Summary
機能的な心筋細胞発現 Tbx5、ミール 1 とミール 133 Mef2c、Hand2 GATA4 (GHMT2m) と一緒に TGF-β シグナルの阻害を介してプライマリ胚性線維芽細胞を再プログラムする手法をご紹介します。我々 のプロトコル 60% までの 7 日間後の伝達も早く拍動心筋細胞を生成する効率。
Abstract
別に 1 つの体細胞のタイプのトランス分化には、モデルおよび人間の病気の治療に莫大な可能性があります。以前研究示されている、マウス胚は、真皮、そして心臓線維芽細胞を誘導心筋細胞様細胞 (iCMs) に書き換えることができます GATA4、Hand2 Mef2c など心原性転写因子の過剰発現を介して、Tbx5の in vitroとin vivoの両方。ただし、これらの以前の研究は、比較的低効率を示しています。心臓機能障害を復元するために iCMs の成熟と効率を向上させる心臓のリプログラミングを支配するメカニズムを解明する必要があります。
以前、リプログラミング効率を劇的にプロ線維のシグナル伝達の阻害に増加を示した。ここでは、リプログラミング効率 60% を達成する方法を詳しく説明します。また、フローサイトメトリー、蛍光イメージングは、リプログラミング効率とプログラムし直された線維芽細胞の成熟を定量化するカルシウム イメージングなどいくつかの方法をについて説明します。ここで詳細なプロトコルを使用して、心臓のリプログラミングの正と負のレギュレータを決定する解明を引き受けることができます。これらの研究は、リプログラミング効率と人間の心臓病を治療する細胞治療法につながる可能性の成熟を促進するためにターゲットすることができますシグナリング経路を識別できます。
Introduction
虚血性心疾患は、アメリカ合衆国1死の主要な原因です。およそ 800,000 のアメリカ人の経験最初または再発性心筋梗塞 (MI)1年につき。MI、次は、心筋 (CMs) と活性化心臓線維芽細胞による心筋の線維化の死は心臓機能2,3を損ないます。MI の後心不全の進行は主大人 CMs4、5の悪い再生能力により元に戻すこと。現在臨床治療が病気の進行を遅らせる、将来心臓イベント6,7,8,9のリスクを減少させる治療はできないのための病気の進行を逆します。CMs 心筋硬塞後10を再生成します。マイル失意のうち、次の患者を治療するために浮上している新規細胞治療、MI をこれまで続く心臓に幹細胞を提供する臨床試験は決定的でない再生潜在的な11,12,を示されています。13,14,15,16,17,18。
最初高橋 & 山中で示した 4 つの転写因子の過剰発現による線維芽細胞からひと由来の誘導多能性幹細胞 (hiPSCs) の生成は、細胞療法19で新たなブレークスルーにドアを開けた。これらの細胞は、すべて 3 つの胚葉19に区別できる、CMs の大規模な番号を生成するためのいくつかの非常に効率的な方法は、以前20,21を示されています。派生した CMs (腰-CMs) 心筋を勉強する強力なプラットフォームを提供しています、心臓の損傷を修復するための重要な含意があるかもしれない。腰 CMs 現在奇形腫形成22, 懸念のため並進ハードルに直面し、その未熟な性質があります pro 不整脈23。直接他のセルタイプに線維芽細胞をリプログラミングの興味を引き起こした hiPSCs に線維芽細胞をプログラムし直します。家田らは、低効率24どまる Tbx5 (GMT)、Mef2c、GATA4 心臓系統に直接再プログラム化により、線維芽細胞で過剰発現を示した。リプログラミング効率 Hand2 (GHMT)25の付加と改善されました。これらの初期の研究から多くの出版物を示していることは26,27,28,29, 要因追加転写リプログラミング因子カクテルを変更34は改善につながる小さな分子やマイクロ Rna32,33, クロマチン修飾子30,31リプログラミング効率および/または誘導された心筋細胞のような細胞 (iCMs の成熟).
