Summary
여기 선물이 overexpression Mef2c, GATA4, Hand2, Tbx5, 미르-1, 그리고 미르-133 (GHMT2m) TGF-β 신호 전달의 억제와 함께 통해 기능 cardiomyocytes에 기본 미 발달 섬유 아 세포를 재 설 정할 하는 강력한 방법. 우리의 프로토콜 생성 박동 cardiomyocytes 일찍 최대 60 %7 일 후 변환 효율.
Abstract
다른 하나의 체세포 형식의 트랜스-차별화 모델링 하 고 인간의 질병 치료 엄청난 잠재력이 있다. 이전 연구 결과 나타났습니다 그 마우스 배아, 피부, 및 심장 섬유 아 세포 기능 유도 cardiomyocyte 같은 세포 (iCMs)로 재설정 될 수 있습니다 cardiogenic 녹음 방송 요인 Mef2c, GATA4, Hand2 등의 overexpression 통해 고 Tbx5 둘 다 생체 외에서 그리고 에 비보. 그러나, 이러한 이전 연구는 상대적으로 낮은 효율을 나타났습니다. 부상 다음 심장 기능을 복원 하기 위해 심장 프로그래밍 제어 메커니즘 효율과 성숙 iCMs의 향상을 해명 한다.
우리는 이전 프로 거리 신호를 크게 저해 재활 효율을 증가 입증. 여기, 우리는 최대 60%의 재활 효율을 달성 하는 방법 선발. 또한, cytometry, immunofluorescent 이미징 및 칼슘 이미징 재활 효율과 재설정된 섬유 아 세포의 성숙 척도를 포함 하는 여러 가지 방법을 설명 합니다. 여기 상세한 프로토콜을 사용 하 여, 기계 연구 수 이루어져야 심장 프로그래밍의 긍정적이 고 부정적인 레 귤 레이 터를 결정. 이러한 연구는 재활 효율성과 성숙, 인간의 심장 질환 치료 소설 세포 치료로 이어질 수 있는 홍보 하는 대상으로 수 신호 경로 식별할 수 있습니다.
Introduction
허 혈 성 심장 질환은 미국1에서 죽음의 주요 원인. 약 800000 미국인 경험을 첫 번째 또는 재발 성 심근 경색 (MI) 당 년1. 미, 다음 cardiomyocytes (CMs) 및 심장 섬유 증, 활성화 된 심장 섬유 아 세포에서의 죽음 심장 기능2,3손상. 미 다음 심장 마비의 진행 성인 CMs4,5의 가난한 재생 용량 때문 돌이킬 아니다. 현재 임상 치료 질병의 진행을 느리게 하 고 미래의 심장 이벤트6,7,,89의 위험을 감소, 아무 치료 반대로 질병의 진행 하는 무 능력 때문 CMs 후 경색10를 다시 생성 합니다. 새로운 세포 치료 치료 환자 닉 실망 하 떠오르고 있다, 지금까지 미 다음 마음에 줄기 세포를 제공 하는 임상 시험 결정적이 아닌 재생 잠재적인11,12, 나타났습니다. 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.
먼저 다카하시 & 야 마나카, 시연 4 녹음 방송 요인의 overexpression에 의해 섬유 아 세포에서 파생 하는 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)의 생성 세포 치료19에 새로운 돌파구를 문을 열었습니다. 이 세포는 모든 3 개의 세균 층19로 분화 할 수 있다 그리고 CMs의 많은 수를 생성 하기 위한 몇 가지 매우 효율적인 방법을 이전 표시 되었습니다20,21. HiPSC 파생 된 CMs (엉덩이-CMs) cardiomyogenesis를 공부 하는 강력한 플랫폼을 제공 하 고 상해를 따르는 마음을 고치기를 위한 중요 한 의미를 가질 수 있습니다. 그러나, 현재 기형종 형성22의 문제로 인해 변환 장애물을 직면 하는 엉덩이 CMs 그리고 그들의 미 성숙한 성격 프로 arrhythmogenic23을 수 있습니다. HiPSCs로 섬유 아 세포를 프로그래밍 직접 다른 세포 유형으로 섬유 아 세포를 프로그래밍에 관심을 촉발 시켰다. 것 외. 시연 심장 혈통, 직접 프로그래밍에 섬유 아 세포 결과에 GATA4, Mef2c, 및 Tbx5 (그리니치 표준시)의 그 overexpression 이기는 하지만 낮은 효율24. 프로그래밍 효율 Hand2 (GHMT)25의 추가 함께 개선 되었습니다. 이러한 초기 연구 이후 많은 출판물을26,27,,2829, 요인 추가 전사와 재활 요소 칵테일 변경 증명 하고있다 chromatin 한정자30,31, microRNAs32,33또는34 향상을 리드 하는 작은 분자 프로그래밍 효율 및 성숙 유도 cardiomyocyte 같은 셀 (iCMs ).
