Summary
Protokollen beskrevet her udnytter en photolabeling tilgang i nyfødte mus til specifikt at identificere immunceller, der udvandrer fra tyktarmen til ekstra intestinal websteder. Denne strategi vil være nyttigt at studere vært-microbiome interaktioner tidligt i livet.
Abstract
Enterisk bakterielle samfund er etableret tidligt i livet og påvirke immun celle udvikling og funktion. Den neonatale mikrobiota er modtagelige for mange ydre påvirkninger herunder antibiotika brug og kost, som påvirker modtagelighed for autoimmune og inflammatoriske sygdomme. Lidelser såsom inflammatoriske tarm sygdom (IBD) er karakteriseret ved en massiv tilstrømning af immunceller tarmene. Dog kan immunceller betinget af mikrobiota desuden emigrere ud af tarmene til at påvirke immunrespons på ekstra intestinal websteder. Der er således behov for at identificere og karakterisere celler, der kan bære mikrobielle beskeder fra tarmene til distale websteder. Her, beskriver vi en metode til at mærke cellerne i tyktarmen af nyfødte mus i vivo der giver deres identifikation på ekstra intestinal websteder efter overflytningen.
Introduction
Pattedyr mavetarmkanalen havne hundredvis af arter af bakterier, der findes i et symbiotisk forhold med vært1. Immunceller til stede i det lokale miljø håndhæve en fredelig sameksistens med disse mikrober og oprette en beskyttende barriere mod patogenet invasioner. Bi-directional interaktion mellem immunceller og mikrobiota er derfor kritisk at etablere et commensal samfund, der uddanner vært immunsystemet og angiver tærsklen for immun reaktivitet til patogener. Ændringer i den mikrobielle sammensætning eller dysbiosis, kan forstyrre den immun homøostase og forurolige regulerende kredsløb, der hæmmer intestinal betændelser fører til immun-medierede sygdomme som Type 1 Diabetes og IBD2,3 .
Perioden umiddelbart efter fødsel er en unik udviklingsmæssige vindue hvor de intestinale mikrobielle samfund begynder at etablere samtidig immunforsvaret modnes4. Den postnatale mikrobiota er ikke stabil, med skiftehold i Fællesskabet sammensætning forekommer naturligt og ofte5. De immunceller, der interagerer med mikrobiota bosat i to forskellige anatomiske steder i tarmen - lamina propria og den intestinale epitel6. Mange typer af immunceller er til stede i tarmen, herunder lymfocytter (som T-celler, B-celler og medfødte lymfoide celler) samt myeloide celler (som omfatter dendritiske celler, monocytter og makrofager). Disse celler, også kendt som hæmatopoietisk celler, udføre et væld af funktioner, der bevarer den intestinale barriere og opretholde homeostase.
Ud over deres lovgivningsmæssige funktioner på intestinal websteder, kan immunceller af slimhinden endvidere foretage mikrobielle meddelelser til de ekstra intestinal steder at regulere systemisk immunitet7,8,9. Det er et område af voksende forskningsinteresse og fremhæver behovet for metoder til at identificere immunceller, der vandrer ud af tarmens væv for at sonde deres funktion. Protokollen rapporteret her udnytter et kommercielt tilgængelige musemodel, hvor en photoconvertible fluorescerende proteiner er udnyttet til etiketten celler. PhAMskåret ud mus udtrykke allestedsnærværende en grøn fluorescerende Dendra2 protein, der er uigenkaldeligt skiftede til rød fluorescens ved aktivering af ultraviolet (UV) lys10. Ved hjælp af en fiber optic kanyle til at levere 405 nm lys ind i tyktarmen af nyfødte mus, viser vi, at photoconverted hæmatopoietisk celler, som har oprindelse i eller passeres gennem tyktarmen kan findes i milten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr procedurer blev udført med godkendelse af og i overensstemmelse med den institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på Massachusetts General Hospital.
Advarsel: Denne protokol indebærer brug af en laser af klasse 3b (LG3). LG3 laser beskyttelsesbriller skal altid bruges, når de opererer denne laser. Passende uddannelse og sikkerhed retningslinjer skal følges for at undgå risikoen for skader.
1. design og montering af Laser
- Tilslut lysdiode (LED) (405 nm, 19.3 mW, 1400 mA, fiber-kombineret) til LED driver via 4-pin M8-stik kabel, der kommer knyttet til LED. Omhyggeligt stramme skruen for at fastgøre forbindelsen.
