Summary
Här presenterar vi en robust metod för att programmera primära embryonala fibroblaster i funktionella hjärtmuskelceller genom överuttryck av GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 och miR-133 (GHMT2m) tillsammans med hämning av TGF-β signalering. Våra protokoll genererar slående hjärtmuskelceller så tidigt som 7 dagar efter transduktion med upp till 60% effektivitet.
Abstract
Trans-differentiering av en somatisk celltyp till en annan har en enorm potential att modellera och behandla sjukdomar. Tidigare studier har visat att mus embryonala, dermal, och hjärtriskfaktorer fibroblaster kan omprogrammeras till funktionella inducerad-hjärtmuskelcellen-liknande celler (iCMs) genom överuttryck av kardiogen transkriptionsfaktorer inklusive GATA4, Hand2, Mef2c, och Tbx5 både in vitro- och in vivo. Dessa tidigare studier har dock visat relativt låg effektivitet. För att återställa hjärtats funktion efter skada, måste mekanismer som styr hjärtats omprogrammering belysas för att öka effektiviteten och mognaden av iCMs.
Vi har tidigare visat att hämning av pro-fibrotiska signalering dramatiskt ökar omplanering effektivitet. Här, detalj vi metoder för att uppnå en omplanering verkningsgrad på upp till 60%. Dessutom beskriver vi flera metoder inklusive flödescytometri, Immunofluorescerande imaging och kalcium imaging att kvantifiera omplanering effektivitet och mognaden av omprogrammerade fibroblaster. Med hjälp av protokollet som beskrivs här, kan mekanistiska studier genomföras att fastställa positiva och negativa regulatorer av hjärt omprogrammering. Dessa studier kan identifiera signalvägar som kan vara inriktade på att främja omplanering effektivitet och mognad, vilket kan leda till nya cell terapier att behandla mänskliga hjärtsjukdom.
Introduction
Ischemisk hjärtsjukdom är en ledande dödsorsaken i USA1. Cirka 800 000 amerikaner upplever en första eller återkommande hjärtinfarkt (MI) per år1. Efter MI försämra död hjärtmuskelcellerna (CMs) och hjärtfibros, deponeras av aktiverade hjärt fibroblaster, hjärtat funktion2,3. Progression av hjärtsvikt efter MI är i hög grad oåterkallelig på grund av dålig regenerativ kapacitet av vuxen CMs4,5. Medan nuvarande kliniska behandlingar bromsa sjukdomsförloppet och minska risken för framtida hjärt händelser6,7,8,9, vända inga terapier sjukdomsförloppet på grund av oförmåga att regenerera CMs efter hjärtinfarkt10. Ny cellterapi växer fram för att behandla patienter efter MI. nedslående, kliniska prövningar att leverera stamceller till hjärtat efter MI hittills har visat tveksam regenerativ potentiella11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.
Generering av människa inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) från fibroblaster av överuttryck av fyra transkriptionsfaktorer, först visat av Takahashi & Yamanaka, öppnade dörren till nya genombrott i cell terapi19. Dessa celler kan differentieras till alla tre groddar lager19, och flera mycket effektiva metoder för att generera ett stort antal CMs har visats tidigare20,21. HiPSC-derived CMs (höfter-CMs) erbjuder en kraftfull plattform för att studera cardiomyogenesis och kan få viktiga konsekvenser för Reparera hjärtat efter skada. Men höfter-CMs står för närvarande inför translationell häck på grund av oro teratoma bildandet22och deras omogna natur kan vara pro-arytmogena23. Omprogrammering fibroblaster i hiPSCs väckte intresse för direkt omprogrammering fibroblaster till andra celltyper. Ieda et al. visade att överuttryck av GATA4, Mef2c och Tbx5 (GMT) i fibroblaster resulterar i direkta omprogrammering till hjärt härstamning, om än i låg effektivitet24. Omprogrammering effektivitet har förbättrats med tillägg av Hand2 (GHMT)25. Sedan dessa tidiga studier, har många publikationer visat att förändra omplanering faktor cocktail med ytterligare transkription faktorer26,27,28,29, kromatin modifierare30,31, mikroRNA32,33eller små molekyler34 leder till förbättrad omprogrammering effektivitet eller mognaden av inducerad hjärtmuskelcellen-liknande celler (iCMs ).
Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för att generera iCMs från mus embryonala fibroblaster (MEFs) med hög verkningsgrad. Vi visade tidigare att GHMT cocktail är betydligt bättre med tillägg av miR-1 och miR-133 (GHMT2m) och förbättras ytterligare när pro-fibrotiska signalering vägar, inklusive omvandla tillväxtfaktor β (TGF-β) signalering eller Rho-associerade protein kinase (ROCK) signalvägar är hämmad35. Använder det här protokollet, visar vi att cirka 60% av cellerna express hjärt Troponin T (cTnT), cirka 50% express α-actinin och ett stort antal stryk celler kan observeras så tidigt som dagen 11 efter transduktion av omprogrammering faktorer och behandling med av TGF-β typ I receptor hämmare A-83-01. Dessutom dessa iCMs express gap junction proteiner inklusive connexin 43 och uppvisar spontan kontraktion och kalcium transienter. Detta markerad förbättring i omprogrammering effektivitet jämfört med tidigare studier visar potential att regenerera CMs från endogena cellpopulationer som finns kvar i det efter hjärtinfarkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment som kräver djur godkändes av institutionella djur vård och användning kommittén vid UC Denver Anschutz Medical Campus.
1. isolering av MEFs
- Köpa C57BL/6 dräktiga möss på E13. Fartyg över natten.
- Euthanize mor enligt godkända IACUC protokoll (ex: ~1.3 L/min CO2 tills djuret visas döda följt av cervikal dislokation)
- Spray mor med 70% etanol och öppna bukhålan. Ta bort livmoder horn som innehåller embryon och placera i en 10 cm skålen med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning.
- Gör ett snitt i embryo sac att släppa embryo. Överföra embryo för att rengöra 10 cm skålen med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning. Skölj noggrant.
- Skär kroppen under levern och kasta huvudet och överkroppen. Avlägsna inre organ och kassera. Överför återstående vävnaden till en ren 10 cm skålen med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning och överföra plattan till biosäkerhet nivå 1 eller 2 skåp. Kombinera vävnader från alla embryon i en ren, torr 10 cm skålen och färs i fina bitar.
- Tillsätt 6 mL 0,25% trypsin/1 mM EDTA till malet embryon. Pulverisera flera gånger med pipett att bryta upp vävnad. Inkubera under 40 minuter vid 37 ° c med 5% CO2.
- Att resuspendera cellerna i odlingsmedium (tabell 1). Volymen av media är justeras baserat på antalet embryon som skördas. I allmänhet Använd ett förhållande av cirka 25 mL tillväxtmassmedia per 1,2 embryon.
- Tallrik 25 mL återsuspenderade celler i en 15 cm skål. Efter 24 h, aspirera media och tillsätt 25 mL färsk odlingsmedium till varje platta.
- Efter 72 h, tillsätt 2 mL av 0,25% trypsin/1 mM EDTA till varje 15 cm skålen. När celler lossna från kultur skålen, inaktivera trypsin med 15 mL odlingsmedium och samla celler i 50 mL polystyren koniska rör. Centrifugera celler för 3 min vid 160 x g vid rumstemperatur. Återsuspendera cellpelleten i odlingsmedium och filtrera genom en 70 µm porstorlek cell SIL.
- Räkna celler som använder en hemocytometer och frysa MEFs i 2 miljoner celler alikvoter i frysa medium (10% DMSO, 25% FBS i Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) / hög glukos) vid-80 ° C. Överföra celler till flytande kväve efter 24 h och store förrän du är klar att använda.
Obs: Globala genuttryck i MEFs profilerade isolerade använder det här protokollet av RNA-sekvensering (RNA-seq) för att säkerställa cell autentisering. RNA-seq data från koda MEF celler hämtades från NIH gen uttryck Omnibus (GEO) med anslutningen nummer GSE93454. RNA-seq gen uttryck data för de MEFs som används av oss och deponerades i NIH GEO med anslutningen nummer GSE71405. Dessa två datamängder slogs enligt vanliga genen symboler. Uttrycket data sedan log-omformades och ett spridningsdiagram data som uttryck för våra MEFs och koda MEFs var genereras och passar med en linjär regressionslinje (figur 1A). MEFs isolerade använder det här protokollet är molekylärt liknar isolerat av andra laboratorier.
2. produktion av Retrovirus och transduktion av MEFs
Obs: Alla stegen i detta avsnitt skall utföras i ett biosäkerhet nivå 2 skåp. Eftersom detta protokoll använder retrovirala transduktion, säkerställa att säkerhet försiktighetsåtgärder vidtas inklusive behandling av allt avfall som innehåller viral media med 10% blekmedel i minst 20 min. se figur 1B för en tidslinje för omprogrammering.
-
Produktion av Retrovirus med Platinum E (PE) cell:
- Upprätthålla kommersiellt tillgängliga PE celler i PE medium (tabell 1) innehållande blasticidin och puromycin markörerna för uttryck av gag-pol och env -gener för effektiv retrovirala partikel produktion36 . Passagen-celler 1:4 eller 1:5 varje två dagar. Var noga med för att förhindra överbeläggning av celler eftersom detta kan minska retrovirala avkastningen.
