Summary
Здесь мы представляем надежный метод для перепрограммирования первичной эмбриональных фибробластов в функциональной кардиомиоцитов путем Сверхэкспрессия GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, мир-1 и мир-133 (GHMT2m) наряду с ингибированием TGF-β сигнализации. Наш протокол создает избиение cardiomyocytes как 7 дней после трансдукция с до 60% эффективности.
Abstract
Транс дифференциация одной соматической клетки типа в другой имеет огромный потенциал для моделирования и лечения заболеваний человека. Предыдущие исследования показали что мыши эмбриональные, фибробласты дермы и сердца могут быть перепрограммированы в функциональных индуцированной cardiomyocyte как клетки (ОГВС) через гиперэкспрессия кардиогенным транскрипционных факторов, в том числе GATA4, Hand2, Mef2c, и Tbx5 в пробирке и в естественных условиях. Однако эти предыдущие исследования показали относительно низкая эффективность. Чтобы восстановить функции сердца, после травмы, механизмы, регулирующие сердца перепрограммирования должны раскрыты для повышения эффективности и созревания ОГВС.
Ранее мы показали, что ингибирование pro фиброзный сигнализации резко повышает эффективность перепрограммирования. Здесь мы подробно методы для перепрограммирования эффективности до 60%. Кроме того мы опишем несколько методов, включая проточной цитометрии, immunofluorescent изображений и изображений кальция для количественного определения перепрограммирования эффективность и созревания перепрограммировать фибробластов. С использованием протокола подробно здесь, механистических исследования могут быть приняты для определить положительные и отрицательные регуляторы сердечной перепрограммирования. Эти исследования могут идентифицировать сигнальных путей, которые могут быть направлены на содействие перепрограммирования эффективность и созревания, что может привести к Роман клеточной терапии для лечения заболеваний сердца человека.
Introduction
Ишемическая болезнь сердца является ведущей причиной смерти в Соединенных Штатах1. Приблизительно 800 000 американцев опыт первого или рецидивирующие инфаркта миокарда (MI) за1год. После ми гибели кардиомиоцитов (CMs) и сердечной фиброз, сданный активированные сердечной фибробластов, повредить сердце функция2,3. Прогрессирование сердечной недостаточности после ми в значительной степени необратимы, из-за плохой регенеративной способностью взрослых CMs4,5. Хотя текущий клинической терапии замедлить прогрессирование болезни и уменьшить риск будущих сердца события6,,78,9, не терапии вспять прогрессирование болезни из-за неспособности Восстановите CMs после инфаркта10. Роман клеточной терапии начинают лечить пациентов после смертоносного MI. неутешительно, клинические испытания, обеспечивая стволовых клеток к сердцу, до настоящего времени после ми показали неубедительными регенеративный потенциал11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.
Поколение человека производные индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) от фибробластов, гиперэкспрессия четырех факторов транскрипции, впервые продемонстрированная Такахаси и Яманака, открыл дверь в новые прорывы в ячейке терапии19. Эти клетки могут дифференцироваться в все три зародышевых19, и несколько очень эффективных методов для генерации большого количества CMs были ранее показали20,21. HiPSC производные CMs (бедра CMs) предлагает мощную платформу для изучения cardiomyogenesis и может иметь важные последствия для восстановления сердца после травмы. Однако бедра CMs в настоящее время сталкиваются поступательные препятствиями из-за проблем формирования тератома22, и их незрелых природа может быть pro аритмогенная23. Перепрограммирование фибробластов в hiPSCs вызвал интерес в непосредственно перепрограммирования фибробластов в другие типы клеток. Арип et al. продемонстрировал что Сверхэкспрессия GATA4, Mef2c и Tbx5 (GMT) в фибробласты, приводит к прямой перепрограммирования для сердечной линии, несмотря на низкую эффективность24. Перепрограммирование эффективность была улучшена с добавлением Hand2 (GHMT)25. Поскольку эти ранние исследования многих публикаций показали, что изменяя перепрограммирования фактор коктейль с дополнительной транскрипции факторы26,27,28,29, Хроматин модификаторы30,31, микроРНК32,33или малых молекул,34 , приводит к улучшению перепрограммирования эффективности и/или созревание индуцированных cardiomyocyte подобных клеток (ОГВС ).
