Summary
इस काम के लिए एक विधि एक optogenetic एक कस्टम निर्मित ग्लास optrode का उपयोग कर जाग माउस से मज़बूती से एक इकाई रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने के लिए परिचय ।
Abstract
यह तंत्रिका विज्ञान में एक प्रमुख चिंता का विषय है कैसे ंयूरॉंस के विभिंन प्रकार के तंत्रिका सर्किट में काम करते हैं । optogenetics में हाल के अग्रिमों में vivo electrophysiological प्रयोगों में व्यापक मस्तिष्क क्षेत्रों में ंयूरॉन प्रकार की पहचान सक्षम है । optogenetics प्रयोगों में, यह रिकॉर्डिंग साइट के लिए प्रकाश देने के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, यह अक्सर मस्तिष्क की सतह से गहरी मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए उत्तेजना प्रकाश देने के लिए कठिन है । विशेष रूप से, यह उत्तेजना प्रकाश के लिए मुश्किल है गहरी मस्तिष्क क्षेत्रों तक पहुंचने के लिए जब मस्तिष्क की सतह के ऑप्टिकल पारदर्शिता कम है, के रूप में अक्सर जाग पशुओं से रिकॉर्डिंग के साथ मामला है । यहाँ, हम एक कस्टम बनाया ग्लास optrode का उपयोग कर एक जाग माउस से प्रकाश के लिए स्पाइक प्रतिक्रियाओं रिकॉर्ड करने के लिए एक विधि का वर्णन. इस विधि में, प्रकाश रिकॉर्डिंग ग्लास इलेक्ट्रोड के माध्यम से इतना है कि यह मज़बूती से गहरे मस्तिष्क क्षेत्रों में प्रकाश के साथ दर्ज की ंयूरॉन को उत्तेजित करने के लिए संभव है दिया है । इस कस्टम निर्मित optrode प्रणाली सुलभ और सस्ती सामग्री के होते है और इकट्ठा करने के लिए आसान है ।
Introduction
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र ंयूरॉंस के विभिंन प्रकार के होते हैं, जो विभिंन कार्यों है । कैसे इन विभिंन प्रकार के ंयूरॉंस के भीतर काम तंत्रिका सर्किट तंत्रिका विज्ञान में प्रमुख चिंताओं में से एक है । हालांकि, कई मस्तिष्क क्षेत्रों में, यह विद्युत गतिविधियों के vivo रिकॉर्डिंग में में न्यूरॉन प्रकार भेद करने के लिए असंभव हो गया है क्योंकि वहाँ बिजली के स्पाइक संकेत में कोई स्पष्ट अंतर ही है, कुछ अपवादों के साथ. optogenetics में हाल के अग्रिमों एक सफलता1,2बना दिया है । ट्रांसजेनिक जानवरों में जो प्रकाश के प्रति संवेदनशील opsin (जैसे, channelrhodopsin-2) विशिष्ट ंयूरॉंस प्रकार में व्यक्त की है का उपयोग करना, यह संभव हो गया में ंयूरॉन प्रकार भेद करने के लिए कुशलतापूर्वक में vivo रिकॉर्डिंग3, 4,5,6. इन जानवरों में, प्रकाश के प्रति संवेदनशील opsin के साथ न्यूरॉन्स विद्युत रिकॉर्डिंग के दौरान प्रकाश उत्तेजनाओं देने से उत्साहित हैं, लेकिन अन्य न्यूरॉन्स नहीं हैं. opsin-सकारात्मक न्यूरॉन्स, इसलिए, आसानी से प्रकाश करने के लिए अपनी प्रतिक्रियाओं से अन्य न्यूरॉन प्रकार से प्रतिष्ठित हैं.
