Summary
Diese Arbeit stellt eine Methode, um eine optogenetische Monoblock-Aufnahme zuverlässig aus einem wach Maus über eine maßgeschneiderte Glas Optrode durchführen.
Abstract
Es ist ein wichtiges Anliegen in den Neurowissenschaften wie verschiedene Arten von Neuronen arbeiten auf neuronale Schaltkreise. Jüngste Fortschritte in der optogenetik haben die Identifizierung des neuronalen in in Vivo elektrophysiologischer Experimente in breiten Hirnregionen aktiviert. Optogenetik Experimente ist es wichtig, die Licht auf die Aufnahme-Website zu bieten. Jedoch ist es oft schwer zu Anregung Licht an den tiefen Hirnregionen von Oberfläche des Gehirns liefern. Vor allem, ist es schwierig für die Stimulation Licht, die tiefen Hirnregionen zu erreichen, wenn die optische Transparenz der Oberfläche Gehirn niedrig ist, wie oft der Fall mit Aufnahmen von Tieren, wach ist. Hier beschreiben wir eine Methode um Spike Antworten auf das Licht von einer wach Maus über eine maßgeschneiderte Glas Optrode aufzuzeichnen. Bei dieser Methode ist das Licht durch die Aufnahme Glaselektrode geliefert, so dass man zuverlässig die aufgezeichneten Neuron mit Licht in den tiefen Hirnregionen stimulieren kann. Dieses maßgeschneiderte Optrode-System besteht aus zugänglich und preiswerten Materialien und ist leicht zu montieren.
Introduction
Das zentrale Nervensystem besteht aus verschiedenen Arten von Neuronen, die unterschiedliche Funktionen haben. Wie diese verschiedenen Arten von Neuronen innerhalb der neuronalen Schaltung funktionieren, ist eines der wichtigsten Anliegen in den Neurowissenschaften. In vielen Regionen des Gehirns war es jedoch unmöglich, die neuronalen Typen in in-Vivo -Aufnahmen der elektrischen Aktivitäten zu unterscheiden, denn es keinen klaren Unterschied in der elektrischen Spike-Signal selbst, mit einigen Ausnahmen gibt. Jüngste Fortschritte in der optogenetik haben einen Durchbruch1,2. Mit transgenen Tieren in der lichtempfindlichen Opsin (z.B.Channelrhodopsin-2) in bestimmten neuronalen Arten ausgedrückt ist, wurde es möglich, die neuronalen Arten effizient in in Vivo Aufnahmen3, 4,5,6. Bei diesen Tieren die Neuronen mit lichtempfindlichen Opsin sind durch lichtreize während der elektrische Aufnahmen geben aufgeregt, aber anderen Neuronen sind nicht. Opsin-positiven Neuronen, zeichnen daher leicht von anderen Neuron durch ihre Reaktionen auf Licht.
Optogenetik Experimente ist es wichtig, die Licht auf die Aufnahme-Website zu bieten. Als nicht-invasive Methode richtet das Licht oft von Oberfläche des Gehirns. Jedoch weil das Licht Stärke verringert während es Hirngewebe durchläuft, ist es schwer, die tiefen Hirnregionen von Oberfläche des Gehirns zu stimulieren. Vor allem, ist es schwierig für die Stimulation Licht, die tiefen Hirnregionen zu erreichen, wenn die optische Transparenz der Oberfläche Gehirn niedrig ist, wie oft der Fall mit Aufnahmen von Tieren, wach ist. Elektrophysiologische Experimente wurden oft an narkotisierten Tieren durchgeführt, weil die Bewegung des Körpers Lärm in den Aufnahmen verursacht. Wie gut dokumentiert ist, ist jedoch Anästhesie bekannt, um die neuronalen Antworten7,8,9,10zu ändern. Daher ist es notwendig, wach Tiere zu nutzen, um neuronale Reaktionen ohne künstliche Effekte der Narkose zu studieren. Im Gegensatz zu den Experimenten mit narkotisierten Tieren werden die elektrophysiologischen Aufnahmen nach der Erholung von der Operation in den Experimenten mit wach Tieren durchgeführt. Während der Zeit zwischen der Operation und die Aufnahmen Gewebe Exsudat oft sammelt sich auf der Oberfläche des Gehirns und macht die optische Transparenz von der Oberfläche des Gehirns gering.
