Summary
この作品は、特注ガラス optrode を使用して目を覚ましマウスから確実に記録光単一ユニットを実行するメソッドを紹介します。
Abstract
それはどのように異なる神経科学における主要な関心事は種類のニューロンは、神経回路の動作します。光遺伝学の最近の進歩は、広範な脳領域における生体内の電気生理学的実験で神経のタイプの id を有効にしています。光遺伝学実験、記録サイトへ光を提供しますが重要です。しかし、脳の表面から深い脳の領域に刺激ライトを提供するは難しいですよく。特に、目がさめている動物からの録音の場合は、しばしば、脳表面の光透過性が低く、脳深部の領域に到達する光線への刺激は困難です。ここでは、オーダーメイド ガラス optrode を使用して目を覚ましマウスから光にスパイク応答を記録する方法をについて説明します。この方法で光は確実に脳深部領域における光と記録されたニューロンを刺激できるように記録ガラス電極を介して配信されます。このカスタムメイドの optrode システムはアクセス可能で、安価な材料で構成されています、組み立てやすい。
Introduction
中枢神経系のニューロンは、異なる機能を持つさまざまな種類で構成されます。神経回路内のニューロンのこれらの異なったタイプの仕組みは、神経科学における主要な関心事の一つです。しかし、脳の多くの地域で解除されたいくつかの例外を除いて電気スパイク信号自体に明確な違いはありませんので、電気活動の生体内での録音で神経の種類を区別すること。光遺伝学の最近の進歩は画期的な1,2にしました。神経細胞の特定の種類の光に敏感なオプシン (例えばチャネルロドプシン 2) を表現するトランスジェニック動物を使用して、効率的に体内録音3,の神経の種類を区別するために可能になった4,5,6。これらの動物で光に敏感なオプシンとニューロンの電気録音中に軽い刺激を与えることによって興奮しているが、他のニューロンはないです。オプシン陽性ニューロン、したがって、簡単に区別される他のニューロン タイプ光への応答。
光遺伝学実験、記録サイトへ光を提供しますが重要です。非侵襲的な方法として光はしばしば脳の表面から送られます。しかし、それは脳組織を通過、ライトの強度が低下するため、脳の表面から深い脳の領域を刺激するは難しいです。特に、目がさめている動物からの録音の場合は、しばしば、脳表面の光透過性が低く、脳深部の領域に到達する光線への刺激は困難です。電気生理学的実験はしばしば麻酔下の動物の体の動きの録音にノイズが発生するため行われています。よく説明されています、しかし、麻酔は神経応答7,8,9,10を変更する知られています。したがって、麻酔の人工効果なし神経反応を研究するために目がさめている動物を使用する必要があります。麻酔下の動物実験とは異なり、電気生理学的記録は目を覚まし動物による実験で手術からの回復後実行されます。手術と録音の間隔中に組織の滲出液はしばしば脳表面に溜まるし、低脳表面の光透過性になります。
ここでは、オーダーメイド ガラス optrode を使用して目を覚ましマウスから単体録音を記録する手法について述べる。この方法で光は確実に脳深部領域における光と記録されたニューロンを刺激できるように記録ガラス電極を介して配信されます。このカスタムメイドの optrode システムはアクセス可能で、安価な材料で構成されています、組み立てやすい。
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Protocol
すべてのプロシージャは、日本生理学会の動物ケア委員会の金沢医科大学の承認の原則に従って行われます。
1. ガラスの Optrode ホルダーの建設
注: ガラス optrode ホルダーを構築する商業電極ホルダーは使用 (図 1 a)。
- ホルダーのバレルから圧力制御用鋼管を優しく引き出します。
- ドリル、ホルダーのバレルのピン シート側の穴を広げます。深さ 3 mm 直径 12 mm の穴を作る。
- (直径 3 mm、厚さ 0.5 mm、長さ 8 mm のステンレス製パイプを入れてください。図 1A2) 穴の中。
- セラミックの穴に合うスリーブ ⌀2.5 mm フェルール (図 1 a1) を分割を挿入します。
- エポキシ接着剤で L 字の留めに電極ホルダーのバレルを固定します。
- これをネジを有するマニピュレーターに添付して、留めの穴 (直径 3 mm) を作る。
2. 頭ポスト インストール
- 回路基板スペーサー製特注ヘッド ポストを準備します。フライス カッター立方形に柱状の回路基板のスペーサーを作るし、2 頭の記事に (図 1 b) のこぎりで切ってください。フライス カッター ヘッドの記事の下部を平らにします。
- 研究のための特定のニューロン タイプで光に敏感なオプシンを表現する遺伝子組換え動物を準備します。この作品は、抑制性ニューロンがチャネルロドプシン 2 (ChR2)11を表現するトランスジェニック マウス (ChR2 vgat ノックアウト マウス) が使用されます。
