Summary
ويدخل هذا العمل وسيلة لأداء وحدة-أوبتوجينيتيك واحد تسجيل موثوق من ماوس مستيقظا استخدام أوبترودي من زجاج مصنوعة خصيصا.
Abstract
مصدر قلق كبير في علم الأعصاب كيف مختلف أنواع الخلايا العصبية تعمل في الدوائر العصبية. وقد مكنت التقدم الذي أحرز مؤخرا في أوبتوجينيتيكس تحديد نوع الخلايا العصبية في فيفو التجارب الكهربية في مناطق واسعة من الدماغ. في تجارب أوبتوجينيتيكس، أنها حاسمة بالنسبة لإيصال الضوء إلى موقع التسجيل. ومع ذلك، من الصعب غالباً ما يسلم على ضوء التحفيز في المناطق العميقة من الدماغ من سطح الدماغ. وبخاصة، من الصعب على ضوء التحفيز للوصول إلى مناطق الدماغ العميق عند الشفافية الضوئية من سطح الدماغ منخفض، كما الحال بالنسبة لتسجيلات من الحيوانات مستيقظا غالباً. هنا، نحن تصف طريقة لتسجيل استجابات سبايك للضوء من ماوس مستيقظا استخدام أوبترودي من زجاج مصنوعة خصيصا. في هذا الأسلوب، يتم تسليم الضوء من خلال تسجيل الزجاج الكهربائي حيث أنه من الممكن أن تحفز موثوق العصبية مسجل مع الضوء في المناطق العميقة من الدماغ. هذا النظام أوبترودي مصنوعة خصيصا ويتألف من مواد متاحة وغير مكلفة وسهلة لتجميع.
Introduction
الجهاز العصبي المركزي يتكون من أنواع مختلفة من الخلايا العصبية، التي لها وظائف مختلفة. كيف تعمل هذه الأنواع المختلفة من الخلايا العصبية داخل الدائرة العصبية أحد الشواغل الرئيسية في علم الأعصاب. ومع ذلك، في العديد من مناطق الدماغ، كان من المستحيل التمييز بين أنواع الخلايا العصبية في التسجيلات في فيفو الأنشطة الكهربائية لأنه لا يوجد أي اختلاف واضح في الإشارة الكهربائية سبايك نفسها، مع بعض الاستثناءات. التقدم الذي أحرز مؤخرا في أوبتوجينيتيكس جعلت اختراق1،2. استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا التي يتم التعبير عن أوبسين حساسة للضوء (مثلاً، تشانيلرهودوبسين-2) في أنواع معينة من الخلايا العصبية، أصبح من الممكن التمييز بين أنواع الخلايا العصبية في كفاءة في فيفو تسجيلات3، 45،،6. في هذه الحيوانات، متحمسون الخلايا العصبية مع opsin حساسة للضوء بإعطاء المنبهات الخفيفة خلال التسجيلات الكهربائية، ولكن لا تكون الخلايا العصبية الأخرى. الخلايا العصبية أوبسين-إيجابية، ولذلك بسهولة تتميز عن سائر أنواع الخلايا العصبية بردودهم على ضوء.
في تجارب أوبتوجينيتيكس، أنها حاسمة بالنسبة لإيصال الضوء إلى موقع التسجيل. كطريقة غير الغازية، كثيرا ما يوجه الضوء من سطح الدماغ. ومع ذلك، لأنه يقلل القوة على ضوء ما يذهب من خلال أنسجة المخ، من الصعب أن تحفيز مناطق الدماغ العميقة من السطح في الدماغ. وبخاصة، من الصعب على ضوء التحفيز للوصول إلى مناطق الدماغ العميق عند الشفافية الضوئية من سطح الدماغ منخفض، كما الحال بالنسبة لتسجيلات من الحيوانات مستيقظا غالباً. وكثيراً ما تم إجراء التجارب الكهربية على الحيوانات تخديره لحركة الجسم يسبب الضوضاء في التسجيلات. كما هو موثق جيدا، إلا أن التخدير المعروف لتغيير الاستجابات العصبية7،،من89،10. وبالتالي، من الضروري استخدام الحيوانات مستيقظا من أجل دراسة الاستجابات العصبية دون آثار التخدير الاصطناعي. على عكس التجارب مع الحيوانات تخديره، تتم التسجيلات الكهربية بعد الشفاء من جراحة في التجارب مع الحيوانات مستيقظا. أثناء الفاصل الزمني بين الجراحة والتسجيلات، الإفرازات الأنسجة كثيرا ما يتراكم على سطح الدماغ ويجعل الشفافية الضوئية من سطح الدماغ منخفضة.