optogenetics प्रयोगों में, यह रिकॉर्डिंग साइट के लिए प्रकाश देने के लिए महत्वपूर्ण है. एक गैर इनवेसिव विधि के रूप में, प्रकाश अक्सर मस्तिष्क की सतह से निर्देशित है । हालांकि, क्योंकि प्रकाश की शक्ति कम कर देता है के रूप में यह मस्तिष्क ऊतक के माध्यम से चला जाता है, यह मस्तिष्क की सतह से गहरे मस्तिष्क क्षेत्रों को उत्तेजित करने के लिए कठिन है । विशेष रूप से, यह उत्तेजना प्रकाश के लिए मुश्किल है गहरी मस्तिष्क क्षेत्रों तक पहुंचने के लिए जब मस्तिष्क की सतह के ऑप्टिकल पारदर्शिता कम है, के रूप में अक्सर जाग पशुओं से रिकॉर्डिंग के साथ मामला है । Electrophysiological प्रयोगों अक्सर anesthetized जानवरों पर प्रदर्शन किया गया है क्योंकि शरीर आंदोलन रिकॉर्डिंग में शोर का कारण बनता है. के रूप में अच्छी तरह से प्रलेखित है, तथापि, संज्ञाहरण तंत्रिका प्रतिक्रियाओं7,8,9,10बदलने के लिए जाना जाता है । इस प्रकार, यह संज्ञाहरण के कृत्रिम प्रभाव के बिना तंत्रिका प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के क्रम में जाग जानवरों का उपयोग करने के लिए आवश्यक है । anesthetized जानवरों के साथ प्रयोगों के विपरीत, electrophysiological रिकॉर्डिंग जाग जानवरों के साथ प्रयोगों में सर्जरी से वसूली के बाद प्रदर्शन कर रहे हैं । सर्जरी और रिकॉर्डिंग के बीच अंतराल के दौरान, ऊतक रिसाव अक्सर मस्तिष्क की सतह पर जम जाता है और मस्तिष्क की सतह कम की ऑप्टिकल पारदर्शिता बनाता है ।
यहाँ, हम एक कस्टम निर्मित ग्लास optrode का उपयोग कर एक जाग माउस से एकल इकाई रिकॉर्डिंग रिकॉर्ड करने के लिए एक विधि का वर्णन. इस विधि में, प्रकाश रिकॉर्डिंग ग्लास इलेक्ट्रोड के माध्यम से इतना है कि यह मज़बूती से गहरे मस्तिष्क क्षेत्रों में प्रकाश के साथ दर्ज की ंयूरॉन को उत्तेजित करने के लिए संभव है दिया है । इस कस्टम निर्मित optrode प्रणाली सुलभ और सस्ती सामग्री के होते है और इकट्ठा करने के लिए आसान है ।
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Protocol
सभी प्रक्रियाओं जापान के शारीरिक समाज के मार्गदर्शक सिद्धांतों के अनुसार और कनाजावा चिकित्सा विश्वविद्यालय की पशु देखभाल समिति के अनुमोदन के साथ किया जाता है ।
1. ग् Optrode धारक का निर्माण
नोट: एक ग्लास optrode धारक का निर्माण करने के लिए, एक वाणिज्यिक इलेक्ट्रोड धारक का उपयोग किया जाता है (आंकड़ा 1a).
- धीरे धारक के बैरल से दबाव नियंत्रण के लिए इस्पात ट्यूब बाहर खींचो ।
- ड्रिलिंग द्वारा, धारक के बैरल में पिन सीट की ओर के छेद व्यापक । छेद 3 मिमी व्यास में और 12 मिमी गहराई में बनाओ ।
- एक स्टेनलेस स्टील पाइप रखो (व्यास में 3 मिमी, मोटाई में ०.५ मिमी, और लंबाई में 8 मिमी; चित्र 1a 2) छेद में ।
- ⌀ २.५ mm ferrules के लिए एक सिरेमिक भाजित संभोग आस्तीन डालें (चित्रा 1a1) छेद में ।
- epoxy चिपकने के साथ एक एल के आकार rabbet करने के लिए इलेक्ट्रोड धारक की बैरल फिक्स ।
- rabbet में छेद (व्यास में 3 मिमी) बनाओ और यह शिकंजा के साथ एक जोड़तोड़ करने के लिए देते हैं ।
2. हेड पोस्ट स्थापना
- एक कस्टम निर्मित सिर एक सर्किट बोर्ड स्पेसर से बना पोस्ट तैयार करते हैं । एक cuboidal आकार में एक मिलिंग कटर के साथ स्तंभ सर्किट बोर्ड स्पेसर बनाओ और एक देखा (आंकड़ा 1b) के साथ 2 सिर पदों में कटौती । एक मिलिंग कटर के साथ सिर पोस्ट के नीचे समतल ।
- ट्रांसजेनिक पशु तैयार करें जिसमें एक प्रकाश-संवेदी opsin के अध्ययन के लिए एक विशिष्ट ंयूरॉन प्रकार में व्यक्त किया जाता है । इस काम में ट्रांसजेनिक माउस (VGAT-ChR2 चूहों) का प्रयोग होता है जिसमें निरोधात्मक न्यूरॉन्स एक्सप्रेस channelrhodopsin-2 (ChR2)11 का उपयोग किया जाता है ।
- Anesthetize के मिश्रण के साथ पशु ०.३ मिलीग्राम/medetomidine, ४.० मिलीग्राम/मिदाजोलम के किलो, और intraperitoneal प्रशासन द्वारा butorphanol के ५.० मिलीग्राम/किलो । पशु पूरी तरह से anesthetized है कि पुष्टि करने के लिए, पूंछ चुटकी के लिए अपनी प्रतिक्रियाओं का परीक्षण.
