Summary
El protocolo descrito aquí utiliza un enfoque photolabeling en ratones recién nacidos para identificar específicamente las células inmunes que emigran desde el colon a sitios extraintestinales. Esta estrategia será útil para estudiar las interacciones host microbioma en primeros años de vida.
Abstract
Comunidades bacterianas entéricas se establecen temprano en la vida e influyen en la función y desarrollo de las células inmunes. La microbiota neonatal es susceptible a numerosas influencias externas, incluyendo el uso de antibióticos y dieta, que afecta la susceptibilidad a enfermedades autoinmunes e inflamatorias. Trastornos como enfermedad de intestino inflamatoria (IBD) se caracterizan por una afluencia masiva de las células inmunes a los intestinos. Sin embargo, las células inmunológicas condicionadas por la microbiota además pueden emigrar fuera de los intestinos para influir en las respuestas inmunitarias en sitios extraintestinales. Por lo tanto, es necesario identificar y caracterizar las células que lleven mensajes microbianos de los intestinos a sitios distales. Aquí, describimos un método para células de etiqueta en el colon de ratones recién nacidos en vivo que permite su identificación en sitios extra intestinales después de la migración.
Introduction
El tracto gastrointestinal de mamífero alberga cientos de especies de bacterias que existen en una relación simbiótica con el huésped1. Las células inmunes presentes en el medio local hacer una convivencia con estos microbios y establecen una barrera protectora contra invasiones de patógeno. Así, las interacciones bidireccionales entre las células inmunes y la microbiota son críticas para establecer una comunidad de comensal que educa el sistema inmunológico del host y establece el umbral de reactividad inmune a los patógenos. Cambios en la microbiana composición, o disbiosis, pueden perturban la homeostasis inmune y perturban circuitos regulatorios que frenen inflamaciones intestinales llevando a enfermedades inmune-mediadas tales como Diabetes tipo 1 y enfermedad inflamatoria intestinal2,3 .
El período inmediatamente después del nacimiento una única ventana del desarrollo durante el cual las comunidades microbianas intestinales comienzan a establecer al mismo tiempo el sistema inmune madura4. La microbiota postnatal no es estable, con cambios en la composición de la comunidad que ocurren naturalmente y con frecuencia5. Las células inmunes que interaccionan con la microbiota residen en dos localizaciones anatómicas distintas en el intestino - la lámina propia y el epitelio intestinal6. Numerosos tipos de células inmunes están presentes en el intestino, incluyendo los linfocitos (como células T, células B y células linfoides innatas) así como de las células mieloides (que incluyen macrófagos, monocitos y células dendríticas). Estas células, también conocido como células hematopoyéticas, realizan multitud de funciones que preservar la barrera intestinal y mantener la homeostasis.
Además de sus funciones de reguladoras en intestinal, las células inmunes de la mucosa también pueden llevar mensajes microbianos a los sitios extra intestinales regular inmunidad sistémica7,8,9. Esto es un área de creciente interés en la investigación y pone de relieve la necesidad de métodos identificar las células inmunes que migran fuera del tejido intestinal con el fin de sondear su función. El protocolo reportado aquí utiliza un modelo de ratón disponibles en el mercado donde una proteína fluorescente photoconvertible se explota a las células de etiqueta. Ubicuo, PhAMsuprimido ratones expresan una proteína verde fluorescente Dendra2 que esté irreversiblemente fluorescencia roja después de la activación por luz de ultravioleta (UV)10. Utilizando una cánula de fibra óptica para proporcionar luz de 405 nanómetro en el colon de ratones recién nacidos, demostramos que las células hematopoyéticas photoconverted, que originó adentro o tránsito por el colon pueden encontrarse en el bazo.
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Protocol
Animales todos los procedimientos fueron realizados con la aprobación de y de acuerdo con el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) en el Hospital General de Massachusetts.
PRECAUCIÓN: Este protocolo implica el uso de un láser de clase 3b (LG3). LG3 gafas láser siempre deben utilizarse al utilizar este láser. Deben seguirse las directrices apropiadas de capacitación y seguridad para evitar el riesgo de lesiones.