- Før du sætter optogenetics patch kabel til LED, holde stikket åbningen af LED for lys til at sikre, at der er ingen synlige forhindringer. Slag på hullet til at fjerne eventuelle blokeringer, hvis det er nødvendigt og indsætte optogenetics patch kabel i åbningen.
- Tilslut fiber optic kanyle til optogenetics patch kabel ved at indsætte kanylen i hver ende af stikket ærme. Fastgør anden enden af stikket ærme til patch-kabel. Anvende nok pres for at sikre forbindelsen, men pas på ikke at bøje eller bryde den optiske fiber i kanylen.
Bemærk: Den skrøbelige fiber optic kanyle er dækket med beskyttelseshætten når laseren ikke er i brug. - Indstillet LED-driver til kontinuerlig bølge (CW) med den løbende tilpasning knop på 0 og den nuværende grænse er fastsat til 1.2 A.
2. Photoconversion af celler i tyktarmen
Bemærk: Mandlige og kvindelige mus blev udsat for intracolonic 405 nm lys 1-2 dage efter deres fødsel og blev ofret inden 1 uge gammel.
- Sikre et mørkt sted med adgang til en stikkontakt. Sæt LED-driver til stikkontakten.
Bemærk: Denne procedure er udført i den minimale hvidt lys, som en lang eksponering af mus til det omgivende lys kan medføre en uønsket photoconversion af celler. Rødt lys bruges som et alternativ.
Advarsel: Følgende trin indebærer brug af et dyre bedøvelsesmiddel. Administration af narkose finder sted i en klasse II hætte eller ved hjælp af en anden passende skylleluften system. Indånding af narkose kan forårsage svimmelhed, døsighed, eller endda bevidstløshed. - Bedøver musen ved udsættelse for 4-5% isofluran i 100% O2 i en induktion boks. Kontrollér korrekt dybde af anæstesi af fast klemme en hind pote (intet svar). Opretholde anesthesia via næsen kegle på ca 2% isofluran. Forhindre handleren eksponering for isofluran ved hjælp af en passende hood eller bedøvende skylleluften enhed.
- Placer den bedøvede mus for intracolonic eksponering ved hjælp af 1 hånd til harmoniske ryg musen forsigtigt med pegefinger og tommelfinger. Vend musen for at eksponere maven. Løsn grebet, hvis musen begynder at miste sin lyserøde farve, eller hvis dens vejrtrækning begynder at aftage. Sikre hale af musen mellem ringen og små fingre.
- Med anden hånden, Fjern beskyttelseshætten fra kanylen. Samtidig med at indsætte den lange akse af kanylen parallelt med musens midterlinjen, forsigtigt fiber optic kanyle gennem anus i tyktarmen, så alle 5 mm optisk fiber er inde i musen.
Bemærk: Denne procedure udføres langsomt og forsigtigt for ikke at perforere den kolon væg. Minut vrikke og vride af kanylen aids avancement i tyktarmen. - Don beskyttelsesbriller og øge laser nuværende til den maksimale værdi (hele vejen med uret). Bekræfte tilstedeværelsen af UV-lys ved at kigge på gennemskinnelig maven af musen.
Bemærk: LG3 laser sikkerhed goggles dramatisk mindske synligheden. Har en kollega (iført beskyttelsesudstyr) bistå i påtagning beskyttelsesbriller og dreje på laser. - Udsætte kolon til laserlys for et samlet beløb på 2 min. Udbetal kanyle ca 1 mm hver 30 s til at maksimere den luminale område udsat for lys. I slutningen af 2 min, sluk laser.
- Langsomt fjernes kanylen fra musen. Efter at inddrive fra anæstesi i en tom varm bur, returnere musen til burene.
3. isolering af Intestinal lymfocytter
- Forbered 1 L af Hank's Balanced Salt løsning/kalv serum (HBSS/CS) buffer, 200 mL af epitel strip buffer, 500 mL af vask medier og 200 mL ethylendiamintetra syre (EDTA)-gratis vask medier.
Bemærk: Reagens diskenheder er beregnet for en stikprøve på 9.- Gøre HBSS/CS buffer (HBSS, 5% CS) ved at tilføje 50 mL af CS til 950 mL af HBSS. Det opbevares på is.