- एक हीटिंग पैड पर एक stereotaxic फ्रेम में माउस रखें । stereotaxic फ्रेम और अग्रिम में ७०% शराब के साथ हीटिंग पैड साफ । काटने पट्टी के छेद में दांत रखें, और हल्के से नाक दबाना कस । कान सलाखों का उपयोग कर सिर के दोनों पक्षों को ठीक करें । जब सिर कान की पट्टियों से ठीक से ठीक हो जाए तो नाक दबाना कस लें । आंखों के लिए एक नेत्र मरहम लागू करें ।
- छोटे कैंची के साथ सिर त्वचा दाढ़ी और chlorhexidine gluconate की एक कपास झाड़ू के साथ खोपड़ी साफ । सर्जरी से पहले, सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों और एक आटोक्लेव (१२१ डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट) के साथ एक सिर के बाद निष्फल ।
- कैंची के साथ midline के साथ खोपड़ी में कटौती और यह एक तरफ धक्का । सिर के पीछे से आंखों के लिए चीरा बनाओ (लगभग 20 मिमी). एक कपास झाड़ू के साथ periosteum निकालें ७०% शराब में डूबा हुआ है और खोपड़ी सूखी ।
- जोड़ तोड़ के लिए प्रमुख पद देते हैं । स्थिति सिर जोड़ तोड़ का उपयोग bregma के आसपास खोपड़ी पर फ्लैट पोस्ट ।
- मोनोमर (4 बूंदें), उत्प्रेरक (1 ड्रॉप), और बहुलक (एक छोटी सी डिश है कि अग्रिम में फ्रिज में ठंडा है पर दंत सीमेंट के 1 छोटी चंमच) मिश्रण । खोपड़ी के ललाट और पार्श्विका की हड्डी पर दंत सीमेंट (1 ग्राम) को सिर के पोस्ट को ठीक करने के लिए रखें ।
- डेंटल सीमेंट के सख्त हो जाने के बाद, माउस को stereotaxic फ्रेम से हटा दें । उजागर त्वचा पर एक एंटीबायोटिक मरहम रखो । medetomidine विरोधी सुई (०.३ मिलीग्राम/किग्रा) और एंटीबायोटिक्स (ओक्षयत्टे्रास्यकलने; 20 मिलीग्राम/ प्लेस और एक पिंजरे में गर्मी पैड पर माउस की निगरानी जब तक यह जाग, और यह एक आवास पिंजरे में वापस ।
- कुछ संवर्धन डिवाइस के साथ एक व्यक्ति के आवास पिंजरे में पशु घर । पिंजरे को साफ रखने और संक्रमण को रोकने के लिए दैनिक पशु कागज बिस्तर बदलें । ध्यान से निगरानी कि पशु असुविधा के किसी भी संकेत से पता चलता है । किसी भी दर्द संदिग्ध है, तो घाव के लिए lidocaine लागू करें । प्रशासन meloxicam या दोनों सिर पोस्ट स्थापना और craniotomy सर्जरी के बाद ४८ ज के लिए हर 24 एच एक बार carprofen । इसके अलावा अगर NSAID पर्याप्त नहीं है तो लोकल lidocaine दी जा सकती है ।
3. Acclimation
- दो दिन (न्यूनतम) संज्ञाहरण से वसूली के बाद, acclimate पशु रिकॉर्डिंग चैंबर में सिर तय राज्य के लिए । acclimation सत्रों के लिए कम से कम 5 दिनों के लिए प्रदर्शन ।
- acclimation सत्रों के दौरान, एक कस्टम-निर्मित क्लैंप के लिए तय सिर पोस्ट के साथ रिकॉर्डिंग चैंबर में पशु जगह है । सत्र के दौरान, आदेश में आंदोलन को सीमित करने के लिए एक कस्टम निर्मित राल आधा ट्यूब (चित्रा 1C), एक 3 डी प्रिंटर का उपयोग कर बनाया के साथ शरीर को कवर ।
नोट: 1 दिन पर, acclimation सत्र 5 मिनट लंबा होना चाहिए । यह तो दैनिक के लिए 10, 20, ४०, और ६० मिनट के लिए दिन में वृद्धि हुई है 2, 3, 4, और 5, क्रमशः । - प्रत्येक सत्र के अंत में, पशु एक भोजन इनाम दे । अगर acclimation के दौरान पशु लगातार संघर्ष करते हैं तो सत्र बंद कर दें ।
