Summary
עבודה זו מציגה שיטה לבצע optogenetic יחיד-יחידת הקלטה אמינה מכל עכבר ער באמצעות optrode של זכוכית בהזמנה אישית.
Abstract
זה הדאגה העיקרית במדעי המוח שונה סוגי נוירונים עובדים את המעגלים העצביים. התפתחויות אחרונות optogenetics אפשרו את הזיהוי של הסוג עצביים בניסויים ויוו אלקטרופיזיולוגיות באזורים במוח רחבה. בניסויים optogenetics, חיוני כדי לספק את האור אל אתר הקלטה. עם זאת, קשה לעתים קרובות לספק את האור גירוי לאזורים מוחי עמוק ממשטח של המוח. במיוחד, קשה לאור גירוי להגיע אל האזורים מוחי עמוק כאשר שקיפות אופטית של המשטח המוח נמוך, כפי שקורה לעיתים קרובות עם הקלטות חיות ער. כאן, אנו מתארים שיטה כדי להקליט את ספייק אל האור של תגובות העכבר ער באמצעות optrode של זכוכית בהזמנה אישית. בשיטה זו, האור מועברת באמצעות אלקטרודת זכוכית ההקלטה כך ניתן לעורר בצורה אמינה נוירון שהוקלט עם אור באזורים מוחי עמוק. מערכת optrode לפי הזמנה זו כוללת חומרים נגיש וזול והוא קל להרכיב.
Introduction
מערכת העצבים המרכזית מורכבת מסוגים שונים של נוירונים, אשר יש פונקציות שונות. איך עובדים אלה סוגים שונים של נוירונים בתוך המעגל העצבי הוא אחד החששות העיקריים במדעי המוח. עם זאת, באזורים במוח רבים, עבר בלתי. אפשרי להבחין את סוגי עצביים ויוו בהקלטות של פעילויות חשמל כי אין הבדל ברור בתוך האות החשמלי ספייק עצמו, עם מספר חריגים. התפתחויות אחרונות optogenetics הפכו את פריצת הדרך1,2. באמצעות בעלי חיים מהונדס שבו רגישים לאור אופסין (למשל, channelrhodopsin-2) מתבטא בסוגי עצביים מסוימים, ניתן היה להבחין את סוגי עצביים יעיל בויוו הקלטות3, 45,,6. החיות הללו, הנוירונים עם רגישים לאור אופסין שמחים על ידי מתן גירויים קלים במהלך הקלטות חשמל, אך נוירונים אחרים אינם. הנוירונים אופסין-חיוביים, ולכן בקלות נבדלים סוגים אחרים נוירון על ידי תשובותיהן לאור.
בניסויים optogenetics, חיוני כדי לספק את האור אל אתר הקלטה. כמו שיטה לא פולשנית, האור מכוונת בדרך כלל מפני השטח של המוח. עם זאת, כי כוחו של האור מפחית כמו זה עובר דרך רקמת המוח, קשה לעורר את האזורים מוחי עמוק ממשטח של המוח. במיוחד, קשה לאור גירוי להגיע אל האזורים מוחי עמוק כאשר שקיפות אופטית של המשטח המוח נמוך, כפי שקורה לעיתים קרובות עם הקלטות חיות ער. ניסויים אלקטרופיזיולוגיות לעיתים קרובות בוצעו על חיות מורדם בגלל תנועת הגוף גורם רעש בהקלטות. כפי מתועד היטב, עם זאת, הרדמה ידוע כדי לשנות את תגובות עצביות7,8,9,10. לפיכך, יש צורך להשתמש בבעלי חיים ער ללימוד תגובות עצביות ללא השפעת הרדמה מלאכותי. בניגוד הניסויים בחיות מרדימים, ההקלטות אלקטרופיזיולוגיות מבוצעות לאחר ההחלמה מניתוח בניסויים בחיות ער. במהלך מרווח בין הניתוח ובין ההקלטות, תפליט רקמת לעיתים קרובות מצטבר על פני המוח והופכת את שקיפות אופטית של המשטח המוח נמוך.
כאן, אנו מתארים שיטה כדי להקליט הקלטות יחיד-יחידה העכבר ער באמצעות optrode של זכוכית בהזמנה אישית. בשיטה זו, האור מועברת באמצעות אלקטרודת זכוכית ההקלטה כך ניתן לעורר בצורה אמינה נוירון שהוקלט עם אור באזורים עמוקים במוח. מערכת optrode לפי הזמנה זו כוללת חומרים נגיש וזול והוא קל להרכיב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים נעשים על פי העקרונות המנחים של החברה פיזיולוגיים של יפן, באישור של בעלי חיים אכפת הוועדה של קנאזאווה רפואי האוניברסיטה.