Здесь мы предоставляем подробный протокол для создания iCMs от мыши эмбриональных фибробластов (MEFs) с высокой эффективностью. Мы ранее показал, что коктейль GHMT значительно улучшилась с добавлением мир-1 и мир-133 (GHMT2m) и дальнейшего улучшения при про фиброзный сигнальные пути, включая преобразование фактор роста β (TGF-β) сигнализации или Ро связанные протеин киназы (рок) сигнальные пути являются тормозится35. Используя этот протокол, мы показываем, что приблизительно 60% клеток выразить сердечные тропонина T (cTnT), примерно 50% Экспресс α-актинина, и большое количество биений клеток может наблюдаться 11 день после трансдукции перепрограммирования факторы и лечение в кратчайшие сроки с фонд TGF-β типа ингибитор рецепторов A-83-01. Кроме того эти iCMs Экспресс разрыв соединения белков, включая connexin 43 и спонтанного сокращения и кальция транзиентов. Это отмечено улучшение перепрограммирования эффективности по сравнению с предыдущими исследованиями демонстрирует потенциал для восстановления CMs от эндогенных клеточных популяций, которые остаются в сердца после инфаркта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты, требующих животных были утверждены институциональный уход животных и использования Комитетом на UC Денвер Anschutz медицинского университета.
1. изоляция MEFs
- Приобрести беременных мышей C57BL/6 на E13. Корабль на ночь.
- Усыпить мать согласно утвержденным IACUC протоколы (ex: ~1.3 Л/мин CO2 до появления мертвых животных следуют шейки матки дислокации)
- Спрей мать с 70% этанола и открыть брюшной полости. Удаление рога матки, содержащие эмбрионов и место в 10 см блюдо с стерильных PBS.
- Сделайте надрез в sac эмбриона выпустить эмбриона. Трансфер эмбрионов для очистки 10 см блюдо с стерильных PBS. Тщательно промойте.
- Вырезать тела ниже печени и отбросить головы и верхней части тела. Удалите внутренние органы и отбросить. Передать оставшиеся ткани чистой 10 см блюдо с стерильных PBS и передачи пластину биобезопасности уровня 1 или 2 кабинета. Комбинировать ткани от всех эмбрионов в чистые, сухие 10 см блюдо и фарш на мелкие кусочки.
- Добавьте 6 мл 0,25% трипсина/1 мм толщины ЭДТА в фарш эмбрионов. Нарезанных несколько раз в пипетку с распадаются ткани. Инкубируйте 40 минут при 37 ° c с 5% CO2.
- Ресуспензируйте клетки в среднего роста (Таблица 1). Объем средств массовой информации регулируется основе количество эмбрионов собирают. В общем используйте соотношение примерно 25 мл питательной среды на 1.2 эмбрионов.
- Тарелка 25 мл ресуспензированы клеток в 15 см блюдо. После 24 часов аспирационная средства массовой информации и добавить 25 мл свежего роста среднего для каждой пластины.
- После 72 ч добавьте 2 мл 0,25% трипсина/1 мм толщины ЭДТА в каждое блюдо 15 см. Когда клетки отсоединить от культуры блюдо, инактивировать трипсина с 15 мл среднего роста и собирать клетки в 50 мл полистирола конические трубы. Центрифуга клетки на 3 мин на 160 x g при комнатной температуре. Ресуспензируйте Пелле клеток в среднего роста и фильтр через стрейнер клеток поры 70 мкм.
- Подсчитать ячейки с помощью Горяева и заморозить MEFs аликвоты 2 миллионов клеток в среде замораживания (10% ДМСО, 25% FBS в Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) / высокие глюкоза)-80 ° c. Клетки перехода для жидкого азота после 24 h и магазин до готовой к использованию.
Примечание: Глобальные ген выражение в MEFs профилируемый изолированы используя этот протокол, РНК последовательности (РНК seq) для обеспечения аутентификации клеток. РНК seq данных от кодирования MEF клетки были загружены из низ ген выражение Омнибус (GEO) с номером присоединения GSE93454. Данные выражения гена РНК seq для MEFs, используемые нами были сданы в низ GEO присоединения номер GSE71405. Эти два набора данных были объединены согласно общих генов символов. Выражение данных были затем лог трансформированных и рассеяния выражение данных для наших MEFs и КОДИРОВАТЬ MEFs были создан и подходят с линией линейной регрессии (рис. 1A). MEFs, изолированные, используя этот протокол, молекулярно аналогичны изолированы от других лабораторий.
2. производство ретровируса и трансдукция MEFs
Примечание: Все шаги в этом разделе должна осуществляться в шкафу 2 уровня биобезопасности. Поскольку этот протокол использует ретровирусных трансдукции, убедитесь, что безопасность, которую принимаются меры предосторожности, включая лечение, все отходы, содержащие вирусных средств массовой информации с 10% отбеливатель для по крайней мере 20 минут смотрите на рисунке 1B для временной шкалы для перепрограммирования.
-
Производство ретровируса, используя линии клетки Platinum E (PE)
- Поддерживать коммерчески доступных ячеек PE PE среднего (Таблица 1) содержащий blasticidin и puromycin маркеры выделения обеспечить выражение кляп-Поль и env генов для производства эффективного ретровирусные частицы36 . Проход клеток в 1:4 или 1:5 каждые два дня. Будьте осторожны во избежание переполненности камер, поскольку это может уменьшить ретровирусной производства урожаев.
