Summary
Este trabajo presenta un método para realizar un optogenetic de una sola unidad grabación fiable desde un ratón despierto utilizando un optrode de cristal a medida.
Abstract
Es una preocupación importante en Neurociencia cómo diferente tipos de neuronas funcionan en circuitos neurales. Los avances recientes en optogenetics han permitido la identificación del tipo neuronal en vivo experimentos electrofisiológicos en regiones amplias del cerebro. En experimentos de optogenetics, es fundamental para entregar la luz en el sitio de grabación. Sin embargo, a menudo es difícil entregar la luz del estímulo a las regiones profundas del cerebro de la superficie del cerebro. Sobre todo, es difícil para la luz de estimulación llegar a las regiones profundas del cerebro cuando la transparencia óptica de la superficie del cerebro es baja, como sucede a menudo con grabaciones de animales despiertos. Aquí, describimos un método para registrar respuestas de espiga a la luz de un ratón despierto utilizando un optrode de cristal a medida. En este método, la luz se proporciona mediante el electrodo de cristal de la grabación para que sea posible estimular confiablemente la neurona grabada con luz en las regiones profundas del cerebro. Este sistema de optrode por encargo consiste en materiales accesibles y de bajo costo y es fácil de montar.
Introduction
El sistema nervioso central consta de varios tipos de neuronas, que tienen diferentes funciones. Cómo funcionan estos tipos de neuronas dentro del circuito neural es una de las preocupaciones principales de la neurociencia. Sin embargo, en muchas regiones del cerebro, ha sido imposible distinguir los tipos neuronales en grabaciones en vivo de actividades eléctricas porque no hay clara diferencia en la señal de punto eléctrico, con algunas excepciones. Los avances recientes en optogenetics han hecho un gran avance1,2. Uso de animales transgénicos que sensibles a la luz opsina (p. ej., channelrhodopsin-2) se expresa en tipos neuronales específicos, llegó a ser posible distinguir los tipos neuronales eficientemente en vivo grabaciones3, 4,5,6. En estos animales se excitan las neuronas con sensibles a la luz opsina dando estímulos de luz durante las grabaciones eléctricas, pero otras neuronas no son. Las neuronas de la opsina-positivo, por lo tanto, se distinguen fácilmente de otros tipos de neurona por sus respuestas a la luz.
En experimentos de optogenetics, es fundamental para entregar la luz en el sitio de grabación. Como un método no invasivo, la luz es dirigida a menudo de la superficie del cerebro. Sin embargo, porque la fuerza de la luz reduce ya que pasa a través de tejido fino del cerebro, es difícil estimular las regiones profundas del cerebro de la superficie del cerebro. Sobre todo, es difícil para la luz de estimulación llegar a las regiones profundas del cerebro cuando la transparencia óptica de la superficie del cerebro es baja, como sucede a menudo con grabaciones de animales despiertos. Experimentos electrofisiológicos a menudo se han realizado en animales anestesiados ya que el movimiento del cuerpo hace ruido en las grabaciones. Como está bien documentado, sin embargo, la anestesia es conocida por cambiar las respuestas neuronales7,8,9,10. Por lo tanto, es necesario utilizar animales despiertos para estudiar las respuestas neuronales sin el efecto artificial de la anestesia. A diferencia de los experimentos con animales anestesiados, las grabaciones electrofisiológicas se realizan después de la recuperación de la cirugía en los experimentos con animales despiertos. Durante el intervalo entre la cirugía y las grabaciones, el exudado del tejido a menudo se acumula en la superficie del cerebro y hace poco la transparencia óptica de la superficie del cerebro.
Aquí, describimos un método para registrar grabaciones de una sola unidad de un ratón despierto utilizando un optrode de cristal a medida. En este método, la luz se proporciona mediante el electrodo de cristal de la grabación para que sea posible estimular confiablemente la neurona grabada con luz en regiones profundas del cerebro. Este sistema de optrode por encargo consiste en materiales accesibles y de bajo costo y es fácil de montar.
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Protocol
Todos los procedimientos se realizan con arreglo a los principios rectores de la sociedad fisiológica de Japón y con la aprobación de la Animal cuidado Comité de Kanazawa Universidad médica.