1. diseño y montaje de láser
- Conecte el diodo electroluminoso (LED) (405 nm, 19.3 mW, 1400 mA, fibra) para el controlador de LED vía el cable de conector M8 de 4 pines que viene conectado al LED. Con cuidado apriete el tornillo para fijar la conexión.
- Antes de conectar el cable de parche optogenetics al LED, sujete el conector de no apertura del LED a la luz para asegurarse de que están obstrucciones visibles. Golpe en el hoyo para eliminar obstrucciones e inserte el cable de parche optogenetics en la abertura.
- Conectar la cánula de fibra óptica a cable del remiendo optogenetics insertando la cánula en cada extremo de la funda del conector. Conecte el otro extremo de la funda del conector para el cable de interconexión. Aplicar suficiente presión para asegurar la conexión pero tenga cuidado de no doblar o romper la fibra óptica en la cánula.
Nota: La cánula de frágil de la fibra óptica está cubierta con el capuchón protector cada vez que el láser no está en uso. - Configurar el controlador de LED al modo de onda continua (CW) con la perilla de ajuste continuo en 0 y el límite actual establecido a 1,2 A.
2. Photoconversion de las células en el Colon
Nota: Ratones machos y hembras fueron expuestas a la intracolonic 405 nm luz 1-2 días después de su nacimiento y se sacrificaban antes de 1 semana de edad.
- Fije un lugar obscuro con un acceso a una toma de corriente. Conecte el conductor del LED en la salida.
Nota: Este procedimiento se realiza en la mínima luz blanca ya que una larga exposición de los ratones a la luz ambiental puede causar un photoconversion no deseado de las células. La luz roja se utiliza como una alternativa.
PRECAUCIÓN: El siguiente paso implica el uso de un anestésico animal. La administración de la anestesia lleva a cabo en una campana de clase II o mediante otro sistema de depuración adecuado. La inhalación de la anestesia puede causar mareos, somnolencia o incluso pérdida del conocimiento. - Anestesiar el ratón por la exposición a 4-5% de isoflurano en 100% O2 en una caja de inducción. Verificar la adecuada profundidad de la anestesia firmemente pellizcando una pata trasera (sin respuesta). Mantener anestesia mediante un cono de nariz en aproximadamente 2% de isoflurano. Evitar la exposición de controlador al isoflurano por uso de una adecuada campana o dispositivo de depuración anestésico.
- Coloque el ratón anestesiado para la exposición de intracolonic con 1 mano al pescuezo la parte posterior del ratón suavemente con el dedo índice y el pulgar. Poner el mouse al exponer el abdomen. Afloje la empuñadura si el ratón comienza a perder su color rosa o si su tasa de respiración comienza a disminuir. Asegure la cola del ratón entre el anillo y los pequeños dedos.
- Con la otra mano, retire la tapa protectora de la cánula. Manteniendo el eje longitudinal de la cánula paralela a la línea media del ratón, inserte suavemente la cánula de fibra óptica a través del ano en el colon para que todos los 5 mm de la fibra óptica están dentro del ratón.
Nota: Este procedimiento se realiza lentamente y con cuidado de no perforar la pared colónica. Minutos moviendo y girando de la cánula del SIDA el adelanto en el colon. - Ponga las gafas de seguridad y aumentar el láser actual hasta el valor máximo (completamente hacia la derecha). Mirando el abdomen traslúcido del ratón para confirmar la presencia de luz ultravioleta.
Nota: Las gafas de seguridad de láser LG3 disminuyen considerablemente la visibilidad. Con un colega (usar equipo protector) ayudar a ponerse las gafas y encender el láser. - Exponer los dos puntos a la luz del láser para un total de 2 minutos retirar la cánula de aproximadamente 1 mm cada 30 s para maximizar el área luminal expuesto a la luz. Al final de 2 minutos, apague el láser.
- Lentamente retire la cánula del ratón. Después de recuperarse de la anestesia en una jaula caliente vacía, devolver el ratón a la estructura de la casa.
3. aislamiento de los linfocitos intestinales
- Preparar 1 L de tampón de la madeja sal equilibrada solución/becerro suero (HBSS/CS), 200 mL de tampón de la franja epitelial, 500 mL de medio de lavado y 200 mL de ácido etilendiaminotetracético (EDTA)-libre de los medios de lavado.
