Summary
Protokollen beskrevet her benytter en photolabeling tilnærming i nyfødte mus å identifisere spesifikt immunceller som emigrere fra kolon ekstra intestinal områder. Denne strategien vil være nyttig å studere vert-microbiome interaksjoner i tidlige liv.
Abstract
Innstigning bakteriell samfunn er etablert tidlig i livet og påvirke immun celle utvikling og funksjon. Neonatal bakterieflora er utsatt for mange ytre påvirkninger inkludert antibiotika bruk og kosthold, som påvirker mottakelighet for autoimmune og inflammatoriske sykdommer. Lidelser som inflammatorisk tarm sykdom (IBD) er preget av en massiv tilstrømning av immunceller i tarmen. Imidlertid kan immunceller betinget av bakterieflora i tillegg emigrere av tarmen å påvirke immunreaksjoner på ekstra intestinal nettsteder. Dermed er det behov for å identifisere og karakterisere celler som kan bære mikrobiell meldinger fra tarmen til distale nettsteder. Her beskriver vi en metode til etiketten celler i tykktarmen nyfødte mus i vivo som gjør sin legitimasjon på ekstra intestinal nettsteder etter overføringen.
Introduction
Pattedyr fordøyelsessystemet havner hundrevis arter av bakterier som finnes i et symbiotisk forhold med verten1. Immunceller i det lokale miljøet håndheve en fredelig sameksistens med disse mikrobene og etablere en beskyttende barriere mot patogen invasjoner. Dermed er toveis interaksjoner mellom immunceller og bakterieflora avgjørende for å etablere en commensal samfunn som utdanner immunsystemet verten og angir terskelen for immun reaktivitet til patogener. Mikrobiell sammensetning, eller dysbiosis, kan forstyrre immun homeostasis og forurolige regulatoriske kretser som holde intestinal betennelser som fører til immun-mediert sykdommer som Type 1 Diabetes og IBD2,3 .
Perioden umiddelbart etter fødselen er et unikt utviklingsmessige vindu der intestinal mikrobielle samfunn begynne å etablere samtidig immunsystemet modnes4. Postnatal bakterieflora er ikke stabil, med endringer i samfunnet sammensetningen forekommer naturlig og ofte5. Immunceller som samhandler med bakterieflora ligger i to forskjellige anatomiske steder i tarmen - lamina propria og intestinal epitel6. Det finnes mange typer immunceller i tarmen, inkludert lymfocytter (som T celler, B-celler og medfødte lymfoide celler) og myeloide celler (som omfatter dendrittiske celler, monocytter og makrofager). Disse cellene, også kjent som blodkreft cellene, utføre en rekke funksjoner som bevare intestinal barriere og opprettholde homeostase.
I tillegg til deres juridiske funksjoner på intestinal nettsteder kan immunceller mucosa også bære mikrobiell meldinger til ekstra intestinal steder å regulere systemisk immunitet7,8,9. Dette er et område av voksende forskningsinteresse fremhever behovet for metoder for å identifisere immunceller overføre av intestinal vev for å undersøke sin funksjon. Protokollen rapporterte her benytter en kommersielt tilgjengelig musemodell der en photoconvertible fluorescerende protein er utnyttet til etiketten celler. PhAMforbrukeravgift mus uttrykke overalt en grønn fluorescerende Dendra2 protein som er irreversibelt byttet til røde fluorescens ved aktivering av ultrafiolett (UV) lys10. Bruke en fiber optisk kanyle for å levere 405 nm lys inn i tykktarmen nyfødte mus, viser vi at photoconverted blodkreft cellene, som stammer fra eller passerte gjennom kolon kan bli funnet i milten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrer ble utført med godkjenning av og i samsvar med institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Massachusetts General Hospital.
Advarsel: Denne protokollen innebærer bruk av en klasse 3b laser (LG3). LG3 laser vernebriller må alltid brukes når dette laser. Passende opplæring og retningslinjer må følges for å unngå risikoen for skade.
