Summary
البروتوكول هو موضح هنا تستخدم نهجاً فوتولابيلينج في الفئران حديثي الولادة على وجه الخصوص تحديد الخلايا المناعية التي يهاجر من القولون إلى مواقع خارج المعوية. سوف تكون هذه الاستراتيجية مفيدة لدراسة التفاعلات بين المضيف-ميكروبيومي في وقت مبكر من الحياة.
Abstract
المجتمعات البكتيرية المعوية تقام في بداية الحياة والتأثير على تنمية الخلايا المناعية والدالة. الحجمية الولدان عرضه للتأثيرات الخارجية العديدة بما في ذلك استخدام المضادات الحيوية والنظام الغذائي، مما يؤثر على قابلية لأمراض المناعة الذاتية والالتهابات. اضطرابات مثل أمراض الأمعاء الملتهبة (الأمريكتين) تتميز بتدفق إعداد كبيرة من الخلايا المناعية للامعاء. ومع ذلك، قد بالإضافة إلى ذلك الهجرة الخلايا المناعية مكيفة حسب الحجمية الخروج من الأمعاء للتأثير على الاستجابات المناعية في مواقع خارج المعوية. وبالتالي، هناك حاجة تحديد وتوصيف الخلايا التي قد تحمل رسائل للميكروبات من الأمعاء إلى المواقع البعيدة. هنا، يمكننا وصف طريقة لتسمية الخلايا في القولون من الفئران حديثي الولادة في فيفو التي تمكن من التعرف عليهم في مواقع خارج المعوية بعد الهجرة.
Introduction
الجهاز الهضمي الثدييات تؤوي مئات الأنواع من البكتيريا التي توجد في علاقة تكافلية مع المضيف1. فرض تعايش سلمي مع هذه الميكروبات الخلايا المناعية الموجودة في الوسط المحلي وإقامة حاجز وقائي ضد الغزوات الممرض. وهكذا، التفاعلات ثنائية الاتجاه بين الخلايا المناعية والحجمية ذات الأهمية الحاسمة لإقامة مجتمع commensal أن يثقف المضيف الجهاز المناعي ويقوم بتعيين عتبة مفاعليه المناعي لمسببات الأمراض. التغييرات في العوامل الجرثومية يمكن تكوينها، أو dysbiosis، تخل بالتوازن المناعي والتشويش الدوائر التنظيمية التي تقيد الالتهابات المعوية مما يؤدي إلى الأمراض بوساطة جهاز المناعة مثل داء السكري من النوع 1 وبنك التنمية بين الأمريكتين2،3 .
الفترة مباشرة بعد الولادة هو نافذة التنموية فريدة خلالها المجتمعات الميكروبية الأمعاء تبدأ في إنشاء نظام المناعة في نفس الوقت ينضج4. الحجمية بعد الولادة ليست مستقرة، مع التحولات في تركيبة المجتمع التي تحدث طبيعيا وكثيراً ما5. الخلايا المناعية التي تتفاعل مع الحجمية الموجودة في هذين الموقعين تشريحية متميزة في الأمعاء- بروبريا الصفيحة و ظهارة الأمعاء6. توجد أنواع عديدة من الخلايا المناعية في الأمعاء، بما في ذلك الخلايا الليمفاوية (مثل خلايا T وخلايا ب والخلايا اللمفاوية الفطرية) فضلا عن الخلايا النقوي (التي تتضمن الخلايا الجذعية، وحيدات، والضامة). هذه الخلايا، تعرف أيضا باسم الخلايا المكونة للدم، القيام بالعديد من الوظائف التي تحافظ على الحاجز المعوي، والحفاظ على التوازن.
بالإضافة إلى مهامها التنظيمية في مواقع المعوية، خلايا المناعة في الغشاء المخاطي قد تحمل أيضا رسائل الميكروبية إلى مواقع خارج المعوية لتنظيم الحصانة الشاملة7،،من89. هذا هو مجال يحظى باهتمام متزايد من البحوث ويسلط الضوء على الحاجة إلى أساليب لتحديد الخلايا المناعية التي تهاجر من الأنسجة المعوية من أجل التحقيق في وظيفتها. ويستخدم البروتوكول ذكرت هنا نموذجا ماوس متاحة تجارياً التي يتم استغلالها بروتين فلوري فوتوكونفيرتيبلي لتسمية الخلايا. أوبيكويتوسلي express الفئراناقتطعت أم بروتين Dendra2 فلورية خضراء التي يتم تبديل لا رجعة فيه إلى الأسفار حمراء عند التنشيط بالضوء من الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية)10. استخدام قنية ألياف بصرية لتقديم 405 نانومتر الضوء في القولون الفئران حديثي الولادة، وعلينا أن نبرهن أن يمكن العثور على الخلايا المكونة للدم فوتوكونفيرتيد، التي يكون منشؤها أو عبور القولون في الطحال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت جميع الإجراءات الحيوان مع موافقة وامتثالا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في مستشفى ماساشوستس العام.