هنا، نحن تصف طريقة لتسجيل تسجيلات وحدة واحدة من ماوس مستيقظا استخدام أوبترودي من زجاج مصنوعة خصيصا. في هذا الأسلوب، يتم تسليم الضوء من خلال تسجيل الزجاج الكهربائي حيث أنه من الممكن أن تحفز موثوق العصبية مسجل مع الضوء في المناطق العميقة من الدماغ. هذا النظام أوبترودي مصنوعة خصيصا ويتألف من مواد متاحة وغير مكلفة وسهلة لتجميع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتتم جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية من "المجتمع اليابانية الفيزيولوجية" ومع الموافقة على الحيوان رعاية اللجنة كانازاوا الطبية جامعة.
1-بناء على حامل أوبترودي الزجاج
ملاحظة: لإنشاء حامل أوبترودي زجاج، حامل قطب تجاري يستخدم (الشكل 1A).
- بلطف سحب أنبوب الصلب للتحكم في الضغط من فوهة الحامل.
- بالحفر وتوسيع ثقب الجانب المقعد دبوس في برميل حامل. جعل الحفرة 3 مم وقطرها 12 مم في العمق.
- وضع أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ (3 مم في القطر 0.5 مم في السمك و 8 مم في الطول؛ الشكل 1A 2) في الحفرة.
- إدراج سيراميك تقسيم الحفرة الأكمام التزاوج للحلقات, ومم ⌀2.5 (1A الشكل1).
- إصلاح ماسورة صاحب القطب إلى وصلة على شكل L مع لاصق الإيبوكسي.
- جعل الثقوب (3 مم في القطر) في وصلة وإرفاقه مناور بمسامير.
2-رئيس مرحلة ما بعد التثبيت
- تعد وظيفة رئيس مبنية خصيصا لفاصل حلبة المجلس. جعل فاصل عمودي مجلس الدائرة إلى شكل كوبويدال مع قطع طحن ومقطعة 2 وظيفة الرأس مع رأي (الشكل 1B). تسطيح الجزء السفلي من وظيفة الرأس مع قطع طحن.
- إعداد الحيوانات المحورة وراثيا الذي أعرب فيه عن أوبسين حساسة للضوء في نوع معين من الخلايا العصبية للدراسة. في هذا العمل، استخدام الماوس المحورة وراثيا (الفئران ChR2 فجأت) الذي يعرب عن الخلايا العصبية المثبطة تشانيلرهودوبسين-2 (ChR2)11 .
- تخدير الحيوان مع خليط من 0.3 ملغ/كغ ميديتوميديني و 4.0 مغ/كغ من الميدازولام 5.0 مغ/كغ من بوتورفانول داخل الإدارة. للتأكد من أن الحيوان تم تخديره تماما، اختبار ردود أفعاله إلى الذيل معسر.
- ضع الماوس في إطار ستيريوتاكسيك على وسادة تدفئة. تنظيف الإطار ستيريوتاكسيك والتدفئة لوحة بالكحول 70% مقدما. وضع الأسنان في الحفرة الشريط لدغة، وتشديد طفيفة المشبك الآنف. إصلاح كلا الجانبين من الرأس باستخدام أشرطة الإذن. عند الرأس ثابتة بشكل صحيح بأشرطة الإذن، تشديد المشبك الآنف. تطبيق مرهم العيون إلى العيون.