4. Craniotomy
नोट: acclimation के बाद, एक craniotomy रिकॉर्डिंग के लिए मस्तिष्क क्षेत्र पर बना है । craniotomy stereotaxic फ्रेम में संज्ञाहरण के तहत किया जाता है, के रूप में सिर के बाद स्थापना के साथ । पद-संचालन प्रक्रिया प्रधान पद स्थापना के समान है ।
- craniotomy से पहले, chlorhexidine gluconate और ७०% अल्कोहल के साथ एक कपास झाड़ू के साथ खोपड़ी को साफ करें ।
- ध्यान से एक दंत ड्रिल के साथ रिकॉर्डिंग साइट पर खोपड़ी परिमार्जन । जब हड्डी काफी पतली हो जाती है तो उसे स्केलपेल की नोक से काट कर निकाल लें ।
- खोपड़ी को मजबूत बनाने के लिए उजागर क्षेत्र के आसपास दंत सीमेंट रखो ।
- सिलिकॉन चिपकने के साथ उजागर मस्तिष्क क्षेत्र को कवर के बाद दंत सीमेंट मुश्किल हो जाता है । पोस्ट-सर्जरी प्रक्रिया के रूप में चरण २.८ में वर्णित है ।
5. Electrophysiological रिकॉर्डिंग
- electrophysiological रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने से पहले craniotomy के बाद कम 1 दिन के लिए पशु को पुनर्प्राप्त करने की अनुमति दें । रिकॉर्डिंग चैंबर में एक ही तरह से यह acclimation सत्र के दौरान किया गया था जब रिकार्डिंग शुरू होता है में पशु प्लेस ।
- borosilicate ग्लास केशिकाओं (आयुध डिपो = १.५ मिमी, आईडी = ०.९ मिमी, ९०.० मिमी लंबे) एक इलेक्ट्रोड खींचने पर खींचा से ग्लास पिपेट बनाओ । इनका टिप व्यास २-३ µm है, और उनका प्रतिरोध ४-६ MΩ है जब वे १० एमएम के पंजाबियों से भरे होते हैं. इलेक्ट्रोड की लंबाई 40 – 50 मिमी है. कुछ रिकॉर्डिंग में, 2% neurobiotin 10 मिमी पंजाबियों में जोड़ा जाता है ।
- भरे हुए ग् पिपेट को कस्टम-मेड optrode धारक को अटैच करें ।
- गिलास पिपेट में एजी-सीएल लेपित चांदी के तार (व्यास में ०.२ मिमी) रखो । एक पतली लेपित बिजली के तार के माध्यम से एक पिन करने के लिए चांदी के तार कनेक्ट । पिन रिकॉर्डिंग एम्पलीफायर के headstage करने के लिए कनेक्ट करें ।
- फाइबर ऑप्टिक पैच कॉर्ड कनेक्ट (कोर = ९६० µm, cladding = १,००० µm, NA = ०.६३) एक zirconia सामी (आयुध डिपो = २.५ मिमी) के साथ optrode धारक पर भाजित संभोग आस्तीन के लिए । आस्तीन में पैच कॉर्ड पुश सामी की नोक तक कांच पिपेट के पीछे संपर्क । पैच कॉर्ड एलईडी से प्रकाश (तरंग दैर्ध्य = ४६५ एनएम) बचाता है । एलईडी प्रकाश एक एकल चैनल एलईडी चालक द्वारा नियंत्रित किया जाता है ।
- craniotomy पर सिलिकॉन चिपकने वाला निकालें । रिकॉर्डिंग सत्र के दौरान सुखाने से मस्तिष्क की सतह को रोकने के लिए समय-वक्त पर मस्तिष्क की सतह पर गर्म खारा (३८ डिग्री सेल्सियस) रखो । अगर जरूरी हो तो बाडी को तेज चिमटी से निकाल लें ।
- एक जोड़ तोड़ के साथ मस्तिष्क के ऊतकों में कांच इलेक्ट्रोड डालें. यह डाला जाता है जब इलेक्ट्रोड प्रतिरोध की निगरानी. इलेक्ट्रोड की नोक क्षतिग्रस्त हो सकती है, क्योंकि प्रतिरोध की अपेक्षा से कम है, जब से बदलें । ब्याज की गहराई पर, खोज और 2 से 5 µm चरणों में गहराई का समायोजन करके एकल इकाई spikes को अलग ।