1. design og montering av Laser
- Koble lysdiode (LED) (405 nm, 19.3 mW, 1400 mA, fiber-kombinert) til den LED driver via 4-pinners M8 kontakt kabelen som kommer knyttet til LED. Nøye skru festes tilkoblingen.
- Monterer optogenetics patch-kabel LED, holde kontakten åpning av LED opptil lyset å sikre at det ikke er synlig. Slaget ved å eliminere eventuelle hindringer eventuelt og optogenetics patch-kabel inn i åpningen.
- Koble fiber optisk kanyle optogenetics oppdateringen kabelen ved å sette inn kanyle i hver ende av kontakten ermet. Koble den andre enden av koblingen ermet til patch-kabel. Bruk nok trykk å sikre tilkoblingen, men vær forsiktig så du ikke bøye eller bryte optisk fiber i kanyle.
Merk: Den skjøre fiber optisk kanyle er dekket med beskyttelseshetten når laser ikke er i bruk. - Angi LED driveren til kontinuerlige bølgen (CW) modus med den kontinuerlige posis på 0 og den gjeldende grensen satt til 1.2 A.
2. Photoconversion av celler i tykktarmen
Merk: Mannlige og kvinnelige mus ble utsatt for intracolonic 405 nm lys 1-2 dag(er) etter deres fødselen og ble ofret før 1 uke alder.
- Sikre en mørk beliggenhet med tilgang til en stikkontakt. Koble LED driveren i stikkontakten.
Merk: Denne prosedyren utføres i minimal hvitt lys en lang eksponering av mus til omgivelseslyset kan forårsake en uønsket photoconversion celler. Rødt lys brukes som et alternativ.
Advarsel: Følgende trinn innebærer bruk av en dyr bedøvende. Administrasjon av anesthetic foregår i klasse II hette eller et annet passende scavenging system. Innånding av anesthetic kan forårsake svimmelhet, døsighet eller selv bevisstløshet. - Bedøve musen ved eksponering for 4-5% isoflurane i 100% O2 i en induksjon-boksen. Kontrollere riktig dybde av anestesi ved å knipe fast en bakben pote (ingen svar). Opprettholde anestesi via en forpart på ca 2% isoflurane. Hindre hånd eksponering for isoflurane ved hjelp av en passende hette eller anestesi scavenging enhet.
- Plasser bedøvet musen for intracolonic eksponering ved hjelp av 1 hånd til scruff baksiden av musen forsiktig med pekefingeren og tommelen. Snu musen for å avsløre magen. Løsne grepet Hvis musen begynner å miste sin rosa farge eller dens pustefrekvens begynner å avta. Sikre halen av musen mellom ringen og små fingre.
- Med den andre hånden, Fjern beskyttelseshetten fra kanyle. Samtidig opprettholde den lange aksen kanyle parallelt med musen er midtlinjen, forsiktig inn fiber optisk kanyle gjennom anus i tykktarmen slik at alle 5 mm av inne i musen.
Merk: Denne prosedyren utføres langsomt og med forsiktighet for ikke å autoperforering colonic veggen. Minutt wiggling og vridning av kanyle hjelpemidler fremme inn i tykktarmen. - Don vernebriller og øke laser gjeldende til maksimal verdi (helt klokken). Bekrefte tilstedeværelse av UV-lys ved å se på gjennomskinnelig magen av mus.
Merk: LG3 laser vernebriller dramatisk redusere synligheten. Har en kollega (Bruk verneutstyr) hjelpe donning briller og aktivere laser. - Utsette kolon til laser lys for totalt 2 min. uttak kanyle ca 1 mm hver 30 å maksimere luminal området utsettes for lys. På slutten av 2 min, deaktivere laser.
- Fjern sakte kanyle fra musen. Etter anestesi i en tom varm bur, tilbake musen til hjem buret.
3. isolering av Intestinal lymfocytter
- Forberede 1 L Hanks balansert Salt løsning/kalv serum (HBSS/CS) bufferen, 200 mL epithelial stripe buffer, 500 mL vask media og 200 mL ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA)-gratis vask media.