Nota: Los volúmenes de reactivo se calculan un tamaño de muestra de 9.- Hacer el tampón HBSS/CS (HBSS; 5% CS) mediante la adición de 50 mL de CS a 950 mL de HBSS. Guárdelo en hielo.
- Preparar la memoria intermedia de la franja epitelial [HBSS; 5% CS 1 mM Ditiotreitol (DTT), EDTA 5 mM; mM 15 4-(2-Hydroxyethyl) piperazina-1-(n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido ácido (HEPES) (pH 7.2-7.5)] añadiendo 10 mL de CS, 200 μL de TDT, 2 mL de EDTA de 0,5 M y 3 mL de tampón de HEPES de 1 M 1 M y 185 mL de HBSS. Colocar el buffer de la franja epitelial en un baño de agua de 37 ° C.
- Hacer los medios de lavado (HBSS; % 1 CS y 1 mM EDTA) añadiendo 5 mL de CS y 1 mL de EDTA de 0.5 M a 494 mL de HBSS. Almacenar a temperatura ambiente.
- Preparar los medios de lavado libre de EDTA (HBSS; 1% CS 15 mM HEPES) añadiendo 2 mL de CS y 3 mL de 1 M HEPES y 195 mL de HBSS. Almacenar a temperatura ambiente.
- Hacer un tampón FACS [1 x de tampón fosfato salino (PBS) (pH = 7,2); 2% CS] añadiendo 10 mL de CS y 490 mL de PBS. Guárdelo en hielo.
- Preparar el plato de la colección de tejido mediante la colocación de un filtro de célula 70 μm dentro de una placa de cultivo de 60 x 10 mm. Añadir 10 mL de tampón HBSS/CS (HBSS; 5% buffer de CS en paso 3.1.1 y almacenados en hielo) al plato y coloque en el hielo.
- Eutanasia el ratón a través de una sobredosis de isoflurano inhalado mediante compactación adecuada de anestésico (una exposición de min aproximadamente 3 a > 4% de isoflurano en el aire o en el 100% O2). Después de la aparente cesación de la respiración y reflejo movimiento, verificar la ausencia de dolor profundo firmemente pellizcando una pata trasera (se recomienda usar pinzas). Asegúrese de que la eutanasia a través de una decapitación con un par de tijeras quirúrgicas o una nueva maquinilla de afeitar recta.
Nota: La dislocación Cervical no se recomienda para este paso debido al tamaño y edad del animal. Estos métodos son consistentes con las pautas de AVMA de 2013 sobre la eutanasia y aprobaron por el IACUC MGH. - La cosecha del colon con pinzas limpias y tijeras para abrir el abdomen. Reflejan los intestinos a 1 lado del abdomen del ratón para exponer los dos puntos. Quitar el colon entero por primera transecting lo apenas distal (hacia el ano) para el ciego. Luego, mientras agarra con firmeza el colon con pinzas, use tijeras para cortar a través de la uretra al recto. Corte del colon como cerca del ano como sea posible. Cosecha el bazo después de quitar los dos puntos (véase los pasos 4.1-4.2 más abajo).
Nota: Mientras que el protocolo de photoconversion sólo objetivos de ~ 25% de puntos del recién nacido (5 mm de la cánula de fibra óptica), se cosecha todo el colon para ayudar en el aislamiento de células. - Limpiar el colon mediante el uso de fórceps para empujar el contenido de los dos puntos y en una toalla de papel seca. Homogeneizar el tejido mediante el uso de hojas de afeitar para picar el colon en una goma en la cubierta de una placa de cultivo y luego transferir la pasta a la coladera del celular en la caja Petri.
- Agregar una barra de agitación magnética durante mucho tiempo de limpieza 8 mm a la coladera y coloque el plato en un plato agitador magnético de 9 posiciones. Ajustar la velocidad de la barra de agitación magnética a 800 rpm e incube las células durante 5 minutos a temperatura ambiente. Deseche el búfer y repetir el lavado con 10 mL de HBSS/CS (la HBSS; 5% buffer de CS en paso 3.1.1 y almacenados en hielo). Deseche el búfer al final del lavado.