تنبيه: هذا البروتوكول ينطوي على استخدام الليزر 3b فئة (LG3). يجب دائماً استخدام نظارات واقية الليزر LG3 عندما تعمل هذه الليزر. يجب أن يتبع المبادئ التوجيهية المناسبة للتدريب والسلامة لتجنب خطر الإصابة.
1-التصميم والجمعية لليزر
- الاتصال أدى (الصمام) (405 نانومتر، 19.3 ميغاواط، وماجستير 1400، إلى جانب الألياف) للصمام سائق عن طريق تولي M8 4-دبوس موصل الكابل الذي يأتي للصمام. تشديد المسمار ربط الاتصال بعناية.
- قبل إرفاق كبل تصحيح أوبتوجينيتيكس للصمام، اضغط الرابط الانفتاح للصمام الضوء للتأكد من وجود أية عوائق مرئية. ضربة في حفرة لإزالة أي عوائق إذا لزم الأمر وإدراج كبل تصحيح أوبتوجينيتيكس في فتح.
- الاتصال قنية الألياف البصرية إلى كبل تصحيح أوبتوجينيتيكس بإدراج القنية في أما نهاية الأكمام موصل. إرفاق الطرف الآخر من الأكمام موصل الكبل التصحيح. تطبيق ما يكفي من الضغط تأمين الاتصال ولكن يجب الحرص على عدم ثني أو كسر الألياف الضوئية في القنية.
ملاحظة: قنية الهشة الألياف البصرية مغطى بغطاء الحماية كلما الليزر ليس قيد الاستخدام. - تعيين برنامج تشغيل مجموعة LED للوضع (CW) موجات مستمرة مع إدارة مقبض الضبط المستمر في 0 والحد الحالي إلى 1.2 ألف
2-فوتوكونفيرسيون للخلايا في القولون
ملاحظة: الفئران الذكور والإناث قد تعرضت إينتراكولونيك 405 نانومتر الضوء 1-2 أيام بعد ولادتهم، وضحى بها قبل أسبوع واحد من العمر.
- تأمين مكان الظلام مع وصول إلى مخرج كهربائي. قم بتوصيل برنامج تشغيل الصمام بالمأخذ.
ملاحظة: يتم تنفيذ هذا الإجراء في ضوء أبيض الحد الأدنى قد يسبب تعرض لفترة طويلة من الفئران للضوء المحيط فوتوكونفيرسيون غير المرغوب فيها من الخلايا. الضوء الأحمر كبديل لذلك.
تحذير: الخطوة التالية تنطوي على استخدام الحيوان مخدر. إدارة المخدر تجري في غطاء "الطبقة الثانية" أو بواسطة استخدام نظام المسح مناسب آخر. قد يسبب استنشاق المخدر الدوخة، النعاس، أو حتى فقدان الوعي. - تخدير الماوس بالتعرض إلى إيسوفلوراني 4-5% في 100 ٪ O2 في مربع التعريفي. التحقق من العمق الصحيح للتخدير معسر بقوة باو هند (أي استجابة). المحافظة على التخدير عن طريق الآنف مخروط في حوالي 2% إيسوفلوراني. منع التعرض معالج إلى إيسوفلوراني باستخدام غطاء مناسباً أو جهاز المسح مخدر.
- ضع الماوس أنيسثيتيزيد للتعرض إينتراكولونيك باستخدام اليد 1 إلى القفا الجزء الخلفي الماوس بلطف بواسطة السبابة والإبهام. اقلب الماوس لفضح البطن. تخفيف القبضة إذا كان الماوس يبدأ يفقد لونه الوردي، أو إذا كان معدل التنفس يبدأ ببطء. آمنة ذيل الماوس بين الدائري والأصابع قليلاً.
- باليد الأخرى، انزع الغطاء واقية من القنية. مع الإبقاء على إدراج طويلة محور قنية موازيا لخط الوسط للماوس، بلطف قنية الألياف البصرية من خلال فتحه الشرج في القولون حيث تكون كل 5 مم من الألياف الضوئية داخل الماوس.