- के बाद एकल इकाई अलग है, एलईडी प्रकाश देने और प्रकाश उत्तेजनाओं की प्रतिक्रिया का पालन ।
- सेल प्रकार की पहचान के बाद तंत्रिका गतिविधियों रिकॉर्ड । 2 के लिए रिकॉर्डिंग प्रदर्शन-3 एच । यदि रिकॉर्डिंग लगातार दिनों (2 दिन की अधिकतम) पर किया जाता है, सिलिकॉन चिपकने के साथ craniotomy कवर । जब रिकॉर्डिंग समाप्त हो गया है, और पशु त्याग दिया है, सिर के बाद पुनः प्राप्त और इसे धोने और पुन: उपयोग करने के लिए एसीटोन में डाल ।
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Representative Results
चित्रा 2में, हम टिप आकार के प्रभाव और पिपेट की नोक पर प्रकाश बिजली पर कांच पिपेट की लंबाई (चित्रा 2a-बी) की जांच की । प्रकाश बिजली एक ऑप्टिकल बिजली मीटर से मापा गया था 1 मिमी टिप से दूर रखा । पूर्ण लंबाई के लिए सेट किया गया था ५० ± 2 मिमी जब टिप आकार विविध, जबकि टिप आकार २.५ µm के लिए सेट किया गया था जब पूर्ण लंबाई विविध. ग् पिपेट की टांग 8 एमएम निर्धारित की गई थी । टिप पर प्रकाश शक्ति से लेकर 3-5 मेगावाट (± एसडी मतलब; चित्र 2a: ३.७७ ± ०.२९ मेगावाट, n = 20; चित्र 2 बी: ४.२४ ± ०.३१ मेगावाट, n = 21) । पिपेट के टिप आकार (चित्रा 2a) शायद ही प्रकाश शक्ति (आर = ०.१५५५) के साथ संबंधित था । पिपेट की लंबाई केवल थोड़ा एक नकारात्मक तरीके से प्रकाश शक्ति के साथ संबंधित था (आर =-०.२०५४) । इन परिणामों का सुझाव है कि टिप और पिपेट की लंबाई शायद ही कभी नोक पर प्रकाश शक्ति को प्रभावित करते हैं । हमने यह भी चेक किया है कि ग् पिपेट में समाधान (10 mM पंजाब) की मात्रा लोड की मात्रा हल् की शक्ति (figure2c) को प्रभावित करती है । समाधान की मात्रा पिपेट में समाधान की लंबाई द्वारा मूल्यांकन किया गया था । डेटा 4 पिपेट से दर्ज किया गया (टिप आकार: ०.२५ µm, पूरी लंबाई: ५० ± 2 मिमी, टांग की लंबाई: 8 मिमी) । हमने पाया है कि पिपेट में समाधान की मात्रा अलग प्रकाश शक्ति (चित्रा 2c) को प्रभावित नहीं किया ।
चित्रा 3में, हम (2-4 महीने पुराने) जाग VGAT-ChR2 चूहों के अवर colliculus (आईसी) में दर्ज की कील प्रतिक्रियाओं दिखाते हैं । आईसी midbrain में एक श्रवण केंद्र है और glutamatergic और GABAergic ंयूरॉंस के होते है12,13, दोनों जिनमें से3ध्वनि का जवाब,4। VGAT-ChR2 चूहों के आईसी में, GABAergic ंयूरॉंस विशेष रूप से4ChR2 व्यक्त करते हैं । पिछले काम में, यह दिखाया गया है कि GABAergic और glutamatergic न्यूरॉन्स उत्तेजित या दबा दिया गया था, क्रमशः, जब वे प्रकाश उत्तेजनाओं दिया गया3,4. जाग चूहों में, हम दोनों प्रकार के ंयूरॉंस पाया (आंकड़ा 3ए-बी) । जब प्रकाश उत्तेजना ग्लास इलेक्ट्रोड के माध्यम से दिया जाता है, यह कुछ ंयूरॉंस में स्पाइक प्रतिक्रियाओं (3 ए आंकड़ा) पैदा की है । इसके विपरीत, अन्य न्यूरॉन्स में, प्रकाश उत्तेजनाओं ध्वनि उत्तेजनाओं (चित्र बी) द्वारा पैदा स्पाइक प्रतिक्रियाओं को दबा दिया. इन परिणामों से पता चलता है कि एक गिलास optrode अच्छी तरह से पृथक एकल इकाई गतिविधि रिकॉर्ड कर सकते हैं, और मज़बूती से प्रकाश द्वारा दर्ज ंयूरॉंस को उत्तेजित ।