Merk: Reagens volumene beregnet for en utvalgsstørrelsen av 9.- Gjør HBSS/CS bufferen (HBSS, 5% CS) ved å legge til 50 mL av CS 950 mL av HBSS. Lagre det på isen.
- Forberede epithelial stripe bufferen [HBSS, 5% CS, 1 mM dithiothreitol (DTT), 5 mM EDTA, 15 mM 4-(2-Hydroxyethyl) piperazin-1-ethanesulfonic syre (HEPES) (pH 7.2 7.5)] ved å legge 10 mL av CS, 200 µL av 1 M DTT, 2 mL 0,5 M EDTA og 3 mL 1 M HEPES buffer 185 mL av HBSS. Plass epithelial stripe bufferen i et 37 ° C vannbad.
- Gjøre vask media (HBSS, 1% CS, 1 mM EDTA) ved å legge til 5 mL av CS og 1 mL av 0,5 M EDTA 494 mL av HBSS. Lagre det ved romtemperatur.
- Forberede EDTA-fri vask media (HBSS, 1% CS, 15 mM HEPES) ved å legge til 2 mL av CS og 3 mL 1 M HEPES 195 mL av HBSS. Lagre det ved romtemperatur.
- Gjøre en FACS buffer [1 x fosfat bufret saltvann (PBS) (pH = 7.2), 2% CS] ved å legge 10 mL av CS 490 mL PBS. Lagre det på isen.
- Klargjør vev samling rett ved å plassere en 70 µm celle sil i en 60 x 10 mm kultur parabol. Legge til 10 mL av HBSS/CS buffer (HBSS, 5% CS buffer laget i trinn 3.1.1 og lagret på is) rett og plasser den på isen.
- Avlive den mus via en overdose av inhalert isoflurane bruker riktig scavenging bedøvelse (en ca 3 min eksponering mot > 4% isoflurane i rommet luften eller 100% O2). Etter tilsynelatende opphør av pusting og refleks bevegelse, kontrollere fravær av dyp smerte ved å klemme fast en bakben pote (ved hjelp av pinsett anbefales). Sikre euthanasia via en halshogging et par kirurgisk saks eller nye barberkniv.
Merk: Cervical forvridning anbefales ikke for dette trinnet størrelse og alder på dyret. Disse metodene er forenlig med 2013 AVMA retningslinjene på Euthanasia og godkjent av MGH IACUC. - Høste kolon bruke ren tang og saks for å åpne magen. Gjenspeile tarmen 1 side av musen er magen å avsløre kolon. Fjerne hele kolon ved første transecting det bare distale (mot anus) til cecum. Så, mens fast grasping kolon med tang, bruke saks for å skjære gjennom urinrøret til endetarmen. Kuttet kolon som nær anus som mulig. Høste milten etter fjerne tykktarmen (se trinn 4.1-4.2 nedenfor).
Merk: Mens photoconversion protokollen mål bare ~ 25% av den nyfødte kolon (5 mm fiber optisk kanyle), hele kolon er høstet for å hjelpe i cellen isolasjon. - Rense tykktarmen ved hjelp av tang til å skyve innholdet ut av kolon og på en tørr papirhåndkle. Homogenize vev ved hjelp av barberblader Finhakk kolon i en lime på forsiden av en kultur parabol og deretter overføre lim til celle silen i Petriskål.
- Legge til en ren 8 mm lange magnetic røre bar silen og plasser rett på en 9-posisjon magnetisk rørestang plate. Angi magnetic røre bar hastigheten til 800 rpm og ruge celler for 5 min ved romtemperatur. Forkaste bufferen gjenta vask med 10 mL av HBSS/CS (HBSS, 5% CS buffer laget i trinn 3.1.1 og lagret på is). Kast bufferen etter vask.
- Dissociate epitelceller ved å legge 10 mL prewarmed epitel stripe bufferen (HBSS, 5% CS, 1mM DTT, 5mM EDTA, 15mM HEPES [pH 7.2 7.5] buffer som ble gjort i trinn 3.1.2 og lagret i et vannbad 37 ° C) til celle silen og rør på 800 rpm i 30 min i en 3 7 ° C inkubator. På slutten av inkubering, overføre bufferen beriket i epithelial fraksjonen til en ren 15 mL tube.