1. בנייה של בעל Optrode זכוכית
הערה: כדי לבנות בעל optrode זכוכית, בעל אלקטרודה מסחרי משמש (איור 1 א').
- משוך בעדינות החוצה את צינור פלדה לבקרת לחץ מתוך לוע של המחזיק.
- על ידי קידוח, להרחיב את החור של הצד המושב סיכה בקנה של בעל. להפוך את החור 3 מ מ בקוטר של 12 מ מ עומק.
- לשים צינור פלדה אל חלד (3 מ מ בקוטר של 0.5 מ מ עובי, 8 מ"מ אורך; איור 1A 2) בתוך החור.
- הכנס קרמיקה לפצל שרוול ההזדווגות עבור ⌀2.5 ferrules מ מ (איור 1 א'1) לתוך החור.
- לתקן את החבית של בעל אלקטרודה rabbet בצורת L עם דבק אפוקסי.
- להפוך את החורים (3 מ מ קוטר) rabbet ולחבר אותו תחמן עם ברגים.
2. ראש פוסט התקנה
- להכין פוסט ראש לפי הזמנה של כרווח המעגל. להפוך את מרווח טורי המעגל לצורה cuboidal בחותך הטחינה, לחתוך אותו ל 2 פוסטים בראש עם מסור (איור 1B). לשטח בתחתית העמוד הראשי בחותך הטחינה.
- הכנת החיה מהונדס שבו מתבטאת אופסין רגישים לאור סוג של תא עצב מסוים לצורך המחקר. בעבודה זו, נעשה שימוש בעכבר הטרנסגניים (VGAT-ChR2 עכברים) שבו הנוירונים מעכבות אקספרס channelrhodopsin-2 (ChR2)11 .
- עזים ומתנגד החיה עם תערובת של 0.3 מ"ג/ק"ג של medetomidine, 4.0 מ"ג/ק"ג של midazolam ו- 5.0 מ"ג/ק"ג של butorphanol על ידי מינהל בקרום הבטן. כדי לוודא כי החיה. הוא מורדם לחלוטין, בדיקת התגובות שלה אל הזנב צובט.
- הנח את העכבר בתוך מסגרת stereotaxic על כרית החימום. נקי את המסגרת stereotaxic וחימום פאד עם אלכוהול 70% מראש. למקם את השיניים בתוך החור של שורת ביס, והדק בקלילות את המלחציים האף. לתקן את שני צידי הראש באמצעות האוזן ברים. כאשר הראש כראוי קבוע בסורגים האוזן, להדק את המלחציים האף. משחה אופטלמולוגיות חלות על העיניים.
- לגלח את העור ראש עם מספריים קטנות, לנקות את הקרקפת באמצעות מקלון צמר גפן של chlorhexidine gluconate. לפני הניתוח, לעקר את כל שמכשירי הניתוח וראש פוסט עם החיטוי (121 מעלות, 15 דקות).
- לחתוך את הקרקפת לאורך הקו האמצעי עם מספריים ודחף אותו הצידה. לבצע את החתך מהחלק האחורי של הראש לעיניים (כ 20 מ מ). הסרת קרום העצם באמצעות מקלון צמר גפן טבול באלכוהול 70% ויבש את הגולגולת.
- לצרף את ההודעה לראש manipulator. מקם את ההודעה ראש שטוח על הגולגולת סביב bregma באמצעות manipulator.
- מערבבים את מונומר (4 טיפות), זרז (טיפה 1) ופולימר (1 כף קטנה) של מלט שיניים בצלחת קטנה זה הוא מקורר במקרר מראש. לשים את הבטון שיניים (להלן 1 g) על המצח ועל עצם הקודקוד של הגולגולת כדי לתקן את ההודעה לראש בגולגולת.
- לאחר הבטון שיניים נעשה קשה להסיר את העכבר המסגרת stereotaxic. לשים משחה לאנטיביוטיקה על העור החשוף. להזריק את medetomidine אנטגוניסט (0.3 מ"ג/ק"ג), האנטיביוטיקה (oxytetracycline; 20 מ"ג/ק"ג). מקום לנטר את העכבר על משטח חום בתוך כלוב עד התעורר ו להחזיר אותו לכלוב דיור.
