Summary
Hier presenteren we een robuuste methode om te herprogrammeren primaire embryonale fibroblasten in functionele cardiomyocytes via overexpressie van GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 en miR-133 (GHMT2m) naast remming van TGF-β signalering. Ons protocol genereert kloppend cardiomyocytes zo spoedig 7 dagen na transductie met korting tot 60% efficiëntie.
Abstract
Trans-differentiatie van een somatische in een ander celtype heeft een enorm potentieel aan model en behandelen van ziekten bij de mens. Eerdere studies hebben aangetoond dat muis embryonale, dermale en cardiale fibroblasten kunnen worden geherprogrammeerd in functionele geïnduceerde-cardiomyocyte-achtige cellen (iCMs) via overexpressie van cardiogeen transcriptiefactoren, met inbegrip van GATA4, Hand2, Mef2c, en Tbx5 zowel in vitro als in vivo. Deze eerdere studies hebben echter aangetoond dat relatief lage efficiëntie. Om te herstellen na letsel hartfunctie, moeten mechanismen bestuur cardiale herprogrammering worden opgehelderd om efficiëntie en rijping van iCMs te verhogen.
Wij eerder aangetoond dat remming van pro-fibrotische signalering drastisch verhoogt de efficiëntie van de herprogrammering. Hier, detail we methoden een herprogrammering efficiëntie tot 60% te bereiken. Daarnaast beschrijven we verschillende methoden inclusief stroom cytometry, immunefluorescentie imaging en calcium imaging te kwantificeren herprogrammering efficiëntie en rijping van geherprogrammeerde fibroblasten. Met behulp van het protocol dat gedetailleerde hier, kunnen mechanistisch onderzoek plaatsvinden om te bepalen van de regelgevers van de positieve en negatieve cardiale te herprogrammeren. Deze studies kunnen identificeren signaalroutes die kunnen worden gericht om herprogrammering efficiëntie en rijping, die tot nieuwe celtherapieën leiden kan voor de behandeling van de ziekte van het hart van de mens te bevorderen.
Introduction
Ischemische hartziekten is een belangrijke doodsoorzaak in de Verenigde Staten1. Ongeveer 800.000 Amerikanen ervaring een eerste of terugkerende myocardiaal infarct (MI) per jaar1. Na MI, de dood van cardiomyocytes (CMs) en cardiale fibrose, gestort door geactiveerde cardiale fibroblasten, afbreuk doen aan hart functie2,3. Progressie van hartfalen na MI is grotendeels onomkeerbaar te wijten aan de slechte regeneratief vermogen van volwassen CMs4,5. Terwijl de huidige klinische therapieën vertragen van de progressie van de ziekte en verminderen risico van toekomstige cardiale gebeurtenissen6,,7,,8,9, keren geen therapieën progressie van de ziekte als gevolg van het onvermogen om te regenereren CMs na infarct10. Nieuwe celtherapieën ontstaan voor de behandeling van patiënten na MI. teleurstellend, klinische proeven leveren van stamcellen naar het hart na MI tot nu toe hebben aangetoond onduidelijk regeneratief mogelijke11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.
De generatie van mens-afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) van fibroblasten door overexpressie van vier transcriptiefactoren, eerst gedemonstreerd door Takahashi & Yamanaka, opende de deur naar nieuwe doorbraken in cel therapie19. Deze cellen kunnen onderscheiden in alle drie kiem lagen19, en verscheidene zeer efficiënte methoden voor het opwekken van grote aantallen CMs is eerder gebleken dat20,21. HiPSC-afgeleide CMs (heupen-CMs) biedt een krachtig platform om te bestuderen van de cardiomyogenesis en kan belangrijke gevolgen hebben voor het hart na letsel herstellen. Echter, heupen-CMs momenteel hindernissen translationeel als gevolg van de bezorgdheid van Teratoom vorming22, en hun onvolwassen aard kan pro-arrhythmogenic23. Herprogrammering van de fibroblasten in hiPSCs leidde tot interesse in direct herprogrammering fibroblasten in andere celtypes. Ieda et al. aangetoond dat overexpressie van GATA4, Mef2c en Tbx5 (GMT) fibroblasten resulteert in directe herprogrammering aan cardiale afkomst, zij het op een lage efficiëntie24. Herprogrammering van efficiëntie is verbeterd met de toevoeging van Hand2 (GHMT)25. Sinds deze vroege studies, hebben veel publicaties aangetoond dat het veranderen van de herprogrammering factor cocktail met extra transcriptie26,27,28,29 factoren, chromatine modifiers30,31, microRNAs32,33, of kleine moleculen34 tot verbeterde leidt herprogrammering efficiëntie en/of rijping van geïnduceerde cardiomyocyte-achtige cellen (iCMs ).
Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het genereren van iCMs van muis embryonale fibroblasten (MEFs) met een hoog rendement. Wij eerder toonde aan dat de GHMT cocktail is aanzienlijk verbeterd met de toevoeging van miR-1 en miR-133 (GHMT2m) en is verder verbeterd wanneer pro-fibrotische signaling pathways inclusief transformeren groeifactor β (TGF-β) signalering of Rho-geassocieerde proteïne kinase (ROCK) signaalroutes zijn geremde35. Met behulp van dit protocol, we laten zien dat ongeveer 60% van de cellen express cardiale troponine T (cTnT), ongeveer 50% express α-actinin en een groot aantal cellen van de afstraffing waarneembaar zo spoedig dag 11 na transductie van herprogrammering factoren en behandeling de TGF-β typ ik receptor remmer A-83-01. Bovendien, deze iCMs express gap junction eiwitten met inbegrip van connexin 43 en spontane contractie en calcium transiënten tentoon te stellen. Dit gemarkeerd verbetering in efficiëntie ten opzichte van eerdere studies herprogrammering toont het potentieel om te regenereren CMs van endogene cel populaties die in het na hartinfarct blijven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten waarbij dieren werden goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité bij de UC Denver Anschutz medische Campus.
1. isolatie van MEFs
- Koop C57BL/6 zwangere muizen op E13. Schip 's nachts.
- De moeder volgens goedgekeurde IACUC protocollen euthanaseren (ex: ~1.3 L/min CO2 totdat dier dood verschijnt gevolgd door cervicale dislocatie)
- Spray de moeder met 70% ethanol en openen van de buikholte. Verwijderen van de baarmoeder hoorn met embryo's en plaatsen in een 10 cm schotel met steriel PBS.
- Maak een incisie in de embryo sac vrijgeven embryo. Overdracht van embryo om 10 cm schotel met steriel PBS schoon te maken. Spoel grondig.
- Snijd het lichaam onder de lever en negeren het hoofd en het bovenlichaam. Verwijderen van de inwendige organen en gooi deze weg. Het resterende weefsel overbrengen in een schone 10 cm schotel met steriel PBS en breng de plaat naar een bioveiligheid niveau 1 of 2 kabinet. Combineren weefsels van alle embryo's in een schone, droge 10 cm schotel en gehakt in fijne stukjes.
- 6 mL van 0,25% trypsine/1 mM EDTA aan gehakt embryo's toevoegen. Triturate meerdere malen Pipetteer te breken van weefsel. Incubeer gedurende 40 minuten bij 37 ˚C met 5% CO2.
- Resuspendeer de cellen in groeimedium (tabel 1). Het volume van media is aangepast op basis van het aantal embryo's geoogst. In het algemeen, een verhouding van ongeveer 25 mL groei media per 1.2 embryo's gebruiken.
- Plaat 25 mL geresuspendeerde cellen in een 15 cm schotel. Na 24u, gecombineerd de media en voeg 25 mL vers groeimedium aan elke plaat.
- Na 72 uur, voeg toe 2 mL van 0,25% trypsine/1 mM EDTA aan elke 15 cm schotel. Wanneer cellen van de cultuur-schotel loskoppelen, trypsine met 15 mL groeimedium inactivering en verzamelen van cellen in 50 mL polystyreen conische buisjes. Centrifugeer cellen gedurende 3 minuten op 160 x g bij kamertemperatuur. Resuspendeer de pellet cel in groeimedium en filter door een 70 µm porie cel zeef.
- Met behulp van een hemocytometer cellen tellen en bevriezen van MEFs in 2 miljoen cellen aliquots in bevriezen medium (10% DMSO, 25% FBS in Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) / hoge glucose) bij-80 ° C. Overbrengen in cellen vloeibare stikstof na 24 h en de winkel tot klaar voor gebruik.
Opmerking: Global genexpressie in MEFs werd geprofileerd geïsoleerd met behulp van dit protocol door RNA-sequentiebepaling (RNA-seq) om verificatie van de cel. RNA-seq gegevens uit coderen MEF cellen werden gedownload van NIH gen expressie Omnibus (GEO) met toetreding nummer GSE93454. RNA-seq gen expressie gegevens voor de MEFs door ons gebruikt werden neergelegd in NIH GEO bij toetreding nummer GSE71405. Deze twee gegevensverzamelingen werden samengevoegd volgens gemeenschappelijke gene symbolen. De expressie gegevens werden vervolgens log-omgevormd en een scatterplot van de gegevens van de expressie voor onze MEFs en CODEER MEFs werden gegenereerd en passen met een lineaire regressielijn (figuur 1A). MEFs geïsoleerd met behulp van dit protocol zijn moleculair vergelijkbaar zijn met die geïsoleerd door andere laboratoria.
2. productie van Retrovirus en transductie van MEFs
Opmerking: Alle stappen in deze sectie moeten worden uitgevoerd in een kast van bioveiligheid niveau 2. Aangezien dit protocol maakt gebruik van retrovirale signaaltransductie, zorgen dat de veiligheid voorzorgsmaatregelen worden getroffen, met inbegrip van behandeling die alle die virale media met 10% bleekwater voor ten minste 20 min. verwijs naar figuur 1B voor een tijdlijn afvalstoffen voor herprogrammering.