- В день -1 семя примерно 5 х 106 клеток на 10 см блюдо в среднего роста (Таблица 1) 16-20 h до трансфекции (см. таблицу 2 для покрытия плотности для других размеров блюдо культуры стандартной ячейки). Осторожно покачайте блюда и обратно несколько раз и тщательно место в 37 ° C, 5% CO2 инкубатора для обеспечения даже покрытия распределения (см. Рисунок 1 c для оптимального покрытия плотностью до трансфекции).
Примечание: Будьте осторожны пластины PE клеток в среде свободной от маркеры выделения до трансфекции чтобы убедиться, что носитель, содержащий сгенерированный ретровирусные частицы не убили MEFs. - В тот день 0 подготовиться трансфекции ДНК. Для transfection 10 см блюдо, добавить 2 мкг каждого перепрограммирования фактора — GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, мир-1 и мир-133 (GHMT2m) — до 1,5 мл.
Примечание: Обратитесь к таблице 2 для масштабирования количество ДНК, необходимо transfect другой стандартной ячейки культуры блюдо размеров. - В отдельном 1,5 мл добавьте 360 мкл сокращение сыворотке СМИ. Затем добавьте 36 мкл Реагента трансфекции непосредственно на сокращение сыворотке СМИ. Осторожно проведите трубки и инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин.
Примечание: Чтобы избежать трансфекции снижение эффективности, тщательно добавьте трансфекции реагент непосредственно сокращение сыворотке СМИ. - Добавьте сокращение сыворотке смеси реагентов в СМИ/transfection GHMT2m ДНК коктейль. Осторожно проведите трубки и инкубации при комнатной температуре в течение 15 мин. Сделать не вихря.
- Добавить смесь реакции каплям PE клетки, нежно вихревой СМИ за 10-15 s и место в 37 ° C, 5% CO2 инкубатора.
Примечание: По словам производителя, PE клеток генерировать средний титр 106 -107 инфекционных единиц/мл. Этот протокол создает примерно 2 х 106 инфекций единиц/мл через 24 ч и 6 x 106 инфекций единиц/мл 48 ч в среднем MOI 4. Трансфекция GFP/DsRed может также использоваться в качестве суррогатной эффективность трансфекции/трансдукции при желании; Ожидается, что эффективность трансфекции превышать 90% от 48 h (рис. 1 c).
-
Трансдукция MEFs
- В тот день 0 пальто блюда с коллагеном и место в 37 ° C, 5% CO2 инкубатора для минимум 2 ч.
- Удаление MEFs из жидкого азота и оттепели. Пластина 0,2 х 106 клеток на 60 мм блюдо в среднего роста. Мягко рок пластины для обеспечения даже покрытия распределения и место в инкубатор (см Рисунок 1 c для оптимального покрытия плотностью и таблице 2 покрытие плотности для других размеров блюдо культуры стандартной ячейки).
Примечание: Эти плотности покрытия были протестированы на несколько пакетов изолированных MEFs; Если MEFs дисплея значительно подрывает жизнеспособность, корректировки плотности заполнения ячейки не является необходимым. - В день 1, 24 ч после трансфекции, используйте 30 мл шприц для сбора ретровирусной среднего, порожденных PE клеток. Передайте среды через фильтр размер пор 0,45 мкм в 50 мл Конические трубки. Добавьте hexadimethrine бромид трансфекции реагента в конечной концентрации 6 мкг/мл. Тщательно добавьте 10 мл свежего роста среднего PE клетки дозирования СМИ на стену культуры блюдо для предотвращения перемещения ячеек.
- Аспирационная среднего от MEFs и добавить 4 мл свежеубранных ретровирусной среды в каждое блюдо. Возвращение MEFs для инкубатора. Добавьте 10% Блич все материалы в контакте с вирусной среднего для нейтрализации ретровирусные частицы.
- В день 2, 48 ч после трансфекции, повторите шаги 2.2.2 и 2.2.3. PE клетки удаляются после 2nd коллекции ретровирусной среды.
Примечание: Добавьте 10% отбеливатель отбрасываются клеток PE для по крайней мере 20 минут для нейтрализации нежелательных ретровирус. - На 3 день, аспирационная среднего от MEFs и пополнить с 4 мл iCM носитель (Таблица 1), содержащий 0,5 мкм A-83-01, TGF-β I типа ингибитор рецепторов. Пополняете iCM носитель, содержащий A-83-01 каждые 2 дня.
Примечание: При использовании GFP как элемент трансдукции, выражение ожидается превышает 90% этого времени (рис. 1 c).
3. проточной цитометрии для сердца маркеров
- Аспирационная средний день 9 перепрограммирована MEFs и мыть (1 x) с ПБС для удаления мертвых клеток и мусора.