Merk: Epitel og tilknyttede celler (intestinal epitelceller og intestinal epithelial lymfocytter) utgitt i bufferen, mens cellene i den intakt lamina propria forblir på cellen silen under denne trinn11.- Sentrifuge beriket intestinal epithelial brøken (IELs) på 700 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Forkast nedbryting og resuspend celle pellet i 1 mL av FACS buffer. Lagre det på isen for bruk i trinn 3.15.
- Vask lamina propria brøk i cellen silen 2 x med HBSS/CS. Gjør legge 10 mL av HBSS/CS løsning (HBSS, 5% CS buffer som ble gjort i trinn 3.1.1 som er lagret på is) til celle silen og rør det 800 RPM i 5 minutter i en 37 ° C inkubator. Kaste bufferen etter hver vask.
- Vask prøven 2 x i vask medier. Tilsett 10 mL vask medier (HBSS, 1% CS, 1 mM EDTA buffer som ble gjort i trinn 3.1.3 og oppbevares ved romtemperatur) til celle silen og rør det 800 RPM i 15 min i en 37 ° C inkubator. Kaste bufferen etter hver vask.
- Etter å vaske media, kan du lagre det på isen for bruk i trinn 3.14.
- Vask prøven 2 x med HBSS/CS. legge 10 mL av HBSS/CS buffer (HBSS, 5% CS buffer i trinn 3.1.1 som er lagret på is) til celle silen og rør det 800 RPM i 5 minutter i en 37 ° C inkubator. Kaste bufferen etter hver vask.
- Inkuber vevet i EDTA-fri vaskebuffer. Legge til 10 mL av vaskebuffer EDTA-fri (HBSS, 1% CS, 15 mM HEPES buffer som ble gjort i trinn 3.1.4 og oppbevares ved romtemperatur) i celle silen og ruge platen i 10 min ved romtemperatur uten stirring. Kast bufferen på slutten av dette trinnet.
- Vask prøven 2 x med HBSS/CS og forberede enzym løsningen. Legge til 10 mL av HBSS/CS (HBSS, 5% CS buffer i trinn 3.1.1 som er lagret på is) buffer til celle silen og rør det 800 RPM i 10 minutter i en 37 ° C inkubator. Kaste bufferen etter hver vask.
- Forberede enzym løsningen (EDTA-fri vaske bufferen; 0,1 mg/mL DNase jeg; 167 mg/mL collagenase) i andre vask perioden: legge til 9 mg av DNase jeg og 15 mg lyofilisert collagenase til 90 mL av EDTA-fri vaske bufferen. Lagre løsningen ved romtemperatur.
- Fordøye den lamina propria fraksjon i cellen silen hente lamina propria lymfocytter (LPLs). Legge til 10 mL av enzymet løsningen (EDTA-fri vaskebuffer; 0,1 mg/mL DNase jeg; 167 mg/mL collagenase buffer i trinn 3.12.1 og oppbevares ved romtemperatur) til celle silen og rør det 800 RPM for 45 min i en 37 ° C inkubator.
Merk: LPLs er gitt i løsningen etter enzymatisk fordøyelsen.- Samle enzym løsningen inneholder cellene og filtrere det gjennom en ny cellen sil i et 50 mL konisk rør.
- Legge til 20 mL kaldt vask media (HBSS; 1% CS 1mM EDTA buffer laget i trinn 3.1.3 og lagret på isen i trinn 3.9.1) filtrerte cellene blokkere collagenase aktiviteten i enzym løsningen. Sentrifuge røret på 700 x g for 6 min ved romtemperatur. Forkast nedbryting og resuspend pellets som inneholder LPLs i 1 mL av FACS buffer.
- Kombiner IEL (fra trinn 3.7.1) og LPL (fra trinn 3.14) fraksjoner og stain dem med fluorescerende-konjugerte antistoffer for flyt cytometric analyse (se trinn 5).