ここでは、高効率でマウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEFs) から iCMs を生成する詳細なプロトコルを提供します。以前示したカクテル GHMT ミール 1 とミール-133 (GHMT2m) の追加で大幅に改善され、さらに向上、プロ線維増殖因子 β (TGF-β) シグナリングを変換を含むシグナルまたは Rho 関連蛋白質キナーゼ (ロック) シグナル伝達経路が抑制35です。このプロトコルを使用して、ことを示す細胞の約 60% エクスプレス心臓トロポニン T (cTnT)、50% 約表現 α-アクチニン暴行細胞数が多いが、早ければ次の要因と治療をリプログラミングの伝達日 11 観察できます。TGF-β と I 型受容体阻害剤 A-83-01 です。さらに、これらの iCMs はギャップ結合蛋白質コネキシン 43 を含むを表し、自発収縮とカルシウム濃度を示します。このマークが以前の研究と比較して効率をリプログラミングの改善は心後梗塞に残っている内因性の細胞集団から CMs を再生成する可能性を示しています。
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Protocol
動物を必要とするすべての実験は、動物介護制度と UC デンバー アンシュッツ医療キャンパス利用委員会によって承認されました。
1. MEFs の分離
- E13 の C57BL/6 妊娠マウスを購入します。一晩出荷。
- 承認された IACUC プロトコルによると母親を安楽死させる (ex: 頚部転位続いて ~1.3 L/min CO2動物が死んだが表示されるまで)
- 70% エタノールで母親をスプレーし、腹腔内を開きます。胚を含む子宮角を取り外して滅菌 PBS で 10 cm 皿に置きます。
- 胚を解放する胚嚢に切開を行います。10 cm の滅菌 PBS の皿をきれいにする胚を転送します。徹底的にすすいでください。
- 肝臓の下ボディをカットし、頭と上半身を破棄します。内臓を取り外して廃棄します。残りのティッシュを滅菌 PBS のきれいな 10 cm 皿に転送し、バイオ セーフティ レベル 1 または 2 のキャビネットにプレートを転送します。清潔で乾燥した 10 cm 皿にすべて胚からの組織を結合し、細かくみじん切り。
- みじん切りにした胚に 0.25% トリプシン/1 mM EDTA の 6 mL を追加します。組織を分割するピペットによって数回をカップ刻んだ。5% CO2と 37 ° C で 40 分間インキュベートします。
- 成長媒体 (表 1) で細胞を再懸濁します。メディアのボリュームは、胚の数に基づいて調整されます。一般に、1.2 胚あたり約 25 mL の成長媒体の比率を使用します。
- プレート 15 cm 皿に再懸濁細胞の 25 mL。24 h 後メディアを吸引し、新鮮な成長媒体の 25 mL を各プレートに追加します。
- 72 時間後 15 cm 皿ごとに 0.25% トリプシン/1 mM EDTA の 2 mL を追加します。細胞を培養皿からデタッチ、15 mL の培地でトリプシンを不活化し、50 mL スチロール円錐管の細胞を収集します。室温で 160 x gで 3 分の細胞を遠心します。70 μ m 孔携帯こし器を通って成長培地とフィルターで細胞ペレットを再懸濁します。
- 診断を使用してセルをカウントし、凍結中 200 万セル因数で MEFs を凍結 (10 %dmso、25 %fbs ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) で/高血糖)-80 ° C で液体窒素を使用する準備ができるまでの 24 h とストア後セルを転送します。
注: MEFs グローバル遺伝子発現プロファイリングを実行した RNA 塩基配列解読によってこのプロトコルを使用してを分離 (RNA seq) 携帯認証を確保するため。エンコードの MEF のセルからの RNA シーケンス データ受入番号 GSE93454 と NIH 遺伝子発現オムニバス (GEO) からがダウンロードされました。MEFs 私達によって使用のための RNA シーケンス遺伝子発現データは、受入番号 GSE71405 と NIH の GEO で沈殿させた。これら 2 つのデータ セットは、一般的な遺伝子記号によると併合しました。発現データがログ変換され、MEFs エンコード MEFs、発現データの散布図が生成され、線形回帰直線 (図 1 a) と合います。このプロトコルを使用して分離された MEFs はこれらの他の実験室によって孤立した分子と似ています。
2. レトロ ウイルスと MEFs の伝達の生産
注: このセクションのすべての手順を実行する必要がありますに行なうバイオ セーフティ レベル 2 キャビネット。このプロトコルは、レトロ ウイルスの伝達を利用して、少なくとも 20 分図 1B参照プログラムし直すためのタイムラインの 10% の漂白剤でウイルスのメディアを含むすべての廃棄物を扱うなどの予防措置、安全を確認します。
-
プラチナ E (PE) 細胞株を用いたレトロ ウイルスの生産
- 市販 PE PE 媒体 (表 1) 含むブラストサイジン ・ ピュロマイシン選択マーカー式ギャグ- のように細胞を維持する効率的なレトロ ウイルス粒子生産36 のポルとenv遺伝子.1:4、1:5 2 日で通過細胞。これはレトロ ウイルスの生産量を減らすことができます、セルの混雑を防ぐために注意してください。
- -1 日トランスフェクション前に約成長媒体 (表 1) 16-20 h で 10 cm 皿あたり 5 x 10 の6セルを種子 (メッキその他の標準的な細胞文化皿サイズの密度の表 2を参照)。慎重にロックの料理、前後数回と 37 ° C、5% CO2インキュベーターもめっき分布を確保するために慎重に (トランスフェクション前に最適なめっき密度は図 1を参照)。
