Summary
Her presenterer vi en robust metode for å omprogrammere primære embryonale fibroblaster i funksjonelle cardiomyocytes gjennom overuttrykte GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 og miR-133 (GHMT2m) sammen med hemming av TGF-β signalering. Våre protokollen genererer slo cardiomyocytes så tidlig som i 7 dager etter signaltransduksjon med opptil 60% effektivitet.
Abstract
Trans-differensiering av et somatisk cell type til en annen har enormt potensial modell og behandle menneskelige sykdommer. Tidligere studier har vist at mus embryonale, dermal og kardiale fibroblaster kan omprogrammeres til funksjonelle indusert-cardiomyocyte-lignende celler (iCMs) gjennom overuttrykte kardiogent transkripsjonsfaktorer inkludert GATA4, Hand2, Mef2c, og Tbx5 både i vitro og i vivo. Men har disse tidligere studier vist relativt lav effektivitet. For å gjenopprette hjertefunksjon etter skade, må mekanismer som styrer cardiac omprogrammering bli belyst for å øke effektiviteten og modning av iCMs.
Vi viste tidligere at hemming av pro-fibrotiske signalering dramatisk øker omprogrammering effektivitet. Her detalj vi metoder for å oppnå en reprogramming effektivitet på opptil 60%. I tillegg beskriver vi flere metoder, inkludert flowcytometri, immunofluorescent bilder og kalsium imaging å kvantifisere reprogramming effektivitet og modning av omprogrammeres fibroblaster. Bruker protokollen detaljert her, kan mekanistisk studier foretas å finne positive og negative regulatorer av cardiac omprogrammering. Disse studiene kan identifisere signalveier som kan målrettes for å fremme reprogramming effektivitet og modning, som kan føre til romanen cellen terapi å behandle menneskelige hjerte sykdom.
Introduction
Iskemisk hjertesykdom er en ledende dødsårsaken i USA1. Ca 800 000 amerikanere opplever en første eller gjennomgående myocardial infarction (MI) per år1. Etter MI, død cardiomyocytes (CMs) og kardiale fibrosis, avsatt av aktivert cardiac fibroblaster, svekke hjertet funksjon2,3. Progresjon av hjertesvikt MI reverseres i stor grad på grunn av dårlig regenerativ antall voksne CMs4,5. Mens gjeldende kliniske behandlinger sakte sykdomsprogresjon og redusere risikoen for fremtidige cardiac hendelser6,7,8,9, reversere ingen terapier sykdomsprogresjon på grunn av manglende evne til å Lag CMs post hjerteinfarkt10. Romanen cell behandling dukker opp for å behandle pasienter etter MI. skuffende, kliniske studier levere stamceller til hjertet etter MI hittil har vist mangelfulle regenerativ potensielle11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.
Generering av menneske-avledet indusert pluripotent stamceller (hiPSCs) fra fibroblaster av overuttrykte fire transkripsjonsfaktorer, først vist av Takahashi & Yamanaka, åpnet døren til nye gjennombrudd i cellen terapi19. Disse cellene kan skille ut alle tre bakterie lag19, og flere svært effektive metoder for å generere store antall CMs har tidligere vist20,21. HiPSC-avledet CMs (hiPS-CMs) tilbyr en kraftig plattform for å studere cardiomyogenesis og kan ha viktige implikasjoner for reparasjon hjertet etter skade. Men hiPS-CMs for tiden ansikt translasjonsforskning hekk på grunn av bekymringer teratoma formasjon22, og deres umodne natur kan være pro-arrhythmogenic23. Omprogrammere fibroblaster til hiPSCs skapt interesse i direkte omprogrammering fibroblaster til andre celletyper. Ieda et al. demonstrert at overuttrykte GATA4, Mef2c og Tbx5 (GMT) i fibroblaster fører til direkte omprogrammering til hjerte linje, riktignok på lav effektivitet24. Omprogrammere effektivitet ble forbedret med tillegg av Hand2 (GHMT)25. Siden disse tidlige studiene, har mange publikasjoner vist at endre reprogramming faktor cocktail med ekstra transkripsjon faktorer26,27,28,29, chromatin modifikatorer30,31, microRNAs32,33eller små molekyler34 fører til bedre omprogrammering effektivitet og/eller modning av indusert cardiomyocyte-lignende celler (iCMs ).