- Disociar las células epiteliales mediante la adición de 10 mL de tampón de la franja epitelial precalentado (la HBSS; 5% CS 1mM TDT, 5mM EDTA; buffer HEPES [pH 7.2-7.5] de 15mM que se hizo en el paso 3.1.2 y almacenado en un baño de agua de 37 ° C) a la coladera de la célula y remover a 800 rpm por 30 min en un 3 7 ° C la incubadora. Al final de la incubación, transferir el búfer enriquecido en la fracción epitelial a un tubo limpio de 15 mL.
Nota: El epitelio y las células asociadas (intestinales células epiteliales y los linfocitos epiteliales intestinales) son liberadas en el buffer, mientras que las células en el intacto propria de la lámina quedan en el colador de la célula durante este paso11.- Centrifugar la fracción epitelial intestinal enriquecida (IELs) 700 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 1 mL de tampón FACS. Almacenar en el hielo para su uso en el paso 3.15.
- Lave la fracción de lámina propia dentro de la coladera de la célula 2 x con HBSS/CS. Para ello, añadir 10 mL de solución de HBSS/CS (HBSS; buffer de CS 5% que se hizo en paso 3.1.1 que ha sido almacenado en hielo) a la coladera de la célula y remover a 800 rpm por 5 min en una incubadora de 37 ° C. Deseche el búfer después de cada lavado.
- Lavar la muestra 2 x en medios de lavado. Añadir 10 mL de medio de lavado (HBSS; 1% CS y tampón de EDTA 1 mM que se hizo en el paso 3.1.3 y almacenado a temperatura ambiente) a la coladera de la célula y remover a 800 rpm durante 15 min en una incubadora de 37 ° C. Deseche el búfer después de cada lavado.
- Después de usar los medios de lavado, tienda en el hielo para el uso en paso 3.14.
- Lavar la muestra 2 x con HBSS CS añadir 10 mL de tampón HBSS/CS (HBSS; 5% CS almacenador intermediario en paso 3.1.1 que ha sido almacenado en hielo) a la coladera de la célula y remover a 800 rpm por 5 min en una incubadora de 37 ° C. Deseche el búfer después de cada lavado.
- Incubar el tejido en tampón de lavado libre de EDTA. Añadir 10 mL de tampón de lavado libre de EDTA (HBSS; 1% CS y 15 mM de tampón HEPES con que fue hecha en el paso 3.1.4 y almacenado a temperatura ambiente) a la coladera de la célula e incubar la placa por 10 min a temperatura ambiente sin revolver. Deseche el búfer al final de este paso.
- Lavar la muestra 2 x con HBSS/CS y prepare la solución de enzima. Añadir 10 mL de HBSS/CS (HBSS; 5% buffer de CS en paso 3.1.1 que ha sido almacenado en hielo) de búfer a la coladera de la célula y remover a 800 rpm durante 10 min en una incubadora de 37 ° C. Deseche el búfer después de cada lavado.
- Preparar la solución de enzima (EDTA libre lavado Tampón; 0,1 mg/mL DNasa I; colagenasa 167 mg/mL) durante el segundo período de lavado: Añadir 9 mg de DNasa I y 15 mg de liofilizado colagenasa a 90 mL de EDTA tapón de lavaje. Almacenar la solución a temperatura ambiente.
- Digerir la fracción de lámina propia contenida en el filtro de la célula para obtener linfocitos de lámina propia (LPLs). Añadir 10 mL de la solución de enzima (el EDTA libre tampón de lavado; 0,1 mg/mL DNasa I; 167 mg/mL de tampón de colagenasa en paso 3.12.1 y almacenados a temperatura ambiente) a la coladera de la célula y remover a 800 rpm durante 45 minutos en una incubadora de 37 ° C.
Nota: LPLs se liberan en la solución después de la digestión enzimática.- Recoger la solución de enzima que contiene las células y filtrar con un filtro nuevo de celular en un tubo cónico de 50 mL.
- Añadir 20 mL de medio de lavado fría (la HBSS; CS 1%, EDTA 1mM tampón hecho en paso 3.1.3 y almacenados en hielo en el paso 3.9.1) a las células de filtrado para bloquear la actividad de la colagenasa en la solución de enzima. Centrifugar el tubo a 700 x g durante 6 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado que contiene LPLs en 1 mL de tampón FACS.
