Summary
Hier präsentieren wir eine robuste Methode zur primären embryonale Fibroblasten in funktionellen Herzmuskelzellen durch Überexpression des GATA4, Hand2, Mef2c und Tbx5, MiR-1 und MiR-133 (GHMT2m) neben Hemmung der TGF-β-Signal neu zu programmieren. Unser Protokoll generiert schlagende Herzzellen bereits 7 Tage nach Transduktion mit bis zu 60 % Wirkungsgrad.
Abstract
Trans-Differenzierung des Typs einer somatischen Zelle in eine andere hat ein enormes Potenzial zur Modellierung und menschliche Krankheiten zu behandeln. Frühere Studien haben gezeigt, dass Maus embryonalen, dermale und kardialen Fibroblasten können in funktionale induziert-Cardiomyocyte-ähnlichen Zellen (iCMs) umprogrammiert werden durch Überexpression von kardiogener Transkriptionsfaktoren einschließlich Hand2, GATA4, Mef2c, und Tbx5 in Vitro und in Vivo. Diese früheren Studien haben jedoch relativ geringen Effizienz gezeigt. Um Herz-Funktion nach Verletzung wieder herzustellen, müssen Mechanismen für kardiale Umprogrammierung zur Steigerung von Effizienz und Reifung der iCMs aufgeklärt werden.
Wir zuvor nachweislich Hemmung der Pro-fibrotische Signalisierung dramatisch Neuprogrammierung Effizienzsteigerungen. Hier zeigen wir Methoden, einen Neuprogrammierung Wirkungsgrad von bis zu 60 % zu erreichen. Darüber hinaus beschreiben wir verschiedene Methoden einschließlich Durchflusszytometrie, immunofluorescent Bildgebung und Kalzium Imaging, Neuprogrammierung Effizienz und Reifung der umprogrammierten Fibroblasten zu quantifizieren. Hier das ausführliche Protokoll verwenden, können mechanistische Studien zur positive und negative Regulatoren der kardialen Umprogrammierung bestimmen durchgeführt werden. Diese Studien können Signalwege zu identifizieren, die angegriffen werden kann, zur Förderung der Neuprogrammierung Effizienz und Reifung, die zu neuartiger Zelltherapien zu menschlichen Herzerkrankungen führen könnten.
Introduction
Ischämischer Herzkrankheit ist eine führende Ursache des Todes in den Vereinigten Staaten1. Ca. 800.000 Amerikaner Erfahrung eine erste oder wiederholte Myokardinfarkt (MI) pro Jahr1. Nach MI beeinträchtigen der Tod von Herzmuskelzellen (CMs) und kardialer Fibrose, hinterlegt von aktivierten kardialen Fibroblasten, Herz-Funktion2,3. Fortschreiten der Herzinsuffizienz nach MI ist weitgehend irreversibel durch die schlechte Regenerationsfähigkeit des Erwachsenen CMs4,5. Während die aktuellen klinischen Therapien Fortschreiten der Erkrankung zu verlangsamen und verringern Risiko für zukünftige kardiale Ereignisse6,7,8,9, umkehren keine Therapien Fortschreiten der Erkrankung aufgrund der Unfähigkeit CMs-Post-Infarkt-10zu regenerieren. Neuartiger Therapien zur Behandlung von Patienten nach MI. enttäuschend entstehen, klinische Studien liefern Stammzellen ins Herz nach MI so weit haben gezeigt, nicht schlüssig regenerative potenzielle11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.
Die Generation der Menschen abgeleitet induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs) von Fibroblasten durch Überexpression von vier Transkriptionsfaktoren, erstmals nachgewiesen von Takahashi & Yamanaka, öffnete die Tür zu neuen Durchbrüchen in Zelle Therapie19. Diese Zellen können in alle drei mikrobeschichten19, und mehrere hoch effiziente Methoden zur Generierung zahlreicher CMs haben bisher gezeigt,20,21. HiPSC abgeleitet CMs (Hüften-CMs) bietet eine leistungsstarke Plattform, um Cardiomyogenesis zu studieren und eventuell wichtige Implikationen für die Reparatur von Herzen nach Verletzung. Jedoch kann Hüften-CMs derzeit translationale Hürden aufgrund von Bedenken der Teratom Bildung22, und ihre unreife Natur Pro-Arrhythmogenic23. Reprogrammierung von Fibroblasten in HiPSCs löste Interesse an direkt Umprogrammierung Fibroblasten in andere Zelltypen. Ieda Et Al. zeigten, dass Überexpression des GATA4, Mef2c und Tbx5 (GMT) in Fibroblasten führt direkte Reprogrammierung zu kardialen Abstammung, wenn auch mit geringer Effizienz24. Umprogrammierung der Effizienz wurde mit dem Zusatz von Hand2 (GHMT)25verbessert. Seit diesen frühen Studien haben viele Publikationen gezeigt, dass Veränderung des Neuprogrammierung Faktor-Cocktails mit zusätzlichen Transkription26,27,28,29 Faktoren, Chromatin Modifikatoren30,31, Micro-RNAs32,33oder kleine Moleküle, die34 zu verbesserten führt Umprogrammierung Effizienz und/oder Reifung der induzierten Cardiomyocyte-ähnlichen Zellen (iCMs ).
Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll um iCMs aus Maus embryonalen Fibroblasten (MEFs) mit hohem Wirkungsgrad zu erzeugen. Wir zeigte zuvor, dass die GHMT cocktail mit dem Zusatz von MiR-1 und MiR-133 (GHMT2m) deutlich verbessert wird und wird weiter verbessert, wenn Pro-fibrotische Signalwege einschließlich Umwandlung Wachstumsfaktor β (TGF-β) Signalisierung oder Rho-assoziierten Protein-Kinase (ROCK) Signalwege sind gehemmt35. Anhand dieses Protokolls zeigen wir, dass etwa 60 % der Zellen kardiale Troponin T (cTnT Express), ca. 50 % α-Actinin Express und eine hohe Anzahl von Schlägen Zellen so früh wie Tag 11 nach Transduktion beobachtet werden der Neuprogrammierung Faktoren und Behandlung mit der TGF-β Typ I Rezeptor Hemmer A-83-01. Darüber hinaus diese iCMs express Gap Junction Proteinen einschließlich Connexin 43 und spontane Kontraktion und Kalzium Transienten. Diese deutliche Verbesserung der Effizienz im Vergleich zu früheren Studien Umprogrammierung zeigt das Potenzial, CMs von endogenen Zellpopulationen zu regenerieren, die in der Post-Herzinfarkt bleiben.
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Protocol
Alle Experimente erfordern Tiere wurden von den institutionellen Animal Care und Use Committee an der UC Denver Anschutz Medical Campus genehmigt.
1. Isolierung der MEFs
- Kaufen Sie Schwangere Mäusen C57BL/6 in E13. Schiff über Nacht.
- Einschläfern die Mutter nach genehmigten IACUC Protokolle (ex: ~1.3 L/min CO2 bis Tier tot erscheint gefolgt von zervikale Dislokation)
- Sprühen Sie die Mutter mit 70 % Ethanol und öffnen Sie Bauchhöhle zu. Entfernen der Gebärmutter Horns mit Embryonen und in einer 10 cm Petrischale mit sterilem PBS.
- Machen Sie einen Schnitt in der Embryo-Sac freizugebende Embryo. Übertragen Sie Embryo um 10 cm Teller mit sterilen PBS zu reinigen. Gründlich ausspülen.
- Schneiden Sie den Körper unterhalb der Leber und entsorgen Sie den Kopf und Oberkörper. Inneren Organe entfernen und entsorgen. Das restliche Gewebe auf eine saubere 10 cm Teller mit sterilen PBS übertragen und die Platte auf einer Biosafety Level 1 oder 2 Schrank übertragen. Gewebe aus allen Embryonen in einem sauberen, trockenen 10 cm Teller zu kombinieren und in feine Stücke hacken.
- Hackfleisch / Embryonen 6 mL von 0,25 % Trypsin/1 mM EDTA hinzufügen. Genannte mehrmals mit Pipette Gewebe aufzubrechen. 40 min bei 37 ° c mit 5 % CO2inkubieren.
- Aufschwemmen Sie Zellen im Wachstumsmedium (Tabelle 1). Die Lautstärke der Medien ist abhängig von der Anzahl der Embryonen geerntet eingestellt. Verwenden Sie in der Regel ein Verhältnis von etwa 25 mL Wachstumsmedien pro 1,2 Embryonen.
- Platte 25 mL resuspendierte Zellen in einer Petrischale 15 cm. Aspirieren Sie nach 24 h die Medien und 25 mL frische Wachstumsmedium auf jede Platte.
- Fügen Sie nach 72 h 2 mL von 0,25 % Trypsin/1 mM EDTA zu jeweils 15 cm Schüssel hinzu. Wenn Zellen aus der Kulturschale Loslösen, Trypsin mit 15 mL Wachstumsmedium zu inaktivieren und Zellen in 50 mL Polystyrol konischen Rohren zu sammeln. Zentrifugieren Sie Zellen für 3 min bei 160 X g bei Raumtemperatur. Die Zelle Pellet im Wachstumsmedium und Filter durch ein 70 µm Pore Zelle Sieb aufzuwirbeln.
- Zählen von Zellen mit einem Hemocytometer und MEFs in 2 Millionen Zellen Aliquote Einfrieren Medium Einfrieren (10 % DMSO, 25 % FBS in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) / hohe Glukose) bei-80 ° C. Übertragen Sie Zellen in flüssigem Stickstoff nach 24 h und Store erst unmittelbar vor Gebrauch.
Hinweis: Globale Genexpression in MEFs wurde profiliert durch RNA-Sequenzierung isoliert unter Verwendung dieses Protokolls (RNA-Seq) Zelle Authentifizierung sicherzustellen. RNA-Seq Daten aus KODIEREN MEF-Zellen wurden mit Zbl-Nummer GSE93454 vom NIH Gene Expression Omnibus (GEO) heruntergeladen. RNA-Seq Genexpressionsdaten für die von uns verwendeten MEFs wurden im NIH GEO Zbl-Nummer GSE71405 hinterlegt. Diese zwei Datensätze wurden nach gemeinsamen gen Symbole zusammengeführt. Der Ausdruck Daten wurden dann Log-transformiert und ein Streudiagramm der Ausdruck Daten für unsere MEFs und ENCODE MEFs wurden generiert und fit mit einem linearen Regressionsgeraden (Abbildung 1A). MEFs isoliert unter Verwendung dieses Protokolls sind Molekular ähnlich isoliert von anderen Labors.