여기 우리는 높은 효율 iCMs 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs)에서 생성 하는 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 우리 이전 보여주었다 GHMT 칵테일 1 미르와 미르-133 (GHMT2m)의 추가 함께 크게 개선 하 고 더욱 향상 프로-거리 경로 변형 성장 인자 (TGF-β) β 신호를 포함 하 여 신호 또는 관련 단백질 키 니 아 제 (바위) 신호 통로 저해35. 이 프로토콜을 사용 하 여, 우리 보여 심장 분 T (cTnT)를 표현 하는 세포의 약 60%, 약 50% α-actinin, 표현 및 높은 구타 셀 수 빠르면 하루 11 프로그래밍 요소와 치료의 변환에 따라 관찰 될 수 있다 TGF-β와 내가 입력 수용 체 억제제 A-83-01. 또한, 이러한 iCMs 갭 정션 단백질 connexin 43 등을 표현 하 고 자연 스러운 수축 및 칼슘 과도. 이전 연구에 비해 효율을 프로그래밍 향상을 표시이 심장 후 경색에 남아 있는 생 세포 인구에서 CMs를 재생성을 보여줍니다.
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Protocol
동물을 요구 하는 모든 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 UC 덴버 Anschutz 의료 캠퍼스에 의해 승인 되었다.
1입니다. MEFs의 격리
- E13에서 임신 마우스 C57BL/6를 구입. 밤새 배.
- 승인 된 IACUC 프로토콜에 따라 어머니를 안락사 (예: ~1.3 L/분 CO2 동물 죽은 나타날 때까지 다음 자 궁 경관 탈 구)
- 70% 에탄올으로 어머니를 살포 하 고 복 부 구멍을 엽니다. 포함 된 배아 자 궁 경적을 제거 하 고 살 균 PBS로 10 cm 접시에.
- 출시 배아 배아 삭에서 절 개를 확인 합니다. 10 cm 살 균 PBS 가진 접시를 청소 하는 배아를 전송 합니다. 철저 하 게 린스.
- 간 아래 시체를 잘라내어 머리와 상체를 삭제. 내부 장기를 제거 하 고 삭제. 나머지 조직 살 균 PBS 가진 깨끗 한 10 cm 접시에 전송 하 고 Biosafety 수준 1 또는 2 캐비닛에 접시를 전송. 깨끗 하 고 마른 10 cm 접시에 모든 배아에서 조직을 결합 하 고 정밀한 조각으로 말하다.
- 다진된 배아를 0.25 %trypsin / 1 mM EDTA의 6 mL를 추가 합니다. 조직 헤어 피 펫에 의해 여러 번 triturate. 40 분 5% CO2와 37 ˚C에서 품 어.
- 성장 매체 (표 1)에 셀 resuspend 미디어의 볼륨은 수확 하는 배아의 수에 따라 조정 됩니다. 일반적으로, 약 1.2 배아 당 25 mL 성장 매체의 비율을 사용 합니다.
- 플레이트 25 mL 15 cm 접시에 resuspended 셀의. 24 시간 후 미디어를 발음 하 고 각 플레이트에 신선한 성장 매체의 25 mL를 추가 합니다.
- 72 h, 후 각 15 cm 접시를 0.25 %trypsin / 1 mM EDTA의 2 개 mL를 추가 합니다. 셀 문화 접시에서 분리 때 trypsin 15 mL 성장 매체를 비활성화 하 고 50 mL 폴리스 티 렌 원뿔 튜브에 세포를 수집 합니다. 실 온에서 160 x g 에서 3 분에 대 한 셀 원심 70 µ m 기 공 셀 스 트레이너를 통해 성장 매체 및 필터 셀 펠 릿을 resuspend.
- hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수 및 동결 매체에서 2 백만 셀 aliquots에 MEFs를 동결 (10 %DMSO, 25 %FBS Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) / 높은 포도 당)-80 ° c.에 사용할 준비가 될 때까지 24 시간 및 저장소 후 액체 질소에 셀 전송.
참고: MEFs의 글로벌 유전자 발현은 프로 파일링 RNA 시퀀싱으로이 프로토콜을 사용 하 여 절연 (RNA-seq) 셀 인증 되도록. 인코딩 MEF 세포에서 RNA-seq 데이터 취득 번호 GSE93454에서 NIH 유전자 식 옴니 버스 (지 오)을 다운로드 했다. 우리가 사용 하는 MEFs에 대 한 RNA-seq 유전자 표현 데이터 취득 번호 GSE71405와 NIH GEO에 예금 되었다. 이러한 두 데이터 세트는 일반적인 유전자 기호에 따라 병합 했다. 식 데이터 다음 로그-변형 되었다 그리고 우리의 MEFs 및 인코딩 MEFs 식 데이터 scatterplot 생성 되었고 선형 회귀선 (그림 1A)와 맞는. MEFs이이 프로토콜을 사용 하 여 절연 분자로 다른 실험실에 의해 고립 된 그 유사 하다.