-
Productie van Retrovirus met behulp van de cellijn Platinum E (PE)
- Handhaven van verkrijgbare PE cellen in PE medium (tabel 1) met blasticidin en puromycin selectie markers om expressie van gag-pol en env genen voor efficiënte retrovirale deeltje productie36 . De cellen van de passage op 1:4 of 1:5 om de twee dagen. Zorg om te voorkomen dat overbevolking van cellen zoals dit retrovirale productie rendementen kan verminderen.
- Op de dag -1, seed ongeveer 5 x 106 cellen per 10 cm schotel in het groeimedium (tabel 1) 16-20 h vóór transfectie (Zie tabel 2 voor de plating dichtheden voor andere standaard cel cultuur schotel maten). Zachtjes heen en weer meerdere malen rock gerechten en zorgvuldig plaats in een 37 ° C, 5% CO2 incubator zelfs plating verdeling (Zie Figuur 1 c voor optimale plating dichtheid vóór transfectie).
Opmerking: zorg plaat PE cellen in het medium gratis selectie markeringen vóór transfectie om opslagmedium met gegenereerde retrovirale deeltjes doodt niet MEFs. - Op de dag 0, voorbereiden op DNA transfectie. Voor 10 cm schotel transfectie, voeg 2 µg voor elke herprogrammering factor — GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 en miR-133 (GHMT2m) — tot een 1,5 mL koker.
Opmerking: Raadpleeg tabel 2 op de schaal van de hoeveelheid DNA die nodig zijn voor andere standaard cel cultuur schotel maten transfect. - In een aparte 1,5 mL-buis, 360 µL verminderde serum media hebt toegevoegd. Voeg dan 36 µL transfectiereagens rechtstreeks aan verminderde serum media. Zachtjes flick van de buis en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
Opmerking: Om te voorkomen dat de verminderde transfectie efficiëntie, zorgvuldig transfectiereagens rechtstreeks toevoegen aan de verminderde serum media. - Verminderde serum media/transfectie reagens mengsel toevoegen aan GHMT2m DNA cocktail. Zachtjes flick van de buis en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Doen niet vortex.
- Het reactiemengsel ontkleuring aan PE cellen toevoegen, zachtjes swirl van media voor 10-15 s en plaatsen in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
Opmerking: Volgens de fabrikant, PE cellen genereren een gemiddelde titer van 106 tot 107 besmettelijke eenheden/mL. Dit protocol genereert ongeveer 2 x 106 infecties eenheden/mL door 24 h en 6 x 106 infecties eenheden/mL door 48 h gemiddeld MOI van 4. De transfectie van GFP/DsRed kan ook worden gebruikt als een surrogaat voor Transfectie/transductie efficiëntie indien gewenst; efficiëntie van de transfectie wordt verwacht dat hoger is dan 90% door 48 h (Figuur 1 c).
-
Transductie van MEFs
- Jas gerechten met collageen en breng dit in een 37 ° C, 5% CO2 incubator voor ten minste 2 uur op de dag 0.
- MEFs verwijderen van vloeibare stikstof en dooi. Plaat 0,2 x 106 cellen per 60 mm schotel in het groeimedium. Zachtjes rock platen om ervoor te zorgen zelfs plating distributie en plaats in de incubator (Zie Figuur 1 c voor optimale plating dichtheid en tabel 2 voor de plating dichtheden voor andere standaard cel cultuur schotel maten).
Opmerking: Deze beplating dichtheden hebben getest over meervoudige batches van geïsoleerde MEFs; tenzij MEFs display gecompromitteerd aanzienlijk levensvatbaarheid, is cel zaaien dichtheden aanpassen niet nodig. - Op de dag 1, 24 h na transfectie, kunt een 30 mL spuit retrovirale medium gegenereerd door PE cellen verzamelen. Het medium passeren door een 0,45 µm poriegrootte filter in een conische buis van 50 mL. Hexadimethrine bromide transfectiereagens toevoegen om een eindconcentratie van 6 µg/mL. Voeg 10 mL verse groeimedium aan PE cellen door pipetting media op de wand van de schotel cultuur om te voorkomen dat de verplaatsing van de cellen.
- Het medium van MEFs gecombineerd en 4 mL vers geoogste retrovirale voedingsbodem toevoegen aan elk gerecht. MEFs terugkomen in de incubator. 10% bleekwater toevoegen aan alle materialen in contact met het virale medium te neutraliseren retrovirale deeltjes.
- Op de dag 2, 48 h na transfectie, herhaal stap 2.2.2 en 2.2.3. PE cellen worden verwijderd na de 2nd -collectie van het retrovirale medium.
Opmerking: Voeg 10% bleekwater toe aan afgedankte PE cellen voor ten minste 20 min. te neutraliseren van ongewenste retrovirus. - Op dag 3 gecombineerd medium uit MEFs en vullen met 4 mL iCM medium (tabel 1) met de 0,5 µM A-83-01, een TGF-β controletype I receptor remmer. Aanvullen iCM opslagmedium met A-83-01 om de 2 dagen.