2. Herstellung von Retrovirus und Transduktion von MEFs
Hinweis: Alle Schritte in diesem Abschnitt müssen in einem Biosafety Level 2 Schrank durchgeführt werden. Da dieses Protokoll retrovirale Transduktion nutzt, dafür sorgen Sie, dass die Sicherheit, die Vorkehrungen getroffen werden, einschließlich der Behandlung alle mit viralen Medien mit 10 % Bleichmittel für mindestens 20 min. siehe Abbildung 1 b für eine Zeitleiste Abfälle für die Umprogrammierung.
-
Produktion von Retrovirus mit Platin E (PE)-Zell-Linie
- Halten handelsübliche PE-Zellen in PE Medium (Tabelle 1) enthaltenden Blasticidin und Puromycin Selektionsmarker darauf Ausdruck der gag-Pol und Env -Gene für effiziente retrovirale partikelherstellung36 . Durchgang Zellen auf 1:4 oder 1:5 alle zwei Tage. Achten Sie darauf, um zu verhindern, Überbelegung der Zellen, wie dies retrovirale Produktion Erträge reduzieren kann.
- Am Tag-1 Samen ca. 5 x 106 Zellen pro 10 cm Teller in das Wachstumsmedium (Tabelle 1) 16-20 h vor Transfektion (siehe Tabelle 2 für Galvanik dichten für andere Standardzelle Kultur Schale Größen). Mehrere Male hin und her schütteln es Gerichte und legen Sie vorsichtig in einem 37 ° C, 5 % CO2 Inkubator, gleichmäßige Verteilung der Beschichtung zu gewährleisten (siehe Abbildung 1 für optimale Beschichtung Dichte vor Transfektion).
Hinweis: darauf achten Sie, auf Platte PE Zellen in das Medium frei von Selektionsmarker vor Transfektion um sicherzustellen, dass die generierten retroviralen Partikel-haltigem Medium MEFs nicht tötet. - Am Tag 0 Vorbereitung DNA zur Transfektion. Für 10 cm Schale Transfection hinzufügen 2 µg von jeder Neuprogrammierung Faktor – GATA4, Hand2, Mef2c und Tbx5, MiR-1 und MiR-133 (GHMT2m) — zu einer 1,5 mL-Tube.
Hinweis: Siehe Tabelle 2 , die Menge von DNA benötigt, um andere Standardzelle Kultur Schale Größen transfizieren zu skalieren. - Fügen Sie in einer separaten 1,5 mL Tube 360 µL reduzierte Serum Medien hinzu. Fügen Sie 36 µL Transfection Reagens direkt reduzierte Serum-Medien. Sanft streichen der Röhre und in 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
Hinweis: Zur Vermeidung von reduzierten Transfection Leistungsfähigkeit fügen Sie sorgfältig Transfection Reagens direkt an die reduzierte Serum-Medien hinzu. - GHMT2m DNA cocktail reduzierte Serum Medien/Transfection Reagens Mischung hinzufügen. Sanft streichen Sie das Rohr und bei Raumtemperatur 15 min inkubieren. Tun Sie nicht Wirbel.
- Das Reaktionsgemisch tropfenweise hinzufügen PE Zellen sanft Medien für 10-15 s Wirbel und legen Sie in einem 37 ° C, 5 % CO2 Inkubator.
Hinweis: Laut Hersteller PE Zellen erzeugen eine durchschnittliche Titer von 106 bis 107 infektiösen Einheiten/mL. Dieses Protokoll generiert etwa 2 x 106 Infektionen Einheiten/mL von 24 h und 6 x 106 Infektionen Einheiten/mL nach 48 h bei einer durchschnittlichen MOI von 4. Transfektion von GFP/DsRed kann auch als Ersatz für die Transfektion/Transduktion Effizienz bei Bedarf verwendet werden; Transfektion Effizienz wird voraussichtlich 90 % von 48 h (Abbildung 1) nicht überschreiten.
-
Transduktion von MEFs
- Am Tag 0 Mantel Gerichte mit Kollagen und in einem 37 ° C, 5 % CO2 Inkubator für mindestens 2 h.
- Entfernen Sie MEFs aus flüssigem Stickstoff und Tauwetter. Platte 0,2 x 106 Zellen pro 60 mm Schale in das Wachstumsmedium. Sanft Rock-Platten zu gewährleisten gleichmäßige Beschichtung und in den Inkubator zu platzieren (siehe Abbildung 1 für optimale Beschichtung Dichte und Tabelle 2 für Galvanik dichten für andere Standardzelle Kultur Schale Größen).
Hinweis: Diese Beschichtung dichten wurden über mehrere Batches von isolierten MEFs getestet; es sei denn, MEFs-Display deutlich Lebensfähigkeit gefährdet, ist es nicht notwendig, Anpassung der Zelle Dichte Aussaat. - Am Tag 1, 24 h nach Transfektion, verwenden Sie eine 30 mL Spritze retrovirale Medium erzeugt durch PE-Zellen zu sammeln. Übergeben Sie das Medium durch einen 0,45 µm Porengröße Filter in ein 50 mL konische Röhrchen. Hinzu kommt eine Endkonzentration von 6 µg/mL Hexadimethrine Bromid Transfection Reagens. Fügen Sie 10 mL frisches Wachstumsmedium sorgfältig PE Zellen durch pipettieren Medien an die Wand der Kulturschale, Verschiebung der Zellen zu verhindern hinzu.