Hier beschreiben wir eine Methode um Monoblock-Aufnahmen aus einer wach Maus über eine maßgeschneiderte Glas Optrode aufzuzeichnen. Bei dieser Methode ist das Licht durch die Aufnahme Glaselektrode geliefert, so dass man zuverlässig die aufgezeichneten Neuron mit Licht in tiefen Hirnregionen stimulieren kann. Dieses maßgeschneiderte Optrode-System besteht aus zugänglich und preiswerten Materialien und ist leicht zu montieren.
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Protocol
Alle Verfahren sind im Einklang mit den Leitprinzipien der physiologischen Gesellschaft von Japan und mit Zustimmung der Animal Care Ausschuss von Kanazawa medizinischen Universität durchgeführt.
(1) Bau von Optrode Glashalter
Hinweis: Um ein Glashalter Optrode zu bauen, eine kommerzielle Elektrodenhalter verwendet (Abbildung 1A).
- Ziehen Sie das Stahlrohr für Druckregelung vorsichtig aus dem Faß des Inhabers.
- Durch Bohren, das Loch des Pin-Sitz-Seite in den Lauf des Inhabers zu erweitern. Machen Sie das Loch 3 mm im Durchmesser und 12 mm in der Tiefe.
- Setzen Sie ein Edelstahl-Rohr (Durchmesser 3 mm, 0,5 mm dick und 8 mm Länge; Abbildung 1A ( 2) in das Loch.
- Legen Sie eine Keramik Paarung Hülse für ⌀2.5 mm Ferrulen (Abbildung 1A1) in das Loch aufgeteilt.
- Befestigen Sie den Lauf des elektrodenhalters zu einem L-förmigen Falz mit Epoxy-Kleber.
- Machen Sie die Löcher (3 mm im Durchmesser) in den Falz und an einem Manipulator mit Schrauben befestigen.
2. Leiter Post Installation
- Bereiten Sie einen speziell angefertigten Kopf Beitrag gemacht der eine Leiterplatte Abstandhalter vor. Machen Sie den säulenförmigen Leiterplatte Abstandhalter in Form eines quaderförmigen mit einer Fräse und schneiden Sie es in 2 Kopf stellen mit einer Säge (Abbildung 1 b). Glätten Sie die Unterseite der Kopf Post mit einer Fräse.
- Bereiten Sie die transgenen Tieres, in denen eine lichtempfindliche Opsin in ein bestimmtes Neuron-Typ für die Studie zum Ausdruck kommt. In dieser Arbeit wird die transgenen Maus (VGAT-ChR2 Mäuse) in der hemmenden Neuronen Channelrhodopsin-2 (ChR2)11 Ausdrücken verwendet.
- Betäuben Sie das Tier mit einer Mischung von 0,3 mg/kg Medetomidine, 4,0 mg/kg Midazolam und 5,0 mg/kg Butorphanol durch intraperitoneale Verwaltung. Um zu bestätigen, dass das Tier vollständig betäubt ist, testen Sie seine Reaktionen um die Rute einklemmen.
- Platzieren Sie den Mauszeiger in einem stereotaktischen Rahmen auf ein Heizkissen. Sauberen pad der stereotaktischen Rahmen und die Heizung mit 70 % Alkohol im voraus. Stellen Sie die Zähne in das Loch von der Snack-Bar, und ziehen Sie die Nase Spannbacke leicht an. Befestigen Sie beide Seiten des Kopfes mit Ohr-Stangen. Wenn der Kopf richtig durch die Ohr-Balken befestigt ist, ziehen Sie die Nase Spannbacke an. Anwenden einer ophthalmologischen Salbe für die Augen.
- Rasieren Sie die Kopfhaut mit einer kleinen Schere und Reinigen der Kopfhaut mit einem Wattestäbchen von Chlorhexidin Gluconat. Sterilisieren Sie vor der Operation alles, was, die der chirurgischen Instrumente und einen Kopf mit Autoklav (121 ° C, 15 min Posten).
- Die Kopfhaut entlang der Mittellinie mit einer Schere schneiden und zur Seite schieben. Den Schnitt von der Rückseite des Kopfes, der Augen (ca. 20 mm) zu machen. Entfernen Sie das Periost mit einem Wattestäbchen in 70 % Alkohol getaucht und trocknen Sie den Schädel.