- الحلاقة جلد الرأس مع مقص صغير وتنظيف فروة الرأس مع مسحه القطن من غلوكونات الكلورهيكسيدين. قبل الجراحة، تعقيم جميع الأدوات الجراحية ورأس آخر مع اﻷوتوكﻻف (121 درجة مئوية، 15 دقيقة).
- قص فروة الرأس على طول خط الوسط مع المقص ودفعها جانبا. جعل الشق من الجزء الخلفي الرأس إلى العيون (حوالي 20 مم). إزالة في السمحاق مع مسحه القطن مغموسة في الكحول 70% وجاف في الجمجمة.
- إرفاق منصب رئيس المناول. ضع منصب رئيس شقة في الجمجمة حول بريجما استخدام المناول.
- مزيج مركب (4 قطرات)، ومحفِّز (قطره 1)، والبوليمر (1 ملعقة صغيرة) من الأسمنت الأسنان على طبق صغير هو مبردة في الثلاجة مسبقاً. وضع الأسمنت الأسنان (أقل من 1 غ) أمامي والعظم الجداري الجمجمة لإصلاح هذا المنصب الرئيسي في الجمجمة.
- بعد أن يصبح الأسمنت الأسنان الثابت، إزالة الماوس من الإطار ستيريوتاكسيك. وضع مرهم مضاد حيوي على البشرة المكشوفة. إدخال خصم ميديتوميديني (0.3 مغ/كغ) والمضادات الحيوية (أوكسي تتراسيكيلين؛ 20 مغ/كغ). وضع ورصد الماوس على لوحة الحرارة في قفص حتى أنه يصحو، وإعادته إلى قفص إسكان.
- بيت الحيوان في قفص إسكان فردية مع بعض الأجهزة في تخصيب اليورانيوم. تغيير الورقة الحيوان الفراش يوميا الحفاظ على نظافة القفص ومنع العدوى. ترصد بدقة ما إذا كان هذا الحيوان يظهر أي علامة على عدم الراحة. تطبيق ليدوكائين على الجرح إذا كان يشتبه بأي ألم. ميلوكسيكام إدارة أو والايبوبروفين مرة كل 24 ساعة عن 48 ساعة بعد كل رئيس بعد جراحات التثبيت واوديما. يمكن إعطاء الليدوكايين المحلية بالإضافة إلى ذلك إذا لم تكن كافية الأدوية المضادة للالتهاب.
3-التأقلم
- (الحد الأدنى) بعد يومين التعافي من التخدير، تأقلم الحيوانات للدولة رئيس--الثابتة في دائرة التسجيل. إجراء دورات التأقلم لمدة 5 أيام على الأقل.
- خلال دورات التأقلم، وضع الحيوان في دائرة تسجيل مع منصب رئيس ثابت المشبك مبنية خصيصا. خلال الدورة، بغية الحد من الحركة، التي تغطي الجسم مع أنبوب نصف راتنج مصنوعة خصيصا (الشكل 1)، استخدام طابعة ثلاثية الأبعاد.
ملاحظة: في يوم 1، ينبغي أن تكون الدورة التأقلم 5 دقيقة طويلة. فإنه ثم تزداد يوميا إلى 10 و 20, 40، و 60 دقيقة لأيام 2، 3، 4، و 5، على التوالي. - في نهاية كل دورة، إعطاء الحيوان مكافأة غذاء. إذا كان الحيوان تناضل باستمرار خلال التأقلم، توقف الدورة.
4-اوديما
ملاحظة: بعد التأقلم، يرصد اوديما عبر منطقة الدماغ لتسجيل. يتم تنفيذ في اوديما في الإطار ستيريوتاكسيك تحت التخدير، كما مع الرئيس آخر التثبيت. إجراءات ما بعد العملية هو نفسه كالرئيس في مرحلة ما بعد التثبيت.
- قبل اوديما، تنظيف الجمجمة مع مسحه القطن بالكحول 70% وغلوكونات الكلورهيكسيدين.