- Aspirieren Sie das Medium aus MEFs und jedes Gericht fügen Sie 4 mL frisch geernteten retrovirale Medium hinzu. Der Inkubator MEFs zurückzukehren. Fügen Sie 10 % Bleichmittel auf alle Materialien virale mediumberührte retroviralen Partikel zu neutralisieren.
- Am Tag 2, 48 h nach Transfektion, wiederholen Sie die Schritte 2.2.2 und 2.2.3. PE-Zellen werden nach der 2Nd -Sammlung des Mediums retrovirale verworfen.
Hinweis: Fügen Sie 10 % Bleichmittel auf abgelegten PE-Zellen für mindestens 20 Minuten, unerwünschte Retrovirus zu neutralisieren. - Am 3. Tag, Aspirieren Medium aus MEFs und Auffüllen mit 4 mL iCM (Tabelle 1)-haltigem Medium 0,5 µM A-83-01, TGF-β Typ I Rezeptor-Inhibitor. ICM-Medium mit A-83-01 alle 2 Tage zu ergänzen.
Hinweis: Wenn GFP als Transduktion Steuerelement verwenden, wird der Ausdruck voraussichtlich mehr als 90 % bis zu diesem Zeitpunkt (Abbildung 1).
(3) Durchflusszytometrie für Kardiale Marker
- Aspirat Medium von Tag 9 umprogrammiert MEFs und waschen (1 X) mit 1 X PBS, abgestorbene Zellen und Schmutz zu entfernen.
- Fügen Sie 1 mL 0,25 % Trypsin/EDTA für 5 min bei 37 ° c. Überprüfen Sie Zellen mit einem Lichtmikroskop und schütteln Sie Gericht; Wenn Zellen nicht wegziehen, inkubieren Sie 5 weitere Minuten bei 37 ° c bis Zellen lösen.
- Waschen Sie Zellen mit 1 X PBS-Puffer mit 5 % FBS und Filter durch ein 70 µm Pore Zelle Sieb.
- Zentrifugieren Sie bei 160 X g für 3 min bei Raumtemperatur und aspirat Flüssigkeit aus dem Pellet.
Hinweis: Um die Zellausbeute zu erhöhen, lassen Sie etwa 50 µL Flüssigkeit über die Zelle Pellet. - Waschen Sie Zellen mit 500 µL 1 X PBS mit 1 % BSA.
- Fix-Zellen mit 0,2 mL/1 Million Zellen Fixierung Lösung für 20 min auf Eis.
- Fügen Sie 1 mL 1 X eiskalten Perm/Waschpuffer.
Hinweis: Der Hersteller Lösung ist 10 X. - Zellen bei 160 X g für 5 min bei 4 ° C zentrifugiert und Aspirieren überstand.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.7 und 3.8 eine zusätzliche Zeit. Nach der Wäsche 2Nd direkt zum nächsten Schritt gehen oder Zellen bei 4 ° C über Nacht halten.
- Block mit 100 µL 5 % ziegenserum und Esel Serum 1 x Perm/Waschpuffer für 30 min bei Raumtemperatur.
- 100 µL verdünnter Primärantikörper hinzufügen.
Hinweis: Für dieses Protokoll Zellen wurden mit Maus Troponin T (1: 200) und Maus α-Actinin (1: 200) zu quantifizieren, den Prozentsatz der Zellen positiv für die wichtigsten Komponenten der kardialen sarkomers. Inkubieren Sie Primärantikörper für 1 h bei Raumtemperatur. - Zellen bei 160 X g für 5 m bei 4 ° C zentrifugiert, Aspirieren überstand und 2 X mit eiskalten Perm/Waschpuffer waschen.
- 100 µL verdünnter Sekundärantikörper hinzufügen.
Hinweis: Für dieses Protokoll wurden Zellen mit Anti-Maus 647 nm Sekundärantikörper (1: 200) beschriftet. Inkubieren Sie Sekundärantikörper für 45 min bei Raumtemperatur auf eine durchgängige über Rohr-Rotator. Schützen Sie Zellen durch das Röhrchen in Folie einwickeln vor Licht. - Zellen bei 160 X g für 5 min bei 4 ° C zentrifugiert, Aspirieren überstand und 2 X mit eiskalten Perm/Waschpuffer waschen.
- Fügen Sie 1 mL 1 % BSA mit PBS-Puffer und durchführen Sie FACS sofort.
Hinweis: Erstellen Sie ein forward Scatter Vs Seite Streudiagramm zu lebensfähige Zellen zuerst Tor bei der Durchführung von FACS. Alternativ können Sie einen handelsüblichen lebenden/Toten Zelle Fleck vor der Befestigung Zellen identifizieren Leben und tot Zell-Populationen.
4. Immunostaining umprogrammierten MEFs
- Aspirat Medium ab Tag 14 umprogrammiert MEFs und waschen (1 X) mit 1 mL 1 x eiskaltem PBS.