- В 37 градусов, добавьте 1 мл 0,25% трипсина/ЭДТА на 5 мин. Проверьте ячейки с помощью световой микроскоп и поколебать блюдо; Если клетки остаются присоединенными, Инкубируйте более 5 мин при 37 ° c, пока клетки.
- Вымойте клетки в однократном ПБС, содержащих 5% FBS и фильтр через стрейнер клеток поры 70 мкм.
- Центрифуга на 160 x g 3 мин при комнатной температуре и аспирата жидкости из гранул.
Примечание: Для увеличения урожайности ячейки, оставьте приблизительно 50 мкл жидкости выше ячейки Пелле. - Вымойте клетки с PBS 1 x 500 мкл, содержащей 1% BSA.
- Исправьте клетки с 0,2 мл/1 миллион клеток фиксации решение для 20 мин на льду.
- Добавьте 1 mL 1 x ледяной Пермь/мыть буфера.
Примечание: Решение производителя является 10 x. - Центрифуга клетки на 160 x g 5 минут при температуре 4 ° C и удалить супернатант.
- Повторите шаги 3.7 и 3.8 дополнительное время. После 2-й вымыть сразу перейти к следующему шагу или сохранить клетки на 4 ° C на ночь.
- Блок с 100 мкл 5% сыворотки коза и осел сыворотки в 1 x Пермь/мыть буфер для 30 мин при комнатной температуре.
- 100 мкл разбавленного основное антитело.
Примечание: Для этого протокола, клетки были помечены с помощью мыши тропонина T (1: 200) и мышь α-актинина (1: 200) для количественного определения процент клеток положительный для ключевых компонентов сердца Саркомер. Инкубируйте основное антитело для 1 ч при комнатной температуре. - Центрифуга клетки на 160 x g для 5 м при 4 ° C, аспирационная супернатанта и мыть 2 x с ледяной Пермь/мыть буфера.
- 100 мкл разбавленного вторичное антитело.
Примечание: Для этого протокола, клетки были помечены анти мыши 647 Нм вторичное антитело (1: 200). Инкубируйте вторичное антитело для 45 мин при комнатной температуре на конец над конец трубки ротатора. Защите клетки от света, завернув трубы в фольге. - Центрифуга клетки на 160 x g 5 минут при температуре 4 ° C, аспирационная супернатанта и мыть 2 x с ледяной Пермь/мыть буфера.
- Добавить 1 мл 1% BSA в PBS и немедленно выполнять СУИМ.
Примечание: Генерировать вперед против стороны точечной точечная для первых ворот жизнеспособных клеток, при выполнении СУИМ. Кроме того используйте коммерчески доступных жить/мертвые клетки пятно до фиксации клетки для выявления жить и мертвые клетки населения.
4. иммуноокрашивания перепрограммировать MEFs
- Средний аспирата из 14 день перепрограммировать MEFs и мыть (1 x) с 1 мл раствора 1 x ледяной PBS.
Примечание: Для иммуноокрашивания, перепрограммирование была исполнена в 12 хорошо пластины для сведения к минимуму объемов раствор антител. 24 хорошо плиты также могут быть использованы; просто половина всех после томов. - Аспирационная и исправить клетки с 500 мкл параформальдегида 2% за 10 мин при комнатной температуре.
- Аспирационная и вымыть клетки 3 раза с ПБС 1 мл (5 мин на мыть при комнатной температуре).
- Разрушения клеток с 500 мкл 0,2% permeabilization реагента в PBS для 15 мин при комнатной температуре.
- Аспирационная и блокировать в 500 мкл 10% лошадь сыворотки в PBS на 30 минут при комнатной температуре.
- Аспирационная и проинкубируйте с 500 мкл разбавленного основное антитело за 1 ч при комнатной температуре.
Примечание: Для этого протокола, клетки были помечены с помощью мыши тропонина T или α-актинина (каждый 1: 400) и совместно помечены Connexin 43 (1: 400) или тропонина I (1: 400). - Аспирационная основное антитело и стирать три раза с ПБС 1 мл (5 мин на мыть при комнатной температуре).
- Аспирационная и инкубировать 1 час при комнатной температуре с 500 мкл разбавленного вторичное антитело.
Примечание: Для этого протокола, клетки были помечены анти мыши 555 Нм вторичное антитело (терапевтами) признать тропонина T или α-актинина и анти кролик 488 нм вторичное антитело (терапевтами) признать Connexin 43 или тропонин I. Кроме того, окрашивали ядер "Хёхст" (1:10 000). Защитите клетки от света, инкубации в темноте. - Аспирационная вторичные антитела и стирать три раза с ПБС 1 мл (5 мин на мыть при комнатной температуре). Оберните пластину в фольгу, чтобы защитить клетки от света и хранить при 4 ° C.
- Изображение с помощью 3 канальный микроскопия помощью эпифлуоресцентного.