- בית החיה בכלוב למגורים נפרדים עם איזה מכשיר העשרה. לשנות את הנייר בעלי חיים מצעים כל יום כדי לשמור על ניקיון הכלוב ולמנוע זיהום. בזהירות לפקח אם החיה מראה סימנים של אי נוחות. להחיל לידוקאין הפצע אם חשוד בשום כאב. מנהל meloxicam או carprofen פעם אחת בכל 24 שעות במשך 48 שעות אחרי שני בראש פוסט ניתוחי התקנה של גולגולת. הלידוקאין המקומי יכול להינתן בנוסף אם NSAID אינה מספיקה.
3. להתאקלמות
- שני ימים (לפחות) לאחר ההתאוששות מן ההרדמה, להתאקלם החיות למצב שבו הראש-קבוע בבית הבליעה הקלטה. לבצע את ההפעלות להתאקלמות למשך 5 ימים לפחות.
- במהלך המפגשים והפיזיולוגי, להכניס החיה בבית הבליעה הקלטה עם הדואר ראש קבוע כדי מלחציים לפי הזמנה. במהלך ההפעלה, כדי להגביל את התנועה, כיסוי הגוף בעזרת צינור חצי שרף בהזמנה אישית (איור 1C), עשה שימוש במדפסת תלת-ממד.
הערה: ביום 1, הפעלת להתאקלמות צריך להיות ארוך 5 דקות. זה ואז גדל מדי יום כדי 10, 20, 40 ו- 60 דקות ימים 2, 3, 4 ו-5, בהתאמה. - בסוף כל מפגש, תן החיה לפרס של אוכל. אם החיה נאבק באופן רציף במהלך להתאקלמות, להפסיק את ההפעלה.
4. גולגולת
הערה: לאחר והפיזיולוגי, גולגולת נעשית השתלטה על האזור במוח להקלטה. הניתוח מבוצע במסגרת stereotaxic תחת הרדמה, כמו עם הראש פוסט ההתקנה. ההליך פעולה-מאוחרת זה אותו הדבר כמו הראש פוסט התקנה
- לפני הניתוח, ינקה את הגולגולת באמצעות מקלון צמר גפן עם chlorhexidine gluconate ו- 70% אלכוהול.
- בזהירות לגרד את הגולגולת מעל האתר הקלטה עם מקדח שיניים. כאשר העצם הופכת מספיק דק, חותכים את זה עם קצה האזמל ולהסיר אותו.
- לשים מלט שיניים באזור חשוף על מנת לחזק את הגולגולת.
- לכסות את האזור במוח חשוף עם דבק סיליקון לאחר הבטון שיניים נעשה קשה. הנוהל לאחר הניתוח הוא כפי שמתואר בשלב 2.8.
5. אלקטרופיזיולוגיות הקלטה
- לאפשר את החיה להתאושש במשך לפחות יום אחד לאחר הניתוח לפני ביצוע ההקלטה אלקטרופיזיולוגיות. למקם את החיה בבית הבליעה הקלטה באותה דרך שזה נעשה במהלך המפגשים להתאקלמות מתי התחלת הקלטת.
- להפוך פיפטות זכוכית של נימים זכוכית בורוסיליקט (OD = 1.5 מ מ, ID = 0.9 מ מ, 90.0 מ"מ) של פולר אלקטרודה. קוטר עצה שלהם היא 3-2 מיקרומטר, ההתנגדות שלהם הוא 4-6 MΩ כאשר הם מלאים 10 מ ל- PBS. האורך של האלקטרודה הוא 40 – 50 מ מ. בכמה הקלטות, 2% neurobiotin נוסף של 10 מ ל- PBS.
- לצרף את פיפטה מזכוכית מלא בעל optrode בהזמנה אישית.
- מכניסים את החוט כסף Ag-Cl מצופה (0.2 מ"מ קוטר) פיפטה מזכוכית. לחבר את החוט כסף מספר הזיהוי האישי שלך באמצעות חוט חשמל דק מצופה. לחבר את ה-pin headstage של המגבר הקלטה.
