e maturação, o que poderia levar a terapias celulares novela para tratar a doença de coração humana.
Introduction
Doença isquêmica do coração é das principais causas de morte no Estados Unidos1. Aproximadamente 800.000 americanos experimentam um primeiro ou recorrente do miocárdio (MI) por ano1. MI, na sequência da morte de cardiomyocytes (CMs) e Fibrose cardíaca, depositados por fibroblastos cardíacos registrados, afectar o coração função2,3. Progressão da insuficiência cardíaca após MI é em grande parte irreversível devido a pobre capacidade regenerativa do adulto CMs4,5. Enquanto atuais terapias clínicas retardar a progressão da doença e diminuem o risco de futuros eventos cardíacos6,7,8,9, sem terapias reverter a progressão da doença, devido à incapacidade de regenere o CMs pós-infarto10. Terapias celulares romance surgem para tratar pacientes seguindo mi decepcionante, ensaios clínicos, entregando as células-tronco para o coração após MI até agora mostraram-se inconclusivos regenerativo potencial11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.
A geração de células-tronco pluripotentes induzidas humanos-derivado (hiPSCs) de fibroblastos pela superexpressão de quatro fatores de transcrição, primeiramente demonstrado por Takahashi & Yamanaka, abriu as portas para novos avanços na terapia de célula19. Estas células podem se diferenciar em todas as três camadas germinativas19, e vários métodos altamente eficientes para gerar um grande número de CMs têm demonstrados anteriormente20,21. HiPSC-derivado CMs (quadris-CMs) oferece uma plataforma poderosa para estudar cardiomyogenesis e pode ter implicações importantes para reparar o coração após lesão. No entanto, quadris-CMs atualmente enfrentam obstáculos translacionais devido a preocupações de teratoma formação22, e sua natureza imatura pode ser pro-arrhythmogenic23. Reprogramação de fibroblastos em hiPSCs despertou interesse em diretamente reprogramação de fibroblastos em outros tipos de células. Ieda et al demonstraram que superexpressão de GATA4, Mef2c e Tbx5 (GMT) em resultados de fibroblastos em reprogramação direta linhagem cardíaca, embora a baixa eficiência24. Reprogramação de eficiência foi melhorado com a adição de Hand2 (GHMT)25. Desde os primeiros estudos, muitas publicações têm demonstrado que, alterar o coquetel fator reprogramação com transcrição adicional fatores28,de27,26,29, cromatina modificadores30,31, microRNAs32,33ou34 leva à melhoria de moléculas pequenas reprogramação eficiência e/ou maturação das células de casos-como induzidas (iCMs ).
Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para gerar iCMs de fibroblastos embrionários de rato (MEFs) com alta eficiência. Anteriormente mostramos que o GHMT cocktail é significativamente melhorado com a adição de miR-1 e miR-133 (GHMT2m) e é melhorada quando pró-fibróticos inclusive transformar o fator de crescimento β (TGF-β) sinalização de vias de sinalização ou associadas a Rho vias de sinalização da proteína quinase (ROCK) são inibidas35. Usando este protocolo, mostramos que aproximadamente 60% das células express T de troponina cardíaca (miocardite), aproximadamente 50% express α-actinin, e um elevado número de células de batida pode ser observado logo em dia 11 transdução de reprogramação de fatores e o tratamento a seguir com o TGF-β tipo I inibidor do receptor A-83-01. Além disso, esses iCMs expressam proteínas de junção gap incluindo connexin 43 e apresentam contração espontânea e transientes de cálcio. Esta marcada melhoria na eficiência em comparação com estudos anteriores de reprogramação demonstra o potencial para regenerar CMs de populações de células endógeno que permanecem no infarto de pós coração.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todas as experiências que exigem animais foram aprovadas pelo Comitê de uso no Campus médico da UC Denver Anschutz e institucional Cuidado Animal.
1. isolamento de MEFs
- Compra de ratos grávidas C57BL/6 no E13. Navio durante a noite.
- Eutanásia-a mãe de acordo com protocolos aprovados IACUC (ex: ~1.3 L/min de CO2 até animal aparece morto seguido por deslocamento cervical)
- Pulverizar a mãe com 70% de etanol e abrir a cavidade abdominal. Remover o corno uterino contendo embriões e coloque em um prato de 10 cm com PBS estéril.
- Fazer uma incisão no saco do embrião para liberar o embrião. Transferi o embrião para limpar o prato de 10 cm com PBS estéril. Enxague abundantemente.