ملاحظة: يتم تنفيذ هذا الإجراء ببطء ومع الرعاية لا التسلخات الجدار colonic. دقيقة التلوي والتواء من القنية الإيدز النهوض في القولون. - ارتداء نظارات واقية وزيادة الليزر الحالية إلى الحد الأقصى للقيمة (جميع الطريق عكس اتجاه عقارب الساعة). تأكيد وجود ضوء الأشعة فوق البنفسجية من خلال النظر في البطن شفافة للماوس.
ملاحظة: نظارات واقية الليزر LG3 كبير انخفاض الرؤية. لقد زميل (ارتداء المعدات الواقية) مساعدة في ارتداء نظارات واقية وتحول على الليزر. - كشف القولون بأشعة الليزر لما مجموعة 2 دقيقة سحب قنية حوالي 1 مم كل 30 ثانية تحقيق أقصى قدر من منطقة لومينال المعرضة للضوء. في نهاية 2 دقيقة، قم بإيقاف تشغيل الليزر.
- ببطء بإزالة القنية من الماوس. بعد تعافيه من التخدير في قفص حارة فارغ، العودة الماوس إلى القفص المنزل.
3-عزل الخلايا اللمفية المعوية
- إعداد 1 لتر هانك حل "متوازن الملح"/العجل المصل (حبس/CS) المخزن المؤقت و 200 مل من المخزن المؤقت لقطاع الظهارية، 500 مل من الإعلام غسل و 200 مل من حمض الإيثيلين (يدتا)-يغسل وسائل الإعلام الحرة.
ملاحظة: يتم حساب وحدات التخزين كاشف لحجم عينة من 9.- جعل المخزن المؤقت حبس/CS (حبس؛ CS 5%) بإضافة 50 مل CS إلى 950 مل حبس. تخزينها على الجليد.
- إعداد المخزن المؤقت قطاع الظهارية [حبس؛ CS 5%؛ ديثيوثريتول 1 مم (DTT)؛ يدتا 5 مم؛ 15 ملم حمض الببرازين-1-اثانيسولفونيك 4-(2-Hydroxyethyl) (حبيس) (الرقم الهيدروجيني 7.2-7.5)] بإضافة 10 مل CS، 200 ميليلتر DTT م 1، 2 مل يدتا 0.5 م ومل 3 م 1 حبيس المخزن المؤقت لمل 185 من هبس. وضع المخزن المؤقت قطاع الظهارية في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- جعل الوسائط يغسل (حبس؛ CS 1% 1 مم يدتا) بإضافة 5 مل CS و 1 مل يدتا 0.5 M إلى 494 مل حبس. احفظه في درجة حرارة الغرفة.
- تحضير الوسائط أغسل يدتا خالية (حبس؛ CS 1% 15 ملم حبيس) بإضافة 2 مل من CS و 3 مل 1 م حبيس إلى 195 مل حبس. احفظه في درجة حرارة الغرفة.
- إجراء مخزن مؤقت نظام مراقبة الأصول الميدانية [1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (pH = 7.2)؛ CS 2%] بإضافة 10 مل CS لمل 490 من برنامج تلفزيوني. تخزينها على الجليد.
- تحضير طبق جمع الأنسجة بوضع مصفاة خلية ميكرومتر 70 داخل طبق ثقافة 60 × 10 مم. إضافة 10 مل من المخزن المؤقت حبس/CS (حبس؛ العازلة CS 5% في خطوة 3.1.1 وتخزينها على الجليد) إلى الطبق ووضعه على الجليد.
- Euthanize الماوس عن طريق جرعة زائدة من استنشاق إيسوفلوراني باستخدام المسح المناسب من مخدر (تعرض دقيقة تقريبا 3 > إيسوفلوراني 4 ٪ في هواء الغرفة أو في 100% O2). بعد وقف الظاهر للتنفس ومنعكس الحركة، والتحقق من عدم وجود الألم العميق بشدة معسر مخلب هند (من المستحسن استخدام الملقط). ضمان القتل الرحيم عن طريق قطع رأس استخدام زوج من مقص الجراحة أو الشفرة مباشرة جديدة.
ملاحظة: لا ينصح خلع عنق الرحم لهذه الخطوة نظراً لحجم وسن الحيوان. هذه الأساليب وتتسق مع المبادئ "التوجيهية وبرايتون" عام 2013 بشأن القتل الرحيم، وأقرت MGH IACUC. - حصاد القولون باستخدام الملقط نظيفة ومقص لفتح البطن. وتعكس الأمعاء إلى الجانب 1 من البطن الماوس لفضح القولون. إزالة القولون كله بأول ترانسيكتينج أنه مجرد البعيدة (باتجاه فتحه الشرج) للأعور. ثم، حين تتشبث بشدة القولون مع الملقط، استخدام مقص لقطع طريق مجرى البول للمستقيم. قطع القولون بالقرب من فتحه الشرج ممكن. حصاد الطحال بعد إزالة القولون (انظر الخطوات 4.1-4.2 أدناه).