चित्रा 1: Optrode धारक और रिकॉर्डिंग सामान । पैनलों (A) और (B) optrode धारक को दिखाएं । पैनल (क) optrode धारक के भाग संरचना से पता चलता है । (1) यह एक सिरेमिक भाजित संभोग आस्तीन है । (2) यह एक स्टेनलेस स्टील ट्यूब है । (३) यह धारक का प्रति बैरल होता है. (4) यह एक शंकु वॉशर है । (5) यह एक पॉली कैप है । पैनल (ख) इकट्ठे optrode धारक से पता चलता है । पैनलों (C) और (D) कस्टम निर्मित सिर पोस्ट दिखाओ । पैनल (सी) सिर पोस्ट के एक पक्ष को देखने से पता चलता है । पैनल (डी) हेड पोस्ट का एक परोक्ष दृश्य दिखाता है । दो हेड पोस्ट (दाएं) एक सर्किट बोर्ड स्पेसर (बाएं) से बना रहे हैं । पैनलों (E), (F), और (G) कस्टम-निर्मित राल आधा ट्यूब दिखाएँ । पैनलों (ङ) और (च) राल आधा ट्यूब के आयामी चित्र दिखाएँ. पैनल (ई) राल आधा ट्यूब के सामने देखने से पता चलता है । पैनल (एफ) राल आधा ट्यूब की ओर देखने से पता चलता है । पैनल (जी) आधा ट्यूब की एक तस्वीर छवि से पता चलता है । पैनलों (E) और (F) में संख्याएं मिमी में आरेखण आयामों को इंगित करती हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें कृपया ।
चित्रा 2: शीशे के विन्यास का प्रभाव नोक पर प्रकाश शक्ति पर पिपेट. (क) टिप के आकार प्रकाश शक्ति के खिलाफ साजिश रची गई थी । पिपेट की पूरी लंबाई ५० ± 2 मिमी करने के लिए सेट किया गया था । टांग की लंबाई 8 एमएम निर्धारित की गई थी । (ख) पिपेट की लम्बाई प्रकाश शक्ति के विरुद्ध रची गई । टिप आकार ०.२५ µm के लिए सेट किया गया था । टांग की लंबाई 8 एमएम निर्धारित की गई थी । (ग) यह पैनल प्रकाश शक्ति पर समाधान (10 एमएम पंजाबस) के वॉल्यूम लोड का असर दिखाता है । 4 पिपेट से डेटा भिंन प्रतीकों और रेखाओं द्वारा दर्शाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 : प्रकाश जाग VGAT-ChR2 चूहों के आईसी में प्रतिक्रियाओं का आह्वान । (क) प्रकाश उत्तेजनाओं (नीले बॉक्स, ०.०३ एस) स्पाइक प्रतिक्रियाओं का आह्वान । (ख) प्रकाश उत्तेजनाओं (ब्लू बॉक्स, ०.०३ एस) ध्वनि द्वारा पैदा की कील प्रतिक्रियाओं दबा (ग्रे बॉक्स) । ऊपरी 3 निशान ध्वनि करने के लिए प्रतिक्रिया कर रहे हैं, और कम 3 निशान प्रतिक्रिया कर रहे हैं जब दोनों ध्वनि और प्रकाश दिया गया था. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
Optogenetics तंत्रिका विज्ञान में एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है । यह vivo में विशिष्ट ंयूरॉन प्रकार की पहचान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विशिष्ट ंयूरॉंस रास्ते की गतिविधियों में हेरफेर के लिए उपयोग किया गया है । अलग न्यूरॉन प्रकार के तंत्रिका गतिविधियों के स्पष्टीकरण तंत्रिका सर्किट के तंत्र की समझ को बढ़ावा देता है. यहां, हम जाग VGAT-ChR2 चूहों के आईसी में एक गिलास इलेक्ट्रोड के माध्यम से रिकॉर्डिंग साइट के लिए प्रकाश देने के लिए एक विधि का प्रदर्शन किया.