Her gir vi en detaljert protokoll for å generere iCMs fra mus embryonale fibroblaster (MEFs) med høy effektivitet. Vi viste tidligere at GHMT cocktail er forbedret med tillegg av miR-1 og miR-133 (GHMT2m) og er ytterligere forbedret når pro-fibrotiske signalnettverk trasé inkludert transformasjon av vekstfaktor β (TGF-β) signalering eller Rho-assosiert protein kinase (ROCK) signalveier er hemmet35. Bruker denne protokollen, viser vi at ca 60% av celler uttrykke cardiac Troponin T (cTnT), ca 50% express α-actinin og et høyt antall juling celler kan observeres så tidlig som i dag 11 etter signaltransduksjon med reprogramming faktorer og behandling med TGF-β type I-reseptor hemmere A-83-01. Videre disse iCMs express gapet krysset proteiner inkludert connexin 43 og utstilling spontan sammentrekning og kalsium transienter. Dette markert forbedring i omprogrammering effektivitet sammenlignet med tidligere studier viser potensial til å regenerere CMs fra endogene celle populasjoner som forblir i etter hjerteinfarkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter krever dyr ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen ved UC Denver Anschutz medisinsk Campus.
1. isolering av MEFs
- Kjøpe C57BL/6 gravid mus på E13. Skip over natten.
- Euthanize moren etter godkjent IACUC protokoller (ex: ~1.3 L/min CO2 til dyr vises døde etterfulgt av cervical forvridning)
- Spray mor med 70% etanol og åpne bukhule. Fjern livmor hornet som inneholder embryoer og plasser i en 10 cm parabolen med sterilt PBS.
- Gjør et snitt i embryo sac å løslate fosteret. Overføre embryoet å rengjøre 10 cm parabolen med sterilt PBS. Skyll grundig.
- Skjær kroppen under leveren og forkaste hodet og overkroppen. Fjern indre organer og kast. Overføre gjenværende vev til en ren 10 cm parabolen med sterilt PBS og overføre platen et biosikkerhet nivå 1 eller 2 skap. Kombiner vev fra alle embryo i en ren, tørr 10 cm rett og hakke i fine stykker.
- Legg til 6 mL av 0,25% trypsin/1 mM EDTA hakket embryoer. Triturate flere ganger av pipette å bryte opp vev. Inkuber for 40 min på 37 grader med 5% CO2.
- Resuspend celler i vekst medium (tabell 1). Volumet av media justeres basert på hvor mange embryoer høstet. Generelt, bruk en ratio på ca 25 mL vekst medier per 1,2 embryoer.
- Plate 25 mL av resuspended celler i en 15 cm rett. Etter 24 timer, Sug opp media, og Legg til 25 mL av fersk oppblomstringen medium hver plate.
- Etter 72 h, legge til 2 mL 0,25% trypsin/1 mM EDTA hver 15 cm rett. Når celler koble fra kultur parabol, deaktivere trypsin med 15 mL vekst medium og samle celler i 50 mL polystyren konisk rør. Sentrifuge celler for 3 min 160 x g ved romtemperatur. Resuspend celle pellet i vekstmediet og filtrere gjennom en 70 µm pore celle sil.
- Telle celler ved hjelp av en hemocytometer og fryse MEFs i 2 millioner celler dele fryse medium (10% DMSO 25% FBS i Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) / høy glukose) på-80 ° C. Overføre celler til flytende nitrogen etter 24 timer og store helt klar til å bruke.
Merk: Global byggkorn under MEFs ble profilert isolert bruker denne protokollen av RNA-sekvenser (RNA-seq) å sikre celle godkjenning. RNA-seq data fra kode MEF celler ble lastet ned fra NIH Gene Expression Omnibus (GEO) med tiltredelse nummer GSE93454. RNA-seq genuttrykk data for MEFs vi avsatt på NIH GEO tiltredelse nummer GSE71405. Disse to datasett slått sammen etter vanlige genet symboler. Uttrykket dataene ble deretter Logg-forvandlet og et scatterplot uttrykk dataene for våre MEFs og kode MEFs ble generert og passer med en lineære regresjonslinjen (figur 1A). MEFs isolert bruker denne protokollen er molecularly ligner isolert av andre laboratorier.
2. produksjon av Retrovirus og Albin på MEFs
Merk: Alle trinnene i dette avsnittet må utføres i et biosikkerhet nivå 2 skap. Siden denne protokollen benytter retroviral signaltransduksjon, sikre at sikkerhet forholdsregler er tatt inkludert behandle alle avfall som inneholder viral media med 10% blekemiddel i minst 20 min. se figur 1B for en tidslinje for å omprogrammere.
-
Produksjon av Retrovirus ved å bruke Platinum E (PE) cellen:
- Opprettholde kommersielt tilgjengelig PE celler i PE medium (tabell 1) som inneholder blasticidin og puromycin markørene å sikre uttrykk for kneble-pol og konv gener for effektiv retroviral partikler produksjon36 . Passasjen celler på 1:4 eller 1:5 hver to dager. Ta vare for å unngå overbefolkning av celler som dette kan redusere retroviral produksjon gir.