ملاحظة: بينما يستهدف البروتوكول فوتوكونفيرسيون فقط ~ 25% من القولون في حديثي الولادة (5 ملم قنية الألياف البصرية)، يتم حصاد القولون الكامل للمساعدة في عزل الخلية. - تنظيف القولون باستخدام الملقط لدفع محتويات الخروج من القولون وعلى منشفة ورقية جافة. مجانسة الأنسجة باستخدام شفرات الحلاقة لختم ناعما القولون في لصق على غلاف طبق الثقافة ومن ثم نقل هذا اللصق إلى مصفاة الخلية في طبق بتري.
- إضافة شريط إثارة مغناطيسية طويلة نظيفة 8 مم إلى المصفاة ووضع الطبق على لوحة 9-موقف محرض مغناطيسية. تعيين سرعة شريط إثارة المغناطيسية إلى 800 لفة في الدقيقة واحتضان الخلايا لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل المخزن المؤقت وتكرار الغسيل باستخدام 10 مل من حبس/CS (حبس؛ العازلة CS 5% في خطوة 3.1.1 وتخزينها على الجليد). تجاهل المخزن المؤقت في نهاية الغسيل.
- فصل الخلايا الظهارية بإضافة 10 مل من قطاع طلائي بريوارميد المخزن المؤقت (حبس CS 5% 1 مم DTT؛ يدتا 5 مم; 15 ملم حبيس [الرقم الهيدروجيني 7.2-7.5] المخزن المؤقت الذي تم في الخطوة 3.1.2 وتخزينها في حمام مائي 37 درجة مئوية) إلى مصفاة الخلية ويحرك 800 لفة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في 3 حاضنة 7 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، نقل المخزن المؤقت الذي أثري في الكسر الظهارية في أنبوب نظيف 15 مل.
ملاحظة: ظهارة والخلايا المرتبطة بها (الخلايا الظهارية المعوية والخلايا الظهارية المعوية) تم إصدارها في المخزن المؤقت، بينما تبقى الخلايا في سليمة بروبريا الصفيحة في مصفاة الخلية أثناء هذه الخطوة11.- الطرد المركزي الكسر الظهارية المعوية المخصب (IELs) في 700 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية. تخزينها على الجليد للاستخدام في الخطوة 3، 15.
- تغسل الصفيحة بروبريا الكسر داخل مصفاة الخلية 2 x مع حبس/CS. للقيام بذلك، بإضافة 10 مل من محلول حبس/CS (حبس؛ 5% CS المخزن المؤقت التي تم إجراؤها في الخطوة 3.1.1 الذي تم تخزينه على الجليد) إلى مصفاة الخلية ويقلب 800 لفة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في حاضنة 37 درجة مئوية. تجاهل المخزن المؤقت بعد كل غسل.
- تغسل العينة 2 x في الغسيل وسائل الإعلام. إضافة 10 مل الإعلام يغسل (حبس؛ CS 1% 1 مم يدتا المخزن المؤقت الذي تم في الخطوة 3.1.3 وتخزينها في درجة حرارة الغرفة) إلى مصفاة الخلية وآثاره من 800 لفة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية. تجاهل المخزن المؤقت بعد كل غسل.
- بعد استخدام وسائط الإعلام الغسيل، قم بتخزينها على الجليد للاستخدام في الخطوة 3.14.
- تغسل العينة 2 x مع حبس CS. بإضافة 10 مل من المخزن المؤقت حبس/CS (حبس؛ العازلة CS 5% في خطوة 3.1.1 الذي تم تخزينه على الجليد) إلى مصفاة الخلية وآثاره من 800 لفة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في حاضنة 37 درجة مئوية. تجاهل المخزن المؤقت بعد كل غسل.
- احتضان الأنسجة في المخزن المؤقت ليغسل يدتا مجاناً. إضافة 10 مل من الغسيل خالية يدتا العازلة (حبس؛ CS 1% 15 ملم حبيس المخزن المؤقت الذي تم في الخطوة 3.1.4 وتخزينها في درجة حرارة الغرفة) إلى مصفاة الخلية واحتضان لوحة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة دون إثارة. تجاهل المخزن المؤقت في نهاية هذه الخطوة.