1. construcción del vidrio Optrode titular
Nota: Para construir un soporte de optrode de vidrio, se utiliza un soporte de electrodo comercial (figura 1A).
- Extraiga con cuidado el tubo de acero para control de la presión del barril del titular.
- Por perforación, ampliar el agujero del lado del asiento de pin en el cañón del titular. Hacer el agujero 3 mm de diámetro y 12 mm de profundidad.
- Poner un tubo de acero inoxidable (3 mm de diámetro, 0,5 mm de espesor y 8 mm de longitud; Figura 1A 2) en el agujero.
- Inserte el partido manga de acoplamiento para virolas de ⌀2.5 mm (figura 1A1) en el orificio de cerámica.
- Fijar el cilindro de la pinza portaelectrodos para una barbilla en forma de L con adhesivo epoxi.
- Hacer los agujeros (3 mm de diámetro) en la barbilla y adjuntarlo a un manipulador con tornillos.
2. cabeza Post instalación
- Preparar un post de cabeza a la medida de un separador de circuitos. Hacer el espaciador cilíndrico de circuitos en forma cuboidal con una fresa y cortar en 2 puestos de cabeza con una sierra (figura 1B). Aplanar la parte inferior del post principal con una fresa.
- Preparar el animal transgénico en el que un opsin de sensibles a la luz se expresa en un tipo de neurona específica para el estudio. En este trabajo, se utiliza el ratón transgénico (ChR2 VGAT ratones) en el cual las neuronas inhibitorias expresan channelrhodopsin-2 (ChR2)11 .
- Anestesiar al animal con una mezcla de 0,3 mg/kg de medetomidina, 4,0 mg/kg de midazolam y 5,0 mg/kg de butorfanol por administración intraperitoneal. Para confirmar que el animal está completamente anestesiado, prueba sus reacciones para pellizcar la cola.
- Coloque el ratón en un marco estereotáctica en un cojín de calefacción. Limpiar el marco estereotáctica y la calefacción almohadilla con alcohol al 70% por adelantado. Colocar los dientes en el agujero de la barra de bocado y apriete ligeramente la abrazadera de la nariz. Fijar ambos lados de la cabeza por medio de barras de oído. Cuando la cabeza se fija correctamente por las barras de oído, apriete la abrazadera de la nariz. Aplicar una pomada oftálmica en los ojos.
- Afeitarse la piel cabeza con pequeñas tijeras y limpiar el cuero cabelludo con un algodón de gluconato de clorhexidina. Antes de la cirugía, esterilizar todos que los instrumentos quirúrgicos y una cabeza de correos con un autoclave (121 ° C, 15 min).
- Corte el cuero cabelludo a lo largo de la línea media con unas tijeras y empuje a un lado. Hacer la incisión de la parte posterior de la cabeza a los ojos (aproximadamente 20 milímetros). Retirar el periostio con un hisopo de algodón humedecido en alcohol al 70% y secar el cráneo.
- Coloque el poste principal en el manipulador. Coloque el post cabeza plana sobre el cráneo en el vértice con el manipulador.
- Mezcla el monómero (4 gotas), catalizador (1 gota) y polímero (1 cuchara pequeña) de cemento dental sobre un pequeño plato que se enfría en la nevera con antelación. Poner el cemento dental (por debajo de 1 g) en el frontal y el hueso parietal del cráneo para fijar el perno de cabeza en el cráneo.
- Después de que el cemento dental se convierte en duro, quitar el ratón en la estructura estereotáxicas. Pongo un ungüento antibiótico en la piel expuesta. Inyecte el antagonista de la medetomidina (0,3 mg/kg) y los antibióticos (oxitetraciclina; 20 mg/kg). Y controlar el mouse sobre el cojín del calor en una jaula hasta que despierta y volver a una jaula cubierta.
- Casa el animal en una jaula de vivienda individual con algún dispositivo de enriquecimiento. Cambiar el papel animal ropa de cama todos los días para mantener la jaula limpia y prevenir infecciones. Controle cuidadosamente si el animal muestra signos de malestar. Se aplica lidocaína a la herida si se sospecha de cualquier dolor. Administrar meloxicam o el carprofeno una vez cada 24 h durante 48 h después de la cabeza de tanto post cirugías instalación y craneotomía. La lidocaína local se puede dar además si el AINE no es adecuada.