- 腹腔内投与によって 0.3 mg/kg のメデトミジン、ミダゾラム、4.0 mg/kg とブトルファノールの 5.0 mg/kg の混合物を持つ動物を麻酔します。動物に麻酔が完全にかかることを確認、摘心を末尾にその反応をテストします。
- 脳定位固定装置フレーム加熱パッドの上にマウスを配置します。きれいな脳定位固定フレームと加熱パッド 70% アルコールで事前にします。一口バーの穴に歯を置き、軽く鼻クランプを締めます。耳バーを使用して頭の両側を修正します。頭は、耳バーで固定されて正しく、鼻クランプを締めます。眼軟膏を目に適用されます。
- 小さなハサミで頭の皮膚を剃るし、グルコン酸クロルヘキシジンの綿棒を使って頭皮をきれい。手術前に手術器具と頭のオートクレーブ (121 ° C、15 分) にポストすべての殺菌をします。
- 正中線に沿って頭皮をハサミで切って、脇に押し込みます。目 (約 20 mm) に頭の後ろから切開を行います。70% アルコールに浸した綿棒で骨膜を削除し、頭蓋骨を乾燥します。
- マニピュレーターに頭ポストを取り付けます。マニピュレーターを使用して前の周りの頭蓋骨の上に平ら頭のポストを配置します。
- モノマー (4 滴)、触媒 (1 滴)、事前に冷蔵庫で冷やして、小さな皿に歯科用セメントのポリマー (小サジ 1 杯) を混ぜます。前頭葉と頭蓋骨にヘッドの記事を修正する頭蓋骨の頭頂骨 (1 g) の下の歯科用セメントを置きます。
- 歯科用セメントは、ハードになると、脳定位固定装置のフレームから、マウスを削除します。露出した皮膚に抗生物質軟膏を置きます。メデトミジン拮抗薬 (0.3 mg/kg) と抗生物質 (オキシテトラサイクリン; 20 の mg/kg) を挿入します。配置およびそれが目を覚ますまでケージの熱パッドの上でマウスを監視し、住宅ケージに戻る。
- いくつかの濃縮デバイスの個々 の住宅檻の中の動物の家。動物紙毎日ケージをきれいに保ち、感染を防ぐために寝具を変更します。動物は、不快感の兆候を示して かどうかを注意深く監視します。のどの痛みが疑われる場合は、リドカイン、傷に適用されます。管理メロキシカムとカルプロフェン一度 48 h 両方頭ポスト インストールと開頭手術後のすべての 24 h。NSAID が適切でない場合、リドカインをさらに与えることができます。
3. 馴化
- (最小) の 2 日後、麻酔からの回復は、録音室で頭固定状態に動物を順応させます。少なくとも 5 日間馴化セッションを実行します。
- 順化セッション中に特注クランプに固定ヘッドのポスト記録室に動物を配置します。運動を制限するために、セッション中に 3 D プリンターを使用して製のカバー オーダーメイド ガレージの半分管 (図 1) が付いているボディ。
注: 1 日に順化セッションは 5 分長いをする必要があります。それは、毎日増加した 10、20、40、60 分に日間、2、3、4、および 5、それぞれ。 - 各セッションの終わりに、動物食糧報酬を与えます。動物の闘争、順化中も常に、セッションを停止します。
4. 開
注: 順化後に開頭術は録音のための脳の領域で行われます。頭でポスト インストールとして、麻酔下で脳定位固定装置のフレームで、開頭術を行います。頭ポスト インストール後の操作手順は同じです。
- 開頭手術前にクロルヘキシジン ・ グルコン酸と 70% アルコールと綿棒で頭蓋骨をきれいに。
- 慎重に記録サイトに歯科用のドリルで頭蓋骨をこすり。骨が十分に薄くなったら、メスの先端でカット、それを取り外します。
- 頭蓋骨を強化するために公開されている地域歯科用セメントを置きます。
- 歯科用セメントは、ハードになった後は、シリコーン接着剤で露出した脳領域をカバーします。2.8 の手順で説明した手術後の手順です。
5. 電気生理学的記録
- 電気生理学的記録を実行する前に開頭手術後少なくとも 1 日回復する動物を許可します。それはときに記録が開始順化セッション中に行われた同じ方法で録音室に動物を配置します。
- ガラス ピペット ホウケイ酸ガラス管を作る (外径 1.5 mm、ID を = = 0.9 mm、長さ 90.0 mm) 電極引き手を引いた。その先端径は 2-3 μ m と、彼ら 10 mM PBS で満ちているとき、彼らの抵抗は 4-6 MΩ。電極の長さは 40 – 50 mm です。いくつかの録音で 2 %neurobiotin は 10 mM PBS に追加されます。
- ガラス ピペットをカスタムメイド optrode ホルダーに取り付けます。
- ガラス ピペットに Ag Cl コーティング シルバー ワイヤ (直径 0.2 mm) を置きます。ピンを介して薄膜被覆電線に銀線を接続します。録音アンプのパッチアンプ用アダプターにピンを接続します。
- 光ファイバー パッチコードを接続 (コア = 960 μ m クラッド = 1,000 μ m、NA = 0.63) ジルコニア フェルールと (OD = 2.5 mm) optrode ホルダーのスリーブを交配分割します。フェルールの先端ガラス ピペットの背面に接触するまで、袖にパッチ ケーブルを押し込みます。パッチ コード提供光 (波長 = 465 nm) LED から。LED の光は、シングル チャネル LED ドライバーによって制御されます。