Opmerking: Als GFP als een transductie-besturingselement gebruikt, de expressie naar verwachting meer dan 90% door dit punt van tijd (Figuur 1 c).
3. Stroom Cytometry voor cardiale Markers
- Aspirate medium uit dag 9 geherprogrammeerd MEFs en wassen (1 x) met 1 x PBS om dode cellen en puin te verwijderen.
- Voeg 1 mL 0,25% trypsine/EDTA gedurende 5 minuten bij 37 ˚C. Controleer met behulp van een lichte Microscoop cellen staan en schud nu schotel; Als cellen aangesloten blijven, incubeer 5 meer min op 37 ˚C tot cellen los.
- Cellen in 1 x PBS met 5% FBS en filter door een 70 µm porie cel zeef wassen.
- Centrifugeer bij 160 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur en aspirate vloeistof uit de pellet.
Opmerking: Het vergroten van de opbrengst van de cel, laat ongeveer 50 µL vloeistof boven de cel-pellet. - Spoel de cellen met 500 µL 1 x PBS met 1% BSA.
- Fix cellen met 0,2 mL/1 miljoen cellen fixatie oplossing voor 20 min op ijs.
- Voeg 1 mL 1 x ijskoude perm/afwas buffer.
Opmerking: De fabrikant oplossing is 10 x. - Centrifugeer cellen bij 160 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en supernatant gecombineerd.
- Herhaal stap 3.7 en 3.8 een extra tijd. Na de 2nd wash, ga direct naar volgende stap of houden cellen bij 4 ° C's nachts.
- Blokkeren met 100 µL van de serum van 5% geit en ezel serum in 1 x perm/afwas buffer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 100 µL van verdunde primair antilichaam.
Opmerking: Voor dit protocol, cellen waren gelabeld met Muis Troponine T (1:200) en muis α-actinin (1:200) te kwantificeren van het percentage cellen positief voor belangrijke onderdelen van de cardiale Sarcomeer. Primair antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur incuberen. - Centrifugeer cellen bij 160 x g gedurende 5 m bij 4 ° C, gecombineerd supernatant en 2 x met ijskoude perm/afwas buffer wassen.
- Voeg 100 µL van verdunde secundair antilichaam.
Opmerking: Voor dit protocol, cellen waren gelabeld met anti-muis 647 nm secundair antilichaam (1:200). Incubeer secundair antilichaam gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur op een eind over buis rotator. Beschermen cellen tegen licht door buizen in folie wikkelen. - Centrifugeer cellen bij 160 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, gecombineerd supernatant en 2 x met ijskoude perm/afwas buffer wassen.
- Voeg 1 mL van de 1% BSA in PBS en FACS onmiddellijk uit te voeren.
Opmerking: Genereer een voorwaartse vs kant scatter scatterplot naar gate levensvatbare cellen eerst bij het uitvoeren van FACS. Ook gebruiken een commercieel beschikbare live/dode cel vlek vóór de vaststelling van de cellen dood cel populaties te identificeren live.
4. immunokleuring van geherprogrammeerde MEFs
- Aspirate medium uit dag 14 geherprogrammeerd MEFs en wassen (1 x) met 1 mL 1 x ijskoude PBS.
Opmerking: Voor immunokleuring, herprogrammering werd uitgevoerd in 12 goed platen om te minimaliseren van antilichaam oplossing volumes. 24 goed platen kunnen ook worden gebruikt; gewoon half alle volgende volumes. - Gecombineerd en herstellen van cellen met 500 µL 2% paraformaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Gecombineerd en wassen van cellen 3 keer met 1 mL 1 x PBS (5 min per wasbeurt bij kamertemperatuur).
- Permeabilize cellen met 500 µL 0,2% permeabilization-reagens in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Gecombineerd en blokkeren in 500 µL 10% paard serum in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Gecombineerd en incubeer met 500 µL van de verdunde primair antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
Opmerking: Voor dit protocol, cellen waren gemarkeerd met Muis Troponine T of α-actinin (elke 1:400) en mede gemarkeerd met Connexin 43 (1:400) of troponine I (1:400). - Gecombineerd primair antilichaam en spoel driemaal met PBS van de 1 x 1 mL (5 min per wasbeurt bij kamertemperatuur).
- Gecombineerd en met 500 µL verdunde secundair antilichaam Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
Opmerking: Voor dit protocol, cellen waren gelabeld met anti-muis 555 nm secundair antilichaam (1:800) te herkennen troponine T of α-actinin en anti-konijn 488 nm secundair antilichaam (1:800) te herkennen Connexin 43 of troponine I. Bovendien, kernen werden gekleurd met Hoechst (1:10, 000). Beschermen cellen tegen licht door het broeden in het donker. - Het secundaire antilichaam gecombineerd en spoel driemaal met PBS van de 1 x 1 mL (5 min per wasbeurt bij kamertemperatuur). Wikkel de plaat in folie cellen beschermen tegen licht te bewaren bij 4 ° C.
- Beeld met behulp van drie-kanaals epifluorescence microscopie.