- Legen Sie die Kopf Post auf der Manipulator. Positionieren Sie den Kopf Pfosten flach auf den Schädel um die Bregma mit der Manipulator.
- Mischen Sie das Monomer (4 Tropfen), Katalysator (1 Tropfen) und Polymer (1 kleiner Löffel) dental Zement auf einen kleinen Teller, der vorher im Kühlschrank gekühlt wird. Dental Zement (unter 1 g) legte die frontalen und parietalen Knochen des Schädels, die Kopf Post an den Schädel zu beheben.
- Nach der zahnärztliche Zement hart wird, entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen. Setzen Sie eine antibiotische Salbe auf die Haut. Spritzen Sie Medetomidine Antagonist (0,3 mg/kg) und Antibiotika (Oxytetracycline; 20 mg/kg). Platzieren überwachen Sie die Maus auf das Wärmekissen in einem Käfig zu, bis er erwacht und schicken Sie es an einem Gehäuse-Käfig.
- Haus das Tier in einem einzelnen Gehäuse-Käfig mit einigen Bereicherung Gerät. Ändern der tierischen Papiers Betten täglich, um den Käfig sauber zu halten und eine Infektion verhindern. Überprüfen Sie sorgfältig, ob das Tier Anzeichen von Unwohlsein zeigt. Soweit Lidocain auf die Wunde Schmerzen vermutet wird. Verwalten Meloxicam oder Carprofen einmal alle 24 h für 48 h nach beide Leiter-Installation und Kraniotomie Operationen Post. Die lokale Lidocain zusätzlich gegeben werden kann, wenn die NSAR nicht ausreicht.
(3) Akklimatisierung
- Akklimatisieren Sie (mindestens) zwei Tage nach der Erholung von der Narkose, die Tiere in den Kopf fixiert Zustand in der Aufnahme-Kammer. Führen Sie die Akklimatisierung Sitzungen für mindestens 5 Tage.
- Während der Akklimatisierung-Sessions legen Sie das Tier in der Aufnahme-Kammer mit dem Kopf Beitrag an einer speziell angefertigten Klemme befestigt. Während der Sitzung, um Bewegung zu begrenzen Abdeckung des Körpers mit einem maßgeschneiderten Harz Halbschlauch (Abbildung 1), machte mit einem 3D-Drucker.
Hinweis: Am 1. Tag, sollte die Akklimatisierung Session 5 min lang sein. Es wird dann täglich um 10, 20, 40 und 60 min für Tage 2, 3, 4 und 5, bzw. erhöht. - Am Ende jeder Sitzung belohnen Sie dem Tier essen. Wenn das Tier ständig während der Akklimatisierung kämpft, beenden Sie die Sitzung.
4. Kraniotomie
Hinweis: Nach der Akklimatisierung ist eine Kraniotomie über die Gehirnregion für die Aufnahme gemacht. Die Kraniotomie erfolgt in der stereotaktischen Rahmen unter Narkose, da mit dem Kopf Installation Posten. Die Post-operative Verfahren ist das gleiche wie die Leiter Installation Post.
- Reinigen Sie vor der Kraniotomie den Schädel mit einem Wattestäbchen mit Chlorhexidin Gluconat und 70 % Alkohol.
- Kratzen Sie sorgfältig den Schädel über die Aufnahme-Website mit einem Zahnbohrer. Sobald die Knochen dünn genug ist, schneiden Sie es mit der Spitze des Skalpells und entfernen Sie es.
- Dental Zement um der exponierten Region gelegt, um den Schädel zu stärken.
- Decken Sie die exponierte Hirnareal mit Silikonkleber, nachdem der dental Zement hart wird. Nach der Operation verläuft wie in Schritt 2.8 beschrieben.
5. elektrophysiologische Aufnahme
- Lassen Sie das Tier, für mindestens 1 Tag nach der Kraniotomie vor der Durchführung der elektrophysiologischen Aufnahme erholen. Legen Sie das Tier in der Aufnahme-Kammer, in der gleichen Weise, die es während der Akklimatisierung-Sessions gemacht wurde, wenn die Aufnahme beginnt.