- 直上にシリコーン粘着剤を削除します。入れて温めた生理食塩水 (38 ° C) 脳表面の記録セッション中に乾燥を防ぐために定期的に脳の表面。必要な場合は、鋭いピンセットで硬膜を削除します。
- マニピュレーターと脳組織にガラス電極を挿入します。挿入されたときは、電極抵抗を監視します。抵抗は電極の先端が破損する場合がありますので予想以上に低い場合、電極を取り付けます。関心の深さで検索し、2 に 5 μ m のステップでの深さを調整することによって 1 つの単位のスパイクを分離します。
- 単一のユニットを分離後、LED ライトを提供、光刺激への応答を観察します。
- 細胞の種類の同定後神経活動を記録します。2-3 h の録音を実行します。記録を (最大 2 日間) の連続した日に行った場合は、シリコーン接着剤で開頭手術をカバーしてください。録音を終了すると、動物が犠牲になると、ヘッドの記事を取得し、アセトン洗浄し、再利用に入れてください。
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Representative Results
図 2先端径の影響とガラス ピペット ピペット (図 2 a・B) の先端に光パワーでの長さを調べた。光のパワーは、先端から 1 mm を配置光パワーメータで測定しました。先端サイズを変えた、フルの長さを変化させた場合、先端サイズは 2.5 μ m に設定されている場合、全長は 50 ± 2 mm に設定されました。ガラス ピペットのシャンクは、8 mm に設定されました。3-5 mW (平均 ± SD; から先端の光図 2 a: 3.77 ± 0.29 mW, n = 20;図 2 b: 4.24 ± 0.31 mW、 n = 21)。ピペットの先端サイズ (図 2 a) はほとんど光のパワーとの相関 (R = 0.1555)。ピペットの長さは少しだけ否定的な方法で光のパワーとの相関 (R =-0.2054)。ヒントと、ピペットの長さほとんど先端に光のパワーを影響が示唆されました。我々 はまた、ガラス ピペットで溶液 (10 mM) のボリューム負荷量 (図 2) の光のパワーに影響を与えるかどうかをチェックしました。溶液の量をピペットで溶液の長さによって評価しました。4 ピペットから記録されたデータ (先端サイズ: 0.25 μ m、全長: 50 ± 2 mm、シャンクの長さ: 8 mm)。ピペットで溶液の量を変化させる (図 2) の光のパワーに影響はないことがわかった。
図 3、目がさめている vgat ノックアウト ChR2 マウス (2-4 ヶ月) の下の丘 (IC) に記録されたスパイク応答を示す.IC は中脳の聴覚センターとサウンド3,4対応のグルタミン酸作動性の gaba 作動性ニューロン12,13, で構成されています。IC vgat ノックアウト ChR2 マウスにおける gaba 作動性ニューロンは具体的に ChR24を表現します。前作、Gaba およびグルタミン酸作動性ニューロンが興奮されたり、光刺激3,4を与えられたとき、それぞれ抑制が示されました。覚醒マウス神経細胞 (図 3 a・B) の両方のタイプを発見しました。光の刺激は、ガラス電極を介して配信されます、いくつかのニューロン (図 3 a) のスパイク応答が誘発されます。対照的に、他のニューロンの光刺激は (図 3 b) 音音刺激に対する誘発スパイク応答を抑制しました。これらの結果を示すガラスの optrode が十分に独立した単一のユニット活動を記録でき、確実に光で記録された神経細胞を刺激します。
図 1:Optrode ホルダーと記録アクセサリー 。パネル (A) と (B) を optrode ホルダー。(A) パネルは、optrode ホルダーの部分の構造を示しています。(1) これはセラミック分割スリーブを交配します。(2) これは、ステンレス鋼チューブです。(3) ホルダーのバレルです。(4) これは円錐ワッシャーです。(5) これはポリカーボネート キャップです。パネル (B) では、組み立てられた optrode ホルダーを示しています。Panels (C) と (D) は、特注の頭部のポストを示しています。パネル (C) は、頭部のポストの側面図を示しています。(D) パネルは、頭役の斜めビューを示します。(右) の 2 つ頭の記事は (左) 基板スペーサーから作られています。パネル (E), (F), (G) オーダーメイド ガレージの半分管の表示。パネル (E) と (F) 樹脂の半分管の寸法図を表示します。(E) パネルは、樹脂の半分管のフロント ビューを示します。パネル (F) は、樹脂の半分管の側面図を示しています。パネル (G) には、半分の管の写真画像が表示されます。