- Corte o corpo abaixo do fígado e elimine a cabeça e parte superior do corpo. Remover os órgãos internos e descarte. Transferir o tecido remanescente para um prato limpo 10cm com PBS estéril e transferir a placa para um nível de biossegurança 1 ou 2 do armário. Combine os tecidos de todos os embriões em um prato limpo e seco de 10 cm e picar em pedaços bem.
- Adicione 6 mL de 0,25% tripsina/1 mM EDTA para embriões picados. Triture várias vezes com uma pipeta para romper o tecido. Incube durante 40 min a 37 ˚ c com 5% de CO2.
- Ressuspender as células em meio de crescimento (tabela 1). O volume de mídia é ajustado com base no número de embriões colhidos. Em geral, use uma proporção de aproximadamente meio de crescimento 25 mL por 1,2 embriões.
- Placa 25 mL de células ressuspensa em um prato de 15 cm. Após 24h, aspirar a mídia e adicionar 25 mL de meio de cultura fresco para cada placa.
- Depois de 72 h, adicione 2 mL de 0,25% tripsina/1 mM EDTA para cada prato de 15 cm. Quando células desanexe o prato de cultura, inativar tripsina com 15 mL de meio de crescimento e recolher pilhas em poliestireno tubos cônicos de 50 mL. Centrifugar as células para 3 min a 160 x g , à temperatura ambiente. Resuspenda o pellet de células em meio de crescimento e filtro através de um filtro de célula 70 µm poro.
- Contar as células usando um hemocytometer e congelar MEFs em alíquotas de 2 milhões de células em meio de congelamento (DMSO 10%, 25% FBS em de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) / alta glicose) a-80 ° C. Transferência de células para nitrogênio líquido após 24h e loja até estar pronto para usar.
Nota: A expressão gênica Global em MEFs foi perfilado isolado usando este protocolo por sequenciação do ARN (RNA-seq) para garantir a autenticação de célula. RNA-seq dados de células codificar MEF foram baixados do NIH Gene Expression Omnibus (GEO) com o número de adesão GSE93454. Dados da expressão do gene do RNA-seq para os MEFs usados por nós foram depositados no NIH GEO com número de adesão GSE71405. De acordo com símbolos comuns do gene, fundiram-se estes dois conjuntos de dados. Os dados de expressão foram então log-transformados e um gráfico de dispersão dos dados de expressão para nosso MEFs e ENCODE MEFs foram gerados e ajuste com uma linha de regressão linear (figura 1A). MEFs isolados usando este protocolo são molecularmente similares àqueles isolados por outros laboratórios.
2. produção de retrovírus e transdução de MEFs
Nota: Todas as etapas desta seção devem ser efectuadas em um armário de 2 do nível de biossegurança. Desde que este protocolo utiliza a transdução retroviral, certifique-se que sejam tomadas precauções, incluindo tratamento de que todos os resíduos contendo mídia viral com 10% de lixívia pelo menos 20 min. consulte a figura 1B para um cronograma para reprogramação a segurança.
-
Produção de retrovírus usando a linha de celular de platina E (PE)
- Manter disponíveis comercialmente células PE PE médio (tabela 1) contendo blasticidin e puromicina seleção marcadores para garantir a expressão de amordaçar-pol e env genes para a produção eficiente de partículas retroviral36 . Células de passagem a 1:4 ou 1:5 em dois dias. Tome cuidado para evitar a superlotação das células, pois isto pode reduzir rendimentos de produção retroviral.
- No dia -1, semente aproximadamente 5 x 106 células por prato de 10cm no meio de crescimento (tabela 1), 16-20 h antes do transfection (ver tabela 2 para chapeamento densidades para outros tamanhos de prato de cultura de célula padrão). Delicadamente rock pratos e para trás várias vezes e coloque cuidadosamente em um 37 ° C, 5% CO2 incubadora para assegurar mesmo distribuição de chapeamento (ver Figura 1 para chapeamento ideal de densidade antes do transfection).
Nota: tenha cuidado para células de PE placa no meio livre de marcadores de seleção antes de Transfeccao para garantir meio contendo partículas retrovirais geradas não mata MEFs. - No dia 0, prepare DNA para transfeccao. Para transfeccao de prato 10cm, adicionar 2 µ g de cada fator reprogramação — GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 e miR-133 (GHMT2m) — para um tubo de 1,5 mL.
Nota: Consulte a tabela 2 para dimensionar a quantidade de DNA necessária para transfect outros tamanhos de prato de cultura de célula padrão. - Em um tubo separado 1,5 mL, adicione 360 µ l soro reduzida mídia. Em seguida, adicione 36 reagente de transfeccao µ l diretamente para a mídia de soro reduzida. Delicadamente, agite o tubo e incubar a temperatura ambiente por 5 min.