- På dag -1, frø ca 5 x 106 celler per 10 cm parabolen i vekstmediet (tabell 1) 16-20 h før transfection (se tabell 2 for plating tettheter for andre standard celle kultur parabol størrelser). Forsiktig rock retter frem og tilbake flere ganger og forsiktig plassere i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator for å sikre jevn plating fordeling (se figur 1 c for optimal plating tetthet før transfection).
Merk: Pass på at platen PE celler i medium uten markørene før transfection å sikre medium som inneholder genererte retroviral partikler ikke dreper MEFs. - På dagen 0, forberede DNA transfection. 10 cm parabolen transfection, legge 2 µg av hver reprogramming faktor, GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 og miR-133 (GHMT2m), til en 1,5 mL tube.
Merk: Se tabell 2 å skalere mengden DNA måtte transfect andre standard celle kultur parabol størrelser. - I en separat 1,5 mL tube, legge 360 µL redusert serum medier. Deretter Legg 36 µL transfection reagens direkte til redusert serum media. Forsiktig sveip røret og ruge ved romtemperatur for 5 min.
Merk: For å unngå redusert transfection effektivitet, må du nøye legge transfection reagens direkte til redusert serum media. - Legg redusert serum media/transfection reagens blanding GHMT2m DNA cocktail. Forsiktig sveip røret og ruge ved romtemperatur i 15 min. Gjør ikke vortex.
- Legg reaksjonsblandingen dropwise PE celler, forsiktig swirl medier for 10-15 s, og plasser i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
Merk: Ifølge produsenten, PE celler generere en gjennomsnittlig titer 106 til 107 smittsomme enheter/mL. Denne protokollen genererer ca 2 x 106 infeksjoner enheter/mL av 24 h og 6 x 106 infeksjoner enheter/mL av 48 timer for et gjennomsnitt MOI 4. Hva med GFP/DsRed kan også brukes som et surrogat for transfection/signaltransduksjon effektivitet hvis ønsket; Hva effektivitet er forventet å overstige 90% av 48 h (figur 1 c).
-
Albin på MEFs
- Coat retter med kollagen og sted i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator for minst 2 timer på dagen 0.
- Fjern MEFs fra flytende nitrogen og tine. Plate 0,2 x 106 celler per 60 mm parabolen i vekstmediet. Forsiktig rock plater å sikre jevn plating fordeling og plasser i inkubator (se figur 1 c for optimal plating tetthet og tabell 2 for plating tettheter for andre standard celle kultur parabol størrelser).
Merk: Disse plating tettheter er testet over flere kladder av isolerte MEFs; med mindre MEFs skjermen betydelig svekket levedyktighet, er justere celle seeding tettheter ikke nødvendig. - På dag 1, 24 timer etter transfection, bruke en 30 mL sprøyte samle retroviral medium generert av PE celler. Pass mediet gjennom et 0,45 µm pore-størrelse filter i et 50 mL konisk rør. Legg hexadimethrine bromide transfection reagens til en siste konsentrasjon av 6 µg/mL. Forsiktig legge 10 mL frisk oppblomstringen medium PE celler av pipettering media på veggen av kultur retten å hindre forskyvning av celler.
- Sug opp mediet MEFs og legge 4 mL av nylig høstet retroviral medium til hver rett. Tilbake MEFs til inkubator. Legge til 10% blekemiddel alle materialer i kontakt med viral medium å nøytralisere retroviral partikler.
- På dag 2, 48 timer etter transfection, Gjenta trinn 2.2.2 og 2.2.3. PE celler forkastes etter samlingen 2nd retroviral medium.
Merk: Legge til 10% blekemiddel kasserte PE celler for minst 20 min å nøytralisere uønskede retrovirus. - Sug opp mediet MEFs dag 3, og fylle med 4 mL iCM medium (tabell 1) som inneholder 0,5 µM A-83-01, en TGF-β type jeg reseptor hemmere. Fylle iCM medium som inneholder A-83-01 hver 2 dager.
Merk: Hvis du bruker GFP som en signaltransduksjon kontroll, uttrykket er forventet å overstige 90% av dette tidspunkt (figur 1 c).
3. flowcytometri for Cardiac markører
- Leveringstanken medium dag 9 omprogrammeres MEFs og vask (1 x) med 1 x PBS å fjerne døde celler og rusk.
- Legge 1 mL 0,25% Trypsin/EDTA i 5 min på 37 grader. Når celler ved hjelp av lys mikroskop og riste rett; Hvis celler forblir tilknyttet, ruge 5 mer min på 37 grader inntil celler løsner.