2. 레트로 바이러스와 MEFs의 변환의 생산
참고:이 섹션의 모든 단계 됩니다 실행 한다 Biosafety 수준 2 캐비닛에. 때문에이 프로토콜 활용 retroviral 변환, 그 안전 주의 모든 바이러스 성 미디어 프로그래밍에 대 한 타임 라인에 대 한 적어도 20 분 그림 1B 를 참조에 대 한 10% 표 백제와 함께 포함 된 낭비 치료 등을 확인 합니다.
-
백 금 전자 (PE) 셀 라인을 사용 하 여 레트로 바이러스의 생산
- 상업적으로 이용 가능한 PE 셀 PE 매체 (표 1) 포함 blasticidin 그리고 puromycin 선택 마커 개 그-의 표현 되도록 유지 효율적인 retroviral 입자 생산36유류 그리고 env 유전자 . 1:4 또는 1:5 매 2 일에서 통행 세포. 이 retroviral 생산 수율 저하로 세포의과 밀을 방지 하기 위해 주의.
- -1 일에 씨앗 10 cm 접시에 성장 매체 (표 1) 16-20 h 당 약 5 x 106 세포 transfection 전에 (다른 표준 셀 문화 접시 크기에 대 한 밀도 도금 표 2 참조). 부드럽게 바위 요리 앞뒤로 여러 번와 37 ° C, 5% CO2 인큐베이터도 도금 배포 되도록 신중 하 게 자리 (transfection 전에 최적의 도금 밀도 그림 1C 참조).
참고: 플레이트 PE 셀 선택 마커 생성된 retroviral 입자를 포함 하는 매체 MEFs 죽 일 하지 않습니다 있도록 transfection 이전 무료 매체 주의. - 당일 0, transfection에 대 한 DNA를 준비 합니다. 10 cm 접시 transfection 추가 재활 각 요소의 2 µ g-GATA4, Hand2, Tbx5, Mef2c 미르-1, 그리고 미르-133 (GHMT2m)-1.5 mL 튜브에.
참고: 다른 표준 셀 문화 접시 크기 transfect 하는 데 필요한 DNA의 양을를 표 2 를 참조 하십시오. - 별도 1.5 mL 튜브에 360 µ L 감소 된 혈 청 미디어를 추가 합니다. 36 µ L transfection 시 감소 된 혈 청 미디어를 직접 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 터치 하 고 5 분 동안 실 온에서 품 어.
참고: 감소 transfection 효율을 피하기 위해, 감소 된 혈 청 미디어에 직접 신중 하 게 transfection 시 약 추가. - GHMT2m DNA 칵테일에 감소 된 혈 청 미디어/transfection 시 혼합물을 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 터치 하 고 15 분 동안 실 온에서 품 어. 와 동 하지 마십시오.
- PE 셀에 dropwise 반응 혼합물을 추가, 부드럽게 미디어에 대 한 10-15, 소용돌이 하 고 37 ° C, 5% CO2 배양 기에.
참고: 제조 업체에 따라 PE 세포 생성 10의 평균 titer6 107 감염 단위/mL. 이 프로토콜 약 2 x 106 감염 단위/mL 24 h 6 x 106 감염 단위/mL 평균 4의 나에 대 한 48 h에 의해 생성 됩니다. 있으 나 transfection GFP/DsRed의 경우; transfection/변환 효율에 대 한 대리로도 사용할 수 있습니다. transfection 효율 48 h (그림 1C) 90%를 초과할 전망 이다.
-
MEFs의 변환
- 0 일에 콜라겐과 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터 2 h 이상에서 요리 코트.
- 액체 질소 및 해 동에서 MEFs를 제거 합니다. 플레이트 0.2 x 106 세포 성장 매체에 60 m m 접시 당. 부드럽게 되도록 락 접시 도금 유통도 하 고 인큐베이터에 (다른 표준 셀 문화 접시 크기에 대 한 밀도 도금에 대 한 최적의 도금 밀도 및 표 2 에 대 한 그림 1C 참조).
참고: 이러한 도금 밀도 격리 된 MEFs;의 여러 일괄 처리를 통해 테스트 되었습니다. MEFs 디스플레이 크게 생존을 손상 하지 않는 셀 시드 밀도 조정 필요 하지 않습니다. - 당일 1, 24 h 후 transfection 30 mL 주사기를 사용 하 여 PE 세포에 의해 생성 된 retroviral 매체를 수집. 50 mL 원뿔 관으로 0.45 μ m 기 공 크기 필터를 통해 매체를 전달 합니다. 6 µ g/mL의 최종 농도를 hexadimethrine 브 로마 이드 transfection 시 약을 추가 합니다. 신중 하 게 세포의 변위를 방지 하기 위해 문화 접시의 벽에 pipetting 미디어 여 PE 셀에 10 mL 신선한 성장 매체를 추가 합니다.