- Forberede epitelial strip buffer [HBSS, 5% CS, 1 mM dithiothreitol (DTT); 5 mM EDTA, 15 mM 4-(2-Hydroxyethyl) piperazin-1-ethanesulfonic syre (HEPES) (pH 7,2-7,5)] ved tilsætning af 10 mL af CS, 200 µL 1 M DTT, 2 mL 0,5 M EDTA og 3 mL 1 M HEPES buffer til 185 mL af HBSS. Sted epitelial strip buffer i et 37 ° C vandbad.
- Gør vask media (HBSS; 1% CS, 1 mM EDTA) ved at tilføje 5 mL af CS og 1 mL 0,5 M EDTA 494 mL af HBSS. Opbevar den ved stuetemperatur.
- Forbered EDTA-gratis vask medierne (HBSS; 1% CS, 15 mM HEPES) ved at tilføje 2 mL af CS og 3 mL 1 M HEPES til 195 mL af HBSS. Opbevar den ved stuetemperatur.
- Gøre en FACS buffer [1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) (pH = 7,2); 2% CS] ved tilsætning af 10 mL af CS til 490 mL PBS. Det opbevares på is.
- Forberede væv samling skålen ved at placere en 70 µm celle si inde en 60 x 10 mm kultur parabol. Der tilsættes 10 mL af HBSS/CS buffer (HBSS, 5% CS buffer foretaget i trin 3.1.1 og opbevares på is) til fadet og placere den på isen.
- Aflive mus via en overdosis af inhaleret isofluran ved hjælp af passende scavenging af anæstesi (en ca. 3 min eksponering > 4% isofluran i rumluften eller i 100% O2). Efter tilsyneladende ophør af vejrtrækning og refleks bevægelse, bekræfte fravær af dyb smerte ved fast klemme en hind pote (ved hjælp af pincet anbefales). Sikre aktiv dødshjælp via en halshugning ved hjælp af enten et par kirurgisk saks eller en ny straight razor.
Bemærk: Cervikal dislokation anbefales ikke til dette trin på grund af størrelse og alder. Disse metoder er i overensstemmelse med retningslinjerne 2013 AVMA om aktiv dødshjælp og godkendt af MGH IACUC. - Høste tyktarmen ved hjælp af ren pincet og saks til at åbne i maven. Afspejle tarmene til 1 side af musens maven til at udsætte kolonet. Fjerne hele tyktarmen ved første transecting det lige distalt (mod anus) til coecum. Derefter, mens fast fatte tyktarmen med pincet, bruge saks til at skære gennem urinrøret til endetarmen. Skære i tyktarmen som tæt på anus som muligt. Høste milten efter fjernelse af tyktarmen (Se trin 4.1-4.2 nedenfor).
Bemærk: Mens photoconversion protokol mål kun ~ 25% af de nyfødte kolon (5 mm i fiber optic kanyle), hele tyktarmen er høstet støtte i celle isolation. - Rense tyktarmen ved hjælp af pincet til at skubbe indholdet ud af tyktarmen og på en tør køkkenrulle. Homogeniseres væv ved hjælp af barberblade til fint snittes tyktarmen i en pasta på forsiden af en kultur parabol og derefter overføre denne pasta til celle sien i petriskålen.
- Tilføje en ren 8 mm lange magnetiske rør bar til sien og Placer skålen på en 9-position magnetomrører plade. Indstille den magnetiske rør bar hastighed til 800 rpm og inkuberes celler i 5 min ved stuetemperatur. Kassér bufferen og Gentag vask ved hjælp af 10 mL af HBSS/CS (HBSS, 5% CS buffer foretaget i trin 3.1.1 og opbevares på is). Kassér bufferen i slutningen af vask.
- Adskille epitelceller ved tilsætning af 10 mL af forvarmet epitelial strip buffer (HBSS 5% CS 1mM DTT; 5mM EDTA; 15mM HEPES [pH 7,2-7,5] buffer, der blev foretaget i trin 3.1.2 og gemmes i et 37 ° C vandbad) til celle sien og røre ved 800 rpm i 30 min. i en 3 7 ° C inkubator. Overføre bufferen beriget i epitelial fraktion til en ren 15 mL rør for enden af inkubation.