- חבר את כבל סיבים אופטיים תיקון (הליבה = 960 מיקרומטר, חיפוי = 1,000 מיקרומטר, NA = 0.63) עם ferrule זרקוניה (OD = 2.5 מ מ) כדי הפיצול ההזדווגות שרוול על בעל optrode. דחוף את תיקון כבל לתוך השרוול עד קצה ferrule הקשר האחורי של פיפטה מזכוכית. תיקון כבל מספק את האור (אורך גל = 465 nm) מ LED. נורית ה-LED נשלטת על ידי נהג LED ערוץ אחד.
- הסר את דבק סיליקון מעל הניתוח. במקום ומחוממת תמיסת מלח (38 ° C) על פני המוח מעת לעת כדי למנוע את פני השטח של המוח ייבוש במהלך להקלטות. במידת הצורך, הסר את השכבה הקשה של המוח עם פינצטה חדה.
- הכנס את אלקטרודת זכוכית רקמת המוח עם תחמן. נטר את ההתנגדות אלקטרודה הוספתו. החלף את האלקטרודה כאשר ההתנגדות היא נמוכים מהמצופה כי קצה האלקטרודה עלולים להינזק. בעומק של עניין, חיפוש ולבודד את הקוצים יחידה על-ידי התאמת העומק בשלבים 2-5 מיקרומטר.
- לאחר היחידה מבודדת, לספק נורית ה-LED ולבחון את התגובה לגירויים קלים.
- להקליט את פעילות עצבית לאחר הזיהוי של סוגי תאים. לבצע ההקלטות עבור 2-3 h. אם ההקלטה מתבצעת על ימים רצופים (מקסימום של 2 ימים), לכסות את הניתוח עם דבק סיליקון. בעת ההקלטה הסתיימה, החיה הוא הקריב, לאחזר את ההודעה לראש ושם אותו בתוך אצטון לשטוף ולהשתמש מחדש זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 2, בדקנו את ההשפעות של גודל הטיפ ואורך פיפטות זכוכית על כוח האור בקצה מדי סוכר (איור 2 א-ב'). אור החשמל נמדדה על ידי מד הכוח האופטי להציב 1 מ"מ מן הקצה. אורך מלא הוגדר 50 ± 2 מ מ כאשר גודל קצה מגוונים, ואילו גודל קצה הוגדר 2.5 מיקרומטר כאשר אורך מלא מגוונות. הדוקרן של פיפטה מזכוכית הוגדר 8 מ מ. הכוח אור בקצה נע בין 3-5 מגוואט (זאת אומרת ± SD; איור 2A: 3.77 ± 0.29 mW, n = 20; איור 2B: 4.24 ± 0.31 mW, n = 21). גודל קצה (איור 2 א) מדי סוכר בקושי היה בקורלציה עם הכוח אור (R = 0.1555). אורך פיפטה היה רק במעט בקורלציה עם הכוח אור בצורה נגטיבית (R =-0.2054). תוצאות אלו מראים כי הטיפ ואורך פיפטות לעיתים רחוקות להשפיע הכוח אור בקצה. בדקנו גם אם מידת נפח טעינה של הפתרון (10 מ ל- PBS) בפיפטות זכוכית משפיע על כוח אור (איור 2C). הנפח של הפתרון הוערך לפי האורך של הפתרון פיפטה. הנתונים נרשמו של מדי סוכר 4 (עצה גודל: 0.25 מיקרומטר, באורך מלא: 50 ± 2 מ מ, אורך הסכין: 8 מ מ). מצאנו כי שינוי הנפח של הפתרון פיפטה לא השפיע על הכוח אור (איור 2C).
איור 3, אנו מראים את התגובות ספייק טלקוה רקתי נחות (IC) של VGAT-ChR2 ער עכברים (בן 2-4 חודשים). IC הוא מרכז השמיעה במוח התיכון והיא מורכבת glutamatergic של הנוירונים GABAergic12,13, אשר שניהם מגיבים קול3,4. בעכברים IC של VGAT-ChR2, הנוירונים GABAergic לבטא במפורש ChR24. בעבודה הקודמת, זה הוצג כי הנוירונים GABAergic ו- glutamatergic היו נרגשים או מדוכא, בהתאמה, כאשר ניתנו להם גירויים אור3,4. בעכברים ער, מצאנו שני סוגי נוירונים (איור 3 א-ב'). כאשר הגירוי אור מועבר דרך אלקטרודת זכוכית, זה עורר תגובות ספייק של נוירונים מסוימים (איור 3 א). לעומת זאת, בנוירונים אחרים, הגירויים קלות לדכא את התגובות ספייק עורר על ידי גירויים קול (איור 3B). תוצאות אלו מראות כי-optrode זכוכית ניתן להקליט את פעילות יחידה מבודדת היטב, בצורה אמינה לעורר את הנוירונים המוקלט על-ידי אור.