5. кальция изображений
Примечание: Если изображений при 10-кратном, стандартная ячейка культуры блюда и тарелки подходят для кальция изображений. Изображений на увеличение требует, что клетки быть покрытие на coverslips стекла или стекла дно блюда.
- Аспирационная среднего и добавить 2 мл (для хорошо пластины 6) изменение Tyrode в раствор (140 мм NaCl, 5 мм KCl, 1.8 мм CaCl2, 1 мм MgCl2, глюкоза 10 мм, 10 мм HEPES, BSA 0,1% и 1% пируват, рН 7,4) содержащий 5 мкм фура-2 AM и 0,1% плюрониевого F-127 к избиению (D14 t iCMs o D20). Инкубируйте 30 минут при 37 ° C.
Примечание: Защитите клетки от света во избежание закалки флуоресцентный индикатор. - Вымыть клетки в 2 мл Tyrode раствора для 30 мин при комнатной температуре, чтобы позволить де этерификации фура-2 AM.
- Изображение с вращением диска конфокальная микроскопия на 340 Нм и 380 Нм, с использованием Slidebook 5.5 Ca2 + визуализации программного обеспечения. Выполнение визуализации при комнатной температуре.
- Кальция транзиентов рассчитаны с использованием коэффициента интенсивности флуоресценции в 340 Нм по интенсивности флуоресценции в 380 Нм.
- При желании, лечить iCMs с 1 или 2 isoproterenol мкм и 10 мкм нифедипин манипулировать кальция, обработка после визуализации исходных кальция транзиентов. Добавление соединений локально клетки и изображения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы с помощью перепрограммирования стратегии, изложенной выше и на рисунке 1B, созданных iCMs с приблизительно 70% клеток выразить сердечные тропонина T и около 55% клеток, выражая сердечной α-актинина, количественно подачей cytometry в день 9 После трансдукции GHMT2m (рисунок 2A и B). Кроме того, большинство клеток выразить сердечные тропонина T, тропонин I и сердца α-актинина, а также разрыв соединения маркер Connexin 43 на 14 день после трансдукции (рис. 2 c и D). Изображений с большим увеличением показывает четко Саркомер структурообразования и разрыв соединения, образуя между соседними клетками (белые стрелки, Рисунок 2D). Кроме того спонтанное сужением и кальция транзиентов указывают функциональность iCMs (Рисунок 3А-C и 1 кино).
Рисунок 1: Хронология перепрограммирования и оптимального покрытия клеток. (A) рассеяния журнала трансформированных РНК seq данных для MEFs, созданных в нашей лаборатории против ENCODE MEFs. Показано значение R2 и линии линейной регрессии. (B) схемы всех критических этапов GHMT2m-опосредованной перепрограммирования MEFs. (C) PE клетки при впадении в 70-80% до трансфекции (верхний ряд, левая панель) и GFP сигнала 48 часов после трансфекции для обозначения эффективность трансфекции (верхняя строка, средней и правой панели). MEFs семенами малонаселенных до инфекции во избежание переполненности за период времени перепрограммирования (Нижняя строка, левая панель) и GFP сигнала 48 часов после инфекции указывают на эффективность инфекции (нижней, средней и правой панели). Шкалы бар = 400 µM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: количественная оценка и характеристика сердечной белков в ОГВС. (A и B). Представитель проточной цитометрии для сердца тропонина T (A) и (B) α-актинина на 9-ый день после GHMT2m трансдукции, n = 3. (C) МУС пятная для сердца маркеры на 14 день после GHMT2m трансдукции. Зеленый: сердца тропонина I, красный: сердца тропонина T (средняя группа) и α-актинина (правая панель) и синий: Hoechst пятная для ядер. Представитель изображений (n = 3). Шкалы бар = 200 мкм (D) высокое увеличение воображает Саркомер структуры (красный: сердца α-актинина (верхняя строка) и сердечной тропонина T (Нижняя строка)) и выражение разрыв соединения белка Connexin 43 (зеленый). Белые стрелки указывают на разрыв соединения образуются между соседними ячейками. Представитель изображений (n = 3). Шкалы бар = 100 µM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: функциональные количественная оценка ОГВС. (A) курс избиении клеток после GHMT2m трансдукции. Избиение клетки были подсчитаны на глаз и клетки подсчитывает из 10 полей за блюдо более 3 блюда за эксперимент были в среднем и включены в группы A. (B и C) Записанная кальция транзиентов ОГВС. Кальция переходные частоты изменяется в iCMs после лечения с 1 мкм Isoproterenol или Нифедипин 10 мкм. F340/F380, отношение интенсивности флуоресценции в 340 и 380 Нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Фильм 1: избивали iCMs. Фильм, показывающий iCMs избиения в день 12 в пробирке. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