- Vask celler i 1 x PBS inneholder 5% FBS og filtrere gjennom en 70 µm pore celle sil.
- Sentrifuge 160 x g for 3 min i romtemperatur og leveringstanken væske fra pellet.
Merk: For å øke avkastningen cellen, la ca 50 µL væske over celle-pellets. - Vask celler med 500 µL 1 x PBS med 1% BSA.
- Fastsette celler med 0,2 mL/1 millioner celler fiksering løsning for 20 min på isen.
- Legg 1 mL 1 x iskald perm/vaskebuffer.
Merk: Produsentens løsning er 10 x. - Sentrifuge cellene på 160 x g i 5 min på 4 ° C og Sug opp nedbryting.
- Gjenta trinn 3.7 og 3.8 et ekstra tid. Etter 2nd vask, gå direkte til neste trinn eller holde celler på 4 ° C over natten.
- Blokker med 100 µL av 5% geit serum og esel serum i 1 x perm/vaskebuffer i 30 min ved romtemperatur.
- Legg 100 µL utvannet primære antistoff.
Merk: For denne protokollen, celler ble merket med musen Troponin T (1:200) og mus α-actinin (1:200) å kvantifisere andelen cellene positivt for sentrale komponenter av cardiac sarcomere. Inkuber primære antistoff 1t ved romtemperatur. - Sentrifuge cellene på 160 x g for 5 m på 4 ° C, Sug opp nedbryting og vask 2 x med iskald perm/vaskebuffer.
- Legg 100 µL utvannet sekundære antistoff.
Merk: For denne protokollen, celler ble merket med anti-musen 647 nm sekundære antistoff (1:200). Inkuber sekundære antistoff for 45 min ved romtemperatur på en over-gjennomgående tube rotator. Beskytte celler fra lys ved å pakke rørene i folie. - Sentrifuge cellene på 160 x g i 5 min på 4 ° C, Sug opp nedbryting og vask 2 x med iskald perm/vaskebuffer.
- Legg 1 mL 1% BSA i PBS og utføre FACS umiddelbart.
Merk: Generere en frem scatter vs siden spredningsdiagram til gate levedyktige cellers først når FACS. Alternativt bruke en kommersielt tilgjengelig live/dead celle flekk tidligere å bestemmer celler å identifisere live og død celle populasjoner.
4. Immunostaining av omprogrammeres MEFs
- Leveringstanken mediet dag 14 omprogrammeres MEFs og vask (1 x) med 1 mL 1 x iskald PBS.
Merk: For immunostaining, omprogrammering ble utført i 12 bra plater å minimere antistoff løsning volumer. 24 bra plater kan også brukes; bare halvparten alt etter volumer. - Sug opp og fikse celler med 500 µL 2% paraformaldehyde for 10 min ved romtemperatur.
- Sug opp og vask celler 3 ganger med 1 mL 1 x PBS (5 min per vask ved romtemperatur).
- Permeabilize celler med 500 µL 0,2% permeabilization reagensen i PBS i 15 min ved romtemperatur.
- Sug opp og tekstblokken i 500 µL 10% hest serum i PBS i 30 min ved romtemperatur.
- Sug opp og ruge med 500 µL av utvannet primære antistoffer 1t ved romtemperatur.
Merk: For denne protokollen, celler ble merket med mus Troponin T eller α-actinin (hver 1:400) og co med Connexin 43 (1:400) eller Troponin jeg (1:400). - Sug opp primære antistoffet, og vaskes tre ganger med 1 mL 1 x PBS (5 min per vask ved romtemperatur).
- Sug opp og ruge med 500 µL utvannet sekundære antistoff i 1 time ved romtemperatur.
Merk: For denne protokollen, celler ble merket med anti-musen 555 nm sekundære antistoff (1:800) å anerkjenne Troponin T eller α-actinin og anti-kanin 488 nm sekundære antistoff (1:800) å anerkjenne Connexin 43 eller Troponin I. i tillegg, kjerner var farget med Hoechst (1:10, 000). Beskytte celler fra lys ved rugende i mørket. - Sug opp sekundære antistoffer og vask tre ganger med 1 mL 1 x PBS (5 min per vask ved romtemperatur). Pakk platen i folie å beskytte cellene fra lys og lagre på 4 ° C.
- Bildet med tre-kanals epifluorescence mikroskopi.
5. kalsium Imaging
Merk: Hvis bildebehandling på 10 X forstørrelse, standard celle kultur retter og plater er egnet for kalsium bildebehandling. Bildebehandling ved høyere forstørrelse krever at cellene være belagt på glass coverslips eller glass bunn retter.