3. aclimatación
- (Mínimo) dos días después de la recuperación de la anestesia, aclimatar a los animales para el estado de cabeza fija en la cámara de grabación. Realizar las sesiones de aclimatación durante al menos 5 días.
- Durante las sesiones de aclimatación, coloque el animal en la sala de grabación con el post principal fijado a una mordaza a la medida. Durante la sesión, con el fin de limitar el movimiento, tapa el cuerpo con un tubo de medio de resina por encargo (figura 1), hecho con una impresora 3D.
Nota: El día 1, la sesión de aclimatación debe ser 5 minutos de largo. Es entonces aumentado diariamente a 10, 20, 40 y 60 min para los días 2, 3, 4 y 5, respectivamente. - Al final de cada sesión, dar al animal una recompensa de comida. Si el animal se esfuerza continuamente durante la aclimatación, detener la sesión.
4. craneotomía
Nota: Después de la aclimatación, se realiza una craneotomía sobre la región del cerebro para la grabación. La craneotomía se realiza en el marco estereotáctica bajo anestesia, como con la cabeza post instalación. El procedimiento posterior a la operación es el mismo como la cabeza post instalación.
- Antes de la craneotomía, limpiar el cráneo con un hisopo de algodón con clorhexidina gluconato y el 70% de alcohol.
- Raspar cuidadosamente el cráneo en el sitio de grabación con un taladro dental. Cuando el hueso se convierte en lo suficientemente delgado, cortar con la punta del bisturí y retírela.
- Poner cemento dental alrededor de la región expuesta a fin de fortalecer el cráneo.
- Cubra el área expuesta del cerebro con adhesivo de silicona después de que el cemento dental se convierte en duro. El procedimiento después de la cirugía es como se describe en el paso 2.8.
5. grabación electrofisiológico
- Permitir que el animal recuperar al menos 1 día después de la craneotomía antes de realizar la grabación electrofisiológica. Colocar el animal en la cámara de grabación de la misma manera que se ha hecho durante las sesiones de aclimatación cuando se inicie la grabación.
- Hacer pipetas de vidrio de Capillares de vidrio de borosilicato (OD = 1,5 mm, ID = 0,9 mm, largo 90,0 mm) tirado en un tirador de electrodo. El diámetro de su punta es 2 – 3 μm, y su resistencia es de 4 a 6 MΩ cuando están llenas de 10 mM PBS. La longitud del electrodo es de 40-50 mm. En algunas grabaciones, neurobiotin 2% se agrega a lo 10 mM PBS.
- Coloque la pipeta de cristal llenado al titular de la optrode por encargo.
- Poner el alambre de plata revestido de Ag-Cl (0,2 mm de diámetro) con la pipeta de cristal. Conecte el alambre de plata a un pin a través de un alambre eléctrico revestido fino. Conectar la clavija en el headstage del amplificador de grabación.
- Conecte el cable de fibra óptica parche (núcleo = 960 μm, revestimiento = 1.000 μm, NA = 0,63) con una virola de zirconia (OD = 2,5 mm) a la división de manga en el soporte de optrode de acoplamiento. Introduzca el cable de parche en la manga hasta la parte posterior de la pipeta de vidrio en contacto con la punta de la virola. Entrega de la cuerda de remiendo de la luz (longitud de onda = 465 nm) del LED. La luz LED es controlada por un controlador de LED de canal único.
- Remover el pegamento de silicona sobre la craneotomía. Poner caliente solución salina (38 ° C) en la superficie del cerebro periódicamente para evitar que la superficie del cerebro se seque durante la sesión de grabación. Si es necesario, retire la duramadre con pinzas afiladas.
- Insertar el electrodo de vidrio en el tejido cerebral con un manipulador. Monitorear la resistencia del electrodo cuando se inserta. Vuelva a colocar el electrodo cuando la resistencia es menor de lo esperado porque la punta del electrodo puede dañarse. En la profundidad de interés, buscar y aislar las puntas de la unidad de ajuste de la profundidad en pasos de 2 a 5 μm.