| iCM СМИ | ||
| Имя реагента | Объем (мл) | Конечная концентрация |
| DMEM высокие глюкоза | 320 | |
| Среда 199 | 80 | |
| Плода бычьим сывороточным | 50 | 10% |
| Доноров лошадь сыворотки | 25 | 5% |
| Незаменимые аминокислоты мем, 50 x | 10 | 1 x |
| Пируват натрия раствор, 100 x | 5 | 1 x |
| МЕМ несущественные аминокислот, 100 x | 5 | 1 x |
| Раствор витамина мкм, 100 x | 5 | 1 x |
| Инсулин трансферрина селен, 100 x | 5 | 1 x |
| B27, 50 x | 10 | 1 x |
| Penicilin стрептомицином | 5.5 | 1,1% |
| L-глютамин добавки | 5.5 | 1,1% |
| PE СМИ | ||
| Имя реагента | Объем (мл) | Конечная концентрация |
| DMEM высокие глюкоза | 450 | |
| Плода бычьим сывороточным | 50 | 10% |
| Penicilin стрептомицином | 5.5 | 1,1% |
| L-глютамин добавки | 5.5 | 1,1% |
| Blasticidin-HCl - 10 мг/мл | 0.5 | 10 мкг/мл |
| Puromycin дигидрохлорид | 0.05 | 1 мкг/мл |
| Средства роста | ||
| Имя реагента / оборудование | Объем (мл) | Конечная концентрация |
| DMEM высокие глюкоза | 450 | |
| Плода бычьим сывороточным | 50 | 10% |
| Penicilin стрептомицином | 5.5 | 1,1% |
| L-глютамин добавки | 5.5 | 1,1% |
Таблица 1: Культура СМИ. Рецепты для питательной среды, используемые в настоящем Протоколе.
| PE клетки | ||||||
| Клетки культуры блюдо | Площадь поверхности (2см) | Плотность посева (клетки) | Средства массовой информации объем (мл) | Общая ДНК в трансфекции (мкг) | Трансфекция реагента (мкл) | Opti-MEM (мкл) |
| 15 см | 176.7 | 11.25 х 106 | 20 | 36 | 108 | 1080 |
| 10 см | 78,5 | 5 x 10-6 | 10 | 12 | 36 | 360 |
| 60 мм | 28.2 | 1.7 x 106 | 4 | 4 | 12 | 120 |
| 6 хорошо пластины | 9 | 0,54 x 106 | 2 | 1.3 | 3.9 | 39 |
| 12 хорошо пластины | 4 | 0.24 x 106 | 1 | 0.6 | 1.8 | 18 |
| 24 хорошо пластины | 2 | 0,12 х 106 | 0.5 | 0,3 | 0.9 | 9 |
| MEFs | ||||||
| Клетки культуры блюдо | Площадь поверхности (2см) | Плотность посева (клетки) | Средства массовой информации объем (мл) | Hexadimethrine бромид (мкл) | ||
| 15 см | 176.7 | 1,35 x 106 | 20 | 12 | ||
| 10 см | 78,5 | 0,6 х 106 | 10 | 6 | ||
| 60 мм | 28.2 | 0.2 x 106 | 4 | 2.4 | ||
| 6 хорошо пластины | 9 | 0,1 х 106 | 2 | 1.2 | ||
| 12 хорошо пластины | 4 | 0,4 x 105 | 1 | 0.6 | ||
| 24 хорошо пластины | 2 | 0.2 x 105 | 0.5 | 0,3 | ||
Таблица 2: посев плотности для перепрограммирования. Таблица посева плотности для PE клеток и MEFs для общих форматов блюдо культуры клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Настоящее исследование излагается стратегия высокой эффективности непосредственно перепрограммировать фибробластов в функциональных iCMs через доставку GHMT2m перепрограммирования факторы, в сочетании с подавления про фиброзный сигнальных путей. С помощью проточной цитометрии, immunofluorescent изображений, кальция изображений и избиение клеток, мы показываем большинство клеток в этом протоколе пройти успешного перепрограммирования и принять см линии судьбы. Ранее мы показали, что добавление анти фиброзных соединений, включая тип TGF-β я ингибитор рецепторов, А-83-01 дает примерно кратные увеличение количество биений iCMs, по сравнению с трансдукция с GHMT2m только, что про фиброзный сигнализации является сильным эндогенного барьером для сердца перепрограммирования. Эта система может таким образом, быть использована для наркотиков скрининг для изучения механизмов, регулирующих cardiomyogenesis; Добавление маленькой молекулы вместе с A-83-01 может выявить негативные регуляторы cardiomyogenesis. И наоборот добавлением маленькой молекулы для GHMT2m только может прояснить позитивные регуляторы cardiomyogenesis. Распад механизмов, через которые эти позитивные и негативные регуляторы регулируют см дифференциация приведет к лучшему пониманию cardiomyogenesis и привести к еще более эффективным перепрограммирования и созревания протоколов.