איור 1: מחזיק Optrode ואביזרים הקלטה. פאנלים (A) ו- (B) הצג בעל optrode. לוח (A) מציגה את מבנה החלק של בעל optrode. (1) זה פיצול קרמיקה ההזדווגות שרוול. (2). זהו צינור פלדה אל חלד. (3) זה חבית של בעל. (4). זה מנקה חרוט. 5 (5) זה כובע פוליקרבונט. החלונית ' (B) מציגה המחזיק optrode מורכבים. Panels (C) ו- (ד) הצג את ההודעה לראש לפי הזמנה. החלונית ' (C) מציגה מבט צד של העמוד הראשי. החלונית ' (D) מציגה מבט עקיפה של העמוד הראשי. ההודעות בראש שני (מימין) עשויים כרווח המעגל (משמאל). פאנלים (E), (F), ו (G) להראות את הצינור חצי שרף בהזמנה אישית. פאנלים (E), ציורים תלת-ממדי הצג (F) של הצינור חצי שרף. החלונית ' (E) מציגה מבט קדמי של הצינור חצי שרף. לוח (F) מראה תצוגה בצד של הצינור חצי שרף. החלונית ' (G) מציגה תמונת צילום של הצינור חצי. המספרים לוחות (E) ו- (F) מצביעים על מידות הציור במ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: השפעת התצורה של פיפטות זכוכית על הכוח אור בקצה. (א) הטיפ של הגודל היה המותווה נגד כוח האור. באורך מלא של פיפטה הוגדר ל 50 ± 2 מ מ. אורך הדוקרן נקבע ל 8 מ מ. (B) אורך פיפטה היה המותווה נגד כוח האור. גודל קצה הוגדר מיקרומטר 0.25. אורך הדוקרן נקבע ל 8 מ מ. (ג) זה לוח מראה את השפעת עומס נפח של הפתרון (10 מ ל- PBS) מטען. הנתונים מכל 4 פיפטות מסומנים באמצעות סמלים שונים וקווים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : התגובות אור-עורר IC של עכברים ער VGAT-ChR2. (א) לאור גירויים (הקופסא הכחולה, 0.03 s) עורר תגובות ספייק. (B) האור גירויים (הקופסא הכחולה, 0.03 s) לדכא את התגובות ספייק עורר על ידי קול (תיבת אפור). עקבות 3 העליון הן התגובה להישמע, עקבות 3 התחתון הם התגובה כאשר צליל ואור ניתנו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optogenetics הפך להיות כלי רב עוצמה במדעי המוח. היא ניצלה זיהוי נוירון מסוים סוגי ויוו , כמו גם מניפולציה הפעילות של מסלולים עצביים מסוימים. ההבהרה של הפעילות העצבית של סוגים עצביים שונים מקדם את ההבנה של המנגנון של מעגלים עצביים. כאן, אנחנו הפגינו שיטה להעברת האור לאתר הקלטה דרך אלקטרודת זכוכית ב IC של עכברים VGAT-ChR2 ער.
ישנם מספר שלבים קריטיים השיטה המתוארת. ראשית, זו דרישה לשימוש בבעלי חיים עם ביטוי מספיק וספציפיות של opsins של הנוירונים היעד. כדי לזהות את התגובות אור עם הקלטות חוץ-תאית, יש צורך כי הפעלת אופסין מעורר הקוצים בתוך הנוירונים היעד. ב זנים הטרנסגניים מסוימים, זה אפשרי כי רמת ביטוי transgene בנוירונים היא נמוכה אפרוחי14, אולי יש גיל מינימום לניסוי. יתרה מזאת, יתכן צורך לבצע ניסויים נוספים כדי לאשר אם התגובות לגירויים קלים הספציפיים לסוגי נוירון המטרה (למשל, אימונוהיסטוכימיה). כאשר נוירון המטרה סינאפסות, זה יהיה צורך להבחין את התגובות עורר ישירות מכל התגובות עורר synaptically, אשר יכול להיעשות על ידי קביעת סף ההשהיה של התגובה. שנית, זה חיוני כדי להבטיח רקמת המוח נקי ככל האפשר. תחזוקה של ניקיון נדרש במיוחד על מנת למנוע דימום במהלך את הניתוח, את ההקלטות. בנוסף, פני השטח של המוח יש למנוע ייבוש לאחר הניתוח על ידי כיסוי השטח הדוק עם דבק סיליקון.