5. calcium Imaging
Opmerking: Als denkbaar ter 10 X vergroting, standaard cel cultuur gerechten en platen zijn geschikt voor calcium imaging. Beeldvorming bij hogere vergroting vereist dat cellen worden verguld op glas coverslips of glazen bodem gerechten.
- Gecombineerd middellange en voeg toe 2 mL (voor een 6 goed plaat) bewerkt Tyrode de oplossing (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, glucose van 10 mM, 10 mM HEPES, 0,1% BSA en 1% pyruvaat, pH 7.4) met 5 µM Fura-2 ben en 0.1% Pluronic F-127 te verslaan (D14 t o D20) iCMs. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
Opmerking: Beschermen cellen tegen licht om te voorkomen dat het blussen van fluorescerende indicator. - Wassen van cellen in 2 mL Tyrode de oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om ambtshalve verestering van Fura-2 AM.
- Afbeelding met draaiende schijf confocale microscopie bij 340 nm en 380 nm met behulp van Slidebook 5.5 Ca2 + beeldbewerkingssoftware. Het uitvoeren van de beeldvorming bij kamertemperatuur.
- Calcium transiënten zijn berekend op basis van de verhouding tussen de intensiteit van de fluorescentie bij 340 nm over de intensiteit van de fluorescentie op 380 nm.
- Desgewenst behandelen iCMs met 1 of 2 µM isoproterenol of 10 µM Nifedipine te manipuleren calcium behandeling na imaging basislijn calcium transiënten. Lokaal verbindingen aan cellen en afbeelding toevoegen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de herprogrammering strategie geschetst boven en in figuur 1B, we genereerden iCMs met ongeveer 70% van de cellen uiten van cardiale troponine T en ongeveer 55% van de cellen, uiting van cardiale α-actinin, gekwantificeerd door stroom cytometry op dag 9 volgende transductie van GHMT2m (figuur 2A en B). Bovendien, de meerderheid van de cellen express cardiale troponine T, troponine I, en cardiale α-actinin, alsmede de kloof kruising markering Connexin 43 op dag 14 na transductie (figuur 2C en D). Beeldbewerking met hogere vergroting onthult welomschreven Sarcomeer Structuurformatie en gat-verbindingen vormen tussen naburige cellen (witte pijlpunten, figuur 2D). Bovendien, spontane contractie en calcium transiënten aangeven die functionaliteit van iCMs (figuur 3A-C en film 1).
Figuur 1: tijdlijn te herprogrammeren en optimale Plating van cellen. (A) Scatterplot van log-getransformeerd RNA-seq gegevens voor MEFs gegenereerd in ons lab versus ENCODE MEFs. De waarde van R2 en lineaire regressielijn worden weergegeven. (B) schematische voorstelling van alle essentiële stappen in de GHMT2m-gemedieerde herprogrammering van de MEFs. (C) PE cellen bij de samenvloeiing van de 70-80% vóór transfectie (bovenste rij, deelvenster links) en 48 uur na transfectie van GFP signaal om aan te geven van de transfectie efficiëntie (bovenste rij, Midden en rechts panelen). MEFs zaadjes dunbevolkte voorafgaand aan infectie om te voorkomen dat overbevolking over de periode van herprogrammering (onderste rij, deelvenster links) en 48 uur na infectie van GFP signaal om aan te geven van de efficiëntie van de infectie (onderste rij, Midden en rechts panelen). Schaal bar = 400 µM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: kwantificering en karakterisering van cardiale eiwituitdrukking in iCMs. (A en B). Representatieve stroom cytometry voor cardiale troponine T (A) en α-actinin (B) op dag 9 na GHMT2m signaaltransductie, n = 3. (C) ICC kleuring voor cardiale markeringen op dag 14 na GHMT2m transductie. Groen: cardiale troponine I, rood: cardiale troponine T (middelste deelvenster) en α-actinin (rechtervenster) en blauw: Hoechst kleuring voor kernen. Representatieve beelden (n = 3). Schaal bar = 200 µM (D) hoge vergroting denkt van Sarcomeer structuur (Red: cardiale α-actinin (bovenste rij) en cardiale troponine T (onderste rij)) en expressie van gap junction eiwit Connexin 43 (groen). Witte pijlpunten geven kloof kruispunten gevormd tussen naburige cellen. Representatieve beelden (n = 3). Schaal bar = 100 µM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: functionele kwantificering van iCMs. (A) tijdsverloop van cel graven na GHMT2m transductie gewonnen. Kloppend cellen werden geteld door oog en cel telt uit 10 velden per schotel meer dan 3 gerechten per experiment werden gemiddeld en opgenomen in deelvenster A. (B en C) calcium transiënten van iCMs opgenomen. Calcium voorbijgaande frequentie wordt gewijzigd in iCMs na behandeling met 1 µM Isoproterenol of 10 µM nifedipine. F340/F380, de verhouding tussen de intensiteit van de fluorescentie op 340 en 380 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Film 1: Beating iCMs. Film kloppend iCMs tonen op dag 12 in vitro. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