Bemærk: Epitel og tilknyttede celler (intestinale epitel celler og de intestinale epitel lymfocytter) udgivet i bufferen, mens cellerne i den intakte lamina propria forbliver på celle sien under dette trin11.- Der centrifugeres den beriget intestinale epitel brøkdel (IELs) på 700 x g i 5 min ved stuetemperatur. Supernatanten og celle resuspenderes i 1 mL af FACS buffer. Det opbevares på is til brug i trin 3.15.
- Vaske lamina propria fraktion inden for celle si 2 x med HBSS/CS. At gøre det, der tilsættes 10 mL af HBSS/CS løsning (HBSS, 5% CS buffer, der blev foretaget i trin 3.1.1, der er gemt på is) til celle sien og rør det på 800 rpm i 5 min i et 37 ° C inkubator. Kassér bufferen efter hver vask.
- Vaske prøve 2 x i vask medier. Der tilsættes 10 mL af vask media (HBSS; 1% CS, 1 mM EDTA buffer, der blev foretaget i trin 3.1.3 og opbevares ved stuetemperatur) til celle si og rør det på 800 rpm i 15 min. i et 37 ° C inkubator. Kassér bufferen efter hver vask.
- Efter brug vaskes medier, opbevares på is til brug i trin 3.14.
- Vaske prøve 2 x med HBSS/CS. tilsættes 10 mL af HBSS/CS buffer (HBSS, 5% CS buffer i trin 3.1.1, der har været opbevaret på køl) til celle sien og rør det på 800 rpm i 5 min i et 37 ° C inkubator. Kassér bufferen efter hver vask.
- Inkuber væv i EDTA-fri wash buffer. Der tilsættes 10 mL af EDTA-fri wash buffer (HBSS; 1% CS, 15 mM HEPES buffer, der blev foretaget i trin 3.1.4 og opbevares ved stuetemperatur) til celle sien og inkuberes plade i 10 min. ved stuetemperatur uden omrøring. Kassér bufferen i slutningen af dette trin.
- Vaske prøve 2 x med HBSS/CS og forberede enzym løsning. Der tilsættes 10 mL af HBSS/CS (HBSS, 5% CS buffer i trin 3.1.1, der er gemt på is) buffer til celle sien og rør det på 800 rpm i 10 min i et 37 ° C inkubator. Kassér bufferen efter hver vask.
- Forberede enzym løsning (EDTA-gratis vask buffer; 0,1 mg/mL DNase I; 167 mg/mL collagenase) i den anden periode, vask: tilføje 9 mg af DNase jeg og 15 mg af frysetørrede collagenase 90 ml EDTA-gratis vask buffer. Gemme løsning ved stuetemperatur.
- Fordøje lamina propria brøkdel indeholdt i celle si at opnå lamina propria lymfocytter (LPLs). Der tilsættes 10 mL af opløsningen enzym (EDTA-fri vaskebuffer; 0,1 mg/mL DNase I; 167 mg/mL collagenase buffer foretaget i trin 3.12.1 og opbevares ved stuetemperatur) til celle sien og rør det på 800 rpm for 45 min i et 37 ° C inkubator.
Bemærk: LPLs frigives til løsningen efter enzymatisk fordøjelsen.- Indsamle enzym løsning med cellerne og filtrere det gennem en ny celle si i en 50 mL konisk slange.
- Der tilsættes 20 mL af kold vask medier (HBSS; 1% CS; 1mM EDTA buffer i trin 3.1.3 og lagret på is i trin 3.9.1) til de filtrerede celler til at blokere collagenase aktivitet i opløsningen enzym. Der centrifugeres tube på 700 x g for 6 min. ved stuetemperatur. Supernatanten og resuspenderes indeholdende LPLs i 1 mL af FACS buffer.
- Kombinere IEL (fra trin 3.7.1) eller LPL (fra trin 3.14) brøkdele og bejdse dem med fluorescerende-konjugerede antistoffer for flow cytometric analyse (Se trin 5).
Bemærk: IEL og LPL fraktioner kan farves separat hvis rum oplysninger ønskes.
4. isolering af lymfocytter fra milten
- Forberede indsamling rør ved at tilføje 500 µL af FACS buffer ind i et microcentrifuge rør. Gemme det på isen.
- Efter fjernelse af tyktarmen (trin 3,4), høste hele milten og placere den i collection tube. Gemme vævet på is.