注: 生成されたレトロ ウイルス粒子を含む培地が MEFs を殺さないようにトランスフェクション前選択マーカーの無料媒体のプレート PE セルに注意してください。 - 0 日、DNA をトランスフェクションに備えます。10 cm 皿 transfection のためそれぞれのリプログラミング因子 2 μ g を追加-GATA4 Hand2、Mef2c、Tbx5、ミール 1 とミール-133 (GHMT2m)-1.5 mL チューブに。
注: は transfect 他標準セル培養皿サイズに必要な DNA の量を拡張する表 2を参照してください。 - 別 1.5 mL チューブ 360 μ L 低下した血清中のメディアを追加します。低下した血清中メディアに直接 36 μ L のトランスフェクション試薬を加えます。軽くチューブをフリックし、5 分間室温でインキュベートします。
注: 低トランスフェクション効率を避けるためには、低下した血清中メディアに直接トランスフェクション試薬を慎重に追加します。 - GHMT2m DNA カクテルに減らされた血清のメディア/トランスフェクション試薬の混合物を追加します。軽くチューブをフリックし、15 分間室温でインキュベートします。ボルテックスにかけないでください。
- PE のセルに反応混合物を滴下し追加、穏やかに 10-15 秒のためのメディアを旋回し、37 ° C、5% CO2インキュベーターに配置。
注: メーカーによると PE 細胞生成 10 の平均価6 107感染ユニット/mL。このプロトコルは約 2 × 106感染症ユニット/mL 24 h と 6 x 106感染症ユニット/mL 平均 4 の MOI のため 48 h を生成します。GFP/下流のトランスフェクションは、トランスフェクション/伝達効率の場合、必要なの代理としても使用トランスフェクションの効率は、48 h (図 1) で 90% を超えると予想されます。
-
MEFs の伝達
- 0 日にコラーゲンと 37 ° C、5% CO2インキュベーター、少なくとも 2 時間の場所で料理をコートします。
- 液体窒素と雪解けから MEFs を削除します。培地に 60 mm ディッシュ プレート 0.2 x 106セルです。ゆっくり確実にロック プレート均一にめっき分布にインキュベーター (メッキその他の標準的な細胞文化皿サイズの密度の最適なめっき密度および表 2 図 1を参照)。
注: これらのめっき密度分離 MEFs; の複数のバッチをテストされています。MEFs 表示生存率を大幅に侵害、しない限り、細胞播種密度を調整することは必要ではありません。 - 1 日目、24 h 後トランスフェクション PE 細胞によって生成されたレトロ ウイルスの媒体を収集するために 30 mL の注射器を使用します。50 mL の円錐管に 0.45 μ m 孔サイズ フィルターを媒体を通過します。6 μ G/ml の最終的な集中に hexadimethrine 臭化トランスフェクション試薬を追加します。慎重にセルの変位を防ぐために培養皿の壁にピペッティング メディアによって PE セルに 10 mL の新鮮な成長媒体を追加します。
- MEFs から培地を吸引し、それぞれの料理に新鮮な収穫のレトロ ウイルスの培地 4 mL を追加します。MEFs をインキュベーターに戻ります。レトロ ウイルス粒子を中和するためにウイルスの媒体との接触のすべての材料を 10% の漂白剤を追加します。
- 2 日目、48 時間後のトランスフェクション 2.2.2 と 2.2.3 の手順を繰り返します。PE セルは、レトロ ウイルスの中の 2ndコレクションの後破棄されます。
注: 不要なレトロ ウイルスを中和するために、少なくとも 20 分の破棄された PE セルに対する 10% の漂白剤を追加します。 - 3 日目、MEFs から培地を吸引し、補充する 0.5 μ M を含む 4 mL iCM 培地 (表 1) と A-83-01 TGF-β I 型受容体阻害剤。ICM 媒質 A-83-01 2 日おきを補充します。
注: 伝達制御として GFP を使用する場合式によって期待される 90% を超えるこの時点 (図 1)。
3. 心臓マーカーのフローサイトメトリー
- 9 日から吸引中は、死んだ細胞や残骸を削除する 1 × PBS の MEFs、洗浄 (1 x) を再プログラム。
- 37 ° C で 1 mL 0.25% トリプシン EDTA/5 分を追加します。光学顕微鏡を使用してセルをチェックし、料理を振るセル接続されたまま、細胞を切り離すまで 37 ° C で 5 以上の分を孵化させなさい。
- 70 μ m 孔携帯こし器を通って 5 %fbs とフィルターを含む 1 × PBS のセルを洗浄します。
- 部屋の温度と、ペレットから液を吸引で 3 分の 160 x gで遠心分離機します。
注: セルの収量を増加するには、細胞ペレットの上約 50 μ L 液体をまま。 - セルを 1 %bsa を含む 500 μ L 1 × PBS で洗浄します。
- 氷の上の 0.2 mL/1, 000 セル セル固定溶液 20 分間を修正します。
- 1 x 冷たいパーマ/洗浄バッファーの 1 つの mL を追加します。
注: 製造元のソリューションは 10 倍です。 - 4 ° C で 5 分間 160 x gで細胞を遠心し、上清を吸引します。
- 追加時間 3.7 ・ 3.8 の手順を繰り返します。2nd洗浄後そのまま次のステップに進むまたは一晩 4 ° C で細胞を保ちます。
- 5% ヤギ血清とロバ血清室温で 30 分間パーマ/洗浄バッファー x 1 の 100 μ L でブロックします。