(E) パネルの番号 (F) mm で図面の寸法を示すとこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:ガラス ピペットの構成の先端に光パワーに及ぼす影響します。(A) 先端のサイズが光の力に対してプロットしました。ピペットの全長は 50 ± に設定された 2 mm。シャンクの長さ開設する 8 mm (B)、ピペットの長さは光に対してプロットしました。先端サイズは 0.25 μ m に設定されました。これに 8 mm. (C) シャンクの長さは設定パネル光パワーのソリューション (10 mM) のボリューム荷重の影響を示しています。4 ピペットからのデータは、異なる記号や線で示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 目がさめている ChR2 vgat ノックアウト マウスの IC の光誘発。(A)、光刺激 (ブルー ボックス、0.03 秒) のスパイク応答を誘発。(B)、光刺激 (ブルー ボックス、0.03 秒) 音 (グレーのボックス) で誘発スパイク応答を抑制します。上部 3 トレース音に反応、低い 3 トレースは、音と光を与えられた応答。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
光遺伝学神経科学における強力なツールとなっています。それは、特定の神経活動を操作すると同様、特定のニューロン タイプ体内を識別するために利用されています。各種神経の神経活動の解明は、神経回路メカニズムの理解を促進します。ここでは、目を覚まし ChR2 vgat ノックアウト マウスの IC でガラス電極を介して記録サイトに光を配布する方法を示しました。
説明した方法のいくつかの重要な手順があります。まず、ターゲット細胞オプシンの十分な特定の表現で動物を使用するための要件です。細胞外記録と光に対する反応を識別するには、オプシンの活性化がターゲット ニューロンのスパイクを連想させることが必要です。いくつかのトランスジェニック マウスの実験のための最低年齢があるかもしれないと、ニューロンの遺伝子発現レベルが若い動物14で低いです。さらに、いくつかの追加実験光刺激に対する応答のターゲット ニューロンの種類 (例えば、免疫組織化学) に固有の確認を実行する必要があります。ターゲット ニューロンは興奮性、応答の遅延しきい値によって行うことができるシナプス誘発応答から直接誘発を区別するために必要なこと。第二に、脳組織ができるだけきれいにするために重要です。清浄度の維持が特に、開頭術と録音の間に任意の出血を防ぐために必要です。また、脳の表面をシリコーン接着剤でしっかりと表面を覆うことによって、開頭後の乾燥から防止必要があります。
電極先端から光を効率的に提供するには、光パスの任意の損失を減らすために重要です。光のパワーが 10 倍低下、optrode の構成では、電極ホルダーを介して: 光のパワーが 45 mW の光ファイバー パッチコード、ガラス ピペットの先端に 3-5 mW がの終わりに。結果に示すように、先端サイズとフルの長さでは、(図 2) の先端に光は影響しなかった.ライトの減衰がガラス ピペットの構成に関係なくかなり安定であることが示唆されました。この光の減衰は ChR2 vgat ノックアウト マウスにおける IC ニューロンのレコーディングで問題はなかったのでそれは他の録画設定に問題可能性がありますが、IC の腹側の端 (深さ 2 mm) で光活性スパイクを記録ことでしたを確認しました。ライトの減衰を大幅に削減するは難しいだろうが、機能強化の可能性があります。まず、電極ピペットとしてホウケイ酸ガラスの代わりに石英を使用した効率的な場合があります。それは電極15を介して光の損失を減らすことがありますので、水晶が伝導率をより良い光が知られています。また、ピペットの最後のポーランドがピペット ・ パッチコード15境界面での光の損失を減少することが報告されました。光減衰の改善は十分ではない場合それは、レーザーのコストよりも LED が LED の代わりにレーザーを使用する効果的なでしょう。
ガラス ピペット電極の利点の 1 つはトレーサーまたはベクトルを充填ソリューションに追加することによって組織の手順を実行することが可能です。組織学的のプロシージャは大量の役に立つ情報 (記録の位置)、記録されたニューロン等の形態を電気生理学的データに追加します。また、ガラス電極を用いた拮抗薬充填ソリューション15の薬理学的調査を実行することが可能だと報告されました。これらの利点と対照をなしてガラス ピペット電極の制限は、複数の分離された単位から録音できないということです。多数の録音を達成するためには、単一 Ag Cl コーティング ワイヤの代わりにガラス製のピペットに・ テトロード ワイヤーを入れることができますがあります。この場合、先端サイズ (30-60 μ m、・ テトロードの典型的な先端サイズ) を大きくして、ピペットを使用し、ピペットの先端からアウト ・ テトロード末に必要になるでしょう。