- MEFs에서 매체를 발음 하 고 각 접시에 갓 수확된 retroviral 매체의 4 mL를 추가 합니다. 인큐베이터에 MEFs를 반환 합니다. 무력화 retroviral 입자 바이러스 매체 접촉 모든 재료를 10% 표 백제를 추가 합니다.
- 하루 2, 48 h 후 transfection, 2.2.2, 2.2.3 단계를 반복 합니다. PE 셀 retroviral 매체의 2nd 컬렉션 다음 삭제 됩니다.
참고: 20 분 이상 원치 않는 레트로 바이러스를 무력화 폐기 PE 셀에 10% 표 백제를 추가 합니다. - 3 일에 MEFs에서 매체를 발음 하 고 보충 4 mL iCM 매체 (표 1) 0.5 µ M를 포함 하는 TGF-β, A-83-01 유형 I 수용 체 억제제. 2 일 마다 A-83-01을 포함 하는 iCM 매체를 보충.
참고: 변환 제어로 GFP를 사용 하는 경우 식 예정입니다 90% 초과이 시간 포인트 (그림 1C).
3. 심장 마커 Cytometry
- 하루 9에서 aspirate 매체 죽은 세포와 파편 제거를 1 x PBS를 가진 MEFs와 세척 (1x) 재설정.
- 37 ˚C에서 5 분 동안 0.25 %Trypsin / EDTA 1 mL를 추가 합니다. 가벼운 현미경을 사용 하 여 셀을 확인 하 고 흔들어 접시; 셀 연결 된 남아 있으면 세포 분리 될 때까지 5 더 분 37 ˚C에서 품 어.
- 70 µ m 기 공 셀 스 트레이너를 통해 5 %FBS 필터를 포함 하는 1 x PBS에 세포를 씻어.
- 실내 온도 펠 릿에서 aspirate 액체에 3 분 동안 160 x g 에서 원심.
참고: 셀 수확량 증가, 약 50 µ L 액체를 셀 펠 릿 위에 둡니다. - 1 %BSA 포함 하는 500 µ L 1 x PBS를 가진 세포를 씻어.
- 얼음에 0.2 mL/1 백만 셀과 셀 20 분 고정 솔루션을 수정.
- 1 x 얼음 파 마/워시 버퍼의 1 mL를 추가 합니다.
참고: 제조업체의 해결책은 10 배 이다. - 4 ° C에서 5 분 동안 160 x g 에서 세포를 원심 하 고 상쾌한 발음.
- 추가 시간 3.7-3.8 단계를 반복 합니다. 2차 세척 후 다음 단계를 직접 진행 또는 하룻밤 4 ° C에서 세포를 유지.
- 5% 염소 혈 청 및 실 온에서 30 분 동안 파 마/워시 버퍼 x 1 혈 청 당나귀의 100 µ L를 차단 합니다.
- 희석된 주 항 체의 100 µ L를 추가 합니다.
참고:이 프로토콜에 대 한 셀은 표시 마우스 분 T (1: 200) 그리고의 비율 척도를 α-actinin (1: 200) 마우스 세포 심장 sarcomere의 주요 구성 요소에 대 한 긍정적인. 실 온에서 1 h에 대 한 1 차적인 항 체를 품 어. - 160 x g 4 ° C에서 5 m에서 세포를 원심, 상쾌한, 발음 및 차가운 파 마/워시 버퍼 2 배를 씻어.
- 희석된 이차 항 체의 100 µ L를 추가 합니다.
참고:이 프로토콜에 대 한 셀 안티 마우스 647 nm 이차 항 체 (1: 200)으로 표시 했다. 이차 항 체는 이상 끝 튜브 회전자에 실 온에서 45 분을 품 어. 호 일에 튜브를 배치 하 여 빛 으로부터 세포를 보호 합니다. - 160 x g 4 ° C에서 5 분 동안에 세포를 원심, 상쾌한, 발음 및 차가운 파 마/워시 버퍼 2 배를 씻어.
- PBS에서 1 %BSA 1 mL을 추가 하 고 즉시 FACS를 수행.
참고: 앞으로 대 쪽 분산형 점도 FACS를 수행할 때 가능한 세포를 먼저 게이트를 생성 합니다. 또는 셀을 수정 하기 전에 상용 라이브/죽은 세포 얼룩을 사용 하 여 라이브 식별 하 고 죽은 세포 인구를.
4입니다. 재설정된 MEFs Immunostaining
- 주 14에서에서 aspirate 매체 MEFs와 세척 (1x) 얼음 처럼 차가운 PBS x 1 mL 1 재설정.
참고: immunostaining에 대 한 프로그래밍 수행 되었다 항 체 솔루션 볼륨을 최소화 하기 위해 12 잘 판에. 24 잘 접시도 사용할 수 있습니다; 단순히 반 모든 볼륨을 다음. - 발음 및 실 온에서 10 분 동안 500 µ L 2 %paraformaldehyde 셀을 수정.
- 발음 하 고 3 번 1 mL 1 x PBS (5 분 실 온에서 세척 당)를 가진 셀을 씻어.