- Ved hjælp af en elektrisk væv homogeniseringsapparat homogeniseres milten i et microcentrifuge rør i ca 1 min. Centrifuge stikprøve på 300 x g [mikro centrifuge] i 5 min ved stuetemperatur og aspirat off supernatanten.
- Udføre røde blodlegemer lysering af resuspending prøven i 500 µL af ammonium-chlorid-kalium (ACK) lysisbuffer at indlede celledød af osmotisk lysering. Tillad prøven Inkubér 1-2 min. ved stuetemperatur og derefter resuspend det i 725 µL af FACS buffer.
- Der centrifugeres stikprøve på 300 x g [mikro centrifuge] i 5 min ved stuetemperatur og aspirat off supernatanten. Resuspenderes i 500 µL af FACS buffer og filtrere det gennem en 40 µm celle si ind i en ny microcentrifuge rør. Overføre hele prøven til et nyt microcentrifuge-rør og bejdse det med fluorescerende-konjugerede antistoffer for flow cytometric analyse (Se trin 5).
5. identifikation af Dendra-r+ celler ved hjælp af Flow flowcytometri
- Der centrifugeres IEL/LPL og milt prøverne ved 300 x g [mikro centrifuge] i 5 min. ved stuetemperatur og aspirat off supernatanten.
- Resuspend pellets i 100 µL antistof farvning mix. Forberede antistof farvning mix ved at tilføje 1 µL af fluorescently-konjugerede anti-CD45 antistof til 100 µL af FACS buffer pr. prøve.
Bemærk: Det er vigtigt at titreres antistofferne anvendes til flowcytometri før forsøget for at bestemme den optimale koncentration hvor bindende mætning opstår. - Inkuber prøver for 35 min på is (i et mørkt sted).
- Resuspend prøverne i 300 µL af FACS buffer og centrifugeres dem ved 300 x g [mikro centrifuge] i 5 min ved stuetemperatur. Opsug supernatanten og resuspend prøverne i 325 µL af FACS buffer. Analysere prøver på en flow Flowcytometret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En fiber-optisk kabel blev brugt til at levere 405 nm lys i kolon af 2 - døgn gammel PhAMskåret ud mus. I tidligere forsøg, en 30 s eksponering var fast besluttet på at give en maksimal photoconversion af kolon celler med minimal cytotoksicitet (fig. 1A). Derfor gennemførte sekventielle 30 s engagementer i forskellige segmenter af tyktarmen, som beskrevet i protokollen. Efter laser eksponering, musene blev straks aflives, og photoconversion af celler blev fastsat. Encellede præparater af den samlede Colon væv var plettet med fluorescerende-konjugerede anti-CD45 antistof og flow cytometric analyse blev udført for at registrere photoconversion. Uomvendte Dendra2-grøn (Dendra-g) protein har excitations- og maxima på 490 og 553 nm henholdsvis og kan påvises i FITC-kanal, der henviser til, at photoconverted Dendra2-rød (Dendra-r) protein har excitations- og maxima på 507 og 573 nm henholdsvis og kan påvises i PE-kanal af et flow Flowcytometret. Når uigenkaldeligt skiftede til den røde form, Dendra2 er meget photostable og nyttig for langsigtet tracking applikationer.
Ingen Dendra-r+ celler blev opdaget i unlasered mus (figur 1B venstre). Men 405 nm lys eksponering resulterede i særskilte Dendra-r+ cellepopulationer i både CD45neg og CD45+ celle rum (figur 1B ret). Til at bestemme, hvis Colon photoconversion protokol resulterede i baggrunden mærkning af celler på ekstra intestinal websteder, vi høstede milt fra nyligt photoconverted mus (T = 0) og analyseres for Dendra-r+ celler ved flowcytometri. Ingen Dendra-r+ celler blev opdaget i CD45neg eller CD45+ celle rum (figur 1C), hvilket tyder på, at intra-Colon laserstrålen ikke trænger nok til at photolabel celler i milten. Således enhver Dendra-r+ celler opdaget i milten efter giver tid til migration (T = 3d, 5d) bør stamme fra tyktarmen.