- Dag -1 frö cirka 5 x 106 celler per 10 cm skålen i odlingsmedium (tabell 1), 16-20 h innan transfection (se tabell 2 för plätering densiteter för andra standard cell kultur maträtt storlekar). Skaka försiktigt rätter fram och tillbaka flera gånger och placera försiktigt i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator att säkerställa även plätering fördelning (se figur 1 c för optimal plätering densitet före transfection).
Obs: var noga med att plattan PE celler i mediet som är fritt från markörerna före transfection att säkerställa medium som innehåller genererade retrovirala partiklar inte dödar MEFs. - Dag 0, att förbereda transfection DNA. Lägg till 2 µg av varje omplanering faktor för 10 cm skålen transfection, — GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 och miR-133 (GHMT2m) — till ett 1,5 mL rör.
Obs: Se tabell 2 att skala mängden DNA som behövs för att transfect andra standard cell kultur maträtt storlekar. - I en separat 1,5 mL tub, lägga till 360 µL minskade serum media. Lägg sedan till 36 µL transfection reagens direkt minskade serum media. Varsamt svep röret och odla i rumstemperatur i 5 min.
Obs: För att undvika nedsatt transfection effektivitet, tillsätt försiktigt transfection reagens direkt till minskade serum media. - Lägga till minskade serum media/transfection reagens blandning GHMT2m DNA cocktail. Varsamt svep röret och odla i rumstemperatur i 15 min. Gör inte vortex.
- Lägga till reaktionsblandningen droppvis i PE celler, försiktigt snurra media för 10-15 s, och placera i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
Obs: Enligt tillverkaren, PE celler generera en genomsnittlig titer för 106 107 infektiösa enheter/ml. Detta protokoll genererar cirka 2 x 106 infektioner enheter/mL av 24 h och 6 x 106 infektioner enheter/mL av 48 h i genomsnitt MOI 4. Transfection av GFP/DsRed kan också användas som ett surrogat för transfection/transduktion effektivitet om så önskas; transfection effektivitet väntas överstiga 90% av 48 h (figur 1 c).
-
Transduktion av MEFs
- Dag 0, coat rätter med kollagen och plats i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator för minst 2 h.
- Ta bort MEFs från flytande kväve och Tina. Platta 0.2 x 106 celler per 60 mm skålen i odlingsmedium. Försiktigt rock plattor att säkerställa även plätering distribution och placera i inkubatorn (se figur 1 c för optimal plätering densitet och tabell 2 för plätering densiteter för andra standard cell kultur maträtt storlekar).
Obs: Dessa plätering tätheter har testats över flera partier av isolerade MEFs; om inte MEFs display äventyras väsentligt livskraft, är justera cell sådd tätheter inte nödvändigt. - Dag 1, 24 h efter transfection, använda en 30 mL spruta för att samla retrovirala medium genereras av PE celler. Passera ett 0,45 µm porstorlek filter mediet till en 50 mL konisk tub. Tillsätt hexadimethrine metylbromid transfection reagens till en slutlig koncentration på 6 µg/mL. Tillsätt försiktigt 10 mL färsk odlingsmedium till PE celler av pipettering media på väggen av kultur skålen att förhindra förskjutning av celler.
- Aspirera på medellång från MEFs och tillsätt 4 mL av nyskördade retrovirala medium till varje maträtt. Återgå MEFs till inkubatorn. Lägga till 10% blekmedel i alla material i kontakt med det virala mediet att neutralisera retrovirala partiklar.
- Dag 2, 48 h efter transfection, upprepa steg 2.2.2 och 2.2.3. PE celler kasseras efter 2nd insamlingen av retrovirala medium.
Obs: Lägga till 10% blekmedel i kasserade PE celler i minst 20 min att neutralisera oönskade retrovirus. - Dag 3, aspirera medium från MEFs och fylla på med 4 mL iCM medium (tabell 1) innehållande 0,5 µM A-83-01, en TGF-β typ I receptor hämmare. Fylla på iCM medium innehållande A-83-01 varannan dag.
Obs: Om du använder GFP som en transduktion kontroll, uttrycket förväntas överstiga 90% av denna tidpunkt (figur 1 c).
3. flödescytometri för kardiella markörer
- Aspirera medium från dag 9 omprogrammeras MEFs och tvätta (1 x) med 1 x PBS att ta bort döda celler och skräp.
- Tillsätt 1 mL 0,25% Trypsin/EDTA för 5 min vid 37 ˚C. Kontrollera celler med ett ljusmikroskop och skaka skålen; om celler kvar, inkubera 5 mer min vid 37 ° c tills cellerna lossa.
- Tvätta cellerna i 1 x PBS som innehåller 5% FBS och filter genom en 70 µm porstorlek cell SIL.