- 500 µ L 0.2 %permeabilization 시 약 PBS에 실 온에서 15 분 동안 셀 permeabilize
- 발음 하 고 500 µ L 10% 말 혈 청 PBS에 실 온에서 30 분 동안에 차단 합니다.
- 발음 하 고 실 온에서 1 h에 대 한 희석된 주 항 체의 500 µ L로 품 어.
참고:이 프로토콜에 대 한 셀 마우스 분 T 또는 α-actinin (각 1:400) 되었고 공동으로 표시 Connexin 43 (1:400) 또는 분 나 (1:400). - 1 차적인 항 체를 발음 하 고 1 mL 1 x PBS (실 온에서 세척 당 5 분)와 세 번 씻어.
- 발음 하 고 실 온에서 1 시간 동안 500 µ L 희석된 이차 항 체와 함께 품 어.
참고:이 프로토콜에 대 한 셀은 표시 반대로 마우스 555 nm 이차 항 체 (1:800) 분 T α-actinin를 인식 하 고 반대로 토끼 488 nm 이차 항 체 (1:800) Connexin 43 나 Troponin I. 인식 하, 핵 물 했다 Hoechst (1:10, 000)입니다. 빛에서 어둠 속에서 배양 하 여 세포를 보호 합니다. - 이차 항 체를 발음 하 고 1 mL 1 x PBS (실 온에서 세척 당 5 분)와 세 번 씻어. 빛 으로부터 세포를 보호 하 고 4 ° c.에 저장을 호 일에 접시 포장
- 이미지는 3 채널 epifluorescence 현미경 검사 법을 사용 하 여입니다.
5. 칼슘 이미징
참고: 경우 10 배 확대에서 이미징, 표준 셀 문화 요리와 접시는 칼슘 이미징에 적합. 높은 확대에 이미징 셀 유리 coverslips 또는 유리 하단 접시에 도금 될 필요 합니다.
- 중간 발음 및 2 mL (6 잘 플레이트)에 대 한 수정 Tyrode의 솔루션 (140 m m NaCl, KCl, 1.8 m m CaCl2, 5mm 1 m m MgCl2, 포도 당 10 mM, 10 mM HEPES, 0.1 %BSA, 및 1 %pyruvate, pH 7.4) 추가 Fura-2 오전 5 µ M를 포함 하 고 0.1% Pluronic F-127 (D14 t를 구타 하 o d 20) iCMs입니다. 37 ° c.에 30 분 동안 품 어
참고: 형광 표시기의 냉각을 방지 하기 위해 빛 으로부터 세포를 보호 합니다. - Fura-2의 디 에스테 르 화 수 있도록 실 온에서 30 분 동안 2 mL Tyrode의 솔루션에 세포를 씻어 오전.
- 이미지 회전 디스크 confocal 현미경 검사 법 340 nm 및 380 nm Slidebook 5.5 캘리포니아2 + 이미징 소프트웨어를 사용 하 여. 실 온에서 이미지를 수행 합니다.
- 칼슘 과도 340 형광 강도의 비율을 사용 하 여 계산는 380에서 형광 강도에 nm nm.
- 원하는 경우, 1 또는 2 µ M isoproterenol 또는 10 µ M iCMs 치료 Nifedipine 칼슘 기준선 칼슘 과도 영상 후 처리를 조작 하. 셀 및 이미지에 화합물을 로컬로 추가 합니다.
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Representative Results
그림 1B에서 위에 설명 된 재활 전략을 사용 하 여, 약 심장 분 T를 표현 하는 세포의 70%와 심장 α-actinin, cytometry 하루 9에 의해 계량을 표현 하는 세포의 약 55 %iCMs 생성 GHMT2m의 변환에 따라 (그림 2A , B). 또한, 대부분의 세포 표현 심장 분 T, 분, 그리고 심장 α-actinin으로 갭 정션 마커 Connexin 43 하루 14 다음 변환 (그림 2C , D)에. 높은 확대와 함께 영상 잘 정의 된 sarcomere 구조 형성 및 간격 접속점 사이 인접 셀 (흰색 화살표, 그림 2D) 형성을 보여준다. 또한, 자발적 수축 및 칼슘 과도 iCMs (그림 3A-C 와 영화 1)의 기능을 나타냅니다.