- Combinar la IEL (del paso 3.7.1) y las fracciones de la LPL (del paso 3.14) y tinción con anticuerpos conjugados con fluorescente para el análisis de citometría de flujo (ver paso 5).
Nota: IEL y LPL fracciones pueden ser manchados por separado si se desea información del compartimiento.
4. aislamiento de linfocitos de bazo
- Preparar el tubo de la colección agregando 500 μl de tampón FACS en un tubo de microcentrífuga. Almacenar en el hielo.
- Después de quitar los dos puntos (paso 3.4), cosecha del bazo entero y colocarlo en el tubo de la colección. Guarde el tejido en el hielo.
- Utilizando un homogenizador de tejido eléctrico, homogeneizar el bazo en un tubo de microcentrífuga durante aproximadamente 1 minuto centrifugar la muestra a 300 x g [centrífuga micro] durante 5 min a temperatura ambiente y aspirado apagado el sobrenadante.
- Realizar la lisis de glóbulos rojos por Resuspender la muestra de 500 μl de tampón de lisis (ACK) de amonio cloruro de potasio para iniciar la muerte celular por lisis osmótica. Permita que la muestra Incubar 1-2 min a temperatura ambiente y luego lo resuspender en 725 μl de tampón FACS.
- Centrifugar la muestra a 300 x g [centrífuga micro] durante 5 min a temperatura ambiente y aspirado apagado el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 500 μl de tampón FACS y filtrar a través de un tamiz de 40 μm células en un tubo nuevo de microcentrífuga. Transferir toda la muestra a un tubo nuevo de microcentrífuga y tinción con anticuerpos conjugados con fluorescente para el análisis de citometría de flujo (ver paso 5).
5. identificación de Dendra-r+ citometría de flujo utilizando las células
- Centrifugar las muestras a 300 x g [centrífuga micro] durante 5 min a temperatura ambiente y aspirado apagado el sobrenadante IEL/LPL y del bazo.
- Resuspender el pellet en 100 μl de mezcla de la coloración del anticuerpo. Preparar el anticuerpo coloración mezcla añadiendo 1 μl de anticuerpo anti-CD45 conjugado fluorescente a 100 μl de tampón FACS por muestra.
Nota: Es importante valorar los anticuerpos utilizados para la citometría de flujo antes del experimento para determinar la concentración óptima donde se produce la saturación de enlace. - Incubar las muestras durante 35 min en hielo (en un lugar obscuro).
- Resuspender las muestras en 300 μL de tampón FACS y centrifugar a 300 x g [centrífuga micro] durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender las muestras en 325 μl de tampón FACS. Analizar las muestras en un citómetro de flujo.
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Representative Results
Un cable de fibra óptica fue utilizado para entregar luz de 405 nanómetro en los dos puntos de los 2 días de edad PhAMsuprimido ratones. En experimentos anteriores, una exposición de s 30 determinó dar una photoconversion máxima de células de colon con la citotoxicidad mínima (figura 1A). Por lo tanto, alternativamente 30 exposiciones de s de los diferentes segmentos del colon se llevaron a cabo como se describe en el protocolo. Después de la exposición de láser, los ratones fueron sacrificados inmediatamente, y se determinó el photoconversion de las células. Sola célula preparaciones del tejido colónico total fueron teñidas con anticuerpos anti-CD45 conjugado fluorescente y el análisis cytometric del flujo se realizaron para detectar photoconversion. Proteína de Dendra2-verde (Dendra-g) tiene máximos de excitación y emisión a 490 y 553 nm respectivamente y puede detectarse en el canal FITC, mientras que el photoconverted proteína Dendra2-rojo (Dendra-r) tiene máximos de excitación y emisión a 507 y 573 nm respectivamente y se pueden detectar en el canal de PE de un citómetro de flujo. Una vez cambiado irreversiblemente a su forma roja, Dendra2 es altamente Fotoestables y útil para aplicaciones de seguimiento a largo plazo.