- 希釈した一次抗体 100 μ L を追加します。
注: このプロトコルのマウス トロポニン T (レバレッジ) で標識した細胞とマウス α-アクチニン (レバレッジ) の割合を定量化する細胞心筋筋節の主要なコンポーネントのために積極的。一次抗体室温で 1 時間インキュベートします。 - 4 ° C で 5 m 160 x gで細胞を遠心、上清を吸引し、冷たいパーマ/洗浄バッファーで 2 倍を洗ってください。
- 希釈した二次抗体の 100 μ L を追加します。
注: このプロトコルの細胞は抗マウス 647 nm 二次抗体 (レバレッジ) で標識しました。エンド オーバー エンド チューブ回転子に室温の 45 分の二次抗体を孵化させなさい。ホイル チューブをラップすることによって光から細胞を保護します。 - 4 ° C で 5 分間 160 x gで細胞を遠心、上清を吸引し、冷たいパーマ/洗浄バッファーで 2 倍を洗ってください。
- PBS で 1 %bsa の 1 つの mL を追加し、FACS をすぐに実行します。
注: は、FACS を実行するときに実行可能なセルを最初ゲート前方散乱対側散布を生成します。また、ライブを識別し、死んだ細胞のセルを修正する前に市販のライブ/死細胞染色を使用します。
4. プログラムし直された MEFs の免疫染色
- 14 日目から吸引中は書き換え MEFs、1 mL の 1 x の氷冷 PBS で洗浄 (1 x)。
注: 免疫染色用抗体ソリューション ボリュームを最小限に抑えるため 12 ウェル プレートで実行されたリプログラミングします。24 ウェル プレートも使用できます。単に半分すべて次のボリューム。 - 吸引、室温で 10 分間 500 μ L 2% パラホルムアルデヒドとセルを修正します。
- 吸引し、1 mL の 1x PBS (常温洗浄あたり 5 分) で 3 回細胞を洗ってください。
- 500 μ L 0.2% 透過性試薬による PBS で室温で 15 分間セルを permeabilize します。
- 吸引し、500 μ L 10% 馬血清 PBS で室温で 30 分間でブロックします。
- 吸引し、1 時間室温で希釈した一次抗体の 500 μ L で孵化させなさい。
注: このプロトコル細胞がマウス トロポニン T または α-アクチニン (各 1: 400) が付いたし、共同コネキシン 43 (1: 400) またはトロポニンに私 (1: 400) ラベル付け。 - 一次抗体を吸引し、1 mL の 1x PBS (常温洗浄あたり 5 分) にて 3 回洗浄します。
- 吸引し、500 μ L の希釈した二次抗体と室温で 1 時間インキュベートします。
注: このプロトコルの抗マウス 555 nm 二次抗体 (1:800) トロポニン T または α-アクチニンを認識すると反うさぎ 488 nm 二次抗体 (1:800) コネキシン 43 またはトロポニン i. また認識するラベルされた細胞、核染色ヘキスト (1:10, 000)。暗闇の中でインキュベートし、光から細胞を保護します。 - 二次抗体を吸引し、1 mL の 1x PBS (常温洗浄あたり 5 分) にて 3 回洗浄します。光から細胞を守るし、4 ° C で保存に箔でプレートをラップします。
- 3 ch 落射蛍光顕微鏡を使用してイメージ。
5. カルシウム イメージング
注: 場合は 10 倍の倍率でイメージング、標準的な細胞培養皿とプレートに適していますカルシウム イメージング。高倍率でイメージング ガラス ガラス底培養皿の細胞をめっきすることが必要です。
- 培地を吸引し、2 mL (、6 ウェル プレート) が変更されたタイロード液 (140 mM NaCl、KCl、1.8 mM CaCl2, 5 mM 1 mM MgCl2、10 mM グルコース、10 mM HEPES、0.1 %bsa および 1% のピルビン酸、pH 7.4) を追加 5 μ M を含む Fura 2 だと 0.1% プルロニック F-127 (D14 t を打つことにo D20) iCMs。37 ° C で 30 分間インキュベートします。
注: は、蛍光指示薬の焼入を防ぐために光から細胞を守る。 - フラ 2 の解消のエステル化を許可する部屋の温度で 30 分間 2 mL タイロード液で細胞を洗う時。
- 340 ディスク共焦点顕微鏡を回転画像 nm と 380 nm Slidebook 5.5 Ca2 +イメージング ソフトウェアを使用して。室温でイメージングを実行します。
- カルシウム濃度は 340 で蛍光強度の比を使用して計算されます 380 で蛍光強度上 nm nm。
- 必要な場合治療 1 または 2 μ M イソプロテレノールや 10 μ M iCMs ニフェジピン カルシウム基準カルシウム トランジェントをイメージングした後の処理を操作します。ローカル セルとイメージする化合物を追加します。
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Representative Results
約 70% と心筋トロポニン T を発現する細胞の心筋 α-アクチニン、日 9 にフローサイトメトリーによる定量化を発現する細胞の約 55% の iCMs 上記及び図 1Bリプログラミングの戦略を使用して、生成しました。次の GHMT2m の伝達 (図 2 aとB)。さらに、細胞の大部分はエクスプレス心臓トロポニン T、トロポニンは心筋 α-アクチニンと次の伝達 (図 2およびD) 日 14 にギャップ接合マーカー コネキシン 43。高倍率画像では、明確に定義された筋節構造形成とギャップ結合隣接細胞 (白い矢印、図 2 D) 形成を明らかにします。さらに、自発的な収縮とカルシウム濃度は、iCMs (図 3 a-Cと映画 1) の機能を示します。