- كشط الجمجمة عبر موقع التسجيل مع حفر أسنان بعناية. عندما تصبح العظام رقيقة ما يكفي، قطع عليه مع طرف دون مشرط وإزالته.
- وضع الأسمنت الأسنان حول منطقة مكشوفة وتعزيزا للجمجمة.
- تغطي منطقة الدماغ مكشوفة مع لاصق السيليكون بعد الأسمنت الأسنان يصبح من الصعب. يتم إجراء جراحة بعد كما هو موضح في الخطوة 2.8.
5-تسجيل الكهربية
- السماح للحيوان لاسترداد لمدة يوم واحد على الأقل بعد اوديما قبل إجراء تسجيل الكهربية. ضع الحيوان في قاعة التسجيل بنفس الطريقة التي تم القيام به خلال دورات التأقلم عند بدء تشغيل التسجيل.
- جعل الزجاج الماصات من زجاج البورسليكات الشعيرات الدموية (OD = 1.5 ملم، معرف = 0.9 مم، طويلة 90.0 مم) سحبت على ساحبة كهربائي. هو تلميح قطرها 2 – 3 ميكرومتر، ومقاومتهم MΩ 4 – 6 عندما كانت تمتلئ 10 ملم برنامج تلفزيوني. طول مسرى 40-50 ملم. في بعض التسجيلات، تتم إضافة نيوروبيوتين 2% إلى 10 ملم من برنامج تلفزيوني.
- إرفاق ماصة زجاجية مليئة بحامل أوبترودي مصنوعة خصيصا.
- وضع سلك الفضة Ag-Cl المغلفة (0.2 مم في القطر) ماصة زجاجية. قم بتوصيل الأسلاك الفضية دبوس عبر أسلاك كهربائية مغلفة رقيقة. قم بتوصيل pin هيدستاجي لتسجيل مكبر للصوت.
- قم بتوصيل سلك التصحيح الألياف البصرية (الأساسية = 960 ميكرومتر، الكسوة = 1,000 ميكرومتر، غ = 0.63) مع التسليح زركونيا (OD = 2.5 ملم) إلى سبليت التزاوج الأكمام على حامل أوبترودي. ادفع الحبل التصحيح في الأكمام حتى اتصالات غيض التسليح الجزء الخلفي ماصة زجاجية. يسلم الحبل التصحيح الضوء (الطول الموجي = 465 nm) من الصمام. ويسيطر على ضوء LED برنامج تشغيل الصمام قناة واحدة.
- إزالة لاصق السيليكون اوديما. وضع حرارة المحلول الملحي (38 درجة مئوية) على سطح الدماغ دورياً لمنع سطح الدماغ من جفاف خلال الدورة تسجيل. إذا لزم الأمر، إزالة في بلده دوراً بالملقط حادة.
- إدراج مسرى الزجاج في أنسجة المخ مع مناور. رصد مقاومة قطب كهربائي عندما يتم إدراجها. استبدال الكهربائي عند المقاومة أقل مما كان متوقعا لأنه قد يكون معطوباً غيض مسرى. في عمق الفائدة، البحث وعزل التموج وحدة واحدة عن طريق ضبط العمق في الخطوات 2 إلى 5 ميكرومتر.
- بعد وحدة وحيدة منعزلة، تسليم الصمام الخفيفة ومراقبة الاستجابة للمحفزات الخفيفة.