Hinweis: Für Immunostaining, Umprogrammierung in 12-well-Platten, Antikörper-Lösung Bände zu minimieren erfolgte. 24-well-Platten können auch verwendet werden; einfach halb alle folgenden Bände. - Aspirieren Sie und Zellen mit 500 µL 2 % Paraformaldehyd für 10 min bei Raumtemperatur.
- Aspirieren Sie und waschen Sie Zellen 3 Mal mit 1 mL 1 X PBS (5 min pro Waschgang bei Raumtemperatur).
- Permeabilize Zellen mit 500 µL 0,2 % Permeabilisierung Reagenz mit PBS-Puffer für 15 min bei Raumtemperatur.
- Aspirieren und in 500 µL 10 % Pferd Serum mit PBS-Puffer für 30 min bei Raumtemperatur zu blockieren.
- Abzusaugen und mit 500 µL verdünnter Primärantikörper für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
Hinweis: Für dieses Protokoll wurden Zellen mit Maus Troponin T oder α-Actinin (jeweils 1: 400) beschriftet und Co beschriftet mit Connexin 43 (1: 400) oder Troponin ich (1: 400). - Aspirieren Sie Primärantikörper und waschen Sie dreimal mit 1 mL 1 X PBS (5 min pro Waschgang bei Raumtemperatur).
- Abzusaugen und mit 500 µL verdünnter Sekundärantikörper für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.
Hinweis: Für dieses Protokoll Zellen wurden beschriftet mit Anti-Maus 555 nm Sekundärantikörper (1:800), Troponin T oder α-Actinin erkennen und Anti-Kaninchen 488 nm Sekundärantikörper (1:800), Connexin 43 oder Troponin I. zusätzlich zu erkennen, Kerne waren voller Flecken mit Hoechst (01:10, 000). Schützen Sie Zellen durch Inkubation im Dunkeln vor Licht. - Aspirieren Sie der Sekundärantikörper und waschen Sie dreimal mit 1 mL 1 X PBS (5 min pro Waschgang bei Raumtemperatur). Wickeln Sie die Platte in Folie Zellen vor Licht schützen und speichern bei 4 ° c
- Bild mit 3-Kanal Epifluoreszenz mikroskopie.
(5) Calcium Imaging
Hinweis: Wenn bei 10facher Vergrößerung imaging, eignen sich Standardzelle Kultur Schalen und Platten für Kalzium Imaging. Bildgebung bei höherer Vergrößerung erfordert, dass die Zellen auf Glasdeckgläser oder Glasschalen unten beschichtet werden.
- Aspirieren Medium und fügen Sie 2 mL (für eine 6 gut Tafel) modifiziert Tyrode Lösung (140 mM NaCl, KCl, 1,8 mM CaCl2, 5 mM 1 mM MgCl2, 10 mM Glucose, 10 mM HEPES, 0,1 % BSA und 1 % Pyruvat, pH 7.4) mit 5 µM Fura-2 bin und 0,1 % Pluronic F-127 zu schlagen (D14 t o D20) iCMs. 30 Minuten bei 37 ° c inkubieren
Hinweis: Schützen Sie Zellen vor Licht, um zu verhindern, dass abschrecken der fluoreszierenden Indikator. - Waschen Sie Zellen in 2 mL Tyrode-Lösung für 30 min bei Raumtemperatur zu de-Veresterung von Fura-2 Uhr.
- Bild mit spinning-Disk konfokalen Mikroskopie bei 340 nm und 380 nm mit Slidebook 5.5 Ca2 + imaging-Software. Führen Sie die Bildgebung bei Raumtemperatur.
- Kalzium-Transienten errechnen sich aus dem Verhältnis der Fluoreszenzintensität bei 340 nm über die Fluoreszenzintensität bei 380 nm.
- Auf Wunsch behandeln iCMs mit 1 oder 2 µM Isoproterenol oder 10 µM Nifedipin Kalzium Handhabung nach imaging Grundlinie Kalzium Transienten zu manipulieren. Hinzu kommen Verbindungen lokal Zellen und Bild.
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Representative Results
Mit der Neuprogrammierung Afrikastrategie oberhalb und in Abbildung 1 b, erzielten wir iCMs mit rund 70 % der Zellen mit dem Ausdruck kardiale Troponin T und rund 55 % der Zellen mit dem Ausdruck kardiale α-Actinin, durch Durchflusszytometrie am 9. Tag quantifiziert Anschluss an Transduktion von GHMT2m (Abb. 2A und B). Darüber hinaus die Mehrzahl der Zellen express kardiale Troponin T, Troponin I, und kardiale α-Actinin sowie die Lücke Kreuzung Markierung Connexin 43 am 14. Tag nach Transduktion (Abbildung 2 und D). Bildgebung mit stärkerer Vergrößerung zeigt klar definierte sarkomers Strukturbildung und Lücke Junctions zwischen benachbarten Zellen (weiße Pfeilspitzen, Abb. 2D) bilden. Darüber hinaus geben Sie spontane Kontraktion und Kalzium Transienten Funktionalität der iCMs (Abb. 3A-C und Film 1).