図 1: リプログラミングのタイムラインとセルの最適なめっきです。(A) MEFs エンコード MEFs 対ラボで生成のための RNA シーケンス データの対数変換の散布図。R2値と回帰直線が表示されます。(B)すべての重要な図は MEFs の GHMT2m を介したリプログラミングのステップします。(C) PE 細胞トランスフェクション (上行、左パネル) および GFP 遺伝子導入効率 (一番上の行、中央と右のパネル) を示す信号 48 時間後トランスフェクション前に 70-80% 合流。MEFs シードまばら (最下行、左右パネル) をプログラムし直すと感染効率 (一番下の行、中央と右のパネル) を示す GFP 信号 48 時間感染後の期間にわたって混雑を防ぐために感染する前に。スケール バー = 400 μ M.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 定量化と iCMs でタンパク質発現の特性。(A と B).心筋トロポニン T (A)の代表的なフローサイトメトリーと α-アクチニン(B)日 9 で次 GHMT2m 伝達、n = 3。(C) ICC GHMT2m 伝達を次の日 14 に心臓マーカーの染色。緑: 心筋トロポニン I、赤: 心臓トロポニン T (中央のパネル) と α-アクチニン (右側のパネル)、青: ヘキスト染色核。代表的な画像 (n = 3)。スケール バー = 筋節構造の 200 μ M (D)高倍率想像 (赤: 心筋 α-アクチニン (上の行) と心臓トロポニン T (下の行)) とギャップ結合蛋白コネキシン 43 (緑) の式。白い矢印は、隣接セル間ギャップ結合で形成されるを示します。代表的な画像 (n = 3)。スケールバー = 100 μ M.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: iCMs の機能定量化します。(A)次の GHMT2m 伝達細胞数を打つの時間コース。目で数えられた暴行セルとセルの一皿以上 3 実験料理された平均し、パネル A に含まれている 10 のフィールドから数(BとC) iCMs のカルシウム濃度を記録。1 μ m の処置に続く iCMs 内カルシウム非定常周波数が変更されるイソプロテレノールや 10 μ M ニフェジピン。F340/F380、340 と 380 nm での蛍光強度の比。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
映画 1: 暴行 iCMs 。12 日体外で暴行 iCMs を示す映画。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
| iCM メディア | ||
| 試薬の名前 | 量 (mL) | 最終濃度 |
| DMEM 高グルコース | 320 | |
| 199 培地 | 80 | |
| ウシ胎児血清 | 50 | 10% |
| ドナー ウマ血清 | 25 | 5% |
| MEM 必須アミノ酸、50 x | 10 | 1 x |
| ナトリウム ピルビン酸溶液、100 x | 5 | 1 x |
| MEM 非本質的なアミノ酸、100 x | 5 | 1 x |
| MEM ビタミン ソリューション、100 x | 5 | 1 x |
| インシュリン ・ トランスフェリン ・ セレニウム、100 x | 5 | 1 x |
| B27、50 x | 10 | 1 x |
| Penicilin ストレプトマイシン | 5.5 | 1.1% |
| L-グルタミン | 5.5 | 1.1% |
| PE メディア | ||
| 試薬の名前 | 量 (mL) | 最終濃度 |
| DMEM 高グルコース | 450 | |
| ウシ胎児血清 | 50 | 10% |
| Penicilin ストレプトマイシン | 5.5 | 1.1% |
| L-グルタミン | 5.5 | 1.1% |
| ブラストサイジン-塩酸 - 10 mg/mL | 0.5 | 10 μ G/ml |
| ピューロマイシン二塩酸塩 | 0.05 | 1 μ G/ml |
| 成長媒体 | ||
| 試薬の名前/機器 | 量 (mL) | 最終濃度 |
| DMEM 高グルコース | 450 | |
| ウシ胎児血清 | 50 | 10% |
| Penicilin ストレプトマイシン | 5.5 | 1.1% |
| L-グルタミン | 5.5 | 1.1% |
表 1:培養基。このプロトコルで使われる培養液のレシピ。
| PE セル | ||||||
| 細胞培養ディッシュ | 表面積 (センチメートル2) | 播種密度 (セル) | メディア ボリューム (mL) | 合計 DNA トランスフェクション (μ g) あたり | トランスフェクション試薬 (μ L) | Opti MEM (μ L) |
| 15 cm | 176.7 | 11.25 x 106 | 20 | 36 | 108 | 1080 |
| 10 cm | 78.5 | 5 x 106 | 10 | 12 | 36 | 360 |
| 60 mm | 28.2 | 1.7 x 106 | 4 | 4 | 12 | 120 |
| 6 ウェル プレート | 9 | 0.54 x 106 | 2 | 1.3 | 3.9 | 39 |
| 12 ウェル プレート | 4 | 0.24 x 106 | 1 | 0.6 | 1.8 | 18 |
| 24 well プレート | 2 | 0.12 x 106 | 0.5 | 0.3 | 0.9 | 9 |
| MEFs | ||||||
| 細胞培養ディッシュ | 表面積 (センチメートル2) | 播種密度 (セル) | メディア ボリューム (mL) | Hexadimethrine 臭化物 (μ L) | ||