- سجل الأنشطة العصبية بعد تحديد أنواع الخلايا. إجراء التسجيلات ح 2 – 3. إذا كان يتم إجراء التسجيل في أيام متتالية (الحد الأقصى من أيام 2)، تغطي اوديما مع لاصق سيليكون. عند الانتهاء من التسجيل، وهو التضحية بالحيوان، استرداد منصب رئيس ووضعها في الأسيتون تغسل وإعادة استخدامها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في الشكل 2، قمنا بدراسة آثار حجم تلميح وطول الماصات الزجاجية على طاقة الضوء في غيض الماصات (الشكل 2 أ-ب). تم قياس قوة الضوء بعداد طاقة ضوئية وضع 1 ملم بعيداً عن الحافة. تم تعيين طول كامل إلى 50 ± 2 مم عند اختلاف حجم تلميح، بينما تم تعيين حجم تلميح إلى 2.5 ميكرون عند تفاوت طول كامل. وكان تعيين عرقوب ماصة زجاجية إلى 8 مم. سلطة خفيفة على طرف تتراوح من 3 – 5 ميغاواط (يعني ± التنمية المستدامة؛ الشكل 2 ألف: 3.77 ± 0.29 ميغاواط، n = 20؛ الشكل 2B: 4.24 ± 0.31 ميغاواط، n = 21). كان لا يكاد يرتبط حجم تلميح (الشكل 2A) الماصات مع سلطة خفيفة (R = 0.1555). طول الماصة كان قليلاً فقط يرتبط بقوة الضوء بطريقة سلبية (R =-0.2054). وتوحي هذه النتائج أن نصيحة وطول الممصات نادراً ما تؤثر سلطة الضوء على الحافة. ونحن أيضا فحص إذا كانت كمية تحميل وحدة التخزين من الحل (10 ملم PBS) في الماصات الزجاجية يؤثر على قوة خفيفة (الشكل 2). تم تقييم حجم الحل بطول الحل في الماصة. وسجلت البيانات من الماصات 4 (تلميح الحجم: 0.25 ميكرومتر، وطول كامل: 50 ± 2 مم، طول شأنك: 8 مم). ووجدنا أن يتراوح حجم الحل في الماصة لا يؤثر في قوة الضوء (الشكل 2).
في الشكل 3، نعرض الردود سبايك سجلت في والاكيميه السفلي (IC) من الفئران ChR2 فجأت مستيقظا (2 – 4 أشهر من العمر). جيم هو مركز السمع في midbrain وتتكون من جلوتاماتيرجيك وجابايرجيك الخلايا العصبية،من1213، التي تستجيب ل الصوت3،4. على وجه التحديد تعرب جابايرجيك الخلايا العصبية في الفئران IC فجأت-ChR2، ChR24. في العمل السابق، وقد تبين أن الخلايا العصبية جابايرجيك وجلوتاماتيرجيك متحمس أو قمعها، على التوالي، عندما قدمت لهم المنبهات الخفيفة3،4. في الفئران مستيقظا، وجدنا كلا النوعين من الخلايا العصبية (الشكل 3 أ-ب). عندما يتم تسليم حافز الضوء من خلال الزجاج الكهربائي، أثارت ردود سبايك في بعض الخلايا العصبية (الشكل 3A). وفي المقابل، في الخلايا العصبية الأخرى، المنبهات الخفيفة قمعت الردود سبايك أثارت من قبل صوت المنبهات (الشكل 3B). تظهر هذه النتائج أن أوبترودي زجاج يمكن تسجيل نشاط وحدة وحيدة معزولة جيدا وموثوق بها تحفيز الخلايا العصبية المسجلة عن طريق الضوء.