- تغسل العينة 2 x مع حبس/CS وإعداد الحل الإنزيم. أضف 10 مل من حبس/CS (حبس؛ العازلة CS 5% في خطوة 3.1.1 الذي تم تخزينه على الجليد) المخزن المؤقت إلى مصفاة الخلية ويقلب من 800 لفة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية. تجاهل المخزن المؤقت بعد كل غسل.
- إعداد الحل إنزيم (خالية من يدتا غسل العازلة؛ 0.1 مغ/مل الدناز الأول؛ كولاجيناز 167 ملغ/مل) خلال الفترة الثانية للمياه والصرف الصحي: إضافة 9 ملغ من الدناز أنا و 15 ملغ من كولاجيناز المجففة بالتبريد إلى 90 مل خالية يدتا يغسل المخزن المؤقت. تخزين الحل في درجة حرارة الغرفة.
- هضم كسر الصفيحة بروبريا الواردة في مصفاة الخلية للحصول على الصفيحة بروبريا اللمفاويات (لبلس). أضف 10 مل الحل إنزيم (خالية يدتا المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي؛ 0.1 مغ/مل الدناز الأول؛ 167 ملغ/مل كولاجيناز المخزن المؤقت في خطوة 3.12.1 وتخزينها في درجة حرارة الغرفة) إلى مصفاة الخلية وآثاره من 800 لفة في الدقيقة لمدة 45 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يتم إصدار لبلس إلى الحل بعد الهضم الأنزيمي.- جمع الحل إنزيم تحتوي على الخلايا وتصفية من خلال مصفاة خلية جديدة في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل.
- إضافة 20 مل الإعلام الغسيل البارد (حبس; CS 1% 1 مم يدتا المخزن المؤقت في خطوة 3.1.3 والمخزنة على الجليد في الخطوة 3.9.1) في الخلايا التي تمت تصفيتها لحظر نشاط كولاجيناز في حل الإنزيم. الطرد المركزي الأنبوب في 700 غ س لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه الذي يحتوي على لبلس في 1 مل من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية.
- الجمع بين IEL (من الخطوة 3.7.1) والكسور LPL (من الخطوة 3.14) ووصمة عار لهم مع الأجسام المضادة مترافق الفلورسنت لتحليل تدفق سيتوميتريك (راجع الخطوة 5).
ملاحظة: الكسور IEL و LPL قد تكون ملطخة بشكل منفصل إذا كان المطلوب هو معلومات المقصورة.
4-عزل الخلايا الليمفاوية من الطحال
- إعداد أنبوب جمع بإضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية في أنبوب ميكروسينتريفوجي. تخزينها على الجليد.
- بعد إزالة القولون (الخطوة 3، 4)، حصاد الطحال كله ووضعه في أنبوب جمع. تخزين الأنسجة على الجليد.
- باستخدام الخالطون أنسجة كهربائية، مجانسة الطحال في أنبوب ميكروسينتريفوجي لحوالي 1 دقيقة للطرد المركزي العينة على 300 غرام x [الطرد المركزي الصغرى] لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة و aspirate قبالة المادة طافية.
- إجراء تحلل خلايا الدم الحمراء عن طريق ريسوسبيندينج العينة في 500 ميليلتر الأمونيوم-كلوريد البوتاسيوم (ACK) تحلل المخزن المؤقت الشروع في موت الخلايا التي تحلل ناضح. تسمح العينة لاحتضان 1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وثم ريسوسبيند أنه في 725 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية.
- الطرد المركزي العينة على 300 غرام x [الطرد المركزي الصغرى] لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة و aspirate قبالة المادة طافية. ريسوسبيند بيليه في 500 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية وتصفيتها من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة. نقل العينة كلها إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة ووصمة عار مع الأجسام المضادة مترافق الفلورسنت لتحليل تدفق سيتوميتريك (راجع الخطوة 5).
5-تحديد ديندرا-r+ "الخلايا باستخدام التدفق الخلوي"
- الطرد المركزي في عينات 300 x ز [الطرد المركزي الصغرى] لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة و aspirate قبالة المادة طافية IEL/LPL والطحال.
- ريسوسبيند الكريات في 100 ميليلتر من جسم تلطيخ المزيج. إعداد جسم تلطيخ المزيج بإضافة 1 ميليلتر من الأجسام المضادة مترافق فلوريسسينتلي-CD45 إلى 100 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت كل عينة.