| 15 cm | 176.7 | 1.35 x 106 | 20 | 12 | ||
| 10 cm | 78.5 | 0.6 x 106 | 10 | 6 | ||
| 60 mm | 28.2 | 0.2 x 106 | 4 | 2.4 | ||
| 6 ウェル プレート | 9 | 0.1 x 106 | 2 | 1.2 | ||
| 12 ウェル プレート | 4 | 0.4 × 105 | 1 | 0.6 | ||
| 24 well プレート | 2 | 0.2 × 105 | 0.5 | 0.3 | ||
表 2: プログラムし直すための播種量。播種密度 PE 電池用と一般的な細胞培養皿形式の MEFs の表。
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Discussion
本研究では、直接初期化因子プロ線維性シグナル伝達経路の抑制と組み合わせる GHMT2m の配信を介して機能 iCMs に線維芽細胞を再プログラムする高効率戦略について説明します。フローサイトメトリー、蛍光イメージング、カルシウム イメージング、およびこのプロトコルでセルの大半を示す細胞数を打つことを使用して成功の書き換えを受けるし、CM リネージュ運命を採用します。我々 は以前に、抗線維化添加化合物の TGF-β 型を含む私受容体阻害剤 A-83-01 利回り GHMT2m 単独でことを示すと伝達に比べて打撃 iCMs 数のおよそ 6 増加プロ線維信号は心臓リプログラミングに強力な内因性バリアです。このシステムは、したがって、心筋; を支配するメカニズムを調査するため薬物をスクリーニングするため活かされるA-83-01 と一緒に小分子添加心筋の負の制御因子が明らかに。逆に、GHMT2m だけに小分子添加心筋正電圧レギュレータを解明できます。これらの正と負のレギュレータは CM の分化を支配するメカニズムの解明と、心筋のより良い理解は、さらに効率的なリプログラミングと成熟プロトコルに 。
リプログラミング効率に影響を与える多くの変数。めっきの細胞密度が大幅 PE セルの場合レトロ ウイルス粒子の製造と MEFs 場合すべて初期化因子の効率的な吸収に影響するとわかった。さらに、通路番号できますこれらのパラメーターも同様に影響を与えます。ウイルス粒子の最適生産を確保するには、通路 20 の前に PE 細胞を transfect します。レトロ ウイルス粒子の効率的な摂取量を確保するため、凍結後 MEFs の通路はないです。
いくつかの最近の調査はまた高効率再 MEFs よう PRC1 メンバー Bmiグリニッジ標準時30の発現をノックダウン、GHMT37に加えて Akt を過剰発現を示した。GHMT + Akt ZFN281 の添加は大人尾先端繊維芽細胞の一部に起因する炎症性遺伝子署名38の抑制における陽性細胞トロポニン T の 4 倍の増加をもたらした。また、TGF-β シグナル伝達阻害剤と WNT シグナル伝達阻害剤の組み合わせは、リプログラミング39GMT を介した心臓を増加しました。重要なは、これらの研究に関与するシグナル伝達経路は重複して表示されません。したがって、それは複数のシグナル伝達経路との間にそのクロストークの心臓リプログラミングがさらに向上します。
研究の数示されてリプログラミング体内要因以下のマウスで左前方下降 (若者) 動脈結紮25,32,39,40 をリプログラミングの配信を介して ,41。これらの研究は、心室機能 MI、傷害に続く心の再生に関する心臓リプログラミングの治療の可能性を強調するのに地味な改善を表示でした。我々 のプロトコルは、最高効率は体外まで MEFs を書き換え。したがって、高効率のリプログラミングは心臓機能の後の損傷を完全に復元することができるかどうかを参照してくださいに興味深いものになる体内。これらの研究は、患者の心筋硬塞後の細胞治療にこの方法を翻訳のための基礎として役立つことができます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この研究は、ベッチャー財団のウェッブ ワーミング生物医学研究プログラム、アメリカ心臓協会の科学者開発補助 (13SDG17400031) コロラド大学部門医学優れた初期のキャリアからの資金によって支えられました。学者プログラムは、コロラド州部の循環器バーロー Nyle 基金、大学と NIH (カンザス) に R01HL133230。A.S.R は、線維症研究 & 翻訳 (CFReT) の NIH/NCATS コロラド CTSA 許可番号 TL1TR001081 とコロラド大学コンソーシアムから博士フェローシップによって支持されました。本研究は、がんセンター助成金 (P30CA046934)、皮膚疾患研究コア助成金 (P30AR057212)、コロラド大学アンシュッツ メディカル キャンパスで流れ Cytometry コアによっても支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 Mice | Charles River's Laboratory | 027 | For MEF isolation |
| Platinum E (PE) Cells | Cell Biolabs, INC | RV-101 | For retrovirus production |
| DMEM High Glucose | Gibco | SH30022.FS | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150-059 | Component of iCM media |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100106 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Donor Horse Serum | Gemini | 100508 500 | Component of iCM media |