رقم 1: زينة حامل والتسجيل أوبترودي- لوحات (A) و (ب) إظهار صاحب أوبترودي. تظهر لوحة (أ) هيكل جزء من صاحب أوبترودي. (1) هذا انقسام سيراميك التزاوج الأكمام. (2) هذا أنبوب الفولاذ المقاوم للصدأ. (3) هذا برميل حامل. (4) هذا غسالة مخروط. (5) هذا سقف البولي. تظهر لوحة (ب) حامل أوبترودي المجمعة. Panels (C) و (د) إظهار منصب رئيس مبنية خصيصا. الفريق (ج) يوضح طريقة عرض جانب من منصب رئيس. تظهر اللوحة (د) طريقة عرض مائل لمنصب رئيس. وظيفتي رئيس (يمين) مصنوعة من فاصل مجلس الدائرة (على اليسار). لوحات (ه)، (و)، و (ز) تبين الأنبوب نصف راتنج مصنوعة خصيصا. لوحات (ﻫ) و (و) إظهار الرسومات الأبعاد من الأنبوب نصف الراتنج. تظهر لوحة (ه) رؤية جبهة للأنبوب نصف الراتنج. تظهر لوحة (و) عرض جانب من الأنبوب نصف الراتنج. تظهر لوحة (ز) صورة صور من الأنبوب نصف. الأرقام في لوحات (ه) و (و) تشير إلى أبعاد الرسم في مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: أثر تكوين الممصات الزجاج على سلطة الضوء على الحافة. الحجم (A) التلميح لكان تآمروا ضد السلطة الخفيفة. تم تعيين طول الماصة الكامل إلى 50 ± 2 مم. تم تعيين طول شأنك إلى 8 مم-(ب) طول الماصة كان تآمروا ضد السلطة الخفيفة. تم تعيين حجم تلميح إلى 0.25 ميكرومتر. طول عرقوب كان تعيين إلى 8 مم-(ج) هذا الفريق ويبين تأثير تحميل وحدة التخزين من الحل (10 ملم PBS) على طاقة الضوء. وترد البيانات من الماصات 4 بخطوط ورموز مختلفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : الردود أثارت الضوء في IC مستيقظا ChR2 فجأت الفئران. (أ) الضوء المحفزات (المربع الأزرق، 0.03 s) أثارت ردود سبايك. (ب) على ضوء المحفزات (المربع الأزرق، 0.03 s) قمعت الردود سبايك أثارت من قبل صوت (مربع رمادي). آثار 3 العلوي هي الاستجابة للصوت، وآثار 3 انخفاض الاستجابة عندما أعطيت الضوء والصوت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أوبتوجينيتيكس أصبحت أداة قوية في علم الأعصاب. وقد استخدمت لتحديد الخلايا العصبية محددة أنواع في فيفو ، فضلا عن التلاعب بأنشطة محددة المسارات العصبية. توضيح الأنشطة العصبية من مختلف أنواع الخلايا العصبية تعزز فهم إليه الدوائر العصبية. هنا، نحن أثبتت طريقة لإيصال الضوء إلى موقع التسجيل عن طريق قطب زجاج في IC مستيقظا ChR2 فجأت الفئران.
وهناك العديد من الخطوات الهامة في الطريقة الموضحة. أولاً، شرط لاستخدام الحيوانات مع تعبير كافية ومحددة من أوبسينس في الخلايا العصبية المستهدفة. لتحديد الاستجابات للضوء مع التسجيلات خارج الخلية، من الضروري أن يستحضر تفعيل opsin طفرات في الخلايا العصبية المستهدفة. في بعض السلالات المحورة وراثيا، من الممكن أن مستوى التعبير التحوير في الخلايا العصبية منخفض في14من صغار الحيوانات، وقد يكون هناك سن أدنى للتجربة. علاوة على ذلك، قد يلزم إجراء بعض تجارب إضافية لتأكيد إذا كانت ردود للمنبهات الخفيفة محددة لأنواع الخلايا العصبية المستهدفة (مثل، إيمونوهيستوتشيميستري). عند العصبية المستهدف عليه، سيكون من يلزم التمييز بين الاستجابات مقولة مباشرة من الردود مقولة سينابتيكالي، الذي يمكن أن يقوم به مستوى عتبة الكمون للاستجابة. ثانيا، من المهم للتأكد من أنسجة المخ نظيفة قدر الإمكان. الحفاظ على نظافة مطلوب خاصة بغية منع أي نزيف خلال في اوديما والتسجيلات. أيضا، ينبغي منع سطح الدماغ من التجفيف بعد اوديما بتغطية سطح محكم مع لاصق سيليكون.