Merk: IEL og LPL fraksjoner kan være farget separat hvis kupé informasjon.
4. isolering av lymfocytter fra milten
- Forberede innsamling røret ved å legge 500 µL FACS bufferen i et microcentrifuge rør. Lagre det på isen.
- Etter fjerner kolon (trinn 3.4), høste hele milten og plasser den i samlingen røret. Lagre vev på is.
- Bruker en elektrisk vev homogenizer, homogenize milten i et microcentrifuge rør i ca 1 sentrifuge prøven på 300 x g [mikro centrifuge] i 5 minutter ved romtemperatur og leveringstanken av nedbryting.
- Utføre den røde blodlegemer lysis av resuspending prøven i 500 µL av ammonium klor kalium (ACK) lyseringsbuffer å starte celledød av osmotisk lysis. Kan prøve å ruge 1-2 min ved romtemperatur og så resuspend det i 725 µL FACS bufferen.
- Sentrifuge prøven på 300 x g [mikro centrifuge] i 5 minutter ved romtemperatur og leveringstanken av nedbryting. Resuspend pellet i 500 µL FACS bufferen og filtrere det gjennom en 40 µm celle sil i en ny microcentrifuge tube. Overføre hele utvalget til en ny microcentrifuge tube og flekk det med fluorescerende-konjugerte antistoffer for flyt cytometric analyse (se trinn 5).
5. identifikasjon av Dendra-r+ celler ved hjelp av Flow cytometri
- Sentrifuge IEL/LPL og milt prøvene på 300 x g [mikro centrifuge] i 5 minutter ved romtemperatur og leveringstanken av nedbryting.
- Resuspend pellets i 100 µL antistoff flekker blanding. Forberede antistoffer flekker blanding ved å legge til 1 µL fluorescently-konjugerte anti-CD45 antistoff 100 µL av FACS buffer per prøve.
Merk: Det er viktig å sjarmere antistoffer brukes for flowcytometri før eksperimentet for å bestemme optimale konsentrasjonen der bindende metning oppstår. - Inkuber prøvene for 35 min på is (i et mørkt sted).
- Resuspend prøvene i 300 µL FACS bufferen og sentrifuge dem 300 x g [mikro centrifuge] i 5 minutter ved romtemperatur. Sug opp nedbryting og resuspend prøvene i 325 µL FACS bufferen. Analysere eksemplene på en flyt cytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En fiberoptisk kabel ble brukt til å levere 405 nm lys i kolon av 2 - dagers gammel PhAMforbrukeravgift mus. Tidligere eksperimenter identifiserte en 30 s avsøring å gi en maksimal photoconversion kolon celler med minimal cytotoksisitet (figur 1A). Derfor ble sekvensiell 30 s eksponeringer av ulike segmenter av kolon utført som beskrevet i protokollen. Etter laser eksponering, musene ble umiddelbart euthanized, og photoconversion av cellene var bestemt. Encellede forberedelser av totale colonic vev var farget med fluorescerende-konjugerte anti-CD45 antistoff og flyt cytometric analysen ble utført for å oppdage photoconversion. Uomvendte Dendra2-grønn (Dendra-g) protein har eksitasjon og utslipp maxima 490 og 553 nm henholdsvis og kan oppdages i FITC kanalen, mens photoconverted Dendra2-rød (Dendra-r) protein har eksitasjon og utslipp maxima 507 og 573 nm henholdsvis og kan påvises i PE kanalen av en flyt cytometer. Når irreversibelt byttet til sin røde form, Dendra2 er svært photostable og nyttig for langsiktig sporingsprogrammer.
Ingen Dendra-r+ celler ble oppdaget i unlasered mus (figur 1B venstre). Men 405 nm lyseksponering resulterte i forskjellige Dendra-r+ celle populasjoner i både CD45neg og CD45+ celle deler (figur 1B høyre). Å avgjøre hvis colonic photoconversion protokollen resultert i bakgrunnen merkingen av cellene på ekstra intestinal nettsteder, vi høstet spleens fra nylig photoconverted mus (T = 0) og assayed for Dendra-r+ celler av flowcytometri. Ingen Dendra-r+ celler ble oppdaget i CD45neg eller CD45+ celle deler (figur 1C), tyder på at intra-colonic laserstrålen ikke trenge nok photolabel celler i milten. Dermed Dendra-r+ celler finnes i milten etter tid for migrasjon (T = 3d, 5d) bør komme fra kolon.