Abbildung 1: Timeline der Neuprogrammierung und optimale Beschichtung von Zellen. (A) Streudiagramm von Log-transformierten RNA-Seq Daten für MEFs in unserem Labor versus ENCODE MEFs generiert. 2 -R-Wert und linearen Regressionsgeraden werden angezeigt. (B) schematische Darstellung der alle wichtigen Schritte in der GHMT2m-vermittelten Reprogrammierung von MEFs. (C) PE Zellen am Zusammenfluss von 70-80 % vor Transfektion (obere Reihe, Links Panel) und GFP Signal 48 Stunden Post-Transfektion Transfektion Effizienz (obere Reihe, Mitte und rechts Paneele) angeben. MEFs dünn gesät, vor der Infektion zu verhindern, Überbelegung über den Zeitraum der Neuprogrammierung (untere Reihe, von Links Panel) und GFP Signal 48 Stunden nach der Infektion Infektion Effizienz (untere Reihe, Mitte und rechts Paneele) angeben. Maßstabsleiste = 400 µM. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Quantifizierung und Charakterisierung von kardialen Proteinexpression in iCMs. (A und B). Repräsentative Durchflusszytometrie für kardiale Troponin T (A) und α-Actinin (B) am Tag 9 nach GHMT2m Transduktion, n = 3. (C) ICC Färbung für Kardiale Marker am 14. Tag nach GHMT2m Transduktion. Grün: kardiale Troponin I, rot: kardiale Troponin T (Mitte Platte) und α-Actinin (Rechte Abbildung) und blau: Hoechst Färbung für Kerne. Repräsentative Bilder (n = 3). Maßstabsleiste = 200 µM (D) hoher Vergrößerung Imagines sarkomers Struktur (rot: kardiale α-Actinin (obere Reihe) und kardiale Troponin T (untere Zeile)) und Expression von Gap Junction Protein Connexin 43 (grün). Weiße Pfeilspitzen zeigen Gap Junctions zwischen benachbarten Zellen gebildet. Repräsentative Bilder (n = 3). Maßstabsleiste = 100 µM. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: funktionale Quantifizierung der iCMs. (A) zeitlichen Verlauf zellenzahlen nach GHMT2m Transduktion zu schlagen. Prügel-Zellen wurden vom Auge gezählt und Zelle zählt von 10 Felder pro Schale über 3 Gerichte pro Experiment wurden gemittelt und im Bedienfeld "A. (B und (C) Kalzium Transienten des iCMs aufgezeichnet. ICMs nach der Behandlung mit 1 µM ist Kalzium transiente Frequenz verändert Isoproterenol oder 10 µM Nifedipin. F340/F380, das Verhältnis der Fluoreszenzintensität bei 340 und 380 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Movie 1: iCMs schlagen. Film zeigt schlagen iCMs am 12. Tag in Vitro. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
| iCM Media | ||
| Name des Reagenz | Volumen (mL) | Endkonzentration |
| DMEM hohe Glukose | 320 | |
| Medium 199 | 80 | |
| Fetale Rinderserum | 50 | 10 % |
| Spender-Pferd-Serum | 25 | 5 % |
| MEM essentielle Aminosäuren, 50 x | 10 | 1 x |
| Natrium-Pyruvat-Lösung, 100 x | 5 | 1 x |
| MEM nicht-essentiellen Aminosäuren, 100 x | 5 | 1 x |
| MEM-Vitamin-Lösung, 100 x | 5 | 1 x |
| Insulin-Transferrin-Selen, 100 x | 5 | 1 x |
| B27, 50 x | 10 | 1 x |
| Penicilin-Streptomycin | 5.5 | 1,1 % |
| L-Glutamin ergänzen | 5.5 | 1,1 % |
| PE-Medien | ||
| Name des Reagenz | Volumen (mL) | Endkonzentration |
| DMEM hohe Glukose | 450 | |
| Fetale Rinderserum | 50 | 10 % |
| Penicilin-Streptomycin | 5.5 | 1,1 % |
| L-Glutamin ergänzen | 5.5 | 1,1 % |
| Blasticidin-HCl - 10mg/mL | 0,5 | 10 µg/mL |
| Puromycin dihydrochloride | 0.05 | 1 µg/mL |
| Wachstumsmedium | ||
| Name des Reagenz / Ausrüstung | Volumen (mL) | Endkonzentration |
| DMEM hohe Glukose | 450 | |
| Fetale Rinderserum | 50 | 10 % |
| Penicilin-Streptomycin | 5.5 | 1,1 % |
| L-Glutamin ergänzen | 5.5 | 1,1 % |
Tabelle 1: Nährmedien. Rezepte für Kulturmedium in dieses Protokoll verwendet.