لتسليم على ضوء كفاءة من طرف القطب، أنها حاسمة للحد من أي خسارة في مسار بصري. في لدينا التكوين أوبترودي، قوة الضوء يسقط عشرة إضعاف عن طريق صاحب القطب: قوة الضوء هو 45 ميغاواط في نهاية الحبل التصحيح الألياف الضوئية، في حين أنه من 3 – 5 ميغاواط في طرف ماصة زجاجية. كما هو موضح في النتائج، حجم تلميح وطول كامل لا يؤثر قوة الضوء على الطرف (الشكل 2). هذه النتائج تشير إلى أن توهين الضوء مستقرا إلى حد ما بغض النظر عن تكوين ماصة زجاجية. ولا يهم هذا توهين الضوء في تسجيل IC الخلايا العصبية في الفئران ChR2 فجأت نظراً لأننا قد أكد أنه كان من الممكن لتسجيل خفيفة التموج المنشط في الحافة البطني (2 مم) من المجتمع الدولي، على الرغم من أنه قد يهم في تكوينات أخرى لتسجيل. أنه سيكون من الصعب على الحد توهين الضوء بشكل كبير، ولكن قد تكون هناك إمكانيات للتحسين. أولاً، قد يكون فعالة لاستخدام الكوارتز بدلاً من زجاج البورسليكات ماصة قطب. ومن المعروف أن الكوارتز، الضوء على أفضل الموصلية، ذلك لأنها قد تقلل من فقدان الخفيفة عن طريق قطب كهربائي15. كما أفيد أن البولندية نهاية الماصة تقليل فقدان الخفيفة على سطح الاتصال بين ماصة والحبل التصحيح15. إذا كان التحسن في توهين الضوء لا يكفي، أنه سيكون فعالة استخدام ليزر بدلاً من الصمام، على الرغم من أن تكاليف الليزر أكثر مما أدى.
واحدة من مزايا القطب ماصة زجاجية أنه من الممكن لتنفيذ إجراءات النسيجي عن طريق إضافة تتبع أو ناقلات لحل ملء. سيتم إضافة إجراءات النسيجي قدرا كبيرا من المعلومات المفيدة (موقع التسجيل)، مورفولوجيا الخلايا العصبية المسجلة، و غيرهاللبيانات الكهربية. وذكر أيضا، أن من الممكن لإجراء الدراسات الاستقصائية الدوائية باستخدام الزجاج الكهربائي مع محصرات في الحل شغل15. وعلى النقيض من هذه المزايا، الحد مسرى ماصة زجاجية فإنه لا يمكن تسجيل من وحدات معزولة متعددة. لتحقيق تسجيلات متعددة، قد يكون من الممكن لوضع سلك تيترودي ماصة زجاجية بدلاً من سلك Ag-Cl مغلفة مفردة. وفي هذه الحالة، سيكون من اللازمة لاستخدام ماصة مع نصيحة أكبر حجماً (30-60 ميكرومتر، وحجم تلميح نموذجي تيترودي) وترك نهاية تيترودي بها من طرف الماصة.
في حين غالباً ما تتطلب أوبتروديس ذكر سابقا مجمع تصنيع16،17، وضعت ماجي وزملائه أوبترودي استخدام الماصات الزجاجية القياسية كما قمنا بتصميم مع أوبترودي18. في هذه الطريقة، أنها إدراج ألياف الضوئية رقيقة في الماصة إيصال الضوء. جعل الألياف رقيقة ما يكفي لإدراج شأنك الماصة، أنها حفرت 125 ميكرومتر الكسوة الألياف مع جوهر ميكرومتر 9 لقطر من 8 – 10 ميكرون في التلميح. وميزة هذا الأسلوب هو أن تنطبق حتى على ماصة بنت غالباً ما تستخدم الرحلان. ومع ذلك، قد يكون من الصعب استخدام LED كمصدر ضوء لأن المصابيح التجارية الموحدة لن يحقق كافية طاقة الضوء عبر ألياف أساسية 9 ميكرومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب تؤيدها الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم كاكينهي منحة JP16K11200 وح 17 02223، والمنحة لتمويل البحوث من كانازاوا الطبية جامعة S2016-8 و C2017 3. ونشكر يوهيتشي كودا لدعمه في أخذ الصور.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrode holder | Molecular Device | 1-HL-U | pipette holder for microelectrode amplifier |
| Ceramic split mating sleeve | Thorlabs | ADAF1 | f2.5 mm ferrule |
| Circuit board spacer | Teishin Denki | SPA-320 | f8.0 mm, 20.0 mm long |
| Stereotaxic frame for mice | Narishige | SR-6M-HT | Stereotaxic instruments for mice |
| Manipulator | Narishige | NA | Manual manipulator |
| Superbond | Sun Medical | M: 204610557 | Dental adhesive resin cement |
| Form2 | Formlabs | NA | 3D printer |
| Kwik-Sil | WPI | KWIK-SIL | Low toxicity silicone adhesive |
| Borosilicate glass capillaries | Narishige | GD-1.5 | OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 90.0 mm long |