- Centrifugera vid 160 x g under 3 minuter vid rumstemperatur och aspirera vätska från pelleten.
Obs: För att öka cellen avkastningen, lämna ca 50 µL vätska ovan cellpelleten. - Tvätta cellerna med 500 µL 1 x PBS med 1% BSA.
- Fixa celler med 0,2 mL 1 miljoner celler fixering lösning för 20 min på is.
- Tillsätt 1 mL 1 x iskall perm/tvättbuffert.
Obs: Tillverkarens lösning är 10 x. - Centrifugera celler vid 160 x g i 5 minuter vid 4 ° C och sug ut supernatant.
- Upprepa steg 3.7 och 3.8 en ytterligare tid. Efter 2nd tvätten, gå direkt till nästa steg eller hålla celler vid 4 ° C över natten.
- Block med 100 µL av 5% get serum och åsna serum i 1 x perm/tvättbuffert i 30 min i rumstemperatur.
- Tillsätt 100 µL utspätt primär antikropp.
Obs: För detta protokoll, celler var märkt med mus Troponin T (1: 200) och mus α-actinin (1: 200) att kvantifiera andelen celler positiv för viktiga komponenter i den kardiella sarcomere. Inkubera primär antikropp för 1 h i rumstemperatur. - Centrifugera celler vid 160 x g i 5 m vid 4 ° C, Aspirera supernatanten och tvätta 2 x med iskall perm/tvättbuffert.
- Tillsätt 100 µL utspätt sekundära antikroppar.
Obs: För detta protokoll, celler var märkt med antimus 647 nm sekundär antikropp (1: 200). Inkubera sekundär antikropp för 45 min i rumstemperatur på en över slut tube rotator. Skydda celler från ljus genom att Linda rören i folie. - Centrifugera celler vid 160 x g i 5 minuter vid 4 ° C, Aspirera supernatanten och tvätta 2 x med iskall perm/tvättbuffert.
- Tillsätt 1 mL 1% BSA i PBS och utföra FACS omedelbart.
Obs: Generera en framåt vs side scatter spridningsdiagram till gate viabla celler först när du utför FACS. Alternativt använda en kommersiellt tillgängliga live/dead cell fläcken före fastställande celler att identifiera levande och döda cell populationer.
4. immunfärgning av omprogrammerade MEFs
- Aspirera medium från dag 14 omprogrammeras MEFs och tvätta (1 x) med 1 mL 1 x iskall PBS.
Obs: För immunfärgning, omprogrammering utfördes 12 plattor att minimera antikropp lösning volymer. 24 plattor kan också användas; bara halv allt efter volymer. - Aspirera och fixa celler med 500 µL 2% PARAFORMALDEHYD under 10 minuter vid rumstemperatur.
- Sug ut och tvätta cellerna 3 gånger med 1 mL 1 x PBS (5 min per tvätt vid rumstemperatur).
- Permeabilize celler med 500 µL 0,2% permeabilisering reagens i PBS under 15 minuter vid rumstemperatur.
- Aspirera och blockera i 500 µL 10% häst serum i PBS i 30 min i rumstemperatur.
- Aspirera och inkubera med 500 µL av den utspädda primär antikroppen för 1 h i rumstemperatur.
Obs: För detta protokoll, celler var märkt med musen Troponin T eller α-actinin (varje 1: 400) och samtidig märkt med Connexin 43 (1: 400) eller Troponin I (1: 400). - Aspirera primär antikropp och tvätta tre gånger med 1 mL 1 x PBS (5 min per tvätt vid rumstemperatur).
- Aspirera och inkubera med 500 µL utspädda sekundär antikropp i 1 timme vid rumstemperatur.
Obs: För detta protokoll, celler var märkt med antimus 555 nm sekundära antikroppar (1:800) att erkänna Troponin T eller α-actinin och anti-kanin 488 nm sekundära antikroppar (1:800) att erkänna Connexin 43 eller Troponin I. Dessutom, kärnor var fläckade Hoechst (1:10 000). Skydda celler från ljus genom ruvning i mörkret. - Aspirera sekundära antikroppen och tvätta tre gånger med 1 mL 1 x PBS (5 min per tvätt vid rumstemperatur). Linda in plattan i folie för att skydda celler från ljus och lagras vid 4 ° C.
- Bild med tre-kanals epifluorescence mikroskopi.
5. kalcium Imaging
Obs: Om imaging vid 10 X förstoring, standard cell kultur rätter och plattorna är lämpliga för kalcium imaging. Imaging med högre förstoring kräver att celler pläteras på glas coverslips eller glas botten rätter.