그림 1: 프로그래밍의 타임 라인 및 셀의 최적의 도금. (A) Scatterplot 인코딩 MEFs 대 실험실에서 생성 된 MEFs에 대 한 RNA-seq 데이터 로그 변환. R2 값과 선형 회귀선 표시 됩니다. (B) 회로도의 모든 중요 한 MEFs의 GHMT2m 중재 재 프로그램에 단계 합니다. (C) PE 세포 transfection (맨 위 행, 왼쪽 패널) 및 GFP 신호 48 시간 후 transfection transfection 효율 (위쪽, 가운데 및 오른쪽 패널)를 나타내기 위해 이전 70-80% 합류에. MEFs (맨 아래 행, 왼쪽 패널) 프로그래밍 및 GFP 신호 48 시간 게시물 감염 감염 효율 (맨 아래 행, 중간 및 오른쪽 패널)를 표시 하는 기간 동안과 밀을 방지 하기 위해 감염 전에 띄엄띄엄 시드. 눈금 막대 = 400 µ M. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 정량화 및 특성화의 심장 단백질 표정 iCMs에. (A와 B). 심장 분 T (A) 에 대 한 대표적인 cytometry 하루 9에서 α-actinin (B) 다음 GHMT2m 변환, n = 3. (C) ICC 심장 마커 하루 14 GHMT2m 변환 다음에 대 한 얼룩. 녹색: 심장 Troponin I, 레드: 심장 분 T (중간 패널)와 α-actinin (오른쪽 패널) 파란색과: Hoechst 얼룩 핵에 대 한. 대표 이미지 (n = 3). 눈금 막대 sarcomere 구조의 200 µ M (D) 높은 확대 상상 = (빨강: 심장 α-actinin (맨 위 행) 및 심장 분 T (아래쪽 행))와 갭 정션 단백질 Connexin 43 (녹색)의 표현. 흰색 화살표는 인접 셀 간의 간격 접속점 형성 나타냅니다. 대표 이미지 (n = 3). 눈금 막대 = 100 µ M. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: iCMs의 기능 정량화. (A) GHMT2m 변환 다음 셀 카운트를 꺾고의 시간 과정. 박동 세포 눈으로 계산 했다 및 셀 개수 접시 3 요리 실험 당 평균 되었고 패널 A.에에서 포함 된 당 10 필드에서 (B 와 C) 칼슘 과도 iCMs의 기록. 1 µ M와 치료 다음과 iCMs에 칼슘 과도 주파수 변경 Isoproterenol 또는 10 µ M nifedipine. F340/F380, 340 380 nm에서 형광 강도의 비율 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
영화 1: iCMs 구타. 주 12 체 외에서 박동 iCMs를 보여주는 영화. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
| iCM 미디어 | ||
| 시 약의 이름 | 볼륨 (mL) | 최종 농도 |
| DMEM 높은 포도 당 | 320 | |
| 중간 199 | 80 | |
| 소 태아 혈 청 | 50 | 10% |
| 기증자 말 혈 청 | 25 | 5% |
| MEM 필수 아미노산, 50 x | 10 | 1 x |
| 나트륨 Pyruvate 솔루션, 100 x | 5 | 1 x |
| MEM 비필수 아미노산, 100 x | 5 | 1 x |
| MEM 비타민 솔루션, 100 x | 5 | 1 x |
| 인슐린-처리가-셀레늄, 100 x | 5 | 1 x |
| B27, 50 x | 10 | 1 x |
| Penicilin-스 | 5.5 | 1.1% |
| L-글루타민 보충 | 5.5 | 1.1% |
| PE 미디어 | ||
| 시 약의 이름 | 볼륨 (mL) | 최종 농도 |
| DMEM 높은 포도 당 | 450 | |
| 소 태아 혈 청 | 50 | 10% |
| Penicilin-스 | 5.5 | 1.1% |
| L-글루타민 보충 | 5.5 | 1.1% |
| Blasticidin-HCl-10 mg/mL | 0.5 | 10 µ g/mL |
| Puromycin dihydrochloride | 0.05 | 1 µ g/mL |
| 성장 매체 | ||
| 시 약의 이름 / 장비 | 볼륨 (mL) | 최종 농도 |
| DMEM 높은 포도 당 | 450 | |
| 소 태아 혈 청 | 50 | 10% |
| Penicilin-스 | 5.5 | 1.1% |
| L-글루타민 보충 | 5.5 | 1.1% |
표 1: 문화 미디어. 이 프로토콜에 사용 되는 문화 매체에 대 한 조리법입니다.
| PE 셀 | ||||||
| 세포 배양 접시 | 면적 (cm2) | 시드 밀도 (셀) | 미디어 볼륨 (mL) | Transfection (µ g) 당 총 DNA | Transfection 시 약 (µ L) | Opti 메모리 (µ L) |
| 15 cm | 176.7 | 11.25 x 106 | 20 | 36 | 108 | 1080 |
| 10 cm | 78.5 | 5 x 106 | 10 | 12 | 36 | 360 |
| 60 mm | 28.2 | 1.7 x 106 | 4 | 4 | 12 | 120 |
| 6 잘 플레이트 | 9 | 0.54 x 106 | 2 | 1.3 | 3.9 | 39 |
| 12 잘 플레이트 | 4 | 0.24 x 106 | 1 | 0.6 | 1.8 | 18 |
| 24 잘 플레이트 | 2 | 0.12 x 106 | 0.5 | 0.3 | 0.9 | 9 |
| MEFs | ||||||
| 세포 배양 접시 | 면적 (cm2) | 시드 밀도 (셀) | 미디어 볼륨 (mL) | Hexadimethrine 브 로마 이드 (µ L) | ||
| 15 cm | 176.7 | 1.35 x 106 | 20 | 12 | ||
| 10 cm | 78.5 | 0.6 x 106 | 10 | 6 | ||
| 60 mm | 28.2 | 0.2 x 106 | 4 | 2.4 | ||
| 6 잘 플레이트 | 9 | 0.1 x 106 | 2 | 1.2 | ||
| 12 잘 플레이트 | 4 | 0.4 x 105 | 1 | 0.6 | ||
| 24 잘 플레이트 | 2 | 0.2 x 105 | 0.5 | 0.3 | ||
표 2: 프로그래밍에 대 한 밀도 시드. 시드 PE 셀 밀도 일반적인 셀 문화 접시 서식에 대 한 MEFs의 테이블.