वहां वर्णित विधि में कई महत्वपूर्ण कदम हैं । सबसे पहले, यह लक्ष्य न्यूरॉन्स में opsins की एक पर्याप्त और विशिष्ट अभिव्यक्ति के साथ जानवरों का उपयोग करने के लिए एक आवश्यकता है. extracellular रिकॉर्डिंग के साथ प्रकाश करने के लिए प्रतिक्रियाओं की पहचान करने के लिए, यह आवश्यक है कि opsin के सक्रियकरण लक्ष्य ंयूरॉंस में spikes उदाहरण देते हैं । कुछ ट्रांसजेनिक उपभेदों में, यह संभव है कि न्यूरॉन्स में transgene अभिव्यक्ति स्तर कम है युवा जानवरों में14, और प्रयोग के लिए एक न्यूनतम उम्र हो सकती है. इसके अलावा, यह करने के लिए कुछ अतिरिक्त प्रयोगों की पुष्टि करने के लिए आवश्यक हो सकता है यदि प्रकाश उत्तेजनाओं के लिए प्रतिक्रियाओं को लक्षित ंयूरॉन प्रकार (जैसे, immunohistochemistry) के लिए विशिष्ट हैं । जब लक्ष्य ंयूरॉन उत्तेजक है, यह synapticallyed प्रतिक्रियाओं, जो प्रतिक्रिया की विलंबता थ्रेसहोल्ड द्वारा किया जा सकता से सीधे पैदा प्रतिक्रियाओं भेद करने के लिए आवश्यक होगा । दूसरा, यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है मस्तिष्क ऊतक के रूप में संभव के रूप में साफ है । सफाई के रखरखाव के लिए विशेष रूप से craniotomy और रिकॉर्डिंग के दौरान किसी भी रक्तस्राव को रोकने के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, मस्तिष्क की सतह सिलिकॉन चिपकने के साथ कसकर सतह को कवर करके craniotomy के बाद सुखाने से रोका जाना चाहिए ।
इलेक्ट्रोड टिप से प्रकाश कुशलतापूर्वक वितरित करने के लिए, यह ऑप्टिकल पथ में किसी भी हानि को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है. optrode के हमारे विंयास में, प्रकाश शक्ति इलेक्ट्रोड धारक के माध्यम से दस गुना गिरता है: प्रकाश शक्ति फाइबर ऑप्टिक पैच कॉर्ड के अंत में ४५ मेगावाट है, जबकि यह ग्लास पिपेट की नोक पर 3-5 मेगावाट है । के रूप में परिणामों में दिखाया गया है, टिप आकार और पूरी लंबाई टिप (चित्रा 2) पर प्रकाश शक्ति को प्रभावित नहीं किया । इन परिणामों से संकेत दिया कि प्रकाश क्षीणन काफी स्थिर कांच पिपेट के विंयास की परवाह किए बिना किया गया था । यह प्रकाश क्षीणन VGAT-ChR2 चूहों में आईसी न्यूरॉन्स की रिकॉर्डिंग में बात नहीं की है क्योंकि हम पुष्टि की है कि यह ventral एज (2 मिमी गहराई) में आईसी प्रकाश सक्रिय spikes रिकॉर्ड करने के लिए संभव था, हालांकि यह अन्य रिकॉर्डिंग विन्यास में बात कर सकते हैं. यह प्रकाश क्षीणन नाटकीय रूप से कम करने के लिए मुश्किल होगा, लेकिन वहां सुधार के लिए संभावनाएं हो सकती है । सबसे पहले, यह एक इलेक्ट्रोड पिपेट के रूप में एक borosilicate ग्लास के बजाय क्वार्ट्ज का उपयोग करने के लिए प्रभावी हो सकता है. यह ज्ञात है कि क्वार्ट्ज बेहतर प्रकाश चालकता है, ताकि यह इलेक्ट्रोड15के माध्यम से प्रकाश हानि को कम कर सकते हैं । साथ ही, यह भी बताया गया कि पिपेट के अंत की पोलिश पिपेट और पैच कॉर्ड15के बीच संपर्क सतह पर हल्के नुकसान कम हो गया । यदि प्रकाश क्षीणन में सुधार पर्याप्त नहीं है, यह एक लेज़र के बजाय एलईडी का उपयोग करने के लिए प्रभावी होगा, हालांकि लेजर एलईडी से अधिक लागत ।
ग्लास पिपेट इलेक्ट्रोड के फायदों में से एक यह है कि इसे भरने के समाधान के लिए अनुरेखकों या वैक्टर जोड़कर ऊतकवैज्ञानिक प्रक्रियाओं का प्रदर्शन संभव है. ऊतकवैज्ञानिक प्रक्रियाओं उपयोगी जानकारी का एक बड़ा सौदा जोड़ देगा (रिकॉर्डिंग का स्थान, दर्ज की आकृति विज्ञान ंयूरॉन, आदि) electrophysiological डेटा के लिए . इसके अलावा, यह है कि यह औषधीय सर्वेक्षण भरने समाधान15में ब्लॉकर्स के साथ कांच इलेक्ट्रोड का उपयोग कर प्रदर्शन करने के लिए संभव है कि बताया गया था । इन फायदों के विपरीत, कांच पिपेट इलेक्ट्रोड की सीमा है कि यह एकाधिक पृथक इकाइयों से रिकॉर्ड नहीं कर सकता है । कई रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए, यह एक एकल एजी सीएल लेपित तार के बजाय गिलास पिपेट में एक tetrode तार डाल करने के लिए संभव हो सकता है । इस मामले में, यह एक बड़ा टिप आकार के साथ एक पिपेट का उपयोग करने के लिए आवश्यक होगा (30 – 60 µm, एक tetrode के ठेठ टिप आकार) और पिपेट की नोक से बाहर tetrode के अंत जाने.