| MEM Essential Amino Acids, 50X | Life Technologies | 11130051 | Component of iCM media |
| Sodium Pyruvate Solution, 100X | Life Technologies | 11360070 | Component of iCM media and for calcium imaging |
| MEM Non-Essential Amino Acids, 100X | Life Technologies | 11140050 | Component of iCM media |
| MEM Vitamin Solution, 100X | Life Technologies | 11120-052 | Component of iCM media |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 41400045 | Component of iCM media |
| B27 | Gibco | 17504-044 | Component of iCM media |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| GlutaMAX (L-Glutamine Supplement) | Gibco | 35050-061 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Blasticidin-HCl | Life Technologies | A11139-03 | Component of PE media |
| Puromycin dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Component of PE media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | For detaching cells from culture dishes |
| A-83-01 | R&D Systems - Tocris | 2939/10 | Treat cells to inhibit TGF-β signaling - promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM |
| DMSO | Thermo Scientific | 85190 | For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium |
| SureCoat | Cellutron | SC-9035 | For coating dishes to plate MEFs |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection Reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 11058-021 | Transfection Reagent |
| pBabe-X Myc-GATA4 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Hand2 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Mef2c | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Tbx5 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-1 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-133 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X GFP | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268-5G | For viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL |
| Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores) | Nalgene | 569-0020 | For filtering media |
| Syringes | Bd Vacutainer Labware | 309654 | For viral filtration |
| 0.45 µm Filters | Celltreat | 229749 | For viral filtration |
| 70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | For MEF isolation and Flow Cytometry |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry |
| perm/wash buffer | BD | 554723 | For washing cells for flow cytometry |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-250 | For washing cells |