- Sug opp middels og legge 2 mL (for en 6 vel plate) endret Tyrodes løsning (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM glukose, 10 mM HEPES og 0,1% BSA 1% pyruvate, pH 7.4) som inneholder 5 µM Fura-2 er og 0,1% Pluronic F-127 å slå (D14 t o D20) iCMs. Inkuber i 30 minutter på 37 ° C.
Merk: Beskytte celler fra lys for å hindre slukke fluorescerende indikator. - Vask celler i 2 mL Tyrode løsning for 30 min ved romtemperatur å tillate de esterification Fura-2 AM.
- Bilde med spinning disk AC confocal mikroskopi på 340 nm og 380 nm benytter Slidebook 5.5 Ca2 + bildebehandlingsprogrammer. Utføre avbilding ved romtemperatur.
- Kalsium transienter beregnes ved hjelp av forholdet mellom fluorescens intensitet på 340 nm over fluorescens intensiteten på 380 nm.
- Eventuelt behandle iCMs med 1 eller 2 µM isoproterenol eller 10 µM Nifedipine å manipulere kalsium håndtering etter imaging planlagte kalsium transienter. Legge til forbindelser lokalt celler og bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruker reprogramming strategi skissert ovenfor og figur 1B, generert vi iCMs med ca 70% av celler uttrykke cardiac Troponin T og ca 55% av celler som uttrykker cardiac α-actinin, kvantifisert ved flowcytometri på dag 9 etter Albin på GHMT2m (figur 2A og B). I tillegg fleste cellene express cardiac Troponin T, Troponin jeg cardiac α-actinin samt gapet krysset markøren Connexin 43 dag 14 etter signaltransduksjon (figur 2C og D). Bildebehandling med høyere forstørring avslører veldefinerte sarcomere struktur dannelse og gapet Forbindelsesstykke danner mellom nabokommunene cellene (hvit pilspisser, figur 2D). Videre angir spontan sammentrekning og kalsium transienter funksjonaliteten til iCMs (figur 3A-C og film 1).
Figur 1: tidslinje med Reprogramming og Optimal Plating av celler. (A) Scatterplot Logg-forvandlet RNA-seq data for MEFs generert i vår lab versus kode MEFs. R2 verdien og lineære regresjonslinjen vises. (B) skjematisk av alle viktige trinn i den GHMT2m-mediert omprogrammering av MEFs. (C) PE celler på 70-80% samløpet før transfection (øverste rad, venstre panel) og GFP signal 48 timer etter hva å indikere hva effektivitet (øverste rad, midtre og høyre panel). MEFs seeded tynt før infeksjon å unngå overbefolkning over for reprogramming (nederste rad, venstre panel) og GFP signal 48 timer etter infeksjon å angi infeksjon effektivitet (nederste rad, midtre og høyre panel). Skala bar = 400 µM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: kvantifisering og karakterisering av Cardiac Protein uttrykk i iCMs. (A og B). Representant flowcytometri hjerte Troponin t (A) og α-actinin (B) på dag 9 GHMT2m transduction, n = 3. (C) ICC flekker for cardiac markører på dag 14 etter GHMT2m signaltransduksjon. Grønn: hjerte Troponin jeg, Red: hjerte Troponin T (midten panel) og α-actinin (høyre panel), og Blue: Hoechst flekker for kjerner. Representant bilder (n = 3). Skala bar = 200 µM (D) forstørring forestiller seg sarcomere struktur (Red: hjerte α-actinin (øverste rad) og kardiale Troponin T (nederste rad)) og uttrykk gapet krysset protein Connexin 43 (grønn). Hvit pilspisser angir gapet veikryss dannet mellom nabokommunene cellene. Representant bilder (n = 3). Skala bar = 100 µM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: funksjonell kvantifisering av iCMs. (A) gang løpet av slo celletall etter GHMT2m signaltransduksjon. Slo celler ble regnet av øyet og celle teller fra 10 felt per rett over 3 retter per forsøk var gjennomsnitt og inkludert i panelet A. (B og C) registrert kalsium transienter av iCMs. Kalsium forbigående frekvens endres i iCMs etter behandling med 1 µM Isoproterenol eller 10 µM nifedipine. F340/F380, forholdet mellom fluorescens intensitet på 340 og 380 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Film 1: slå iCMs. Filmen viser juling iCMs på dag 12 i vitro. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
| iCM Media | ||
| Navnet på reagens | Volum (mL) | Siste konsentrasjon |
| DMEM høy glukose | 320 | |
| Middels 199 | 80 | |
| Fosterets bovin Serum | 50 | 10% |
| Donor hest Serum | 25 | 5% |
| MEM essensielle aminosyrer, 50 x | 10 | 1 x |
| Natrium Pyruvate løsning, 100 x | 5 | 1 x |
| MEM ikke-essensielle aminosyrer, 100 x | 5 | 1 x |
| MEM Vitamin løsning, 100 x | 5 | 1 x |
| Insulin-Transferrin-selen, 100 x | 5 | 1 x |
| B27, 50 x | 10 | 1 x |
| Penicilin-Streptomycin | 5.5 | 1,1% |
| L-glutamin supplement | 5.5 | 1,1% |
| PE medium | ||
| Navnet på reagens | Volum (mL) | Siste konsentrasjon |
| DMEM høy glukose | 450 | |
| Fosterets bovin Serum | 50 | 10% |
| Penicilin-Streptomycin | 5.5 | 1,1% |
| L-glutamin supplement | 5.5 | 1,1% |
| Blasticidin-HCl - 10mg/mL | 0,5 | 10 µg/mL |
| Puromycin dihydrochloride | 0,05 | 1 µg/mL |
| Vekst medier | ||
| Navnet på reagens / utstyr | Volum (mL) | Siste konsentrasjon |
| DMEM høy glukose | 450 | |
| Fosterets bovin Serum | 50 | 10% |
| Penicilin-Streptomycin | 5.5 | 1,1% |
| L-glutamin supplement | 5.5 | 1,1% |
Tabell 1: Kultur medier. Oppskrifter for kultur medium brukes i denne protokollen.