Nota: Para evitar a eficiência reduzida do transfection, adicione cuidadosamente reagente de transfeccao diretamente para a mídia de soro reduzida. - Adicione mistura de reagente de transfeccao/mídia de soro e reduzida ao DNA GHMT2m cocktail. Delicadamente, agite o tubo e incubar a temperatura ambiente por 15 min. Fazer não o vórtice.
- Adicione a mistura de reação gota a gota para células de PE, suavemente redemoinho mídia para 10-15 s e coloque em um 37 ° C, 5% CO2 incubadora.
Nota: De acordo com o fabricante, células PE geram uma concentração média de 106 107 infecciosas unidades/ml. Este protocolo gera aproximadamente 2 x 106 infecções unidades/mL por 24 h e 6 x 106 infecções unidades/mL por 48 h para uma média de 4 "moi". Transfecção de GFP/DsRed também pode ser utilizada como um substituto para eficiência de transfeccao/transdução se desejado; eficiência de transfeccao deverá ultrapassar 90% por 48 h (Figura 1).
-
Transdução de MEFs
- No dia 0, casaco pratos com colágeno e coloque em um 37 ° C, 5% CO2 incubadora pelo menos 2 h.
- Remova MEFs de degelo e nitrogênio líquido. Placa de 0,2 x 106 células por prato de 60 mm no meio de crescimento. Delicadamente placas de pedra para garantir até mesmo a distribuição de chapeamento e colocar na incubadora (ver Figura 1 para densidade ideal do chapeamento e tabela 2 para chapeamento densidades para outros tamanhos de prato de cultura de célula padrão).
Nota: Estas densidades de chapeamento foram testadas ao longo de vários lotes de MEFs isolados; a menos que a exibição de MEFs significativamente comprometida viabilidade, ajustar a célula densidades de semeadura não é necessário. - No dia 1, pós-transfecção 24 h, use uma seringa de 30 mL para coletar retroviral médio gerado pelas células de PE. Passe o meio através de um filtro de tamanho de poro 0,45 µm para um tubo cónico de 50 mL. Adicione o reagente de Transfeccao de brometo de hexadimethrine para uma concentração final de 6 µ g/mL. Cuidadosamente, adicione 10 mL de meio de crescimento fresco às células de PE pela mídia pipetagem das buchas do prato cultura para evitar o deslocamento das células.
- Aspire o meio de MEFs e adicionar 4 mL de meio de retroviral recém-colhidas para cada prato. Retorno MEFs para a incubadora. Adicione água sanitária 10% para todos os materiais em contacto com o meio viral para neutralizar partículas retrovirais.
- No dia 2, pós-transfecção 48 h, repita os passos 2.2.2 e 2.2.3. Células de PE são descartadas após a coleção 2nd do meio retroviral.
Nota: Adicione 10% de lixívia para células de PE descartadas pelo menos 20 min neutralizar o retrovírus indesejados. - No dia 3, Aspire o meio de MEFs e reabasteça com 4 mL de meio de iCM (tabela 1) contendo 0,5 µM A-83-01 uma TGF-β tipo I inibidor do receptor. Reabastecer o iCM médio contendo A-83-01 a cada 2 dias.
Nota: Se utilizar as boas práticas agrícolas como um controle de transdução, a expressão deverá ultrapassar 90% por esse ponto do tempo (Figura 1).
3. citometria de fluxo para marcadores cardíacos
- Aspirado médio de 9 dia reprogramado MEFs e lavagem (1x) com PBS 1x para remover detritos e células mortas.
- Adicione 1 mL 0,25% tripsina/EDTA por 5 min em 37 ˚ c. Verifique as células usando um microscópio de luz e agitar o prato; Se as células continuam a ser anexadas, incube mais 5min em 37 ˚ c até células desanexar.
- Lavam-se células em 1X PBS contendo 5% FBS e filtrar através de um filtro de célula 70 µm poro.
- Centrifugar a 160 x g por 3 min em temperatura ambiente e aspirar líquido da pelota.
Nota: Para aumentar o rendimento da célula, deixe o líquido de cerca de 50 µ l acima o centrifugado. - Lavam-se células com 500 µ l 1X PBS contendo 1% de BSA.
- Solução de fixação por 20 min Fix células com 0,2 mL 1 milhão de células no gelo.
- Adicione 1 mL de tampão de perm/lavagem gelada de 1x.
Nota: A solução do fabricante é de 10x. - Centrifugar as células a 160 x g por 5 min a 4 ° C e aspire o sobrenadante.
- Repita as etapas de 3.7 e 3.8 um tempo adicional. Após a lavagem de 2nd , prossiga diretamente para a próxima etapa ou manter células a 4 ° C durante a noite.