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Discussion
현재 연구 직접 프로 거리 신호 통로의 억제와 함께 요소를 프로그래밍 하는 GHMT2m의 배달을 통해 기능 iCMs에 섬유 아 세포를 재 설 정할 고효율 전략을 설명 합니다. Cytometry, immunofluorescent 이미징, 이미징, 및 셀 카운트, 우리는이 프로토콜에 대부분 셀의 표시 치고 칼슘을 사용 하 성공적인 프로그래밍 받 다 고 CM 혈통 운명 채택. 우리는 반대로 거리의 추가 화합물 TGF-β 유형 포함 나 수용 체 억제제 약 6-fold 박동 iCMs 나타내는 혼자, GHMT2m와 변환에 비해 수 증가 생성 하는 A-83-01 이전 나타났습니다. 프로 거리 신호 심장 프로그래밍에 강한 생 장벽입니다. 이 시스템 따라서 약 cardiomyogenesis;를 관리 하는 메커니즘을 조사 하기 위해 심사 무력화 수 있습니다, A-83-01 함께 작은 분자의 추가 cardiomyogenesis의 부정적인 레 귤 레이 터를 밝히기 수 있습니다. 반대로, GHMT2m 혼자 하는 작은 분자의 추가 cardiomyogenesis의 긍정적인 레 귤 레이 터 명료 수 있습니다. 이러한 긍정적이 고 부정적인 레 귤 레이 터 제어 CM 분화 메커니즘을 탈피 cardiomyogenesis의 더 나은 이해에서 발생 하 고 더욱 효율적인 프로그래밍 및 성숙 프로토콜 이어질 것입니다.
많은 변수 재활 효율을 영향을 줍니다. 우리는 셀 도금 밀도 크게 PE 셀 경우 retroviral 입자의 생산 그리고 MEFs의 경우 모든 재활 요인의 효율적인 이해 둘 다 영향을 찾으십시오. 또한, 통로 수 뿐만 아니라 이러한 매개 변수를 달라질 수 있습니다. 바이러스 성 입자의 최적의 생산을 보장 하기 위해, 통로 20 전에 PE 셀 transfect. Retroviral 입자의 능률적인 통풍 관을 위해 얼 기 후 MEFs를 통과 하지 않습니다.
여러 최근 연구는 또한 높은 효율 PRC1 회원 Bmi 그리니치 표준시30 의 식 함께 아래로 두드리는 또는 GHMT37이외 Akt overexpressing MEFs의 프로그래밍 설명 했다. ZFN281 GHMT + Akt의 추가 성인 꼬리 팁 섬유 아 세포, 염증 유전자 서명을38의 억제에 일부 기인에 긍정적인 세포 분 T에에서 4-fold 증가를 이끌었다. 또한, TGF-β 신호 전달 억제제 및 WNT 신호 전달 억제제의 조합 GMT 중재 심장39프로그래밍 증가. 중요 한 것은, 이러한 연구에 관련 된 신호 경로 중복 표시 되지 않습니다. 따라서, 그것은 가능성이 여러 신호 통로 사이 그 잡담 심장 프로그래밍 향상 시킬 수 있는 더.