| PE celler | ||||||
| Celle kultur parabol | Areal (cm2) | Såing tetthet (celler) | Media-volum (mL) | Totalt DNA per transfection (µg) | Hva reagens (µL) | OPTi-MEM (µL) |
| 15 cm | 176.7 | 11,25 x 106 | 20 | 36 | 108 | 1080 |
| 10 cm | 78,5 | 5 x 106 | 10 | 12 | 36 | 360 |
| 60 mm | 28,2 | 1,7 x 106 | 4 | 4 | 12 | 120 |
| 6 plate vel | 9 | 0.54 x 106 | 2 | 1.3 | 3.9 | 39 |
| 12 godt plate | 4 | 0.24 x 106 | 1 | 0,6 | 1.8 | 18 |
| 24 godt plate | 2 | 0,12 x 106 | 0,5 | 0,3 | 0,9 | 9 |
| MEFs | ||||||
| Celle kultur parabol | Areal (cm2) | Såing tetthet (celler) | Media-volum (mL) | Hexadimethrine bromide (µL) | ||
| 15 cm | 176.7 | 1.35 x 106 | 20 | 12 | ||
| 10 cm | 78,5 | 0,6 x 106 | 10 | 6 | ||
| 60 mm | 28,2 | 0,2 x 106 | 4 | 2.4 | ||
| 6 plate vel | 9 | 0,1 x 106 | 2 | 1.2 | ||
| 12 godt plate | 4 | 0,4 x 105 | 1 | 0,6 | ||
| 24 godt plate | 2 | 0,2 x 105 | 0,5 | 0,3 | ||
Tabell 2: Seeding tettheter omprogrammere. Tabell over seeding tettheter for PE celler og MEFs for felles kultur parabol celleformater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studien skisserer en høy effektivitet strategi for å omprogrammere direkte fibroblaster i funksjonelle iCMs via levering av GHMT2m omprogrammering faktorene kombinert med undertrykkelse av pro-fibrotiske signalveier. Med flowcytometri, immunofluorescent imaging, kalsium imaging, og slo celletall, vi viser fleste cellene i denne protokollen gjennomgå vellykket omprogrammering og vedta CM avstamning skjebne. Vi har tidligere vist at tillegg av anti-fibrotiske forbindelser inkludert hvilken TGF-β jeg reseptor hemmere A-83-01 gir en ca 6-fold økning i antall juling iCMs sammenlignet signaltransduksjon med GHMT2m alene, som indikerer at Pro-fibrotiske signalering er en sterk endogene barriere til hjerte omprogrammering. Dette systemet kan derfor bli brukt for narkotika screening for å undersøke mekanismer som styrer cardiomyogenesis; tillegg av et lite molekyl sammen med A-83-01 kan avdekke negative regulatorer av cardiomyogenesis. Tillegg av et lite molekyl til GHMT2m alene kan derimot belyse positiv regulatorer av cardiomyogenesis. Rakne mekanismer som styrer disse positive og negative regulatorer CM differensiering vil føre til en bedre forståelse av cardiomyogenesis og føre til enda mer effektiv reprogramming og modning protokoller.
Mange variabler påvirker omprogrammering effektivitet. Vi finner at cellen plating tetthet sterkt påvirker både produksjon av retroviral partikler i PE celler, og effektiv opptaket reprogramming faktorer i MEFs. Videre kan passasje nummeret påvirke disse parameterne. For å sikre optimal produksjon av virus partikler, transfect PE celler før passering 20. For å sikre effektiv opptak av retroviral partikler, ikke passasje MEFs etter frysing.