כדי לספק את האור בצורה יעילה מהקצה אלקטרודה, חיוני כדי לצמצם את אובדן בנתיב האופטי. בתצורה שלנו של optrode, אור החשמל טיפות פי עשרה הכנסתם למחזיק אלקטרודה: הכוח אור הוא 45 מגוואט בקצה של חוט תיקון סיבים אופטיים, בעוד 3-5 מגוואט בקצה פיפטה מזכוכית. כפי שניתן לראות את התוצאות, את גודל קצה ואת אורך מלא לא השפיעה הכוח אור בקצה (איור 2). תוצאות אלו ציינו כי הנחתה האור היה יציבים למדי ללא קשר לתצורת פיפטה מזכוכית. זו הנחתה בהיר לא משנה בהקלטה של IC הנוירונים בעכברים VGAT-ChR2 כי אישרנו שזה אפשרי להקליט קוצים מופעל אור בקצה הגחון (2 מ מ עומק) של IC, למרות שלעיתים זה חשוב בתצורות הקלטה אחרים. יהיה קשה להפחית את הנחתה אור באופן דרמטי, אבל אולי יש אפשרויות לשיפור. קודם כל, זה עשוי להיות יעיל להשתמש בקוורץ במקום זכוכית בורוסיליקט כמו פיפטה אלקטרודה. זה ידוע כי קוורץ יש יותר אור מוליכות, כך זה עשוי להפחית את אובדן אור באמצעות אלקטרודה ה-15. כמו כן, דווח כי הפולני של סוף פיפטה צמצם אובדן אור על פני קשר בין תיקון כבל15פיפטה. אם השיפור הנחתה האור אינה מספיקה, זה יהיה יעיל להשתמש בלייזר במקום LED, למרות לייזר עולה יותר הוביל.
אחד היתרונות של האלקטרודה פיפטה מזכוכית הוא שניתן לבצע הליכים היסטולוגית על-ידי הוספת המשדרים או כווקטורים הפתרון מילוי. ההליכים היסטולוגית יוסיף הרבה מאוד מידע שימושי (המיקום של ההקלטה), המורפולוגיה של מוקלטת הנוירון, וכו '.הנתונים אלקטרופיזיולוגיות. כמו כן, נמסר שניתן לבצע סקרים תרופתי באמצעות את אלקטרודת זכוכית עם חוסמי פתרון מילוי15. בניגוד יתרונות אלו, המגבלה של האלקטרודה פיפטה מזכוכית היא כי זה לא יכול להקליט מספר יחידות מבודדות. כדי להשיג הקלטות מרובים, ייתכן שתהיה אפשרות להכניס חוט tetrode פיפטה מזכוכית במקום חוט מצופה Cl-Ag בודד. במקרה זה, זה יהיה צורך להשתמש פיפטה עם מידה טיפ גדול יותר (מיקרומטר 30 – 60, עצה טיפוסי לגודל tetrode) ולתת סוף tetrode החוצה מקצה פיפטה.