- Bloco com 100 µ l de soro de cabra de 5% e soro de burro em 1x tampão de perm/lavagem por 30 min à temperatura ambiente.
- Adicione 100 µ l de anticorpo primário diluído.
Nota: Para o presente protocolo, as células foram rotuladas com mouse troponina T (1: 200) e rato α-actinin (1: 200) para quantificar a porcentagem de células positivas para componentes-chave do sarcômero cardíaco. Incube o anticorpo primário por 1h à temperatura ambiente. - Centrifugar as células a 160 x g durante 5 m a 4 ° C, aspirar o sobrenadante e lavar 2x com tampão de perm/lavagem gelada.
- Adicione 100 µ l de anticorpo secundário diluído.
Nota: Para este protocolo, as células foram rotuladas com anti-rato 647 nm anticorpo secundário (1: 200). Incube o anticorpo secundário por 45 min à temperatura ambiente em um rotador extremidade-sobre-extremidade do tubo. Protege as células de luz envolvendo tubos em folha. - Centrifugar as células a 160 x g por 5 min a 4 ° C, aspirar o sobrenadante e lavar 2x com tampão de perm/lavagem gelada.
- Adicionar 1 mL de 1% de BSA em PBS e executar FACS imediatamente.
Nota: Gere um avanço vs lado dispersão de dispersão para portão células viáveis primeiro ao executar FACS. Alternativamente, use uma mancha comercialmente disponível ao vivo/morto célula antes da fixação de células para identificar ao vivo e morto populações de células.
4. imunocoloração de MEFs reprogramadas
- Meio, aspirado por dia 14 reprogramado MEFs e lavagem (1x) com 1 mL 1 x PBS gelado.
Nota: Para imunocoloração, reprogramação foi realizada em 12 placas bem para minimizar o volume de solução de anticorpos. 24 placas bem também podem ser utilizadas; simplesmente metade de todos os volumes a seguir. - Aspire e reparar células com paraformaldeído de 2% 500 µ l para 10 min à temperatura ambiente.
- Aspirar e lavar as células 3 vezes com PBS 1x de 1 mL (5 min por lavagem à temperatura ambiente).
- Permeabilize células com 500 µ l 0,2% permeabilização reagente em PBS por 15 min à temperatura ambiente.
- Aspire e blocos em 500 µ l soro 10% cavalo em PBS durante 30 min à temperatura ambiente.
- Aspire e incubar com 500 µ l do anticorpo primário diluído por 1h à temperatura ambiente.
Nota: Para este protocolo, células foram rotuladas com mouse troponina T ou α-actinin (cada 1: 400) e co rotuladas com Connexin 43 (1: 400) ou troponina eu (1: 400). - Aspire o anticorpo primário e lavar três vezes com 1 mL 1X PBS (5 min por lavagem à temperatura ambiente).
- Aspire e incubar com anticorpo secundário diluído de 500 µ l por 1 hora em temperatura ambiente.
Nota: Para este protocolo, as células foram rotuladas com o anti-rato 555 nm anticorpo secundário (1:800) para reconhecer a troponina T ou α-actinin e anticoelho 488 nm anticorpo secundário (1:800) reconhecer Connexin 43 ou troponina I. Além disso, núcleos foram corados com Hoechst (01:10, 000). Protege as células de luz incubando no escuro. - Aspirar o anticorpo secundário e lavar três vezes com 1 mL 1X PBS (5 min por lavagem à temperatura ambiente). Enrole a placa com papel de alumínio para proteger células de luz e armazenar a 4 ° C.
- Imagem usando microscopia de epifluorescência de três canais.
5. cálcio Imaging
Nota: Se de imagem com ampliação de 10x, pratos e pratos de cultura de célula padrão são adequados para a imagem latente de cálcio. Imaging na maior ampliação exige que células ser banhado em lamelas de vidro ou pratos de fundo de vidro.
- Aspire médio e adicionar 2 mL (para uma 6 placa bem) modificado solução de Tyrode (140 mM de NaCl, KCl, 1.8 mM CaCl2, de 5 mM 1 mM MgCl2, glicose 10 mM, 10 mM HEPES, 0,1% BSA e 1% de piruvato, pH 7,4) contendo 5 µM Fura-2 estou e 0,1% Pluronic F-127 para bater (D14 t o D20) iCMs. Incubar durante 30 minutos a 37 ° C.
Nota: Protege células de luz para evitar a têmpera do indicador fluorescente. - Lavam-se células em solução de Tyrode 2 mL por 30 min à temperatura ambiente para permitir que a esterificação de Fura-2 AM.