연구의 여러 재활 시연 vivo에서 왼쪽 마우스 다음에 요소 앞쪽 내림차순 (젊은이) 동맥 결 찰25,,3239,40 프로그래밍의 배달을 통해 ,41. 이러한 연구 심 실 기능 미 다음, 심장 심장 재생 부상 다음에 프로그래밍의 치료 잠재력 강조에 겸손 한 향상을 보여 않았다. 우리의 프로토콜 최고 효율에 생체 외에서 날짜를 MEFs로. 따라서, 높은 효율 프로그래밍 인지 심장 기능 후 부상을 완전히 복원 할 수 재미 있을 것입니다 vivo에서. 이러한 연구는 후 경색 환자 들에 대 한 새로운 세포 치료로 번역 하는이 메서드를 기반으로 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 Boettcher 재단의 웹 주의 생물 의학 연구 프로그램, 미국 심장 협회 과학자 개발 그랜트 (13SDG17400031), 콜로라도의 대학 학과 의학 뛰어난 초기 경력에서에서 기금에 의해 지원 되었다 학자 프로그램, 콜로라도 사단의 심장 Barlow Nyle 기부금의 대학 및 NIH R01HL133230 (캔사스)에. A.S.R 섬유 증 연구 및 번역 (CFReT)에 대 한 NIH/NCATS 콜로라도 CTSA 보조금 번호 TL1TR001081와 콜로라도 대학 컨소시엄에서 미리 박사 친목에 의해 지원 되었다. 이 연구는 암 센터 지원 그랜트 (P30CA046934), 피부 질환 연구 코어 그랜트 (P30AR057212), 그리고 콜로라도의 대학 Anschutz 의료 캠퍼스에서 Flow Cytometry 코어에 의해 또한 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 Mice | Charles River's Laboratory | 027 | For MEF isolation |
| Platinum E (PE) Cells | Cell Biolabs, INC | RV-101 | For retrovirus production |
| DMEM High Glucose | Gibco | SH30022.FS | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150-059 | Component of iCM media |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100106 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Donor Horse Serum | Gemini | 100508 500 | Component of iCM media |
| MEM Essential Amino Acids, 50X | Life Technologies | 11130051 | Component of iCM media |
| Sodium Pyruvate Solution, 100X | Life Technologies | 11360070 | Component of iCM media and for calcium imaging |
| MEM Non-Essential Amino Acids, 100X | Life Technologies | 11140050 | Component of iCM media |
| MEM Vitamin Solution, 100X | Life Technologies | 11120-052 | Component of iCM media |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 41400045 | Component of iCM media |
| B27 | Gibco | 17504-044 | Component of iCM media |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| GlutaMAX (L-Glutamine Supplement) | Gibco | 35050-061 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Blasticidin-HCl | Life Technologies | A11139-03 | Component of PE media |
| Puromycin dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Component of PE media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | For detaching cells from culture dishes |
| A-83-01 | R&D Systems - Tocris | 2939/10 | Treat cells to inhibit TGF-β signaling - promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM |
| DMSO | Thermo Scientific | 85190 | For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium |
| SureCoat | Cellutron | SC-9035 | For coating dishes to plate MEFs |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection Reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 11058-021 | Transfection Reagent |
| pBabe-X Myc-GATA4 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Hand2 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Mef2c | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Tbx5 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-1 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-133 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X GFP | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268-5G | For viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL |
| Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores) | Nalgene | 569-0020 | For filtering media |
| Syringes | Bd Vacutainer Labware | 309654 | For viral filtration |
| 0.45 µm Filters | Celltreat | 229749 | For viral filtration |
| 70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | For MEF isolation and Flow Cytometry |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry |
| perm/wash buffer | BD | 554723 | For washing cells for flow cytometry |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-250 | For washing cells |
| Bovine Serum Albumin | VWR | 0332-100g | For flow cytometry and calcium imaging |
| Goat Serum | Sigma | G9023 | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Donkey Serum | Sigma | D9663-10mg | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Mouse Troponin T | Thermo Scientific | ms-295-p | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Mouse α-actinin | Sigma | A7811L | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Rabbit Connexin 43 | Sigma | C6219 | 1:400 IF |
| Rabbit Troponin I | PhosphoSolutions | 2010-TNI | 1:400 IF |
| Hoechst | Life Technologies | 62249 | 1:10000 IF |
| Alexa 488, rabbit | Life Technologies | A-11034 | 1:800 IF |
| Alexa 555, mouse | Life Technologies | A-21422 | 1:800 IF |
| Alexa 647, mouse | Life Technologies | A-31571 | 1:200 Flow Cytometry |
| 27-color ZE5 Flow Cytometer | Bio-RAD | For FACS | |
| Paraformaldehyde | sigma | P6148-500mg | For fixing cells for IF |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | For permeabilization of cells for IF |
| EVOS™ FL Color Imaging System | Thermo Scientific | AMEFC4300 | For IF |
| NaCl | RPI | S23020-5000 | For calcium imaging |
| KCl | VWR | 395 | For calcium imaging |
| CaCl2 | Fisher | C614-500 | For calcium imaging |
| MgCl2 | VWR | 97061-352 | For calcium imaging |
| glucose | sigma | G7528-250g | For calcium imaging |
| HEPES | sigma | H4034-500g | For calcium imaging |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F1221 | For calcium imaging |
| Fluronic F-127 | Sigma | P2443-250g | For calcium imaging |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | For disruption calcium transients in iCMs - use at 10 µM |
| Isoproterenol | sigma | I6504-1g | For increasing number of calcium transients in iCMs - use at 1-2 µM |
| Marianas Spinning Disk Confocal microscope | 3i | For calcium imaging | |
| ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| bleach | Clorox | ||
| 50 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 227261 | |
| 15 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 188271 | |
| 15 cm cell culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 10 cm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 60 mm cell culture dishes | GREINER BIO-ONE | 628160 | |
| 6 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| 12 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 665180 | |
| 24 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 662160 |
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