| Fiber-optic patch cord | Doric Lenses | MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5 | Monofiberoptic patchcord, OD, 2.5 mm, core = 960 mm, cladding = 1000 mm, NA = 0.63 |
| Connectrized LED | Doric Lenses | LEDC-1B_FC | Central wave length = 465 nm, output power = 45 mW (Core 960 mm 0.63 NA ) |
| LED driver | Doric Lenses | LEDRV_1CH_1000 | 1 ch LED driver, maximum output = 1000 mA |
| Electrode puller | Narishige | PB-7 | Dual-stage glass micropipette puller |
| Borosilicate glass capillary | Narishige | GD-1.5 | Bolosilicate glass capillary, OD, 1.5mm, ID, 0.9 mm, 90.0 mm long |
| GENTACIN | MSD CO., Ltd | 185711173 | Antibiotic ointment |
| Terramycin®-LA | Zoetis | G 333 | Oxytetracycline |
| Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J | Jackson Labs | #14548 | VGAT-ChR2 mice |
| Multiclamp 700B | Molecular Devices | 2500-0157 | Microelectrode amplifier |
References
- Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K.
- Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216 (2015).
- Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Identified GABAergic and glutamatergic neurons in the mouse inferior colliculus share similar response properties. Journal of Neuroscience. 37 (37), 8952-8964 (2017).
- Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Long-lasting sound-evoked afterdischarge in the auditory midbrain. Scientific Reports. 6, 20757 (2016).
- Munoz, W., Tremblay, R., Rudy, B. Channelrhodopsin-assisted patching: in vivo recording of genetically and morphologically identified neurons throughout the brain. Cell Reports. 9 (6), 2304-2316 (2014).
- Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4 (7), e6099 (2009).
- Kuwada, S., Batra, R., Stanford, T. R. Monaural and binaural response properties of neurons in the inferior colliculus of the rabbit: effects of sodium pentobarbital. Journal of Neurophysiology. 61 (2), 269-282 (1989).
- Populin, L. C. Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus. Journal of Neuroscience. 25 (25), 5903-5914 (2005).
- Duque, D., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects. Brain Structure and Function. 220 (6), 3385-3398 (2015).
- Cai, R., Richardson, B. D., Caspary, D. M. Responses to predictable versus random temporally complex stimuli from single units in auditory thalamus: impact of aging and anesthesia. Journal of Neuroscience. 36 (41), 10696-10706 (2016).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
- Ito, T., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Two classes of GABAergic neurons in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 29 (44), 13860-13869 (2009).
- Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties. Neuroscience Research. 51 (4), 475-492 (2005).
- Chen, Q., et al. Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice. Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).
- Hirai, Y., Nishino, E., Ohmori, H. Simultaneous recording of fluorescence and electrical signals by photometric patch electrode in deep brain regions in vivo. Journal of Neurophysiology. 113 (10), 3930-3942 (2015).
- LeChasseur, Y., et al. A microprobe for parallel optical and electrical recordings from single neurons in vivo. Nature Methods. 8 (4), 319-325 (2011).
- Abaya, T. V., Blair, S., Tathireddy, P., Rieth, L., Solzbacher, F. A 3D glass optrode array for optical neural stimulation. Biomedical Optics Express. 3 (12), 3087-3104 (2012).
- Bittner, K. C., et al. Conjunctive input processing drives feature selectivity in hippocampal CA1 neurons. Nature Neuroscience. 18 (8), 1133-1142 (2015).