- Glaspipetten aus Borosilikatglas Kapillaren zu machen (OD = 1,5 mm, ID = 0,9 mm 90,0 mm lang) auf eine Elektrode Puller gezogen. Ihr Tipp-Durchmesser beträgt 2 – 3 µm, und ihr Widerstand ist 4 – 6 MΩ, wenn sie mit 10 mM PBS gefüllt sind. Die Länge der Elektrode ist 40-50 mm. In manchen Aufnahmen ergänzt, 2 % Neurobiotin 10 mM PBS.
- Die maßgeschneiderte Optrode Halter die gefüllten Glaspipette zuordnen.
- Die Glaspipette Ag-Cl beschichtet Silberdraht (0,2 mm im Durchmesser) umgesetzt. Verbinden Sie den Silberdraht mit ein Stift über eine dünne beschichtete Elektrokabel. Verbinden Sie die Pin mit der Headstage des Verstärkers Aufnahme.
- Die LWL-Patchkabel verbinden (Kern = 960 µm Verkleidung = 1.000 µm, NA = 0,63) mit einem Zirkonia zwinge (OD = 2,5 mm) nach der Paarung Hülse auf dem Optrode Halter Split. Drücken Sie die Patch-Kabel in die Hülse, bis die Spitze der zwinge am Ende die Glaspipette Kontakte. Die Patch-Kabel liefert das Licht (Wellenlänge = 465 nm) von LED. Das LED-Licht wird durch ein Einkanal-LED-Treiber gesteuert.
- Entfernen Sie den Silikonkleber über die Kraniotomie. Put angewärmte Kochsalzlösung (38 ° C) auf der Oberfläche des Gehirns in regelmäßigen Abständen zu verhindern, dass die Gehirn Oberfläche Trocknen während der Aufnahme-Session. Falls erforderlich, entfernen Sie die Dura mit scharfen Pinzette.
- Legen Sie die Glaselektrode in das Hirngewebe mit einem Manipulator. Der elektrodenwiderstand zu überwachen, wenn sie eingefügt wird. Die Elektrode zu ersetzen, wenn der Widerstand niedriger ist als erwartet, da die Elektrodenspitze möglicherweise beschädigt. Suchen Sie in einer Tiefe von Interesse und isolieren Sie die Einheit Spikes durch die Tiefe in 2 bis 5 µm Schritten anpassen.
- Nachdem die Einheit isoliert ist, liefern Sie die LED-Leuchte und beobachten Sie die Reaktion auf die lichtreize.
- Notieren Sie die neuronalen Aktivitäten nach der Identifizierung der Zelltypen. Führen Sie die Aufnahmen für 2 – 3 h. Erfolgt die Aufnahme an aufeinander folgenden Tagen (maximal 2 Tage), decken Sie die Kraniotomie mit Silikonkleber. Wenn die Aufnahme beendet ist, und das Tier geopfert, die Kopf Post abrufen und steckte es in Aceton zu waschen und wiederverwenden.
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Representative Results
In Abbildung 2untersuchten wir die Auswirkungen der Werkzeugspitze ändern und die Länge der glaspipetten auf die Lichtleistung an der Spitze der Pipetten (Abbildung 2A-B). Die Lichtleistung wurde durch eine optische Leistungsmesser platziert 1 mm von der Spitze gemessen. Die volle Länge wurde auf 50 ± 2 mm eingestellt, wenn die Spitzengröße variiert während der Werkzeugspitze ändern bis 2,5 µm festgelegt wurde, wenn die volle Länge abwechslungsreich. Der Schaft der Glaspipette wurde auf 8 mm festgelegt. Die Lichtleistung an der Spitze reichte von 3 bis 5 mW (Mittelwert ± SD; Abbildung 2A: 3,77 ± 0,29 mW, n = 20; Abbildung 2 b: 4,24 ± 0,31 mW, n = 21). Der Werkzeugspitze ändern (Abbildung 2A) der Pipetten war kaum korreliert mit der Lichtleistung (R = 0.1555). Die Länge der Pipette war nur leicht mit der Lichtleistung in einer negativen Weise korreliert (R =-0.2054). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Spitze und die Länge der Pipetten selten die Lichtleistung an der Spitze beeinflussen. Wir haben uns auch wenn die Größe der Belastung der Volumen der Lösung (10 mM PBS) in die glaspipetten wirkt sich auf die Lichtleistung (Abbildung 2). Das Volumen der Lösung wurde anhand der Länge der Lösung in die Pipette. Die Daten wurden aus 4 Pipetten (Düsengröße: 0,25 µm, die volle Länge: 50 ± 2 mm, die Länge des Schaftes: 8 mm). Wir fanden, dass variiert das Volumen der Lösung in die Pipette keinen Einfluss auf die Lichtleistung (Abbildung 2).