- Imagem com fiação microscopia confocal disco a 340 nm e 380 nm, utilizando Slidebook 5.5 Ca2 + software de imagem. Execute a imagem à temperatura ambiente.
- Transientes de cálcio são calculados usando a relação de intensidade de fluorescência a 340 nm sobre a intensidade de fluorescência em 380 nm.
- Se desejado, tratar de iCMs com 1 ou 2 µM isoproterenol ou 10 µM nifedipina para manipular cálcio manipulação após a imagem transientes de cálcio de linha de base. Adicione compostos localmente para as células e imagem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Usando a estratégia de reprogramação descrita acima e na figura 1B, geramos iCMs com aproximadamente 70% das células expressando T de troponina cardíaca e aproximadamente 55% das células expressando cardíaca α-actinin, quantificada por citometria de fluxo no dia 9 transdução de GHMT2m a seguir (Figura 2A e B). Além disso, a maioria das células express cardíaca troponina T, troponina e α-actinin cardíaca bem como o marcador de junção de lacuna Connexin 43 no dia 14 após transdução (Figura 2 e D). Imagem com maior ampliação revela formação de estrutura do sarcômero bem-definidos e junções formando entre células vizinhas (setas brancas, Figura 2D). Além disso, contração espontânea e transientes de cálcio indicam a funcionalidade do iCMs (Figura 3A-C e 1 filme).
Figura 1: cronograma de reprogramação e chapeamento ideal de células. (A) gráfico de dispersão dos dados de RNA-seq log-transformadas por MEFs gerados no nosso laboratório contra ENCODE MEFs. O valor de2 R e a linha de regressão linear são mostrados. (B) esquema de todos críticos entra a reprogramação mediada por GHMT2m de MEFs. (C) células de PE na confluência de 70-80% antes de transfeccao (linha superior, deixada o painel) e GFP sinal 48 horas pós do transfection para indicar a eficiência do transfection (linha superior, painéis de médios e direito). MEFs escassamente semeado antes da infecção para evitar superlotação durante o período de reprogramação (linha de fundo, deixada o painel) e GFP sinal 48 horas pós infecção para indicar a eficiência da infecção (linha inferior, painéis de médios e direito). Barra de escala = 400 µM. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: quantificação e caracterização de proteínas cardíacas expressão no iCMs. (A e B). Citometria de fluxo representativo para cardíaca troponina T (A) e α-actinin (B) no dia 9 após transdução de GHMT2m, n = 3. (C) ICC mancha para marcadores cardíacos no dia 14 após transdução de GHMT2m. Verde: troponina cardíaca eu, vermelho: cardíaca troponina T (painel central) e α-actinin (painel direito) e azul: Hoechst mancha para núcleos. Imagens representativas (n = 3). Barra de escala = 200 imagina de alta magnificação (D) µM de estrutura do sarcômero (vermelho: cardíaca α-actinin (linha superior) e T de troponina cardíaca (linha inferior)) e a expressão da proteína de junção gap Connexin 43 (verde). Setas brancas indicam formam de junções entre as células vizinhas. Imagens representativas (n = 3). Barra de escala = 100 µM. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: quantificação funcional de iCMs. (A) curso de tempo de bater a contagem de células após transdução de GHMT2m. Batendo células foram contadas pelo olho e conta de celular de 10 campos por prato, mais de 3 pratos por experimento foram em média e incluídos no painel r. (B e C) gravou transientes de cálcio de iCMs. Frequência de transiente de cálcio é alterada no iCMs após o tratamento com 1 µM Isoproterenol ou 10 µM de nifedipina. F340/F380, a relação da intensidade de fluorescência em 340 e 380 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1: batendo iCMs. Filme mostrando iCMs batendo no dia 12 em vitro. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
| iCM Media | ||
| Nome do reagente | Volume (mL) | Concentração final |
| DMEM glicose alta | 320 | |
| Meio 199 | 80 | |
| Soro fetal bovino | 50 | 10% |
| Soro de cavalo doador | 25 | 5% |
| MEM aminoácidos essenciais, 50 x | 10 | 1 x |
| Solução de piruvato de sódio, 100 x | 5 | 1 x |
| Madame não aminoácidos essenciais, 100 x | 5 | 1 x |
| Solução de vitamina MEM, 100 x | 5 | 1 x |
| Insulina-transferrina-selênio, 100 x | 5 | 1 x |
| B27, 50 x | 10 | 1 x |
| Penicilin-estreptomicina | 5.5 | 1,1% |
| Suplemento de L-glutamina | 5.5 | 1,1% |
| Mídia de PE | ||
| Nome do reagente | Volume (mL) | Concentração final |
| DMEM glicose alta | 450 | |
| Soro fetal bovino | 50 | 10% |
| Penicilin-estreptomicina | 5.5 | 1,1% |
| Suplemento de L-glutamina | 5.5 | 1,1% |
| Blasticidin-HCl - 10mg/mL | 0,5 | 10 µ g/mL |
| Dicloridrato de puromicina | 0.05 | 1 µ g/mL |
| Mídia de crescimento | ||
| Nome do reagente / equipamentos | Volume (mL) | Concentração final |
| DMEM glicose alta | 450 | |
| Soro fetal bovino | 50 | 10% |
| Penicilin-estreptomicina | 5.5 | 1,1% |
| Suplemento de L-glutamina | 5.5 | 1,1% |
Tabela 1: Meios de cultura. Receitas para o meio de cultura utilizado no presente protocolo.