No hay células de Dendra-r+ fueron detectadas en ratones unlasered ( izquierdade lafigura 1B ). Sin embargo, la exposición luz de 405 nm resultó en distintas poblaciones de la célula de Dendra-r+ CD45 CD45neg y+ celular compartimentos (figura 1B a la derecha). Para determinar si el protocolo de photoconversion colon resultó en el etiquetado de fondo de las células de sitios extraintestinales, que cosechan bazos de ratones de photoconverted recientemente (T = 0) y se analiza para Dendra-r+ de las células mediante citometría de flujo. No hay células de Dendra-r+ fueron detectadas en el CD45neg o CD45+ celular compartimentos (figura 1C), sugiriendo que el rayo láser intra-colon no penetran lo suficiente a las células photolabel en el bazo. Por lo tanto, cualquier célula de Dendra-r+ detectado en el bazo después de tiempo para la migración (T = 3d, 5D) deben haberse originado de los dos puntos.
Figura 1 : En vivo photoconversion de tejido colónico. Las células del colon de 2 días de edad PhAMsuprimido cachorros fueron expuestas a la luz de nm 405 intra-colónica para 30 s como se describe. El photoconversion y el etiquetado de las células se determinaron inmediatamente después del procedimiento (T = 0) por un análisis de citometría de flujo de preparaciones unicelulares del tejido colónico y del bazo. (A) este representante flujo cytometric punto de terreno muestra la expresión de CD45 (x-eje) y la tinción de la tintura de muerto vivo (y-axis) en preparaciones unicelulares de los dos puntos de control y ratones lasered. Los paneles B y C son superposiciones de trama de punto de citometría de flujo representativo que muestran la expresión de la proteína Dendra2-verde (Dendra2-g, eje horizontal) y la proteína Dendra2-rojo (Dendra2-r, eje vertical) en control no expuestos y expuestos CD45+ (hematopoyéticas) y células CD45neg (no-hematopoyéticas) en (B) el colon y el ()C) bazo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los datos de un experimento de photoconversion típico para identificar células migratorias en el bazo se muestran en la figura 2. Se realizó la photoconversion de las células en los dos puntos de los 2 días de edad PhAMsuprimido ratones como en la figura 1. Ratones fueron sacrificados 3 y 5 días después de la exposición y se determinó la presencia de células de Dendra-r+ en la bazo por citometría de flujo. Había ninguna célula Dendra-r+ en el subconjunto de células CD45neg , consistente con la visión que el CD45neg las células son principalmente epiteliales y otras células estructurales del intestino. Algunos CD45+ células hematopoyéticas expresaron Dendra-r, sugiriendo que habían sido photoconverted en el colon y migran al bazo.
Figura 2 : CD45+ células hematopoyéticas migran desde el colon al bazo. Ratones desuprimidos de PhAM de recién nacido (día 0 - 2) fueron expuestos a luz 405 nm photoconvert Dendra2 proteína por la exposición intra-colónica. Las parcelas de la citometría de flujo representativos muestran la expresión de la proteína Dendra2-verde (Dendra2-g, eje horizontal) y la proteína Dendra2-rojo (Dendra2-r, eje vertical) en CD45neg y CD45+ las células del bazo de los ratones no expuestos de 5 días de edad y expuesto ratones analizados en 3 y 5 días (T = 3d, 5D) después de la photoconversion. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La identificación y caracterización de células que interactúan con y son influenciados por la microbiota del colon son importantes y deben facilitar la comprensión de cómo información del microambiente de la mucosa se transmitió al resto del cuerpo. Un método para estudiar la migración de células de intestino requiere el aislamiento de las células asociadas con tripa, seguida de una transferencia adoptiva en ratones receptores para determinar sus patrones de tejido-autoguiado hacia el blanco y función12,13. Este enfoque es limitado, como sólo los tipos de células específicas que fueron transferidos pueden ser rastreados. Además, artefactos debidos al aislamiento de las células de los tejidos y el proceso de purificación pueden obstaculizar el proceso migratorio en vivo . Más recientemente, un protocolo photoconversion endoscópica para etiquetar las células intestinales utilizando ratones de Kaede fue divulgado14. Este estudio encontró un amplio tráfico de leucocitos desde el intestino y en ratones adultos.