| iCM Media | ||
| Naam van het reagens | Volume (mL) | Eindconcentratie |
| DMEM hoge Glucose | 320 | |
| Medium 199 | 80 | |
| Foetale runderserum | 50 | 10% |
| Donor paard Serum | 25 | 5% |
| MEM essentiële aminozuren, 50 x | 10 | 1 x |
| Natrium pyruvaat oplossing, 100 x | 5 | 1 x |
| MEM niet-essentiële aminozuren, 100 x | 5 | 1 x |
| MEM vitamine oplossing, 100 x | 5 | 1 x |
| Insuline-transferrine-Selenium, 100 x | 5 | 1 x |
| B27, 50 x | 10 | 1 x |
| Penicilin-streptomycine | 5.5 | 1,1% |
| L-Glutamine supplement | 5.5 | 1,1% |
| PE-Media | ||
| Naam van het reagens | Volume (mL) | Eindconcentratie |
| DMEM hoge Glucose | 450 | |
| Foetale runderserum | 50 | 10% |
| Penicilin-streptomycine | 5.5 | 1,1% |
| L-Glutamine supplement | 5.5 | 1,1% |
| Blasticidin-HCl - 10mg/mL | 0,5 | 10 µg Mo/mL |
| Dihydrochloride puromycin | 0,05 | 1 µg/mL |
| Groei Media | ||
| Naam van reagens / apparatuur | Volume (mL) | Eindconcentratie |
| DMEM hoge Glucose | 450 | |
| Foetale runderserum | 50 | 10% |
| Penicilin-streptomycine | 5.5 | 1,1% |
| L-Glutamine supplement | 5.5 | 1,1% |
Tabel 1: Voedingsbodems. Recepten voor kweekmedium gebruikt in dit protocol.
| PE cellen | ||||||
| Cel cultuur schotel | Oppervlakte (cm2) | Seeding dichtheid (cellen) | Media Volume (mL) | Totale DNA per transfectie (µg) | Transfectiereagens (µL) | Opti-MEM (µL) |
| 15 cm | 176,7 | 11.25 x 106 | 20 | 36 | 108 | 1080 |
| 10 cm | 78,5 | 5 x 106 | 10 | 12 | 36 | 360 |
| 60 mm | 28.2 | 1.7 x 106 | 4 | 4 | 12 | 120 |
| 6 goed plaat | 9 | 0.54 x 106 | 2 | 1.3 | 3.9 | 39 |
| 12 goed plaat | 4 | 0,24 x 106 | 1 | 0.6 | 1.8 | 18 |
| 24 goed plaat | 2 | 0.12 x 106 | 0,5 | 0.3 | 0.9 | 9 |
| MEFs | ||||||
| Cel cultuur schotel | Oppervlakte (cm2) | Seeding dichtheid (cellen) | Media Volume (mL) | Hexadimethrine bromide (µL) | ||
| 15 cm | 176,7 | 1.35 x 106 | 20 | 12 | ||
| 10 cm | 78,5 | 0,6 x 106 | 10 | 6 | ||
| 60 mm | 28.2 | 0,2 x 106 | 4 | 2.4 | ||
| 6 goed plaat | 9 | 0.1 x 106 | 2 | 1.2 | ||
| 12 goed plaat | 4 | 0,4 x 105 | 1 | 0.6 | ||
| 24 goed plaat | 2 | 0,2 x 105 | 0,5 | 0.3 | ||
Tabel 2: zaaien dichtheden voor herprogrammering. Inhoudsopgave seeding dichtheden voor PE cellen en MEFs voor gemeenschappelijke celopmaak cultuur schotel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De huidige studie schetst een hoogrenderende strategie om rechtstreeks het herprogrammeren van fibroblasten in functionele iCMs via de levering van GHMT2m factoren gecombineerd met onderdrukking van pro-fibrotische signaalroutes herprogrammering. Met behulp van stroom cytometry, immunefluorescentie beeldvorming, calcium imaging, en het verslaan van de graven van de cel, tonen we de meerderheid van de cellen in dit protocol ondergaan succesvolle herprogrammering en aannemen van CM lineage lot. Wij hebben eerder aangetoond dat de toevoeging van anti-fibrotische verbindingen met inbegrip van het type TGF-β ik receptor remmer A-83-01 levert ongeveer 6-fold toename van het aantal gewonnen iCMs t.o.v. transductie met GHMT2m alleen, waaruit blijkt dat Pro-fibrotische signalering is een sterke endogene belemmering voor cardiale herprogrammering. Dit systeem kan dus worden ingezet voor de drug screening om te onderzoeken van de mechanismen inzake cardiomyogenesis; de toevoeging van een klein molecuul naast A-83-01 kon ontdekken negatieve regulatoren van cardiomyogenesis. Omgekeerd kan de toevoeging van een klein molecuul te GHMT2m alleen positieve regulatoren van cardiomyogenesis verhelderen. Ontrafelen van de mechanismen waarmee deze positieve en negatieve toezichthouders CM differentiatie regeren zal leiden tot een beter begrip van cardiomyogenesis en leiden tot nog meer efficiënte herprogrammering en rijping protocollen.