以前に報告された optrodes はしばしば複雑な16,17を必須、マギーと彼の同僚は、optrode 我々 は設計18標準的なガラス ピペットを使用して、optrode を開発しました。方法で、彼らは光を提供するピペットに細い光ファイバーを挿入します。ピペットのシャンクを挿入するのに十分に薄い繊維をするためには、彼らは先端に 8-10 μ m の直径 9 μ m のコアを 125 μ m クラッド径ファイバーをエッチングしました。このメソッドの利点は、イオントフォレーシスに用いられる曲がったピペットに対しても適用されることです。ただし、標準的な商業 Led を十分な光を介して9 μ m コアファイバー達成できないだろうので、光源として LED を使用するは難しいことがあります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、昇進の科学科研費補助金 JP16K11200 ・ 17 H 02223、会と金沢医科大学 S2016 8 C2017 3 研究グラントによって支えられました。写真を撮るに彼のサポートを Yuhichi クダを感謝いたします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrode holder | Molecular Device | 1-HL-U | pipette holder for microelectrode amplifier |
| Ceramic split mating sleeve | Thorlabs | ADAF1 | f2.5 mm ferrule |
| Circuit board spacer | Teishin Denki | SPA-320 | f8.0 mm, 20.0 mm long |
| Stereotaxic frame for mice | Narishige | SR-6M-HT | Stereotaxic instruments for mice |
| Manipulator | Narishige | NA | Manual manipulator |
| Superbond | Sun Medical | M: 204610557 | Dental adhesive resin cement |
| Form2 | Formlabs | NA | 3D printer |
| Kwik-Sil | WPI | KWIK-SIL | Low toxicity silicone adhesive |
| Borosilicate glass capillaries | Narishige | GD-1.5 | OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 90.0 mm long |
| Fiber-optic patch cord | Doric Lenses | MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5 | Monofiberoptic patchcord, OD, 2.5 mm, core = 960 mm, cladding = 1000 mm, NA = 0.63 |
| Connectrized LED | Doric Lenses | LEDC-1B_FC | Central wave length = 465 nm, output power = 45 mW (Core 960 mm 0.63 NA ) |
| LED driver | Doric Lenses | LEDRV_1CH_1000 | 1 ch LED driver, maximum output = 1000 mA |
| Electrode puller | Narishige | PB-7 | Dual-stage glass micropipette puller |
| Borosilicate glass capillary | Narishige | GD-1.5 | Bolosilicate glass capillary, OD, 1.5mm, ID, 0.9 mm, 90.0 mm long |
| GENTACIN | MSD CO., Ltd | 185711173 | Antibiotic ointment |
| Terramycin®-LA | Zoetis | G 333 | Oxytetracycline |
| Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J | Jackson Labs | #14548 | VGAT-ChR2 mice |
| Multiclamp 700B | Molecular Devices | 2500-0157 | Microelectrode amplifier |
References
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