| Células de PE | ||||||
| Placa de cultura de células | Área de superfície (cm2) | Densidade de semeadura (células) | Mídia Volume (mL) | DNA total por transfecção (µ g) | Reagente de transfeccao (µ l) | Opti-MEM (µ l) |
| 15 cm | 176.7 | 11,25 x 106 | 20 | 36 | 108 | 1080 |
| 10 cm | 78,5 | 5 x 106 | 10 | 12 | 36 | 360 |
| 60 mm | 28,2 | 1.7 x 106 | 4 | 4 | 12 | 120 |
| 6 placa bem | 9 | 0,54 x 106 | 2 | 1.3 | 3.9 | 39 |
| 12 placa bem | 4 | 0,24 x 106 | 1 | 0.6 | 1.8 | 18 |
| 24 prato bem | 2 | 0.12 x 106 | 0,5 | 0.3 | 0.9 | 9 |
| MEFs | ||||||
| Placa de cultura de células | Área de superfície (cm2) | Densidade de semeadura (células) | Mídia Volume (mL) | Brometo de Hexadimethrine (µ l) | ||
| 15 cm | 176.7 | 1,35 x 106 | 20 | 12 | ||
| 10 cm | 78,5 | 0,6 x 106 | 10 | 6 | ||
| 60 mm | 28,2 | 0,2 x 106 | 4 | 2.4 | ||
| 6 placa bem | 9 | 0.1 x 106 | 2 | 1.2 | ||
| 12 placa bem | 4 | 0,4 x 105 | 1 | 0.6 | ||
| 24 prato bem | 2 | 0,2 x 105 | 0,5 | 0.3 | ||
Tabela 2: semeadura densidades para reprogramação. Tabela de semeadura MEFs para formatos comuns de prato de cultura celular e densidades para células de PE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O presente estudo descreve uma estratégia de alta eficiência para reprogramar diretamente fibroblastos em iCMs funcional através de entrega de GHMT2m fatores combinados com a supressão das vias de sinalização pró-fibróticos de reprogramação. Utilizando citometria de fluxo, imagem latente de imunofluorescência, cálcio imaging e bater a contagem de células, vamos mostrar a maioria das células no presente protocolo submetido a reprogramação bem sucedida e adotar o destino de linhagem CM. Mostramos anteriormente que a adição de antifibrótico compostos, incluindo o tipo de TGF-β eu inibidor do receptor A-83-01 produz um aproximadamente 6-fold aumento do número de espancamento iCMs comparado a transdução com GHMT2m sozinho, indicando que a sinalização pró-fibróticos é uma barreira forte endógena para reprogramação cardíaca. Este sistema pode, portanto, ser aproveitado para a seleção de drogas para investigar os mecanismos que regem a cardiomyogenesis; a adição de uma pequena molécula ao lado A-83-01 poderia descobrir os reguladores negativos da cardiomyogenesis. Por outro lado, a adição de uma pequena molécula de GHMT2m sozinho poderia elucidar reguladores positivos de cardiomyogenesis. Desvendar os mecanismos através dos quais estes reguladores positivos e negativos governam diferenciação CM irá resultar em um melhor entendimento de cardiomyogenesis e levar a reprogramação ainda mais eficiente e protocolos de maturação.
Muitas variáveis afetam a eficiência de reprogramação. Encontramos que densidade de chapeamento de célula influencia grandemente tanto a produção de partículas retrovirais no caso de células de PE e a absorção eficiente de todos os factores reprogramação no caso de MEFs. Além disso, o número de passagem pode afetar esses parâmetros também. Para garantir a melhor produção de partículas virais, transfect células de PE antes de passagem 20. Para garantir uma absorção eficiente de partículas retrovirais, não passagem MEFs após congelamento.