- Después de que la unidad está aislada, entregar la luz y observar la respuesta a los estímulos de luz.
- Registrar las actividades neuronales después de la identificación de los tipos de células. Realizar las grabaciones para 2-3 h. Si la grabación se realiza en días consecutivos (máxima de 2 días), cubrir la craneotomía con adhesivo de silicona. Cuando la grabación está terminada, y el animal es sacrificado, recuperar el post principal y ponerlo en acetona para lavar y reutilícelo.
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Representative Results
En la figura 2, se analizaron los efectos del tamaño de la punta y la longitud de las pipetas de vidrio en la potencia de luz en la punta de las pipetas (figura 2A-B). La potencia de luz fue medida por un medidor de potencia óptica a 1 mm de la punta. La longitud total se estableció en 50 ± 2 mm cuando el tamaño de la punta varía, mientras que el tamaño de la punta fue a 2.5 μm cuando la longitud total varió. El vástago de la pipeta de vidrio se estableció en 8 mm. La potencia de luz en la punta entre 3 – 5 mW (media ± SD; Figura 2A: 3,77 ± 0.29 mW, n = 20; Figura 2B: 4,24 ± 0.31 mW, n = 21). El tamaño de la punta (figura 2A) de las pipetas no se correlacionó con la potencia de luz (R 0.1555 de =). La longitud de la pipeta se correlacionó sólo ligeramente con la potencia de luz de una manera negativa (R =-0.2054). Estos resultados sugieren que la punta y la longitud de las pipetas raramente afectan a la energía ligera en la punta. También comprobamos si la cantidad de carga volumen de la solución (10 mM PBS) en las pipetas de cristal afecta a la potencia de luz (figura 2). El volumen de la solución se evaluó por la longitud de la solución en la pipeta. Los datos fueron registrados de 4 pipetas (punta tamaño: 0.25 μm, la longitud total: 50 ± 2 mm, la longitud de la caña: 8 mm). Se encontró que variando el volumen de la solución en la pipeta no afectó la potencia de luz (figura 2).
En la figura 3, muestran las respuestas de spike en el colliculus inferior (IC) de ratones de ChR2 VGAT despiertos (2 – 4 meses). La IC es un centro auditivo en el cerebro medio y consiste en glutamatérgicos y GABAérgicos neuronas12,13, los cuales responden al sonido3,4. En los ratones de IC de VGAT ChR2, las neuronas GABAérgicas específicamente expresan ChR24. En trabajos previos, se demostró que las neuronas GABAérgica y glutamatérgica excitadas o suprimidas, respectivamente, cuando se les dio estímulos luz3,4. En los ratones despiertos, encontramos dos tipos de neuronas (Figura 3A-B). Cuando el estímulo de luz se entrega a través del electrodo de vidrio, evoca respuestas de espiga en algunas neuronas (Figura 3A). En cambio, en otras neuronas, los estímulos de luz suprimen las respuestas punto evocadas por estímulos de sonido (figura 3B). Estos resultados demuestran que una optrode de vidrio puede registrar la actividad de la unidad bien aisladas y confiablemente, estimular las neuronas registradas por la luz.