Flere studier har også vist høyeffektive omprogrammering av MEFs ved å slå ned PRC1 medlem Bmi sammen med uttrykk for GMT30 eller overexpressing Akt i tillegg til GHMT37. Tillegg av ZFN281 GHMT + Akt førte til en 4-fold økning i troponin T positiv celler i voksen hale tips fibroblaster, delvis tilskrives undertrykkelse av inflammatoriske genet signaturer38. Videre økt kombinasjon av TGF-β signalnettverk hemmer og WNT signalering hemmer GMT-mediert cardiac omprogrammering39. Viktigere, vises ikke signalveier involvert i disse studiene overlappe. Det er derfor sannsynlig at kryss-snakk mellom flere signalveier kan forbedre hjerte omprogrammering.
En rekke studier vist omprogrammering i vivo gjennom levering av omprogrammering faktorer i mus etter venstre fremre synkende (gutt) arterie ligation25,32,39,40 ,41. Disse studiene viste beskjedne forbedring i ventrikkel funksjon etter MI, understreker terapeutiske potensialet i cardiac omprogrammering på hjertet regenerasjon etter skade. Våre protokollen omprogrammerer MEFs med høyeste effektivitet i vitro hittil. Derfor det vil være interessant å se om høy effektivitet omprogrammering er i stand til å gjenopprette fullt hjertet funksjon etter skade i vivo. Disse studiene kan tjene som grunnlag for å oversette denne metoden i romanen cellen terapi for pasienter etter hjerteinfarkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av midler fra Boettcher stiftelsens Webb-Waring biomedisinsk forskningsprogram, American Heart Association forsker Development Grant (13SDG17400031), University of Colorado Institutt for medisin enestående tidlig karriere Forsker Program, University of Colorado divisjon av kardiologi Barlow Nyle legat og NIH R01HL133230 (til KS). A.S.R ble støttet av NIH/NCATS Colorado CTSA Grant nummer TL1TR001081 og en pre fellesskap fra University of Colorado konsortiet fibrose Research & oversettelse (CFReT). Denne forskningen ble også støttet av Cancer Center støtte Grant (P30CA046934), hud sykdommer forskning kjerner Grant (P30AR057212) og Flow cytometri kjernen ved University of Colorado Anschutz medisinsk Campus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 Mice | Charles River's Laboratory | 027 | For MEF isolation |
| Platinum E (PE) Cells | Cell Biolabs, INC | RV-101 | For retrovirus production |
| DMEM High Glucose | Gibco | SH30022.FS | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150-059 | Component of iCM media |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100106 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Donor Horse Serum | Gemini | 100508 500 | Component of iCM media |
| MEM Essential Amino Acids, 50X | Life Technologies | 11130051 | Component of iCM media |
| Sodium Pyruvate Solution, 100X | Life Technologies | 11360070 | Component of iCM media and for calcium imaging |
| MEM Non-Essential Amino Acids, 100X | Life Technologies | 11140050 | Component of iCM media |
| MEM Vitamin Solution, 100X | Life Technologies | 11120-052 | Component of iCM media |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 41400045 | Component of iCM media |
| B27 | Gibco | 17504-044 | Component of iCM media |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| GlutaMAX (L-Glutamine Supplement) | Gibco | 35050-061 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Blasticidin-HCl | Life Technologies | A11139-03 | Component of PE media |
| Puromycin dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Component of PE media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | For detaching cells from culture dishes |
| A-83-01 | R&D Systems - Tocris | 2939/10 | Treat cells to inhibit TGF-β signaling - promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM |
| DMSO | Thermo Scientific | 85190 | For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium |
| SureCoat | Cellutron | SC-9035 | For coating dishes to plate MEFs |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection Reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 11058-021 | Transfection Reagent |
| pBabe-X Myc-GATA4 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Hand2 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Mef2c | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Tbx5 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-1 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-133 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X GFP | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268-5G | For viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL |
| Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores) | Nalgene | 569-0020 | For filtering media |
| Syringes | Bd Vacutainer Labware | 309654 | For viral filtration |
| 0.45 µm Filters | Celltreat | 229749 | For viral filtration |
| 70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | For MEF isolation and Flow Cytometry |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry |
| perm/wash buffer | BD | 554723 | For washing cells for flow cytometry |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-250 | For washing cells |
| Bovine Serum Albumin | VWR | 0332-100g | For flow cytometry and calcium imaging |
| Goat Serum | Sigma | G9023 | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Donkey Serum | Sigma | D9663-10mg | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Mouse Troponin T | Thermo Scientific | ms-295-p | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Mouse α-actinin | Sigma | A7811L | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Rabbit Connexin 43 | Sigma | C6219 | 1:400 IF |
| Rabbit Troponin I | PhosphoSolutions | 2010-TNI | 1:400 IF |
| Hoechst | Life Technologies | 62249 | 1:10000 IF |
| Alexa 488, rabbit | Life Technologies | A-11034 | 1:800 IF |
| Alexa 555, mouse | Life Technologies | A-21422 | 1:800 IF |