ملاحظة: من المهم تيتراتي الأجسام المضادة التي تستخدم لقياس التدفق قبل التجربة لتحديد تركيز المثلى التي يحدث فيها الربط تشبع. - احتضان هذه العينات لمدة 35 دقيقة على الجليد (في مكان مظلم).
- ريسوسبيند العينات في 300 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت والطرد المركزي لهم في ز 300 x [الطرد المركزي الصغرى] لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح المادة طافية وريسوسبيند العينات في 325 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية. تحليل العينات في سيتوميتير تدفق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدم كبل الألياف الضوئية لتوصيل 405 نانومتر الضوء إلى النقطتين الفئراناقتطعت أم 2-القديمة يوم. في التجارب السابقة، تعرض s 30 مصممة على إعطاء فوتوكونفيرسيون قصوى لخلايا القولون مع سيتوتوكسيسيتي الحد الأدنى (الشكل 1أ). ولذلك، التعرض s 30 متسلسلة من قطاعات مختلفة من القولون نفذت كما هو موضح في البروتوكول. عقب التعرض الليزر، الفئران كانت euthanized فورا، وتم تحديد فوتوكونفيرسيون الخلايا. الاستعدادات خلية واحدة من الأنسجة colonic مجموع كانت ملطخة بجسم CD45 المضادة مترافق الفلورسنت وأجرى التحليل سيتوميتريك تدفق للكشف عن فوتوكونفيرسيون. غير محولة Dendra2 الأخضر (ديندرا-ز) البروتين قد ماكسيما الإثارة والانبعاثات في 490 و 553 نيوتن متر على التوالي، ويمكن الكشف عن في قناة فيتك، بينما فوتوكونفيرتيد البروتين Dendra2 الحمراء (ديندرا-r) ماكسيما الإثارة والانبعاثات في شمال البحر الأبيض المتوسط 507 و 573 على التوالي، وقد يمكن الكشف عنها في قناة بي سيتوميتير تدفق. مرة واحدة لا رجعة فيه تحول إلى شكله أحمر، Dendra2 الغاية فوتوستابل ومفيدة لتطبيقات التعقب طويلة الأجل.
تم الكشف عن لا خلايا ديندرا-r+ في الفئران أونلاسيريد (الشكل 1ب اليسار). لكن 405 التعرض للضوء نانومتر أدى إلى السكان خلية ديندرا-r+ متميزة في كل من CD45neg و CD45+ خلية مقصورات (الشكل 1ب الحق). لتحديد إذا كان البروتوكول فوتوكونفيرسيون colonic أسفرت عن العلامات الخلفية للخلايا في مواقع خارج المعوية، نحن حصاد الطحال من الفئران فوتوكونفيرتيد حديثا (T = 0) وجزيئي للخلايا ديندرا-r+ بالتدفق الخلوي. لم يتم اكتشاف لا خلايا ديندرا-r+ في CD45الراتب أو CD45+ خلية مقصورات (الشكل 1ج)، مما يوحي بأن شعاع الليزر داخل colonic عدم اختراق ما يكفي للخلايا فوتولابيل في الطحال. وهكذا، أي خلايا ديندرا-r+ اكتشفت في الطحال بعد إتاحة الوقت للهجرة (T = 3d، 5 د) ينبغي أن تكون قد نشأت من القولون.
الشكل 1 : في فيفو فوتوكونفيرسيون أنسجة colonic. خلايا القولون من الجراءاقتطعت أم 2-القديمة يوم تعرضوا للضوء نانومتر 405 داخل colonic لمدة 30 ثانية كما هو موضح. في فوتوكونفيرسيون، وتسمية الخلايا حددت فورا بعد هذا الإجراء (T = 0) بتحليل سيتوميتريك لتدفق الأعمال التحضيرية خلية واحدة من الأنسجة colonic والطحال. (A) هذه المؤامرة دوت سيتوميتريك تدفق الممثل يظهر التعبير عن CD45 (x-المحور) وتلطيخ لصبغ الميت يعيش (y-المحور) في الأعمال التحضيرية لخلية واحدة من نقطتين التحكم والفئران lasered. لوحات B و C هي تدفق الممثل سيتوميتريك دوت الأرض التراكبات التي تبين التعبير عن البروتين Dendra2 والأخضر (Dendra2-ز، المحور الأفقي) والبروتين الأحمر Dendra2 (Dendra2-r، المحور العمودي) في عنصر التحكم وبالاوفست و تعرض CD45+ (المكونة للدم) والخلايا CD45الراتب (غير-المكونة للدم) في (ب) في القولون و (C) الطحال. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
وترد البيانات المستمدة من تجربة نموذجية فوتوكونفيرسيون لتحديد الخلايا المهاجرة في الطحال في الشكل 2. وأجرى فوتوكونفيرسيون الخلايا في نقطتين الفئراناقتطعت أم 2-يوم القديمة كما في الشكل 1. وجود خلايا ديندرا-r+ في الطحال كان تحدد التدفق الخلوي والفئران كانت euthanized 3 و 5 أيام بعد التعرض. كانت هناك أية خلايا ديندرا-r+ في فرعية خليةneg CD45، تمشيا مع الرأي القائل بأن الخلايا CD45الراتب أساسا الظهارية والخﻻيا الهيكلية الأخرى من الأمعاء. بعض CD45+ أعرب عن الخلايا المكونة للدم آر ديندرا، مما يوحي بأنهم قد فوتوكونفيرتيد في القولون وترحيلها إلى الطحال.