Figura 1: Accesorios de soporte y grabación de Optrode. Los paneles (A) y (B) Mostrar el soporte optrode. Panel (A) muestra la estructura de parte del titular de la optrode. (1) se trata de una fractura de cerámica de la manga de acoplamiento. (2) se trata de un tubo de acero inoxidable. (3) se trata de un barril del titular. (4) esta es una arandela de cono. (5) se trata de una tapa de policarbonato. Panel (B) muestra el soporte montado optrode. Panels (C) y (D) Mostrar el post a la medida de cabeza. Panel (C) muestra una vista lateral de la entrada principal. Panel (D) muestra una vista oblicua del post principal. Los dos puestos de cabeza (derecha) están hechos de un espaciador de circuitos (izquierdo). Paneles (E) (F) y (G) muestran el medio tubo de resina por encargo. Los paneles (E) y (F) Mostrar croquis del medio tubo de resina. Panel (E) muestra una vista frontal del medio tubo de resina. Panel (F) muestra una vista lateral del tubo la mitad de la resina. Panel (G) muestra una foto del medio tubo. Los números en los paneles (E) y (F) indique el dibujo las dimensiones en mm haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El efecto de la configuración de las pipetas de vidrio en la potencia de luz en la punta. (A) la punta de tamaño fue trazada contra el poder de la luz. La longitud completa de la pipeta fue fijada a 50 ± 2 mm. La longitud de la caña fue fijada a 8 mm. (B) la longitud de la pipeta se enfrenta a la potencia de luz. El tamaño de la punta se estableció en 0.25 μm. La longitud de la caña fue fijada a 8 mm. (C) este panel muestra el efecto de la carga de volumen de la solución (10 mM PBS) en la potencia de luz. Los datos de 4 pipetas se indican mediante líneas y símbolos diferentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Las respuestas evocadas de la luz en el IC de despiertas ratones VGAT ChR2. Estímulos (A) la luz (caja azul, 0.03 s) evoca respuestas de spike. Estímulos (B) la luz (caja azul, 0.03 s) suprime las respuestas punto por sonido (caja gris). Los 3 rastros superiores son la respuesta al sonido, y los 3 rastros inferiores son la respuesta al sonido y la luz fueron dados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Optogenetics se ha convertido en una herramienta poderosa en la neurociencia. Se ha utilizado para identificar tipos específicos neuronas en vivo así como manipular las actividades de vías neuronales específicas. La clarificación de las actividades neuronales de diferentes tipos neuronales promueve la comprensión del mecanismo de los circuitos neuronales. Aquí, hemos demostrado un método para proporcionar la luz en el sitio de grabación a través de un electrodo de vidrio en el IC de despiertas ratones VGAT ChR2.
Hay varios pasos críticos en el método descrito. En primer lugar, es un requisito para utilizar animales con una expresión suficiente y específica de opsins en las neuronas de destino. Para identificar las respuestas a la luz con las grabaciones extracelulares, es necesario que la activación de la opsina evoca los picos en las neuronas de destino. En algunas cepas transgénicas, es posible que el nivel de expresión del transgén en las neuronas es bajo en los animales jóvenes de14, y puede haber una edad mínima para el experimento. Además, puede ser necesario realizar algunos experimentos adicionales para confirmar si las respuestas a los estímulos de luz son específicas de los tipos de neurona de destino (por ejemplo, inmunohistoquímica). Cuando la neurona destino es excitatoria, sería necesario distinguir las respuestas evocadas directamente de las respuestas evocadas CCIS, que podrían hacerse por umbralización de la latencia de la respuesta. En segundo lugar, es fundamental para que el tejido cerebral es tan limpio como sea posible. Un mantenimiento de limpieza es especialmente necesario para evitar el sangrado durante la craneotomía y las grabaciones. Además, la superficie del cerebro debe ser prevenida de secado después de la craneotomía cubriendo la superficie con adhesivo de silicona.
Para entregar la luz eficientemente desde la punta del electrodo, es fundamental para reducir la pérdida en el trayecto óptico. En nuestra configuración de la optrode, la potencia de luz cae diez veces a través del soporte del electrodo: la potencia de luz es de 45 mW en el extremo de la cuerda de remiendo de fibra óptica, si bien es 3 – 5 mW en la punta de la pipeta de cristal. Como se muestra en los resultados, el tamaño de la punta y la longitud total no afectó la potencia de luz en la punta (figura 2). Estos resultados indicaron que la atenuación de la luz era bastante estable independientemente de la configuración de la pipeta de cristal. Esta atenuación de la luz no importa en la grabación de las neuronas de la IC en ratones VGAT ChR2 porque hemos comprobado que era posible grabar luz activados picos en el borde ventral (2 mm de profundidad) de la IC, aunque puede importar en otras configuraciones de grabación. Sería difícil reducir dramáticamente la atenuación de la luz, pero puede haber posibilidades de mejora. En primer lugar, puede ser efectivo utilizar cuarzo en lugar de un vidrio borosilicato como una pipeta de electrodo. Es conocido que el cuarzo ha luz mejor conductividad, por lo que puede reducir la pérdida de luz a través del electrodo15. Además, se informó que el pulimento del extremo de la pipeta reduce pérdida de luz en la superficie de contacto entre la pipeta y la cuerda de remiendo15. Si la mejora en la atenuación de la luz no es suficiente, sería efectivo usar un láser en vez de LED, aunque láser cuesta más de LED.