Vários estudos recentes também demonstraram alta eficiência reprogramação de MEFs por derrubando PRC1 membro IMC juntamente com expressão de GMT30 ou superexpressão Akt além GHMT37. Adição de ZFN281 para GHMT + Akt levou a um 4-fold aumento de troponina T células positivas em fibroblastos de ponta de cauda adulto, atribuídas em parte à supressão do gene inflamatória assinaturas38. Além disso, a combinação de um inibidor da sinalização do TGF-β e inibidor de sinalização de WNT aumentou cardíaco GMT-mediada reprogramação39. Importante, as vias de sinalização envolvidas nestes estudos parecem não se sobrepõem. Portanto, é provável que conversas cruzadas entre múltiplas vias de sinalização poderiam melhorar ainda mais a reprogramação cardíaca.
Vários estudos demonstraram reprogramação na vivo através da entrega de reprogramação fatores em ratos seguindo deixadas anterior descendente (LAD) artéria ligadura25,32,39,40 ,,41. Estes estudos mostraram melhoria modesta da função ventricular após MI, ressaltando o potencial terapêutico de reprogramação cardíaca na regeneração do coração após lesão. Nosso protocolo reprograma MEFs com a mais alta eficiência em vitro até à data. Portanto, será interessante ver se a reprogramação de alta eficiência é capaz de restaurar totalmente pós-lesão de coração função in vivo. Esses estudos poderiam servir como uma base para traduzir este método em terapias com células romance pós-infarto dos pacientes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada por fundos da Fundação Boettcher Webb-Waring biomédica pesquisa programa, americano coração Associação cientista desenvolvimento Grant (13SDG17400031), Universidade do Colorado departamento medicina pendentes do início de carreira Programa acadêmico, Universidade de Colorado divisão de Cardiologia Barlow Nyle doação e NIH R01HL133230 (para Klein). A.S.R foi apoiada pelo NIH/NCATS Colorado CTSA Grant número TL1TR001081 e uma bolsa doutorandos do consórcio Universidade do Colorado para pesquisa de fibrose & tradução (CFReT). Esta pesquisa foi apoiada também pela concessão de apoio do centro de câncer (P30CA046934), a concessão de núcleos de investigação de doenças pele (P30AR057212) e o núcleo de citometria de fluxo no Campus Anschutz-médica da Universidade do Colorado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 Mice | Charles River's Laboratory | 027 | For MEF isolation |
| Platinum E (PE) Cells | Cell Biolabs, INC | RV-101 | For retrovirus production |
| DMEM High Glucose | Gibco | SH30022.FS | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150-059 | Component of iCM media |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100106 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Donor Horse Serum | Gemini | 100508 500 | Component of iCM media |
| MEM Essential Amino Acids, 50X | Life Technologies | 11130051 | Component of iCM media |
| Sodium Pyruvate Solution, 100X | Life Technologies | 11360070 | Component of iCM media and for calcium imaging |
| MEM Non-Essential Amino Acids, 100X | Life Technologies | 11140050 | Component of iCM media |
| MEM Vitamin Solution, 100X | Life Technologies | 11120-052 | Component of iCM media |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 41400045 | Component of iCM media |
| B27 | Gibco | 17504-044 | Component of iCM media |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| GlutaMAX (L-Glutamine Supplement) | Gibco | 35050-061 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Blasticidin-HCl | Life Technologies | A11139-03 | Component of PE media |
| Puromycin dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Component of PE media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | For detaching cells from culture dishes |
| A-83-01 | R&D Systems - Tocris | 2939/10 | Treat cells to inhibit TGF-β signaling - promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM |
| DMSO | Thermo Scientific | 85190 | For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium |
| SureCoat | Cellutron | SC-9035 | For coating dishes to plate MEFs |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection Reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 11058-021 | Transfection Reagent |
| pBabe-X Myc-GATA4 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Hand2 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Mef2c | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Tbx5 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-1 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-133 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X GFP | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268-5G | For viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL |
| Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores) | Nalgene | 569-0020 | For filtering media |
| Syringes | Bd Vacutainer Labware | 309654 | For viral filtration |
| 0.45 µm Filters | Celltreat | 229749 | For viral filtration |
| 70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | For MEF isolation and Flow Cytometry |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry |
| perm/wash buffer | BD | 554723 | For washing cells for flow cytometry |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-250 | For washing cells |
| Bovine Serum Albumin | VWR | 0332-100g | For flow cytometry and calcium imaging |
| Goat Serum | Sigma | G9023 | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Donkey Serum | Sigma | D9663-10mg | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Mouse Troponin T | Thermo Scientific | ms-295-p | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Mouse α-actinin | Sigma | A7811L | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Rabbit Connexin 43 | Sigma | C6219 | 1:400 IF |
| Rabbit Troponin I | PhosphoSolutions | 2010-TNI | 1:400 IF |
| Hoechst | Life Technologies | 62249 | 1:10000 IF |
| Alexa 488, rabbit | Life Technologies | A-11034 | 1:800 IF |