Vele variabelen beïnvloeden herprogrammering efficiëntie. Wij vinden dat de celdichtheid plating sterk zowel de productie van retrovirale deeltjes in het geval van PE cellen, en de efficiënte opname van alle herprogrammering factoren in het geval van MEFs beïnvloedt. Het nummer van de passage kunt verder afbreuk doen aan deze parameters zo goed. Om te zorgen voor optimale productie van virale deeltjes, transfect PE cellen voor passage 20. Om ervoor te zorgen efficiënte opname van retrovirale deeltjes, niet MEFs passage na invriezen.
Verschillende recente studies hebben ook aangetoond hoogrenderende herprogrammering van MEFs door de PRC1 lid Bmi samen met expressie van GMT30 neerhalend of overexpressing Akt naast GHMT37. Toevoeging van ZFN281 aan GHMT + Akt leidde tot een 4-fold verhoging van troponine T positieve cellen in volwassen staart tip fibroblasten, gedeeltelijk toegeschreven aan onderdrukking van de inflammatoire gene handtekeningen38. Verder is de combinatie van een signalering TGF-β-remmer en WNT signalering remmer verhoogd GMT-gemedieerde cardiale herprogrammering van39. De signaalroutes betrokken in deze studies lijken nog belangrijker is, niet overlappen. Daarom is het waarschijnlijk dat cross-talk tussen meerdere signaalroutes kon versterken cardiale herprogrammering.
Een aantal studies aangetoond herprogrammering in vivo via de levering van herprogrammering factoren in muizen na verlaten anterior aflopende (LAD) slagader afbinding25,32,39,40 ,41. Deze studies toonde bescheiden verbetering in ventriculaire functie na MI, onderstrepen de therapeutische mogelijkheden van cardiale herprogrammering op hart regeneratie na letsel. Ons protocol reprograms MEFs met de hoogste efficiëntie in vitro tot nu toe. Dus het zal interessant om te zien als hoogrendabele herprogrammering geschikt is voor volledig herstel van hart functie na letsel in vivo. Deze studies kunnen dienen als basis voor het vertalen van deze methode in nieuwe celtherapieën voor patiënten na infarct.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door fondsen uit van de Stichting van de Boettcher Webb-Waring biomedische Research Program, American Heart Association wetenschapper ontwikkeling Grant (13SDG17400031), Universiteit van Colorado Vakgroep Geneeskunde uitstaande vroege carrière Geleerde Program, Universiteit van Colorado divisie van cardiologie Barlow Nyle endowment en NIH R01HL133230 (naar KS). A.S.R werd gesteund door de NIH/NCATS Colorado CTSA Grant nummer TL1TR001081 en een-gepromoveerde beurs van de Universiteit van Colorado-Consortium voor fibrose onderzoek & vertaling (CFReT). Dit onderzoek werd ook ondersteund door de kanker Center ondersteuning Grant (P30CA046934), de huid ziekten Cores onderzoeksbeurs (P30AR057212) en de Stroom Cytometry kern op de Universiteit van Colorado Anschutz medische Campus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 Mice | Charles River's Laboratory | 027 | For MEF isolation |
| Platinum E (PE) Cells | Cell Biolabs, INC | RV-101 | For retrovirus production |
| DMEM High Glucose | Gibco | SH30022.FS | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150-059 | Component of iCM media |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100106 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Donor Horse Serum | Gemini | 100508 500 | Component of iCM media |
| MEM Essential Amino Acids, 50X | Life Technologies | 11130051 | Component of iCM media |
| Sodium Pyruvate Solution, 100X | Life Technologies | 11360070 | Component of iCM media and for calcium imaging |
| MEM Non-Essential Amino Acids, 100X | Life Technologies | 11140050 | Component of iCM media |
| MEM Vitamin Solution, 100X | Life Technologies | 11120-052 | Component of iCM media |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 41400045 | Component of iCM media |
| B27 | Gibco | 17504-044 | Component of iCM media |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| GlutaMAX (L-Glutamine Supplement) | Gibco | 35050-061 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Blasticidin-HCl | Life Technologies | A11139-03 | Component of PE media |
| Puromycin dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Component of PE media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | For detaching cells from culture dishes |
| A-83-01 | R&D Systems - Tocris | 2939/10 | Treat cells to inhibit TGF-β signaling - promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM |
| DMSO | Thermo Scientific | 85190 | For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium |
| SureCoat | Cellutron | SC-9035 | For coating dishes to plate MEFs |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection Reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 11058-021 | Transfection Reagent |
| pBabe-X Myc-GATA4 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Hand2 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Mef2c | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Tbx5 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-1 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-133 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X GFP | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268-5G | For viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL |
| Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores) | Nalgene | 569-0020 | For filtering media |
| Syringes | Bd Vacutainer Labware | 309654 | For viral filtration |
| 0.45 µm Filters | Celltreat | 229749 | For viral filtration |
| 70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | For MEF isolation and Flow Cytometry |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry |
| perm/wash buffer | BD | 554723 | For washing cells for flow cytometry |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-250 | For washing cells |
| Bovine Serum Albumin | VWR | 0332-100g | For flow cytometry and calcium imaging |
| Goat Serum | Sigma | G9023 | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Donkey Serum | Sigma | D9663-10mg | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Mouse Troponin T | Thermo Scientific | ms-295-p | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Mouse α-actinin | Sigma | A7811L | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Rabbit Connexin 43 | Sigma | C6219 | 1:400 IF |