In Abbildung 3zeigen wir die Spike-Antworten in der minderwertigen Colliculus (IC) wach VGAT-ChR2 Mäuse (2 – 4 Monate alt) aufgezeichnet. Der IC ist ein Hörzentrum im Mittelhirn und besteht aus glutamatergen und Gabaergen Neuronen12,13, beide reagieren auf Ton3,4. Bei den Mäusen IC VGAT-ChR2 express Gabaergen Neuronen speziell ChR24. In früheren Arbeiten wurde gezeigt, dass die Gabaerge und glutamatergen Neuronen waren aufgeregt oder unterdrückt, bzw. Wenn sie lichtreize3,4gegeben wurden. In den Wachen-Mäusen fanden wir beide Arten von Neuronen (Abb. 3A-B). Wenn der Lichtreiz durch die Glaselektrode geliefert wird, erwähnt es Spike Reaktionen in einigen Neuronen (Abb. 3A). Im Gegensatz dazu unterdrückt die lichtreize in anderen Neuronen, die Spike-Reaktionen hervorgerufen durch Ton Reize (Abb. 3 b). Diese Ergebnisse zeigen, dass ein Glas Optrode gut isolierte Einheit Aktivität aufzuzeichnen und zuverlässig die aufgezeichneten Neuronen durch Licht stimulieren kann.
Abbildung 1: Optrode Halter und Aufnahme Zubehör. Seitenteile (A) und (B) zeigen die Optrode Halter. (A) zeigt die Struktur des Inhabers Optrode. (1) Dies ist eine keramische Split Paarung Ärmel. (2) Dies ist ein Edelstahl-Rohr. (3) Dies ist ein Fass des Inhabers. (4) Dies ist ein Kegel-Unterlegscheibe. (5) Dies ist ein Polycarbonat-Abdeckung. (B) zeigt den montierten Optrode Halter. Panels (C) und (D) zeigen die speziell angefertigten Kopf Post. Feld (C) zeigt eine Seitenansicht der Kopf Post. (D) zeigt eine Schrägansicht der Kopf Post. Die beiden Kopf stellen (rechts) bestehen aus einer Leiterplatte Abstandhalter (links). Platten (E), (F) und (G) die maßgeschneiderte Harz Halbschlauch zeigen. Platten (E) und (F) zeigen den Harz Halbschlauch Maßzeichnungen. Platte (E) zeigt eine Vorderansicht der Harz eine halbe Tube. Panel (F) zeigt eine Seitenansicht der Harz eine halbe Tube. (G) zeigt ein Foto des halben Rohres. Die Zahlen in Platten (E) und (F), geben Sie die Zeichnung Abmessungen in mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Die Wirkung der Konfiguration der glaspipetten auf die Lichtleistung an der Spitze. (A) die Spitze der Größe wurde aufgetragen gegen die Lichtleistung. Die volle Länge der Pipette wurde gegründet um 50 ± 2 mm. Die Länge des Schaftes wurde bis 8 mm. (B) festgelegt, die die Länge der Pipette, gegen die Lichtleistung aufgetragen wurde. Die Spitzengröße wurde auf 0,25 µm festgelegt. Die Länge des Schaftes einstellen bis 8 mm. (C) das Panel zeigt die Auswirkung der Belastung Volumen der Lösung (10 mM PBS) auf die Lichtleistung. Die Daten aus 4 Pipetten werden durch verschiedene Symbole und Linien angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Die Licht-evozierten Antworten im IC wach VGAT-ChR2 Mäuse. (A) das Licht Reize (blaue Box, 0,03 s) Spike Reaktionen hervorgerufen. (B) das Licht Reize (blaue Box, 0,03 s) unterdrückt die Spike-Reaktionen hervorgerufen durch Ton (graues Feld). Die oberen 3 Spuren sind die Antwort auf Klang, und die unteren 3 Spuren sind die Antwort, wenn Ton und Licht erhielten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Optogenetik ist ein leistungsfähiges Werkzeug in den Neurowissenschaften geworden. Es ist verwendet worden, für bestimmtes Neuron Typen in Vivo zu identifizieren sowie die Aktivitäten der spezifischen neuronalen Bahnen zu manipulieren. Die Klärung der neuronalen Aktivitäten der verschiedenen neuronalen Arten fördert das Verständnis des Mechanismus der neuronalen Schaltkreise. Hier haben wir eine Methode, um das Licht um die Aufnahme-Site durch eine Glaselektrode im IC von wach VGAT-ChR2 Mäusen zu liefern.