| Alexa 555, mouse | Life Technologies | A-21422 | 1:800 IF |
| Alexa 647, mouse | Life Technologies | A-31571 | 1:200 Flow Cytometry |
| 27-color ZE5 Flow Cytometer | Bio-RAD | For FACS | |
| Paraformaldehyde | sigma | P6148-500mg | For fixing cells for IF |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | For permeabilization of cells for IF |
| EVOS™ FL Color Imaging System | Thermo Scientific | AMEFC4300 | For IF |
| NaCl | RPI | S23020-5000 | For calcium imaging |
| KCl | VWR | 395 | For calcium imaging |
| CaCl2 | Fisher | C614-500 | For calcium imaging |
| MgCl2 | VWR | 97061-352 | For calcium imaging |
| glucose | sigma | G7528-250g | For calcium imaging |
| HEPES | sigma | H4034-500g | For calcium imaging |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F1221 | For calcium imaging |
| Fluronic F-127 | Sigma | P2443-250g | For calcium imaging |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | For disruption calcium transients in iCMs - use at 10 µM |
| Isoproterenol | sigma | I6504-1g | For increasing number of calcium transients in iCMs - use at 1-2 µM |
| Marianas Spinning Disk Confocal microscope | 3i | For calcium imaging | |
| ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| bleach | Clorox | ||
| 50 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 227261 | |
| 15 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 188271 | |
| 15 cm cell culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 10 cm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 60 mm cell culture dishes | GREINER BIO-ONE | 628160 | |
| 6 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| 12 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 665180 | |
| 24 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 662160 |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
- Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D. Cardiac muscle regeneration: lessons from development. Genes & Development. 25 (4), 299-309 (2011).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Nabel, E. G., Braunwald, E. A tale of coronary artery disease and myocardial infarction. N Engl J Med. 366 (1), 54-63 (2012).
- Packer, M., et al. Effect of carvedilol on the morbidity of patients with severe chronic heart failure: results of the carvedilol prospective randomized cumulative survival (COPERNICUS) study. Circulation. 106 (17), 2194-2199 (2002).
- The CAPRICORN Investigators. Effect of carvedilol on outcome after myocardial infarction in patients with left-ventricular dysfunction: the CAPRICORN randomized trial. The Lancet. 357 (9266), 1385-1390 (2001).
- Marangou, J., Paul, V. Current attitudes on cardiac devices in heart failure: a review. Clin Ther. 37 (10), 2206-2214 (2015).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Bio. 14 (8), 529-541 (2013).
- Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomized controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
- Schachinger, V., et al. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1210-1221 (2006).
- Huikuri, H. V., et al. Effects of intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells on left ventricular function, arrhythmia risk profile, and restenosis after thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. Eur. Heart J. 29 (22), 2723-2732 (2008).
- Janssens, S., et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 367 (9505), 113-121 (2006).
- Lunde, K., et al. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1199-1209 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial - a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart J. 152 (3), 434-441 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
- Karantalis, V., et al. Autologous mesenchymal stem cells produce concordant improvements in regional function, tissue perfusion, and fibrotic burden when administered to patients undergoing coronary artery bypass grafting: The Prospective Randomized Study of Mesenchymal Stem Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (PROMETHEUS) trial. Circ Res. 114 (8), 1302-1310 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: A source of cardiac regeneration. J. Mol. Cell. Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
- Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 357-386 (2010).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
- Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100 (1), 105-113 (2013).
- Qian, L., Berry, E. C., Fu, J., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
- Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
- Ifkovitz, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. Inhibition of TGFβ signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes. PLoS One. 9 (2), e89678 (2014).
- Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
- Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8 (5), e63577 (2013).
- Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA induced cardiac reprogramming in vivo: evidence for mature cardiac myocytes and improved cardiac function. Circ Res. 116 (3), 418-424 (2015).
- Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110 (11), 1465-1473 (2012).
- Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), 1216-1220 (2016).
- Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nature Communications. 6, 1-15 (2015).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7, 1063-1066 (2000).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Zhou, H., et al. ZFN281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression. Genes & Dev. 31, 1770-1783 (2017).
- Mohamed, T. M., et al. Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming. Circulation. 135, 978-995 (2017).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
- Mathison, M., et al. In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration. J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).