الشكل 2 : CD45+ تهاجر الخلايا المكونة للدم من القولون إلى الطحال. الفئراناقتطعت أم الوليد (اليوم 0-2) تعرضوا ل 405 نانومتر الضوء للبروتين فوتوكونفيرت Dendra2 بالتعرض داخل colonic. المؤامرات الخلوي تدفق الممثل إظهار التعبير عن البروتين Dendra2 والأخضر (Dendra2-ز، المحور الأفقي) والبروتين الأحمر Dendra2 (Dendra2-r، المحور العمودي) في CD45neg و CD45+ خلايا الطحال فئران عمرها 5 أيام لم يتعرضوا و تعرض الفئران التي تم تحليلها في 3 و 5 أيام (T = 3d، 5 د) بعد فوتوكونفيرسيون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تحديد وتوصيف الخلايا التي تتفاعل مع وتتأثر الحجمية في القولون مهمة وينبغي أن تيسر فهم كيف يتم ترحيل المعلومات من المكروية المخاطية إلى بقية الجسم. ويتطلب أسلوب واحد لدراسة الهجرة الخلية المتصلة بالقناة الهضمية عزل الخلايا المرتبطة بالقناة الهضمية متبوعاً نقل التبني في الفئران المستفيدة تحديد أنماط الأنسجة-صاروخ موجه، ويعمل12،13. هذا النهج محدود، كما قد تتبع أنواع الخلايا المحددة فقط التي تم نقلها. علاوة على ذلك، النتائج الملموسة الناجمة عن عزل الخلايا من الأنسجة وعملية تنقية قد تعوق عملية الهجرة في فيفو . في الآونة الأخيرة، كان على بروتوكول فوتوكونفيرسيون المنظار لتسمية الخلايا المعوية باستخدام الفئران كايد عنها14. وجدت هذه الدراسة الاتجار الواسع من الكريات البيضاء من الأمعاء وفي الفئران الكبار.
توضح هذه المقالة طريقة لتسمية الخلايا في القولون الفئران حديثي الولادة تقريرنا وتتبع هجرتها إلى مواقع خارج المعوية مثل الطحال. ويعرب عن الماوساقتطعت أم أوبيكويتوسلي بروتين Dendra2 نيون فوتوكونفيرتيبلي أخضر الذي يتم تبديل لا رجعة فيه إلى الأسفار حمراء عند تنشيطه بالأشعة فوق البنفسجية. تعرض الشارحة للفئران حديثي الولادة إلى 405 نانومتر الضوء المسمى كلا CD45+ المكونة للدم والخلايا غير-المكونة للدمneg CD45. CD45++ Dendra2 الحمراء تم الكشف عن الخلايا في الطحال 3 إلى 5 أيام بعد فوتوكونفيرسيون، مما يشير إلى الهجرة خارج المعوية من الخلايا المكونة للدم.
هذه الخطوة الحد من معدل لهذا الفحص هي جزء منطقة colonic التي تتعرض إلى 405 نانومتر الضوء. هشاشة القولون حديثي الولادة، ووجود البراز، وأن كانت ضئيلة في سن مبكرة، وهذا الحد من طول قنية الألياف البصرية التي يمكن إدراجها. في التجارب السابقة، قنية أطول لا يمكن بنجاح إدراج أكثر من 5 ملم. تم تجنب مواد التشحيم بسبب خطر إنكسار الضوء المتغير لشعاع الليزر. تنقل إلى الخارج القنية كل 30 s ساعد على تحقيق أقصى قدر من منطقة colonic تتعرض لضوء الليزر. الأهم من ذلك، قنية مع قيمة NA كبيرة (NA = 0.5) كان يستخدم لتوليد مخروط واسعة من الضوء في القولون.