- Aspirera medium och tillsätt 2 mL (för en 6 väl plåt) modified Tyrodes lösning (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM glukos, 10 mM HEPES, 0,1% BSA och 1% pyruvat, pH 7,4) innehållande 5 µM Fura-2 AM och 0,1% Pluronic F-127 att slå (D14 t o D20) iCMs. Inkubera i 30 minuter vid 37 ° C.
Obs: Skydda celler från ljus att förhindra härdning av fluorescerande indikator. - Tvätta cellerna i 2 mL Tyrodes lösning under 30 minuter vid rumstemperatur för att tillåta delning förestring av Fura-2 AM.
- Bild med spinning disk konfokalmikroskopi vid 340 nm och 380 nm med Slidebook 5.5 Ca2 + bildhanteringsprogram. Utföra bildtagning i rumstemperatur.
- Kalcium transienter beräknas med hjälp av förhållandet mellan fluorescensintensiteten vid 340 nm över fluorescensintensiteten vid 380 nm.
- Om du vill behandla iCMs med 1 eller 2 µM isoproterenol eller 10 µM nifedipin att manipulera kalcium hantering efter imaging baslinjen kalcium transienter. Lägga till föreningar lokalt i celler och bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Använder den omprogrammering strategi som beskrivs ovan och i figur 1B, genererade vi iCMs med cirka 70% av celler som uttrycker hjärt Troponin T och cirka 55% av celler som uttrycker hjärt α-actinin, kvantifieras av flödescytometri på dag 9 efter transduktion av GHMT2m (figur 2A och B). Dessutom flertalet celler express hjärt Troponin T, Troponin I, och hjärt α-actinin samt gap junction markören Connexin 43 dag 14 efter transduction (figur 2 c och D). Imaging med högre förstoring avslöjar väldefinierade sarcomere strukturerabildandet och gap-junctions bildar mellan angränsande celler (vit pilspetsar, figur 2D). Dessutom visar spontan kontraktion och kalcium transienter funktionerna i iCMs (figur 3A-C och film 1).
Figur 1: tidslinje för omprogrammering och Optimal plätering av celler. (A) spridningsdiagram för logg-omvandlad RNA-seq data för MEFs genereras i vårt labb kontra koda MEFs. R2 värdet och linjär regressionslinje visas. (B) Schematisk bild av alla kritiska steg i GHMT2m-medierad omprogrammering av MEFs. (C) PE celler på 70-80% confluence innan transfection (övre raden, från vänster panel) och god Jordbrukarsed signal 48 timmar efter transfection att indikera transfection effektivitet (översta raden, mitten och höger paneler). MEFs seedade glest före infektion att förhindra överbeläggning över tidsperioden för omprogrammering (nedre raden, från vänster panel) och god Jordbrukarsed signal 48 timmar efter infektion att indikera infektion effektivitet (nedersta raden, mitten och höger paneler). Skalstapeln = 400 µM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: kvantifiering och karakterisering av hjärt proteinuttryck i iCMs. (A och B). Representativa flödescytometri för hjärt Troponin T (A) och α-actinin (B) vid dag 9 efter GHMT2m transduktion, n = 3. (C) ICC färgning för kardiella markörer vid dag 14 efter GHMT2m transduktion. Grön: hjärt Troponin I, Red: hjärt Troponin T (mellersta panelen) och α-actinin (höger panel), och blå: Hoechst färgning för kärnor. Representativa bilder (n = 3). Skalstapeln = 200 µM (D) hög förstoring föreställer sarcomere struktur (Red: hjärt α-actinin (översta raden) och hjärt Troponin T (nedersta raden)) och uttryck av gap junction proteinet Connexin 43 (grön). Vita pilar indikerar gap-junctions bildats mellan angränsande celler. Representativa bilder (n = 3). Skalstapeln = 100 µM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: funktionella kvantifiering av iCMs. (A) tid kursen slå blodkroppar efter GHMT2m transduktion. Misshandeln cellerna räknades av ögat och blodkroppar från 10 fält per maträtt över 3 rätter per experiment var i genomsnitt och ingår i panelen A. (B och (C) inspelade kalcium transienter av iCMs. Kalcium övergående frekvens ändras i iCMs efter behandling med 1 µM Isoproterenol eller 10 µM nifedipin. F340/F380, förhållandet mellan fluorescensintensiteten vid 340 och 380 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1: slå iCMs. Filmen visar misshandeln iCMs på dag 12 in vitro. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
| iCM Media | ||
| Namnet på reagens | Volym (mL) | Slutlig koncentration |
| DMEM hög glukos | 320 | |
| Medium 199 | 80 | |
| Fetalt bovint Serum | 50 | 10% |
| Givare häst Serum | 25 | 5% |
| MEM essentiella aminosyror, 50 x | 10 | 1 x |
| Natrium pyruvat lösning, 100 x | 5 | 1 x |
| MEM icke-essentiella aminosyror, 100 x | 5 | 1 x |
| MEM Vitamin lösning, 100 x | 5 | 1 x |
| Insulin-Transferrin-selen, 100 x | 5 | 1 x |
| B27, 50 x | 10 | 1 x |
| Penicilin-Streptomycin | 5.5 | 1,1% |
| L-glutamin tillägg | 5.5 | 1,1% |
| PE-medier | ||
| Namnet på reagens | Volym (mL) | Slutlig koncentration |
| DMEM hög glukos | 450 | |
| Fetalt bovint Serum | 50 | 10% |
| Penicilin-Streptomycin | 5.5 | 1,1% |
| L-glutamin tillägg | 5.5 | 1,1% |
| Blasticidin-HCl - 10mg/mL | 0,5 | 10 µg/mL |
| Puromycin dihydroklorid | 0,05 | 1 µg/mL |
| Tillväxt medier | ||
| Namnet på reagens / utrustning | Volym (mL) | Slutlig koncentration |
| DMEM hög glukos | 450 | |
| Fetalt bovint Serum | 50 | 10% |
| Penicilin-Streptomycin | 5.5 | 1,1% |
| L-glutamin tillägg | 5.5 | 1,1% |
Tabell 1: Odlingsmedier. Recept på odlingsmedium som används i detta protokoll.