Figur 1 : In vivo photoconversion af Colon væv. Cellerne i tyktarmen fra 2 - døgn gammel PhAMskåret ud unger blev udsat for intra-Colon 405 nm lys for 30 s som beskrevet. Photoconversion og mærkning af celler blev bestemt umiddelbart efter indgrebet (T = 0) ved en cytometric analyse af encellede præparater af Colon væv og milt. (A) denne repræsentative flow cytometric dot plot viser udtryk for CD45 (x-akse) og farvning af levende døde farvestof (y-akse) i én celle præparater fra kolon af kontrol og laserbehandlet mus. Paneler B og C er repræsentative flow cytometric dot plot overlejringer, som viser et udtryk for Dendra2-grønne protein (Dendra2-g, vandrette akse) og Dendra2-rød protein (Dendra2-r, lodret akse) i kontrol-eksponerede og udsat CD45+ (hæmatopoietisk) og CD45neg (ikke-hæmatopoietisk) celler i (B) kolon og ()C) milten. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Data fra en typisk photoconversion eksperiment at identificere vandrende celler i milt er vist i figur 2. Photoconversion af celler i kolon af 2 - døgn gammel PhAMskåret ud mus blev udført som i figur 1. Mus blev aflivet 3-5 dage efter eksponering og tilstedeværelse af Dendra-r+ celler i milt blev bestemt ved flowcytometri. Der var ingen Dendra-r+ celler i CD45neg celle delmængde, overensstemmelse med den opfattelse, at CD45neg celler primært epitel og andre strukturelle celler af tarmen. Nogle CD45+ hæmatopoietisk celler udtrykt Dendra-r, hvilket tyder på at de havde været photoconverted i tyktarmen og migreret til milten.
Figur 2 : CD45+ hæmatopoietisk celler vandrer fra tyktarmen til milten. Nyfødte (dag 0 - 2) PhAMskåret ud mus blev udsat for 405 nm lys til photoconvert Dendra2 protein af intra-Colon eksponering. Repræsentative flow flowcytometri parceller Vis udtryk for Dendra2-grønne protein (Dendra2-g, vandrette akse) og Dendra2-rød protein (Dendra2-r, lodret akse) i CD45neg og CD45+ milt celler af eksponerede 5 dage gamle mus og udsat mus analyseret på 3 og 5 dage (T = 3d, 5d) efter photoconversion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Identifikation og karakterisering af celler, der interagerer med og er påvirket af mikrobiota i tyktarmen er vigtige og bør lette forståelsen af hvordan oplysninger fra den slimhinde mikromiljø videresendes til resten af kroppen. En metode til at studere gut-relateret celle migration kræver isolering af gut-associerede celler efterfulgt af en adoptiv overførsel til recipient mus til at bestemme deres væv-homing mønstre og fungere12,13. Denne tilgang er begrænset, så kun specifikke celletyper, der blev overført kan spores. Yderligere, artefakter som følge af isolation af celler fra væv og rensningsprocessen kan hindre den i vivo vandrende proces. For nylig, en endoskopisk photoconversion protokol at mærke tarmens celler ved hjælp af Kaede mus blev rapporteret14. Denne undersøgelse fandt en bred handel af leukocytter til og fra tarmen med voksne mus.
Vores rapport beskriver en metode til at mærke cellerne i tyktarmen af nyfødte mus og spore deres migration til ekstra intestinal steder såsom milten. PhAMskåret ud mus udtrykker allestedsnærværende en photoconvertible grøn fluorescerende Dendra2 protein, der er uigenkaldeligt skiftede til rød fluorescens ved dens aktivering af UV-lys. Eksponering af koloner af nyfødte mus til 405 nm lys mærket begge CD45+ hæmatopoietisk og CD45neg ikke-hæmatopoietisk celler. CD45+Dendra2-red+ celler blev opdaget i milten 3 til 5 dage efter photoconversion, der angiver den ekstra intestinal migration af hæmatopoietisk celler.
Det hastighedsbegrænsende trin for denne analyse er brøkdel af området Colon, der er udsat for 405 nm lys. Skrøbeligheden af den nyfødte kolon og tilstedeværelsen af fæces, begrænse omend minimal i denne tidlige alder, længden af fiber optic kanyle, der kan indsættes. I tidligere forsøg, kunne en længere kanyle ikke være indsat mere end 5 mm. Smøremidler blev undgået på grund af risikoen for den variable lys brydning af laserstrålen. Passiv bevægelse af kanylen hver 30 s hjalp maksimere området Colon udsat for laserlys. Vigtigere er, en kanyle med en stor NA værdi (NA = 0,5) blev brugt til at generere en bred kegle af lys i tyktarmen.