| PE-Zellen | ||||||
| Zelle Kulturschale | Fläche (cm2) | Aussaatdichte (Zellen) | Media-Volumen (mL) | Gesamt-DNA pro Transfektion (µg) | Transfection Reagens (µL) | Opti-MEM (µL) |
| 15 cm | 176.7 | 11,25 x 106 | 20 | 36 | 108 | 1080 |
| 10 cm | 78,5 | 5 x 106 | 10 | 12 | 36 | 360 |
| 60 mm | 28.2 | 1.7 x 106 | 4 | 4 | 12 | 120 |
| 6-well-Platte | 9 | 0,54 x 106 | 2 | 1.3 | 3.9 | 39 |
| 12-well-Platte | 4 | 0,24 x 106 | 1 | 0,6 | 1.8 | 18 |
| 24-well-Platte | 2 | 0,12 x 106 | 0,5 | 0,3 | 0,9 | 9 |
| MEFs | ||||||
| Zelle Kulturschale | Fläche (cm2) | Aussaatdichte (Zellen) | Media-Volumen (mL) | Hexadimethrine Bromid (µL) | ||
| 15 cm | 176.7 | 1,35 x 106 | 20 | 12 | ||
| 10 cm | 78,5 | 0,6 x 106 | 10 | 6 | ||
| 60 mm | 28.2 | 0,2 x 106 | 4 | 2.4 | ||
| 6-well-Platte | 9 | 0,1 x 106 | 2 | 1.2 | ||
| 12-well-Platte | 4 | 0,4 x 105 | 1 | 0,6 | ||
| 24-well-Platte | 2 | 0,2 x 105 | 0,5 | 0,3 | ||
Tabelle 2: Aussaat dichten Umprogrammierung. Tabelle der Aussaat dichten für PE-Zellen und MEFs für gemeinsame Kultur Gericht Zellformate.
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Discussion
Die vorliegende Studie beschreibt eine hocheffiziente Strategie zur Fibroblasten in funktionale iCMs über Lieferung von GHMT2m Umprogrammierung Faktoren kombiniert mit Unterdrückung der Pro-fibrotische Signalwege direkt neu zu programmieren. Mit Durchflusszytometrie, immunofluorescent Bildgebung, Kalzium imaging und schlagen Zellzahlen, wir zeigen die meisten Zellen in diesem Protokoll erfolgreiche Reprogrammierung zu unterziehen und CM Abstammung Schicksal anzunehmen. Wir haben bereits gezeigt, dass der Zusatz von Anti-fibrotischen Verbindungen einschließlich der TGF-β-Typ Rezeptor-Hemmer, die A-83-01 in der Anzahl der Schläge iCMs im Vergleich zur Transduktion mit GHMT2m allein, darauf hinweist, dass ein etwa 6-fold Ertragssteigerung Pro-fibrotische Signalisierung ist eine endogene Schranke zu kardialen Umprogrammierung. Dieses System kann daher genutzt werden, für Drug screening zur Untersuchung von Mechanismen für Cardiomyogenesis; die Zugabe eines kleinen Moleküls neben A-83-01 könnte negative Regulatoren der Cardiomyogenesis aufzudecken. Umgekehrt könnte der Zusatz eines kleinen Moleküls zu GHMT2m allein positive Regulatoren der Cardiomyogenesis aufzuklären. Entschlüsselung der Mechanismen, durch die welche diese positiven und negativen Regulatoren CM Differenzierung regieren, wird ein besseres Verständnis der Cardiomyogenesis und führen noch effizienter Neuprogrammierung und Reifung Protokolle.
Viele Variablen beeinträchtigen Neuprogrammierung Wirksamkeit. Wir finden, dass Zelldichte Beschichtung stark sowohl die Produktion von retroviralen Partikel bei PE-Zellen und die effiziente Aufnahme aller Neuprogrammierung Faktoren bei MEFs beeinflusst. Darüber hinaus kann die durchgangsnummer auch diese Parameter beeinflussen. Um optimale Produktion von viralen Partikel zu gewährleisten, transfizieren Sie PE Zellen vor Durchgang 20. Um effiziente Aufnahme von retroviralen Partikel zu gewährleisten, Durchgang Sie MEFs nicht nach einfrieren.
Mehrere neuere Studien haben auch gezeigt Hocheffizienz Umprogrammierung der MEFs PRC1 Mitglied Bmi zusammen mit Ausdruck der GMT30 umzuwerfen oder Akt neben GHMT37überexprimiert. Zusatz von ZFN281 GHMT + Akt führte zu ein 4-facher Anstieg in Troponin T positive Zellen in Erwachsenen Schweif Tipp Fibroblasten, Unterdrückung der entzündlichen gen Unterschriften38teilweise zugeschrieben. Darüber hinaus erhöht die Kombination von TGF-β-Signalisierung-Inhibitor und WNT signalisieren Inhibitor GMT-vermittelte kardiale Umprogrammierung39. Wichtig ist, erscheinen die Signalwege involviert in diesen Studien nicht überlappen. Daher ist es wahrscheinlich das Übersprechen zwischen mehreren Signalwege könnte weiter zu verbessern, kardiale Umprogrammierung.