| PE celler | ||||||
| Cell kultur maträtt | Yta (cm2) | Seedning densitet (celler) | Media volym (mL) | Totala DNA per transfection (µg) | Transfection reagens (µL) | Opti-MEM (µL) |
| 15 cm | 176,7 | 11.25 x 106 | 20 | 36 | 108 | 1080 |
| 10 cm | 78,5 | 5 x 106 | 10 | 12 | 36 | 360 |
| 60 mm | 28,2 | 1,7 x 106 | 4 | 4 | 12 | 120 |
| 6 väl plattan | 9 | 0,54 x 106 | 2 | 1.3 | 3.9 | 39 |
| 12 väl plattan | 4 | 0,24 x 106 | 1 | 0,6 | 1.8 | 18 |
| 24 väl plattan | 2 | 0,12 x 106 | 0,5 | 0,3 | 0,9 | 9 |
| MEFs | ||||||
| Cell kultur maträtt | Yta (cm2) | Seedning densitet (celler) | Media volym (mL) | Hexadimethrine metylbromid (µL) | ||
| 15 cm | 176,7 | 1,35 x 106 | 20 | 12 | ||
| 10 cm | 78,5 | 0,6 x 106 | 10 | 6 | ||
| 60 mm | 28,2 | 0,2 x 106 | 4 | 2.4 | ||
| 6 väl plattan | 9 | 0,1 x 106 | 2 | 1.2 | ||
| 12 väl plattan | 4 | 0,4 x 105 | 1 | 0,6 | ||
| 24 väl plattan | 2 | 0,2 x 105 | 0,5 | 0,3 | ||
Tabell 2: seedning densiteter för omprogrammering. Tabell över seedning densiteter för PE celler och MEFs för gemensamma cellformat kultur maträtt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Föreliggande studie beskriver en högeffektiv strategi för att programmera direkt fibroblaster i funktionella iCMs via leverans av GHMT2m omprogrammering faktorer kombinerat med dämpning av pro-fibrotiska signalvägar. Med hjälp av flödescytometri, Immunofluorescerande imaging, kalcium imaging, och slog blodkroppar, visar vi flertalet celler i detta protokoll genomgå framgångsrika omprogrammering och anta CM härstamning öde. Vi har tidigare visat att tillägg av anti fibrotiska föreningar inklusive TGF-β typ jag receptor hämmare A-83-01 ger en ungefär 6-fold ökning av antalet stryk iCMs jämfört transduktion med GHMT2m ensam, vilket indikerar att Pro-fibrotiska signalering är en stark endogena barriär mot hjärt omprogrammering. Detta system kan därför utnyttjas för drug screening för att undersöka mekanismer som styr cardiomyogenesis; tillägg av en liten molekyl tillsammans med A-83-01 kunde avslöja negativ regulatorer av cardiomyogenesis. Omvänt, tillägg av en liten molekyl till GHMT2m ensam kunde belysa positiva regulatorer av cardiomyogenesis. Nysta upp de mekanismer genom vilka dessa positiva och negativa regulatorer styr CM differentiering kommer att resultera i en bättre förståelse av cardiomyogenesis och leda till ännu mer effektiv omprogrammering och mognad protokoll.
Många variabler påverkar omplanering effektivitet. Vi finner att bordläggningen celldensitet kraftigt påverkar både produktionen av retrovirala partiklar vid PE celler och effektiva upptaget av alla omplanering faktorer när det gäller MEFs. Dessutom kan antalet passage påverka dessa parametrar samt. För att säkerställa optimal produktion av viruspartiklar, transfect PE celler innan passage 20. För att säkerställa effektivt upptag av retrovirala partiklar, inte passage MEFs efter frysning.