Es gibt mehrere wichtige Schritte in der beschriebenen Methode. Erstens ist es erforderlich, Tiere mit einem ausreichenden und spezifischen Ausdruck des Opsins in den Ziel-Neuronen zu nutzen. Um die Reaktionen auf Licht mit den extrazellulären Aufnahmen zu identifizieren, ist es notwendig, dass die Aktivierung der Opsin die Spikes in den Ziel-Neuronen evoziert. In einigen transgenen Stämmen ist es möglich, dass die Transgen-Expression in den Neuronen in jungen Tieren14niedrig, und möglicherweise gibt es ein Mindestalter für das Experiment. Darüber hinaus ist es möglicherweise erforderlich, um sicherzustellen, dass die Reaktionen auf die lichtreize spezifisch für die Zieltypen Neuron (z.B. Immunohistochemistry) sind weitere Experimente durchzuführen. Wenn das Ziel Neuron exzitatorischen ist, wäre es notwendig, die direkt evozierten Antworten aus den synaptisch evozierten Antworten zu unterscheiden, die durch Schwellwerte die Latenz der Antwort getan werden könnte. Zweitens ist es wichtig, sicherzustellen, dass das Hirngewebe so sauber wie möglich ist. Eine Erhaltung der Sauberkeit ist vor allem erforderlich, um zu verhindern, dass eine Blutung während der Kraniotomie und die Aufnahmen. Außerdem sollte die Oberfläche des Gehirns Trocknung nach der Kraniotomie durch abdecken der Oberfläche dicht mit Silikonkleber gehindert werden.
Um das Licht effizient aus der Elektrodenspitze liefern, ist es wichtig, den Verlust in den optischen Pfad zu reduzieren. In unserer Konfiguration der Optrode sinkt die Lichtleistung verzehnfacht durch den Elektrodenhalter: die Lichtleistung beträgt 45 mW am Ende des LWL-Patchkabel, während es 3 bis 5 mW an der Spitze der Glaspipette ist. Wie in den Ergebnissen angezeigt, wurde der Werkzeugspitze ändern und die volle Länge die Lichtleistung an der Spitze (Abbildung 2) nicht berührt. Diese Ergebnisse zeigten, dass die leichte Dämpfung unabhängig von der Konfiguration der Glaspipette relativ stabil war. Diese leichte Dämpfung spielte keine Rolle bei der Erfassung von IC Neuronen im VGAT-ChR2 Mäuse, weil wir bestätigt haben, dass man Licht aktivierte Spitzen in den ventralen Rand (2 mm Tiefe) des IC aufnehmen konnte, obwohl es, in anderen Aufnahme-Konfigurationen relevant ist. Es wäre schwer, die leichte Dämpfung drastisch zu reduzieren, aber möglicherweise gibt es Verbesserungsmöglichkeiten. Erstens ist es Quarz anstelle einer Borosilikatglas als eine Elektrode Pipette verwenden wirksam. Es ist bekannt, dass Quarz Leitfähigkeit, besseres Licht hat, so dass es den Lichtverlust durch die Elektrode15reduzieren kann. Darüber hinaus wurde berichtet, dass die Politur des Ende der Pipette Lichtverlust an der Kontaktfläche zwischen der Pipette und Patchkabel15reduziert. Wenn die Verbesserung in der leichten Dämpfung nicht genug ist, wäre es wirksame Verwendung eines Lasers anstelle von LED, obwohl Laser mehr kostet als geführt.