| Alexa 647, mouse | Life Technologies | A-31571 | 1:200 Flow Cytometry |
| 27-color ZE5 Flow Cytometer | Bio-RAD | For FACS | |
| Paraformaldehyde | sigma | P6148-500mg | For fixing cells for IF |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | For permeabilization of cells for IF |
| EVOS™ FL Color Imaging System | Thermo Scientific | AMEFC4300 | For IF |
| NaCl | RPI | S23020-5000 | For calcium imaging |
| KCl | VWR | 395 | For calcium imaging |
| CaCl2 | Fisher | C614-500 | For calcium imaging |
| MgCl2 | VWR | 97061-352 | For calcium imaging |
| glucose | sigma | G7528-250g | For calcium imaging |
| HEPES | sigma | H4034-500g | For calcium imaging |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F1221 | For calcium imaging |
| Fluronic F-127 | Sigma | P2443-250g | For calcium imaging |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | For disruption calcium transients in iCMs - use at 10 µM |
| Isoproterenol | sigma | I6504-1g | For increasing number of calcium transients in iCMs - use at 1-2 µM |
| Marianas Spinning Disk Confocal microscope | 3i | For calcium imaging | |
| ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| bleach | Clorox | ||
| 50 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 227261 | |
| 15 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 188271 | |
| 15 cm cell culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 10 cm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 60 mm cell culture dishes | GREINER BIO-ONE | 628160 | |
| 6 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| 12 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 665180 | |
| 24 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 662160 |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
- Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D. Cardiac muscle regeneration: lessons from development. Genes & Development. 25 (4), 299-309 (2011).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Nabel, E. G., Braunwald, E. A tale of coronary artery disease and myocardial infarction. N Engl J Med. 366 (1), 54-63 (2012).
- Packer, M., et al. Effect of carvedilol on the morbidity of patients with severe chronic heart failure: results of the carvedilol prospective randomized cumulative survival (COPERNICUS) study. Circulation. 106 (17), 2194-2199 (2002).
- The CAPRICORN Investigators. Effect of carvedilol on outcome after myocardial infarction in patients with left-ventricular dysfunction: the CAPRICORN randomized trial. The Lancet. 357 (9266), 1385-1390 (2001).
- Marangou, J., Paul, V. Current attitudes on cardiac devices in heart failure: a review. Clin Ther. 37 (10), 2206-2214 (2015).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Bio. 14 (8), 529-541 (2013).
- Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomized controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
- Schachinger, V., et al. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1210-1221 (2006).
- Huikuri, H. V., et al. Effects of intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells on left ventricular function, arrhythmia risk profile, and restenosis after thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. Eur. Heart J. 29 (22), 2723-2732 (2008).
- Janssens, S., et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 367 (9505), 113-121 (2006).
- Lunde, K., et al. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1199-1209 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial - a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart J. 152 (3), 434-441 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
- Karantalis, V., et al. Autologous mesenchymal stem cells produce concordant improvements in regional function, tissue perfusion, and fibrotic burden when administered to patients undergoing coronary artery bypass grafting: The Prospective Randomized Study of Mesenchymal Stem Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (PROMETHEUS) trial. Circ Res. 114 (8), 1302-1310 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: A source of cardiac regeneration. J. Mol. Cell. Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
- Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 357-386 (2010).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
- Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100 (1), 105-113 (2013).
- Qian, L., Berry, E. C., Fu, J., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
- Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
- Ifkovitz, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. Inhibition of TGFβ signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes. PLoS One. 9 (2), e89678 (2014).
- Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
- Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8 (5), e63577 (2013).
- Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA induced cardiac reprogramming in vivo: evidence for mature cardiac myocytes and improved cardiac function. Circ Res. 116 (3), 418-424 (2015).
- Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110 (11), 1465-1473 (2012).
- Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), 1216-1220 (2016).
- Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nature Communications. 6, 1-15 (2015).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7, 1063-1066 (2000).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Zhou, H., et al. ZFN281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression. Genes & Dev. 31, 1770-1783 (2017).
- Mohamed, T. M., et al. Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming. Circulation. 135, 978-995 (2017).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
- Mathison, M., et al. In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration. J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).