Flera färska studier har även visat hög verkningsgrad omprogrammering av MEFs genom att knacka ner PRC1 medlem Bmi tillsammans med uttryck av GMT30 eller överuttryck Akt utöver GHMT37. Tillägg av ZFN281 till GHMT + Akt ledde till en 4-faldig ökning av troponin T positiva celler i vuxen tail tip fibroblaster, delvis tillskrivas dämpning av inflammatoriska gen signaturer38. Kombinationen av en TGF-β signalering hämmare och WNT signalering hämmare ökade dessutom GMT-medierad hjärt omprogrammering39. Allt verkar signalvägar som är inblandade i dessa studier inte överlappar varandra. Därför är det sannolikt att överhörning mellan flera signalvägar kan ytterligare förbättra hjärt omprogrammering.
Ett antal studier visat omplanering i vivo genom leverans av omprogrammering faktorer hos möss efter vänster främre fallande (LAD) artär ligatur25,32,39,40 ,41. Dessa studier visade blygsam förbättring vänsterkammarfunktion efter MI, vilket understryker den terapeutiska potentialen av hjärt omprogrammering på hjärtat regeneration efter skador. Våra protokoll omprogrammerar MEFs med högsta effektivitet i vitro hittills. Därför, det ska bli intressant att se om högeffektiv omprogrammering är kan helt återställa hjärtat funktion efter skada invivo. Dessa studier skulle kunna tjäna som en grund för att omsätta denna metod i romanen cellterapi för patienternas efter infarkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av medel från Boettcher stiftelsens Webb-Waring biomedicinska forskningsprogram, amerikansk hjärtat Association vetenskapsman utveckling Grant (13SDG17400031), University of Colorado Institutionen för medicin utestående tidig karriär Scholar Program, University of Colorado avdelningen för kardiologi Barlow Nyle kapitalförsäkring och NIH R01HL133230 (till KS). A.S.R stöddes av NIH/NCATS Colorado CTSA Grant nummer TL1TR001081 och en pre doktorand stipendium från University of Colorado konsortiet för fibros forskning & översättning (CFReT). Denna forskning stöddes också av Cancer Center stöd beviljande (P30CA046934), den kärnor forskningsbidrag för hud sjukdomar (P30AR057212) och Flow flödescytometri kärnan vid University of Colorado Anschutz Medical Campus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 Mice | Charles River's Laboratory | 027 | For MEF isolation |
| Platinum E (PE) Cells | Cell Biolabs, INC | RV-101 | For retrovirus production |
| DMEM High Glucose | Gibco | SH30022.FS | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150-059 | Component of iCM media |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100106 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Donor Horse Serum | Gemini | 100508 500 | Component of iCM media |
| MEM Essential Amino Acids, 50X | Life Technologies | 11130051 | Component of iCM media |
| Sodium Pyruvate Solution, 100X | Life Technologies | 11360070 | Component of iCM media and for calcium imaging |
| MEM Non-Essential Amino Acids, 100X | Life Technologies | 11140050 | Component of iCM media |
| MEM Vitamin Solution, 100X | Life Technologies | 11120-052 | Component of iCM media |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 41400045 | Component of iCM media |
| B27 | Gibco | 17504-044 | Component of iCM media |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| GlutaMAX (L-Glutamine Supplement) | Gibco | 35050-061 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Blasticidin-HCl | Life Technologies | A11139-03 | Component of PE media |
| Puromycin dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Component of PE media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | For detaching cells from culture dishes |
| A-83-01 | R&D Systems - Tocris | 2939/10 | Treat cells to inhibit TGF-β signaling - promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM |
| DMSO | Thermo Scientific | 85190 | For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium |
| SureCoat | Cellutron | SC-9035 | For coating dishes to plate MEFs |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection Reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 11058-021 | Transfection Reagent |
| pBabe-X Myc-GATA4 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Hand2 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Mef2c | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Tbx5 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-1 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-133 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X GFP | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268-5G | For viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL |
| Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores) | Nalgene | 569-0020 | For filtering media |
| Syringes | Bd Vacutainer Labware | 309654 | For viral filtration |
| 0.45 µm Filters | Celltreat | 229749 | For viral filtration |
| 70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | For MEF isolation and Flow Cytometry |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry |
| perm/wash buffer | BD | 554723 | For washing cells for flow cytometry |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-250 | For washing cells |
| Bovine Serum Albumin | VWR | 0332-100g | For flow cytometry and calcium imaging |
| Goat Serum | Sigma | G9023 | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Donkey Serum | Sigma | D9663-10mg | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Mouse Troponin T | Thermo Scientific | ms-295-p | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Mouse α-actinin | Sigma | A7811L | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Rabbit Connexin 43 | Sigma | C6219 | 1:400 IF |
| Rabbit Troponin I | PhosphoSolutions | 2010-TNI | 1:400 IF |
| Hoechst | Life Technologies | 62249 | 1:10000 IF |
| Alexa 488, rabbit | Life Technologies | A-11034 | 1:800 IF |