Многие факторы влияют на эффективность перепрограммирования. Мы находим, что плотность клеток покрытие существенно влияет как производство ретровирусные частицы в случае PE клетки, так и эффективное усвоение всех перепрограммирования факторов в случае MEFs. Кроме того номер прохода может повлиять на эти параметры. Для обеспечения оптимального производства вирусных частиц, transfect PE клетки до прохода 20. Для обеспечения эффективного поглощения ретровирусные частицы, не проход MEFs после замораживания.
Некоторые недавние исследования также показали, высокой эффективности перепрограммирование MEFs путем стучать вниз PRC1 член Bmi наряду с проявлением GMT30 или экспрессирующих Akt помимо GHMT37. Добавление ZFN281 GHMT + Akt привело к 4-кратное увеличение тропонина T позитивные клетки в взрослых хвост кончик фибробластов, отчасти для подавления воспалительных генов подписей38. Кроме того сочетание TGF-β сигнализации ингибитора и WNT сигнализации ингибитор увеличилась GMT-опосредованной сердечной перепрограммирования39. Важно отметить, что сигнальные пути, участвующие в этих исследованиях не перекрываются. Таким образом, вполне вероятно, что кросс говорить между несколькими сигнальных путей может повысить сердца перепрограммирования.
Ряд исследований показал перепрограммирования в естественных условиях через доставку перепрограммирования факторов в мышей после левой передней нисходящей (LAD) артерии лигирование25,32,39,40 ,41. Эти исследования показала скромные улучшения в функции желудочка после ми, подчеркнув терапевтический потенциал сердечной перепрограммирования на сердце регенерации после травмы. Наш протокол перепрограммирует MEFs с высокой эффективности в vitro на сегодняшний день. Таким образом, это будет интересно посмотреть, если высокая эффективность перепрограммирования способен полностью восстановление после травмы сердца функции в vivo. Эти исследования могли бы служить основой для перевода этого метода на роман клеточной терапии для пациентов после инфаркта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано средств от Боттчер Уэбб-Уоринг биомедицинских исследований программы Фонда, американский ученый сердца ассоциации грант развития (13SDG17400031), Университет Колорадо Департамента медицины выдающиеся начало карьеры Программа, Университет Колорадо Отдела кардиологии Барлоу Nyle Дотационный и низ R01HL133230 (для K.S). A.S.R было поддержано TL1TR001081 номер гранта NIH/NCATS Колорадо CTSA и предварительного докторских стипендий из университета Колорадо консорциума для исследования фиброз и перевода (CFReT). Это исследование было также поддерживается рака центр поддержки Грант (P30CA046934), кожи болезни исследования ядер Грант (P30AR057212) и потока Cytometry основных медицинских кампуса университета Колорадо Anschutz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 Mice | Charles River's Laboratory | 027 | For MEF isolation |
| Platinum E (PE) Cells | Cell Biolabs, INC | RV-101 | For retrovirus production |
| DMEM High Glucose | Gibco | SH30022.FS | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150-059 | Component of iCM media |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100106 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Donor Horse Serum | Gemini | 100508 500 | Component of iCM media |
| MEM Essential Amino Acids, 50X | Life Technologies | 11130051 | Component of iCM media |
| Sodium Pyruvate Solution, 100X | Life Technologies | 11360070 | Component of iCM media and for calcium imaging |
| MEM Non-Essential Amino Acids, 100X | Life Technologies | 11140050 | Component of iCM media |
| MEM Vitamin Solution, 100X | Life Technologies | 11120-052 | Component of iCM media |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 41400045 | Component of iCM media |
| B27 | Gibco | 17504-044 | Component of iCM media |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| GlutaMAX (L-Glutamine Supplement) | Gibco | 35050-061 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Blasticidin-HCl | Life Technologies | A11139-03 | Component of PE media |
| Puromycin dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Component of PE media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | For detaching cells from culture dishes |
| A-83-01 | R&D Systems - Tocris | 2939/10 | Treat cells to inhibit TGF-β signaling - promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM |
| DMSO | Thermo Scientific | 85190 | For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium |
| SureCoat | Cellutron | SC-9035 | For coating dishes to plate MEFs |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection Reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 11058-021 | Transfection Reagent |
| pBabe-X Myc-GATA4 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Hand2 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Mef2c | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Tbx5 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-1 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-133 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X GFP | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268-5G | For viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL |
| Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores) | Nalgene | 569-0020 | For filtering media |
| Syringes | Bd Vacutainer Labware | 309654 | For viral filtration |
| 0.45 µm Filters | Celltreat | 229749 | For viral filtration |
| 70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | For MEF isolation and Flow Cytometry |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry |
| perm/wash buffer | BD | 554723 | For washing cells for flow cytometry |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-250 | For washing cells |
| Bovine Serum Albumin | VWR | 0332-100g | For flow cytometry and calcium imaging |
| Goat Serum | Sigma | G9023 | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Donkey Serum | Sigma | D9663-10mg | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Mouse Troponin T | Thermo Scientific | ms-295-p | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Mouse α-actinin | Sigma | A7811L | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Rabbit Connexin 43 | Sigma | C6219 | 1:400 IF |