| Bovine Serum Albumin | VWR | 0332-100g | For flow cytometry and calcium imaging |
| Goat Serum | Sigma | G9023 | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Donkey Serum | Sigma | D9663-10mg | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Mouse Troponin T | Thermo Scientific | ms-295-p | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Mouse α-actinin | Sigma | A7811L | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Rabbit Connexin 43 | Sigma | C6219 | 1:400 IF |
| Rabbit Troponin I | PhosphoSolutions | 2010-TNI | 1:400 IF |
| Hoechst | Life Technologies | 62249 | 1:10000 IF |
| Alexa 488, rabbit | Life Technologies | A-11034 | 1:800 IF |
| Alexa 555, mouse | Life Technologies | A-21422 | 1:800 IF |
| Alexa 647, mouse | Life Technologies | A-31571 | 1:200 Flow Cytometry |
| 27-color ZE5 Flow Cytometer | Bio-RAD | For FACS | |
| Paraformaldehyde | sigma | P6148-500mg | For fixing cells for IF |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | For permeabilization of cells for IF |
| EVOS™ FL Color Imaging System | Thermo Scientific | AMEFC4300 | For IF |
| NaCl | RPI | S23020-5000 | For calcium imaging |
| KCl | VWR | 395 | For calcium imaging |
| CaCl2 | Fisher | C614-500 | For calcium imaging |
| MgCl2 | VWR | 97061-352 | For calcium imaging |
| glucose | sigma | G7528-250g | For calcium imaging |
| HEPES | sigma | H4034-500g | For calcium imaging |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F1221 | For calcium imaging |
| Fluronic F-127 | Sigma | P2443-250g | For calcium imaging |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | For disruption calcium transients in iCMs - use at 10 µM |
| Isoproterenol | sigma | I6504-1g | For increasing number of calcium transients in iCMs - use at 1-2 µM |
| Marianas Spinning Disk Confocal microscope | 3i | For calcium imaging | |
| ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| bleach | Clorox | ||
| 50 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 227261 | |
| 15 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 188271 | |
| 15 cm cell culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 10 cm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 60 mm cell culture dishes | GREINER BIO-ONE | 628160 | |
| 6 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| 12 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 665180 | |
| 24 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 662160 |
References
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