Una de las ventajas del electrodo de pipeta de vidrio es que es posible realizar procedimientos histológicos mediante la adición de trazadores o vectores para la solución de llenado. Los procedimientos histológicos añadirá una gran cantidad de información útil (la ubicación de la grabación), la morfología de la neurona registrada, etc.los datos electrofisiológicos. Además, se informó que es posible realizar estudios farmacológicos con el electrodo de cristal de bloqueo en la solución de llenado15. En contraste con estas ventajas, la limitación del electrodo de la pipeta de cristal es que no se puede grabar en varias unidades aisladas. Para la realización de varias grabaciones, es posible poner un alambre de tetrodo con la pipeta de vidrio en lugar de un solo alambre de Ag-Cl cubierto. En este caso, sería necesario utilizar una pipeta con un punta más grande (30-60 μm, el tamaño de la punta típica de un tetrodo) y dejar que el extremo de la tetrodo hacia fuera desde la punta de la pipeta.
Mientras que optrodes previamente divulgados a menudo compleja fabricación16,17, Magee y sus colegas han desarrollado un optrode usando pipetas de vidrio estándar como con el optrode hemos diseñado18. En su método, inserte una delgada fibra óptica dentro de la pipeta para entregar la luz. Para hacer la fibra fina suficiente para insertar el vástago de la pipeta, graba al agua fuerte de fibra de revestimiento de 125 μm con un núcleo de μm 9 a un diámetro de 8 – 10 μm en la punta. La ventaja de este método es que se aplicaría incluso para la pipeta doblada que se utiliza a menudo para iontoforesis. Sin embargo, puede ser difícil utilizar LED como fuente de luz porque LEDs comerciales estándar no lograr suficiente potencia de luz a través de una fibra de base de 9 μm.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores fueron apoyados por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia KAKENHI Grant JP16K11200 y 17H 02223 y la subvención para la investigación de Kanazawa médica Universidad S2016-8 y C2017-3. Damos las gracias por su apoyo en la toma de las fotos Yuhichi Kuda.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrode holder | Molecular Device | 1-HL-U | pipette holder for microelectrode amplifier |
| Ceramic split mating sleeve | Thorlabs | ADAF1 | f2.5 mm ferrule |
| Circuit board spacer | Teishin Denki | SPA-320 | f8.0 mm, 20.0 mm long |
| Stereotaxic frame for mice | Narishige | SR-6M-HT | Stereotaxic instruments for mice |
| Manipulator | Narishige | NA | Manual manipulator |
| Superbond | Sun Medical | M: 204610557 | Dental adhesive resin cement |
| Form2 | Formlabs | NA | 3D printer |
| Kwik-Sil | WPI | KWIK-SIL | Low toxicity silicone adhesive |
| Borosilicate glass capillaries | Narishige | GD-1.5 | OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 90.0 mm long |
| Fiber-optic patch cord | Doric Lenses | MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5 | Monofiberoptic patchcord, OD, 2.5 mm, core = 960 mm, cladding = 1000 mm, NA = 0.63 |
| Connectrized LED | Doric Lenses | LEDC-1B_FC | Central wave length = 465 nm, output power = 45 mW (Core 960 mm 0.63 NA ) |
| LED driver | Doric Lenses | LEDRV_1CH_1000 | 1 ch LED driver, maximum output = 1000 mA |
| Electrode puller | Narishige | PB-7 | Dual-stage glass micropipette puller |
| Borosilicate glass capillary | Narishige | GD-1.5 | Bolosilicate glass capillary, OD, 1.5mm, ID, 0.9 mm, 90.0 mm long |
| GENTACIN | MSD CO., Ltd | 185711173 | Antibiotic ointment |
| Terramycin®-LA | Zoetis | G 333 | Oxytetracycline |
| Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J | Jackson Labs | #14548 | VGAT-ChR2 mice |
| Multiclamp 700B | Molecular Devices | 2500-0157 | Microelectrode amplifier |
References
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