| Rabbit Troponin I | PhosphoSolutions | 2010-TNI | 1:400 IF |
| Hoechst | Life Technologies | 62249 | 1:10000 IF |
| Alexa 488, rabbit | Life Technologies | A-11034 | 1:800 IF |
| Alexa 555, mouse | Life Technologies | A-21422 | 1:800 IF |
| Alexa 647, mouse | Life Technologies | A-31571 | 1:200 Flow Cytometry |
| 27-color ZE5 Flow Cytometer | Bio-RAD | For FACS | |
| Paraformaldehyde | sigma | P6148-500mg | For fixing cells for IF |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | For permeabilization of cells for IF |
| EVOS™ FL Color Imaging System | Thermo Scientific | AMEFC4300 | For IF |
| NaCl | RPI | S23020-5000 | For calcium imaging |
| KCl | VWR | 395 | For calcium imaging |
| CaCl2 | Fisher | C614-500 | For calcium imaging |
| MgCl2 | VWR | 97061-352 | For calcium imaging |
| glucose | sigma | G7528-250g | For calcium imaging |
| HEPES | sigma | H4034-500g | For calcium imaging |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F1221 | For calcium imaging |
| Fluronic F-127 | Sigma | P2443-250g | For calcium imaging |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | For disruption calcium transients in iCMs - use at 10 µM |
| Isoproterenol | sigma | I6504-1g | For increasing number of calcium transients in iCMs - use at 1-2 µM |
| Marianas Spinning Disk Confocal microscope | 3i | For calcium imaging | |
| ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| bleach | Clorox | ||
| 50 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 227261 | |
| 15 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 188271 | |
| 15 cm cell culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 10 cm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 60 mm cell culture dishes | GREINER BIO-ONE | 628160 | |
| 6 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| 12 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 665180 | |
| 24 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 662160 |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
- Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D. Cardiac muscle regeneration: lessons from development. Genes & Development. 25 (4), 299-309 (2011).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Nabel, E. G., Braunwald, E. A tale of coronary artery disease and myocardial infarction. N Engl J Med. 366 (1), 54-63 (2012).
- Packer, M., et al. Effect of carvedilol on the morbidity of patients with severe chronic heart failure: results of the carvedilol prospective randomized cumulative survival (COPERNICUS) study. Circulation. 106 (17), 2194-2199 (2002).
- The CAPRICORN Investigators. Effect of carvedilol on outcome after myocardial infarction in patients with left-ventricular dysfunction: the CAPRICORN randomized trial. The Lancet. 357 (9266), 1385-1390 (2001).
- Marangou, J., Paul, V. Current attitudes on cardiac devices in heart failure: a review. Clin Ther. 37 (10), 2206-2214 (2015).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Bio. 14 (8), 529-541 (2013).
- Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomized controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
- Schachinger, V., et al. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1210-1221 (2006).
- Huikuri, H. V., et al. Effects of intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells on left ventricular function, arrhythmia risk profile, and restenosis after thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. Eur. Heart J. 29 (22), 2723-2732 (2008).
- Janssens, S., et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 367 (9505), 113-121 (2006).
- Lunde, K., et al. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1199-1209 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial - a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart J. 152 (3), 434-441 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
- Karantalis, V., et al. Autologous mesenchymal stem cells produce concordant improvements in regional function, tissue perfusion, and fibrotic burden when administered to patients undergoing coronary artery bypass grafting: The Prospective Randomized Study of Mesenchymal Stem Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (PROMETHEUS) trial. Circ Res. 114 (8), 1302-1310 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: A source of cardiac regeneration. J. Mol. Cell. Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
- Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 357-386 (2010).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
- Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100 (1), 105-113 (2013).
- Qian, L., Berry, E. C., Fu, J., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
- Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
- Ifkovitz, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. Inhibition of TGFβ signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes. PLoS One. 9 (2), e89678 (2014).
- Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
- Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8 (5), e63577 (2013).
- Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA induced cardiac reprogramming in vivo: evidence for mature cardiac myocytes and improved cardiac function. Circ Res. 116 (3), 418-424 (2015).
- Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110 (11), 1465-1473 (2012).
- Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), 1216-1220 (2016).
- Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nature Communications. 6, 1-15 (2015).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7, 1063-1066 (2000).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Zhou, H., et al. ZFN281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression. Genes & Dev. 31, 1770-1783 (2017).
- Mohamed, T. M., et al. Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming. Circulation. 135, 978-995 (2017).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
- Mathison, M., et al. In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration. J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).