Eine Reihe von Studien gezeigt, Neuprogrammierung in Vivo durch die Lieferung der Neuprogrammierung Faktoren bei Mäusen nach links vorderen absteigenden (LAD) Arterie Ligatur25,32,39,40 ,41. Diese Studien zeigten leichte Verbesserung in der linksventrikulären Funktion nach MI, unterstreicht das therapeutische Potenzial von kardialen Umprogrammierung auf Herz Regeneration nach Verletzungen. Unser Protokoll programmiert MEFs mit dem höchsten Wirkungsgrad in-vitro- bis heute. Daher, es wird interessant sein zu sehen, ob Hocheffizienz Umprogrammierung vollständig wiederherstellen Herz Funktion posttraumatischen kann in-vivo. Diese Studien dienen als Grundlage für die Umsetzung dieser Methode in neuartiger Therapien für Patienten nach Infarkt.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde mit Mitteln der Boettcher Stiftung Webb Waring Biomedical Research Program, American Heart Association Wissenschaftler Development Grant (13SDG17400031), Universität von Kolorado Abteilung von Medizin herausragende Karriere unterstützt. Scholar Program, University of Colorado Division of Cardiology Barlow Nyle Endowment und NIH R01HL133230 (zu K.S). A.S.R wurde von NIH/NCATS Colorado CTSA Grant Nummer TL1TR001081 und Pre-Promotionsstipendium von der University of Colorado-Konsortium für Forschung der Fibrose und Übersetzung (CFReT) unterstützt. Diese Forschung wurde auch von der Cancer Center Support Grant (P30CA046934), die Haut Krankheiten Kerne Forschungsstipendium (P30AR057212) und der Flow Cytometry Kern an der University of Colorado Anschutz Medical Campus unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 Mice | Charles River's Laboratory | 027 | For MEF isolation |
| Platinum E (PE) Cells | Cell Biolabs, INC | RV-101 | For retrovirus production |
| DMEM High Glucose | Gibco | SH30022.FS | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150-059 | Component of iCM media |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100106 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Donor Horse Serum | Gemini | 100508 500 | Component of iCM media |
| MEM Essential Amino Acids, 50X | Life Technologies | 11130051 | Component of iCM media |
| Sodium Pyruvate Solution, 100X | Life Technologies | 11360070 | Component of iCM media and for calcium imaging |
| MEM Non-Essential Amino Acids, 100X | Life Technologies | 11140050 | Component of iCM media |
| MEM Vitamin Solution, 100X | Life Technologies | 11120-052 | Component of iCM media |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 41400045 | Component of iCM media |
| B27 | Gibco | 17504-044 | Component of iCM media |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| GlutaMAX (L-Glutamine Supplement) | Gibco | 35050-061 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Blasticidin-HCl | Life Technologies | A11139-03 | Component of PE media |
| Puromycin dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Component of PE media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | For detaching cells from culture dishes |
| A-83-01 | R&D Systems - Tocris | 2939/10 | Treat cells to inhibit TGF-β signaling - promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM |
| DMSO | Thermo Scientific | 85190 | For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium |
| SureCoat | Cellutron | SC-9035 | For coating dishes to plate MEFs |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection Reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 11058-021 | Transfection Reagent |
| pBabe-X Myc-GATA4 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Hand2 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Mef2c | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Tbx5 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-1 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-133 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X GFP | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268-5G | For viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL |
| Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores) | Nalgene | 569-0020 | For filtering media |
| Syringes | Bd Vacutainer Labware | 309654 | For viral filtration |
| 0.45 µm Filters | Celltreat | 229749 | For viral filtration |
| 70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | For MEF isolation and Flow Cytometry |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry |
| perm/wash buffer | BD | 554723 | For washing cells for flow cytometry |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-250 | For washing cells |
| Bovine Serum Albumin | VWR | 0332-100g | For flow cytometry and calcium imaging |
| Goat Serum | Sigma | G9023 | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Donkey Serum | Sigma | D9663-10mg | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Mouse Troponin T | Thermo Scientific | ms-295-p | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Mouse α-actinin | Sigma | A7811L | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Rabbit Connexin 43 | Sigma | C6219 | 1:400 IF |
| Rabbit Troponin I | PhosphoSolutions | 2010-TNI | 1:400 IF |
| Hoechst | Life Technologies | 62249 | 1:10000 IF |
| Alexa 488, rabbit | Life Technologies | A-11034 | 1:800 IF |
| Alexa 555, mouse | Life Technologies | A-21422 | 1:800 IF |
| Alexa 647, mouse | Life Technologies | A-31571 | 1:200 Flow Cytometry |
| 27-color ZE5 Flow Cytometer | Bio-RAD | For FACS | |
| Paraformaldehyde | sigma | P6148-500mg | For fixing cells for IF |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | For permeabilization of cells for IF |
| EVOS™ FL Color Imaging System | Thermo Scientific | AMEFC4300 | For IF |
| NaCl | RPI | S23020-5000 | For calcium imaging |
| KCl | VWR | 395 | For calcium imaging |
| CaCl2 | Fisher | C614-500 | For calcium imaging |
| MgCl2 | VWR | 97061-352 | For calcium imaging |
| glucose | sigma | G7528-250g | For calcium imaging |
| HEPES | sigma | H4034-500g | For calcium imaging |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F1221 | For calcium imaging |
| Fluronic F-127 | Sigma | P2443-250g | For calcium imaging |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | For disruption calcium transients in iCMs - use at 10 µM |
| Isoproterenol | sigma | I6504-1g | For increasing number of calcium transients in iCMs - use at 1-2 µM |
| Marianas Spinning Disk Confocal microscope | 3i | For calcium imaging | |
| ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| bleach | Clorox | ||
| 50 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 227261 | |
| 15 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 188271 | |
| 15 cm cell culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 10 cm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 60 mm cell culture dishes | GREINER BIO-ONE | 628160 | |
| 6 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| 12 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 665180 | |
| 24 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 662160 |
References
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