| Rabbit Troponin I | PhosphoSolutions | 2010-TNI | 1:400 IF |
| Hoechst | Life Technologies | 62249 | 1:10000 IF |
| Alexa 488, rabbit | Life Technologies | A-11034 | 1:800 IF |
| Alexa 555, mouse | Life Technologies | A-21422 | 1:800 IF |
| Alexa 647, mouse | Life Technologies | A-31571 | 1:200 Flow Cytometry |
| 27-color ZE5 Flow Cytometer | Bio-RAD | For FACS | |
| Paraformaldehyde | sigma | P6148-500mg | For fixing cells for IF |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | For permeabilization of cells for IF |
| EVOS™ FL Color Imaging System | Thermo Scientific | AMEFC4300 | For IF |
| NaCl | RPI | S23020-5000 | For calcium imaging |
| KCl | VWR | 395 | For calcium imaging |
| CaCl2 | Fisher | C614-500 | For calcium imaging |
| MgCl2 | VWR | 97061-352 | For calcium imaging |
| glucose | sigma | G7528-250g | For calcium imaging |
| HEPES | sigma | H4034-500g | For calcium imaging |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F1221 | For calcium imaging |
| Fluronic F-127 | Sigma | P2443-250g | For calcium imaging |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | For disruption calcium transients in iCMs - use at 10 µM |
| Isoproterenol | sigma | I6504-1g | For increasing number of calcium transients in iCMs - use at 1-2 µM |
| Marianas Spinning Disk Confocal microscope | 3i | For calcium imaging | |
| ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| bleach | Clorox | ||
| 50 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 227261 | |
| 15 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 188271 | |
| 15 cm cell culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 10 cm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 60 mm cell culture dishes | GREINER BIO-ONE | 628160 | |
| 6 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| 12 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 665180 | |
| 24 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 662160 |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
- Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D. Cardiac muscle regeneration: lessons from development. Genes & Development. 25 (4), 299-309 (2011).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Nabel, E. G., Braunwald, E. A tale of coronary artery disease and myocardial infarction. N Engl J Med. 366 (1), 54-63 (2012).
- Packer, M., et al. Effect of carvedilol on the morbidity of patients with severe chronic heart failure: results of the carvedilol prospective randomized cumulative survival (COPERNICUS) study. Circulation. 106 (17), 2194-2199 (2002).
- The CAPRICORN Investigators. Effect of carvedilol on outcome after myocardial infarction in patients with left-ventricular dysfunction: the CAPRICORN randomized trial. The Lancet. 357 (9266), 1385-1390 (2001).
- Marangou, J., Paul, V. Current attitudes on cardiac devices in heart failure: a review. Clin Ther. 37 (10), 2206-2214 (2015).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Bio. 14 (8), 529-541 (2013).
- Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomized controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
- Schachinger, V., et al. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1210-1221 (2006).
- Huikuri, H. V., et al. Effects of intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells on left ventricular function, arrhythmia risk profile, and restenosis after thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. Eur. Heart J. 29 (22), 2723-2732 (2008).
- Janssens, S., et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 367 (9505), 113-121 (2006).
- Lunde, K., et al. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1199-1209 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial - a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart J. 152 (3), 434-441 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
- Karantalis, V., et al. Autologous mesenchymal stem cells produce concordant improvements in regional function, tissue perfusion, and fibrotic burden when administered to patients undergoing coronary artery bypass grafting: The Prospective Randomized Study of Mesenchymal Stem Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (PROMETHEUS) trial. Circ Res. 114 (8), 1302-1310 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: A source of cardiac regeneration. J. Mol. Cell. Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
- Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 357-386 (2010).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
- Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100 (1), 105-113 (2013).
- Qian, L., Berry, E. C., Fu, J., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
- Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
- Ifkovitz, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. Inhibition of TGFβ signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes. PLoS One. 9 (2), e89678 (2014).
- Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
- Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8 (5), e63577 (2013).
- Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA induced cardiac reprogramming in vivo: evidence for mature cardiac myocytes and improved cardiac function. Circ Res. 116 (3), 418-424 (2015).
- Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110 (11), 1465-1473 (2012).
- Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), 1216-1220 (2016).
- Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nature Communications. 6, 1-15 (2015).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7, 1063-1066 (2000).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Zhou, H., et al. ZFN281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression. Genes & Dev. 31, 1770-1783 (2017).
- Mohamed, T. M., et al. Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming. Circulation. 135, 978-995 (2017).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
- Mathison, M., et al. In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration. J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).