Denne protokol er blevet standardiseret for nyfødte (dag 0 - 2) PhAMskåret ud unger. I betragtning af ændringerne i indhold og længde af tyktarmen med en alder af mus, skal teknikken optimeres i overensstemmelse hermed, når du bruger ældre unger. Først og fremmest bliver ændringer til den samlede varighed af photoconversion og længde for indsættelse af fiber optic kanylen nødvendigt.
Denne tilgang til at forstå den vandrende opførsel af celler i tyktarmen er lettet af flow cytometric analyse. Multi-parameter flowcytometri kan yderligere bruges til at identificere og fænotype den vandrende immun celle typer inden for CD45+ celle delmængde. Dendra2-r+ celler kan også sorteres efter FACS til downstream applikationer såsom gen expression profilering eller proteomics analyser. Mens rettet til forståelsen af hæmatopoietisk celle subsets i tyktarmen i denne undersøgelse, kan metoden tilpasses for at studere cellulær migration fra yderligere væv sites herunder hjernen og huden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Flemming Ørholt Jain blev støttet af en NIH/NIAID karriere overgang pris 1K22AI116661-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser | |||
| Light Emitting Diode (LED) | THORLABS | M405FP1 | CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 |
| LED driver | THORLABS | LEDD1B | Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 |
| Optogenetics patch cable | THORLABS | M87L01 | 1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454 |
| Fiber optic cannula | Doric lenses | MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 | 5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036 |
| Power supply | THORLABS | KPS101 | Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 |
| LG3 laser safety goggles | THORLABS | LG3 | Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 |
| Red light | Electron Microscopy Sciences | 74327-10 | 15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences |
| Intestinal cell isolation | |||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3 |
| 1X HBSS | Gibco | 14025076 | Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 |
| Calf Serum | Hyclone AZM | 197696 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 |
| DTT | Sigma | 10197777001 | CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US |
| HEPES | Gibco | 15630080 | 1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 |
| Petri dish | Corning | 353004 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F |
| 70 micron cell strainer | Falcon | 352350 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712 |
| Micro magnetic stir bar | Fisherbrand | 1451364 | Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364 |
| Magnetic stir plate | Corning Laboratory Stirrers | 440826 | https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE |
| Collagenase | Roche | 5401020001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE |
| DNase I | Sigma | 10104159001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US |
| 1X PBS | Gibco | 20012-027 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 |
| Pipet aid | Thermo Scientific | 14387165 | https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357530 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357515 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 15 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339651 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339653 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| Single cell suspension | |||
| Eppendorf tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx |
| Tissue homogenizer | Kimble | K7495400000 | Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000 |
| Homogenizer tips | Kimble | 7495210590 | Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| Antibodies | |||
| BV786 anti-mouse CD45 | BD | 564225 | Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 |
| Live/Dead | Invitrogen | L34962 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962 |
| Other | |||
| Razor blades | VWR | 55411-050 | Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades |
References
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489, 231-241 (2012).
- Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes. Journal of Immunology. 198, 590-595 (2017).
- Mathis, D., Benoist, C. Microbiota and autoimmune disease: the hosted self. Cell Host Microbe. 10, 297-301 (2011).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46, 350-363 (2017).
- Jain, N., Walker, W. A. Diet and host-microbial crosstalk in postnatal intestinal immune homeostasis. Nature Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 12, 14-25 (2015).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews in Immunology. 14, 667-685 (2014).
- Macpherson, A. J., Uhr, T. Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria. Science. 303, 1662-1665 (2004).
- Mowat, A. M. Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens. Nature Reviews in Immunology. 3, 331-341 (2003).
- Diehl, G. E., et al. Microbiota restricts trafficking of bacteria to mesenteric lymph nodes by CX(3)CR1(hi) cells. Nature. 494 (3), 116-120 (2013).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50, 833-843 (2012).
- Conway, K. L., et al. ATG5 regulates plasma cell differentiation. Autophagy. 9, 528-537 (2013).
- Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii. Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).
- Guo, X., Muite, K., Wroblewska, J., Fu, Y. X. Purification and Adoptive Transfer of Group 3 Gut Innate Lymphoid Cells. Methods in Molecular Biology. 1422, 189-196 (2016).
- Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).