Einer der Vorteile der Glas-Pipette-Elektrode ist, dass man histologische Verfahren durchführen, indem die Abfüllung Tracer oder Vektoren hinzufügen kann. Die histologischen Verfahren werden die elektrophysiologischen Daten viel nützliche Informationen (die Lage der Aufnahme), die Morphologie der aufgezeichneten Neuron usw.hinzufügen. Darüber hinaus wurde berichtet, dass es möglich ist, führen Sie pharmakologische Untersuchungen mit der Glaselektrode mit Blocker in der Füllung Lösung15. Im Gegensatz zu diesen Vorteilen ist die Begrenzung der Pipette Glaselektrode, dass es aus mehreren isolierten Einheiten aufnehmen kann. Um mehrere Aufnahmen zu erreichen, kann es möglich, einen tuberkuloseinfektion Draht in die Glaspipette statt einen einzelnen Draht Ag-Cl beschichtet sein. In diesem Fall wäre es notwendig, verwenden Sie eine Pipette mit einer größeren Spitze (30-60 µm, der typische Werkzeugspitze Ändern einer Tetrode) und lassen sich zum Jahresende ab, von der Spitze der Pipette.
Während bisher gemeldeten Optrodes oft, komplexe Fertigung16,17 erforderlich, entwickelten Magee und seinen Kollegen ein Optrode standard glaspipetten mit, wie wir mit den Optrode18entwickelt. In ihrer Methode stecken sie eine dünne Glasfaser die Pipette, das Licht zu liefern. Um die Faser dünn genug, um den Schaft der Pipette legen machen, geätzt sie 125 µm Verkleidung Faser mit 9 µm Kern auf einen Durchmesser von 8 – 10 µm an der Spitze. Der Vorteil dieser Methode ist, dass es auch für die gebogene Pipette gelten würde, die oft für Iontophorese verwendet wird. Allerdings wäre es schwer zu LED als Lichtquelle zu verwenden, da kommerzielle standard LEDs nicht ausreichender Lichtleistung über eine 9 µm Kern Faser erreichen würde.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Unterstützt wurden die Autoren von der Japan Society for Promotion of Science KAKENHI Grant JP16K11200 und 17 H 02223 und der Zuschuss für die Forschung von Kanazawa Medizinische Universität S2016-8 und C2017-3. Wir danken Yuhichi Kuda für seine Unterstützung bei der Aufnahme der Fotos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrode holder | Molecular Device | 1-HL-U | pipette holder for microelectrode amplifier |
| Ceramic split mating sleeve | Thorlabs | ADAF1 | f2.5 mm ferrule |
| Circuit board spacer | Teishin Denki | SPA-320 | f8.0 mm, 20.0 mm long |
| Stereotaxic frame for mice | Narishige | SR-6M-HT | Stereotaxic instruments for mice |
| Manipulator | Narishige | NA | Manual manipulator |
| Superbond | Sun Medical | M: 204610557 | Dental adhesive resin cement |
| Form2 | Formlabs | NA | 3D printer |
| Kwik-Sil | WPI | KWIK-SIL | Low toxicity silicone adhesive |
| Borosilicate glass capillaries | Narishige | GD-1.5 | OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 90.0 mm long |
| Fiber-optic patch cord | Doric Lenses | MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5 | Monofiberoptic patchcord, OD, 2.5 mm, core = 960 mm, cladding = 1000 mm, NA = 0.63 |
| Connectrized LED | Doric Lenses | LEDC-1B_FC | Central wave length = 465 nm, output power = 45 mW (Core 960 mm 0.63 NA ) |
| LED driver | Doric Lenses | LEDRV_1CH_1000 | 1 ch LED driver, maximum output = 1000 mA |
| Electrode puller | Narishige | PB-7 | Dual-stage glass micropipette puller |
| Borosilicate glass capillary | Narishige | GD-1.5 | Bolosilicate glass capillary, OD, 1.5mm, ID, 0.9 mm, 90.0 mm long |
| GENTACIN | MSD CO., Ltd | 185711173 | Antibiotic ointment |
| Terramycin®-LA | Zoetis | G 333 | Oxytetracycline |
| Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J | Jackson Labs | #14548 | VGAT-ChR2 mice |
| Multiclamp 700B | Molecular Devices | 2500-0157 | Microelectrode amplifier |
References
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