בעוד optrodes שדווחה בעבר נדרש לעיתים קרובות ייצור מורכבים16,17, מגי ועמיתיו פיתחו את optrode באמצעות פיפטות זכוכית רגילה כפי עם optrode עיצבנו18. השיטה שלהם, הם הכנס של סיב אופטי דק פיפטה להעביר את האור. כדי להפוך את סיב דק מספיק כדי להכניס את הדוקרן של פיפטה, הם חרוט 125 µm חיפוי סיבים עם גרעין מיקרומטר 9 כדי בקוטר של 8-10 מיקרומטר בקצה. היתרון של שיטה זו הוא כי זה חלים גם על פיפטה כפופות זה משמש לעתים קרובות iontophoresis. עם זאת, ייתכן קשה להשתמש LED כמקור אור כי רגיל נוריות מסחרי לא להשיג מספיק כוח האור באמצעות מיקרומטר 9 ליבת סיבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים נתמכו על ידי החברה יפן 17H 02223 של קידום המדע KAKENHI גרנט JP16K11200, המענק לחקר מ קנאזאווה רפואי באוניברסיטת S2016-8 ו- C2017-3. אנו מודים Yuhichi מלון התמיכה שלו לקחת את התמונות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrode holder | Molecular Device | 1-HL-U | pipette holder for microelectrode amplifier |
| Ceramic split mating sleeve | Thorlabs | ADAF1 | f2.5 mm ferrule |
| Circuit board spacer | Teishin Denki | SPA-320 | f8.0 mm, 20.0 mm long |
| Stereotaxic frame for mice | Narishige | SR-6M-HT | Stereotaxic instruments for mice |
| Manipulator | Narishige | NA | Manual manipulator |
| Superbond | Sun Medical | M: 204610557 | Dental adhesive resin cement |
| Form2 | Formlabs | NA | 3D printer |
| Kwik-Sil | WPI | KWIK-SIL | Low toxicity silicone adhesive |
| Borosilicate glass capillaries | Narishige | GD-1.5 | OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 90.0 mm long |
| Fiber-optic patch cord | Doric Lenses | MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5 | Monofiberoptic patchcord, OD, 2.5 mm, core = 960 mm, cladding = 1000 mm, NA = 0.63 |
| Connectrized LED | Doric Lenses | LEDC-1B_FC | Central wave length = 465 nm, output power = 45 mW (Core 960 mm 0.63 NA ) |
| LED driver | Doric Lenses | LEDRV_1CH_1000 | 1 ch LED driver, maximum output = 1000 mA |
| Electrode puller | Narishige | PB-7 | Dual-stage glass micropipette puller |
| Borosilicate glass capillary | Narishige | GD-1.5 | Bolosilicate glass capillary, OD, 1.5mm, ID, 0.9 mm, 90.0 mm long |
| GENTACIN | MSD CO., Ltd | 185711173 | Antibiotic ointment |
| Terramycin®-LA | Zoetis | G 333 | Oxytetracycline |
| Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J | Jackson Labs | #14548 | VGAT-ChR2 mice |
| Multiclamp 700B | Molecular Devices | 2500-0157 | Microelectrode amplifier |
References
- Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K.
- Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216 (2015).
- Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Identified GABAergic and glutamatergic neurons in the mouse inferior colliculus share similar response properties. Journal of Neuroscience. 37 (37), 8952-8964 (2017).
- Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Long-lasting sound-evoked afterdischarge in the auditory midbrain. Scientific Reports. 6, 20757 (2016).
- Munoz, W., Tremblay, R., Rudy, B. Channelrhodopsin-assisted patching: in vivo recording of genetically and morphologically identified neurons throughout the brain. Cell Reports. 9 (6), 2304-2316 (2014).
- Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4 (7), e6099 (2009).
- Kuwada, S., Batra, R., Stanford, T. R. Monaural and binaural response properties of neurons in the inferior colliculus of the rabbit: effects of sodium pentobarbital. Journal of Neurophysiology. 61 (2), 269-282 (1989).
- Populin, L. C. Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus. Journal of Neuroscience. 25 (25), 5903-5914 (2005).
- Duque, D., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects. Brain Structure and Function. 220 (6), 3385-3398 (2015).
- Cai, R., Richardson, B. D., Caspary, D. M. Responses to predictable versus random temporally complex stimuli from single units in auditory thalamus: impact of aging and anesthesia. Journal of Neuroscience. 36 (41), 10696-10706 (2016).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
- Ito, T., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Two classes of GABAergic neurons in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 29 (44), 13860-13869 (2009).
- Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties. Neuroscience Research. 51 (4), 475-492 (2005).
- Chen, Q., et al. Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice. Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).
- Hirai, Y., Nishino, E., Ohmori, H. Simultaneous recording of fluorescence and electrical signals by photometric patch electrode in deep brain regions in vivo. Journal of Neurophysiology. 113 (10), 3930-3942 (2015).
- LeChasseur, Y., et al. A microprobe for parallel optical and electrical recordings from single neurons in vivo. Nature Methods. 8 (4), 319-325 (2011).
- Abaya, T. V., Blair, S., Tathireddy, P., Rieth, L., Solzbacher, F. A 3D glass optrode array for optical neural stimulation. Biomedical Optics Express. 3 (12), 3087-3104 (2012).
- Bittner, K. C., et al. Conjunctive input processing drives feature selectivity in hippocampal CA1 neurons. Nature Neuroscience. 18 (8), 1133-1142 (2015).