El informe describe un método para células de etiqueta en el colon de ratones recién nacidos y rastrear su migración a sitios extraintestinales como el bazo. El PhAMsuprimido ratón ubicuo expresa una proteína fluorescente Dendra2 photoconvertible verde que esté irreversiblemente fluorescencia roja sobre su activación por la luz UV. La exposición de dos puntos de ratones recién nacidos a 405 nm luz etiquetados ambos CD45+ hematopoyéticas y células no hematopoyéticas de CD45neg . CD45++ color rojo Dendra2 las células fueron detectadas en el bazo 3 a 5 días después de la photoconversion, indicando la migración extra intestinal de células hematopoyéticas.
El paso de limitación de velocidad para este ensayo es la fracción de la superficie colónica que es expuesta a 405 nm luz. La fragilidad de los dos puntos recién nacidos y la presencia de las heces, aunque mínimo a esta temprana edad, limitar la longitud de la cánula de fibra óptica que se puede insertar. En experimentos anteriores, una cánula más largo no se pudo exitosamente insertar más de 5 mm. Lubricantes fueron evitados debido al riesgo de la refracción de la luz variable del haz láser. El movimiento hacia el exterior de la cánula cada 30 s ayudó a maximizar el área de colon expuesto a la luz de láser. Lo importante, una cánula con un valor grande de NA (NA = 0.5) se utilizó para generar un amplio cono de luz en el colon.
Este protocolo ha sido estandarizado para recién nacido (día 0 - 2) PhAMsuprimido PUP. Teniendo en cuenta los cambios en el contenido y la longitud del colon con la edad de los ratones, la técnica debe ser optimizado en consecuencia tratándose de cachorros mayores. Sobre todo, modificaciones en la duración total de la photoconversion y la longitud de la inserción de la cánula de fibra óptica será necesarios.
Este enfoque para comprender el comportamiento migratorio de las células en el colon se ve facilitada por análisis cytometric del flujo. Citometría de flujo multiparámetro puede utilizarse además para identificar y fenotipo de la célula inmune migrante tipos dentro de la CD45+ subconjunto de células. Las células Dendra2-r+ también pueden ordenarse por FACS para aplicaciones posteriores, tales como análisis de perfiles o proteómica de expresión génica. Aunque dirigidas a la comprensión de los subconjuntos de células hematopoyéticas en el colon en este estudio, el método puede adaptarse para estudiar la migración celular de los sitios de tejido adicional incluyendo el cerebro y la piel.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nitya Jain fue apoyada por un premio de transición de carrera de NIH/NIAID 1K22AI116661-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser | |||
| Light Emitting Diode (LED) | THORLABS | M405FP1 | CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 |
| LED driver | THORLABS | LEDD1B | Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 |
| Optogenetics patch cable | THORLABS | M87L01 | 1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454 |
| Fiber optic cannula | Doric lenses | MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 | 5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036 |
| Power supply | THORLABS | KPS101 | Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 |
| LG3 laser safety goggles | THORLABS | LG3 | Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 |
| Red light | Electron Microscopy Sciences | 74327-10 | 15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences |
| Intestinal cell isolation | |||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3 |
| 1X HBSS | Gibco | 14025076 | Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 |
| Calf Serum | Hyclone AZM | 197696 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 |
| DTT | Sigma | 10197777001 | CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US |
| HEPES | Gibco | 15630080 | 1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 |
| Petri dish | Corning | 353004 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F |
| 70 micron cell strainer | Falcon | 352350 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712 |
| Micro magnetic stir bar | Fisherbrand | 1451364 | Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364 |
| Magnetic stir plate | Corning Laboratory Stirrers | 440826 | https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE |
| Collagenase | Roche | 5401020001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE |
| DNase I | Sigma | 10104159001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US |
| 1X PBS | Gibco | 20012-027 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 |
| Pipet aid | Thermo Scientific | 14387165 | https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357530 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357515 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 15 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339651 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339653 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| Single cell suspension | |||
| Eppendorf tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx |
| Tissue homogenizer | Kimble | K7495400000 | Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000 |
| Homogenizer tips | Kimble | 7495210590 | Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| Antibodies | |||
| BV786 anti-mouse CD45 | BD | 564225 | Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 |
| Live/Dead | Invitrogen | L34962 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962 |
| Other | |||
| Razor blades | VWR | 55411-050 | Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades |
References
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