जबकि पहले optrodes की सूचना दी अक्सर आवश्यक जटिल16,17, दाना और उनके सहयोगियों ने एक optrode विकसित किया है मानक ग्लास पिपेट का उपयोग कर के रूप में optrode हम18डिजाइन के साथ । उनकी विधि में, वे प्रकाश देने के लिए पिपेट में एक पतली ऑप्टिकल फाइबर डालें । फाइबर काफी पतली पिपेट की टांग डालने के लिए बनाने के लिए, वे एक 9 µm कोर के साथ १२५ µm cladding फाइबर धंसा 8-10 µm टिप पर । इस विधि का लाभ यह है कि यह भी तुला पिपेट है कि अक्सर iontophoresis के लिए प्रयोग किया जाता है के लिए लागू होगा । हालांकि, यह एक प्रकाश स्रोत के रूप में एलईडी का उपयोग करने के लिए कठिन हो सकता है क्योंकि मानक वाणिज्यिक एल ई डी एक 9 µm कोर फाइबर के माध्यम से पर्याप्त प्रकाश शक्ति को प्राप्त नहीं होगा.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक जापान सोसायटी द्वारा विज्ञान KAKENHI अनुदान JP16K11200 और 17H02223 के संवर्धन के लिए समर्थन किया गया था, और कनाजावा चिकित्सा विश्वविद्यालय S2016 से अनुसंधान के लिए अनुदान-8 और C2017-3 । हम तस्वीरें लेने में उनके समर्थन के लिए Yuhichi कुडा धंयवाद ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrode holder | Molecular Device | 1-HL-U | pipette holder for microelectrode amplifier |
| Ceramic split mating sleeve | Thorlabs | ADAF1 | f2.5 mm ferrule |
| Circuit board spacer | Teishin Denki | SPA-320 | f8.0 mm, 20.0 mm long |
| Stereotaxic frame for mice | Narishige | SR-6M-HT | Stereotaxic instruments for mice |
| Manipulator | Narishige | NA | Manual manipulator |
| Superbond | Sun Medical | M: 204610557 | Dental adhesive resin cement |
| Form2 | Formlabs | NA | 3D printer |
| Kwik-Sil | WPI | KWIK-SIL | Low toxicity silicone adhesive |
| Borosilicate glass capillaries | Narishige | GD-1.5 | OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 90.0 mm long |
| Fiber-optic patch cord | Doric Lenses | MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5 | Monofiberoptic patchcord, OD, 2.5 mm, core = 960 mm, cladding = 1000 mm, NA = 0.63 |
| Connectrized LED | Doric Lenses | LEDC-1B_FC | Central wave length = 465 nm, output power = 45 mW (Core 960 mm 0.63 NA ) |
| LED driver | Doric Lenses | LEDRV_1CH_1000 | 1 ch LED driver, maximum output = 1000 mA |
| Electrode puller | Narishige | PB-7 | Dual-stage glass micropipette puller |
| Borosilicate glass capillary | Narishige | GD-1.5 | Bolosilicate glass capillary, OD, 1.5mm, ID, 0.9 mm, 90.0 mm long |
| GENTACIN | MSD CO., Ltd | 185711173 | Antibiotic ointment |
| Terramycin®-LA | Zoetis | G 333 | Oxytetracycline |
| Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J | Jackson Labs | #14548 | VGAT-ChR2 mice |
| Multiclamp 700B | Molecular Devices | 2500-0157 | Microelectrode amplifier |
References
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- Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216 (2015).
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