وقد تم توحيد هذا البروتوكول لحديثي الولادة (اليوم 0-2) فاماقتطعت الجراء. نظراً للتغييرات في محتوى وطول القولون مع سن الفئران، سيكون الأسلوب الأمثل وفقا لذلك، عند استخدام الجراء كبار السن. في المقام الأول، سيكون من الضروري إدخال تعديلات على المدة الإجمالية فوتوكونفيرسيون وطول إدخال قنية الألياف البصرية.
هذا النهج لفهم سلوك المهاجرة من الخلايا في القولون مما يسهل تحليل تدفق سيتوميتريك. معلمة متعددة التدفق الخلوي يمكن أن تستخدم كذلك لتحديد والنمط الظاهري أنواع الخلايا المناعية المهاجرين داخل CD45+ خلية فرعية. قد يتم فرز الخلايا Dendra2-r+ أيضا بنظام مراقبة الأصول الميدانية للمتلقين للمعلومات من تطبيقات مثل تحليلات التنميط أو البروتيوميات التعبير الجيني. بينما توجه إلى فهم مجموعات فرعية من الخلايا المكونة للدم في القولون في هذه الدراسة، قد كيفت الأسلوب لدراسة الهجرة الخلوية من مواقع النسيج إضافية بما في ذلك الدماغ والجلد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
جاين نيتيا أيده "جائزة الانتقال الوظيفي" المعاهد الوطنية للصحة/نييد 1K22AI116661-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser | |||
| Light Emitting Diode (LED) | THORLABS | M405FP1 | CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 |
| LED driver | THORLABS | LEDD1B | Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 |
| Optogenetics patch cable | THORLABS | M87L01 | 1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454 |
| Fiber optic cannula | Doric lenses | MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 | 5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036 |
| Power supply | THORLABS | KPS101 | Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 |
| LG3 laser safety goggles | THORLABS | LG3 | Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 |
| Red light | Electron Microscopy Sciences | 74327-10 | 15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences |
| Intestinal cell isolation | |||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3 |
| 1X HBSS | Gibco | 14025076 | Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 |
| Calf Serum | Hyclone AZM | 197696 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 |
| DTT | Sigma | 10197777001 | CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US |
| HEPES | Gibco | 15630080 | 1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 |
| Petri dish | Corning | 353004 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F |
| 70 micron cell strainer | Falcon | 352350 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712 |
| Micro magnetic stir bar | Fisherbrand | 1451364 | Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364 |
| Magnetic stir plate | Corning Laboratory Stirrers | 440826 | https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE |
| Collagenase | Roche | 5401020001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE |
| DNase I | Sigma | 10104159001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US |
| 1X PBS | Gibco | 20012-027 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 |
| Pipet aid | Thermo Scientific | 14387165 | https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357530 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357515 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 15 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339651 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339653 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| Single cell suspension | |||
| Eppendorf tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx |
| Tissue homogenizer | Kimble | K7495400000 | Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000 |
| Homogenizer tips | Kimble | 7495210590 | Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| Antibodies | |||
| BV786 anti-mouse CD45 | BD | 564225 | Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 |
| Live/Dead | Invitrogen | L34962 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962 |
| Other | |||
| Razor blades | VWR | 55411-050 | Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades |
References
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489, 231-241 (2012).
- Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes. Journal of Immunology. 198, 590-595 (2017).
- Mathis, D., Benoist, C. Microbiota and autoimmune disease: the hosted self. Cell Host Microbe. 10, 297-301 (2011).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46, 350-363 (2017).
- Jain, N., Walker, W. A. Diet and host-microbial crosstalk in postnatal intestinal immune homeostasis. Nature Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 12, 14-25 (2015).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews in Immunology. 14, 667-685 (2014).
- Macpherson, A. J., Uhr, T. Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria. Science. 303, 1662-1665 (2004).
- Mowat, A. M. Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens. Nature Reviews in Immunology. 3, 331-341 (2003).
- Diehl, G. E., et al. Microbiota restricts trafficking of bacteria to mesenteric lymph nodes by CX(3)CR1(hi) cells. Nature. 494 (3), 116-120 (2013).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50, 833-843 (2012).
- Conway, K. L., et al. ATG5 regulates plasma cell differentiation. Autophagy. 9, 528-537 (2013).
- Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii. Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).
- Guo, X., Muite, K., Wroblewska, J., Fu, Y. X. Purification and Adoptive Transfer of Group 3 Gut Innate Lymphoid Cells. Methods in Molecular Biology. 1422, 189-196 (2016).
- Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).