| Alexa 555, mouse | Life Technologies | A-21422 | 1:800 IF |
| Alexa 647, mouse | Life Technologies | A-31571 | 1:200 Flow Cytometry |
| 27-color ZE5 Flow Cytometer | Bio-RAD | For FACS | |
| Paraformaldehyde | sigma | P6148-500mg | For fixing cells for IF |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | For permeabilization of cells for IF |
| EVOS™ FL Color Imaging System | Thermo Scientific | AMEFC4300 | For IF |
| NaCl | RPI | S23020-5000 | For calcium imaging |
| KCl | VWR | 395 | For calcium imaging |
| CaCl2 | Fisher | C614-500 | For calcium imaging |
| MgCl2 | VWR | 97061-352 | For calcium imaging |
| glucose | sigma | G7528-250g | For calcium imaging |
| HEPES | sigma | H4034-500g | For calcium imaging |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F1221 | For calcium imaging |
| Fluronic F-127 | Sigma | P2443-250g | For calcium imaging |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | For disruption calcium transients in iCMs - use at 10 µM |
| Isoproterenol | sigma | I6504-1g | For increasing number of calcium transients in iCMs - use at 1-2 µM |
| Marianas Spinning Disk Confocal microscope | 3i | For calcium imaging | |
| ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| bleach | Clorox | ||
| 50 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 227261 | |
| 15 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 188271 | |
| 15 cm cell culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 10 cm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 60 mm cell culture dishes | GREINER BIO-ONE | 628160 | |
| 6 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| 12 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 665180 | |
| 24 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 662160 |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
- Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D. Cardiac muscle regeneration: lessons from development. Genes & Development. 25 (4), 299-309 (2011).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Nabel, E. G., Braunwald, E. A tale of coronary artery disease and myocardial infarction. N Engl J Med. 366 (1), 54-63 (2012).
- Packer, M., et al. Effect of carvedilol on the morbidity of patients with severe chronic heart failure: results of the carvedilol prospective randomized cumulative survival (COPERNICUS) study. Circulation. 106 (17), 2194-2199 (2002).
- The CAPRICORN Investigators. Effect of carvedilol on outcome after myocardial infarction in patients with left-ventricular dysfunction: the CAPRICORN randomized trial. The Lancet. 357 (9266), 1385-1390 (2001).
- Marangou, J., Paul, V. Current attitudes on cardiac devices in heart failure: a review. Clin Ther. 37 (10), 2206-2214 (2015).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Bio. 14 (8), 529-541 (2013).
- Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomized controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
- Schachinger, V., et al. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1210-1221 (2006).
- Huikuri, H. V., et al. Effects of intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells on left ventricular function, arrhythmia risk profile, and restenosis after thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. Eur. Heart J. 29 (22), 2723-2732 (2008).
- Janssens, S., et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 367 (9505), 113-121 (2006).
- Lunde, K., et al. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1199-1209 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial - a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart J. 152 (3), 434-441 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
- Karantalis, V., et al. Autologous mesenchymal stem cells produce concordant improvements in regional function, tissue perfusion, and fibrotic burden when administered to patients undergoing coronary artery bypass grafting: The Prospective Randomized Study of Mesenchymal Stem Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (PROMETHEUS) trial. Circ Res. 114 (8), 1302-1310 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: A source of cardiac regeneration. J. Mol. Cell. Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
- Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 357-386 (2010).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
- Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100 (1), 105-113 (2013).
- Qian, L., Berry, E. C., Fu, J., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
- Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
- Ifkovitz, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. Inhibition of TGFβ signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes. PLoS One. 9 (2), e89678 (2014).
- Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
- Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8 (5), e63577 (2013).
- Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA induced cardiac reprogramming in vivo: evidence for mature cardiac myocytes and improved cardiac function. Circ Res. 116 (3), 418-424 (2015).
- Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110 (11), 1465-1473 (2012).
- Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), 1216-1220 (2016).
- Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nature Communications. 6, 1-15 (2015).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7, 1063-1066 (2000).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Zhou, H., et al. ZFN281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression. Genes & Dev. 31, 1770-1783 (2017).
- Mohamed, T. M., et al. Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming. Circulation. 135, 978-995 (2017).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
- Mathison, M., et al. In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration. J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).