Figur 1 : I vivo photoconversion av colonic vev. Celler i tykktarmen fra 2 - dagers gammel PhAMforbrukeravgift pups ble utsatt for intra-colonic 405 nm lys for 30 s som beskrevet. Photoconversion og merking av cellene var bestemt umiddelbart etter prosedyren (T = 0) av en flyt cytometric analyse av encellede forberedelser colonic vev og milt. (A) denne representant flyt cytometric dot tomten viser uttrykk for CD45 (x-aksen) og flekker av live-død fargestoffet (y-aksen) i én celle preparater fra kolon av kontroll og lasered mus. Paneler B og C er representativt flyt cytometric dot tomten overlegg som viser uttrykk for Dendra2-grønn protein (Dendra2-g,-aksen) og Dendra2-rød (Dendra2-r, loddrette akser) i kontroll-ueksponerte og utsatt CD45+ (blodkreft) og CD45neg (ikke-blodkreft) celler i (B) tykktarm og ()C) milten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Data fra et typisk photoconversion eksperiment å identifisere vandrende celler i milten vises i figur 2. Photoconversion cellene i kolon av 2 - dagers gammel PhAMforbrukeravgift mus ble utført i figur 1. Mus var euthanized 3 og 5 dager etter eksponering og tilstedeværelsen av Dendra-r+ celler i milten ble bestemt av flowcytometri. Det var ingen Dendra-r+ cellene i CD45neg celle delsettet, forenlig med den oppfatning at CD45neg cellene er primært epitel og andre strukturelle i tarmen. Noen CD45+ blodkreft cellene uttrykte Dendra-r, antyder at de hadde vært photoconverted i tykktarmen og overføres til milten.
Figur 2 : CD45+ blodkreft cellene migrere fra kolon til milten. Nyfødt (dag 0 - 2) PhAMforbrukeravgift mus ble utsatt for 405 nm lys photoconvert Dendra2 protein av intra-colonic eksponering. Representant flyt cytometri tomter Vis uttrykk for Dendra2-grønn protein (Dendra2-g,-aksen) og Dendra2-rød (Dendra2-r, loddrette akser) i CD45neg og CD45+ milt celler ueksponerte 5 dager gammel mus og utsatt mus analyseres på 3 og 5 dager (T = 3d, 5d) etter photoconversion. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Identifisering og karakterisering av celler som samhandler med og påvirkes av bakterieflora i tykktarmen er viktige og skal lette forståelsen av hvordan informasjon fra mucosal microenvironment videresendes til resten av kroppen. En metode for å studere gut-relaterte celle migrasjon krever isolering av gut-assosiert celler etterfulgt av en adopsjon overføring til mottakeren mus å bestemme sine vev-homing mønstre og funksjon12,13. Denne tilnærmingen er begrenset, så bare spesifikke celletyper som ble overført kan spores. Videre kan gjenstander som følge av isolering av celler fra vev og en renselsesprosess hindre i vivo vandrende prosessen. Flere nylig, var en endoskopisk photoconversion protokoll merke intestinal celler med Kaede mus rapporterte14. Denne studien fant en bred smugling av leukocytter til og fra tarmen voksen mus.
Rapporten beskriver en metode til etiketten celler i tykktarmen nyfødte mus og spore flytting til ekstra intestinal nettsteder som milten. PhAMforbrukeravgift musen uttrykker overalt et photoconvertible grønne fluorescerende Dendra2 protein som er irreversibelt byttet til røde fluorescens ved sin aktivering av UV-lyset. Eksponering for kolon av nyfødte mus 405 nm lys merket både CD45+ blodkreft og CD45neg ikke-blodkreft cellene. CD45+Dendra2-rød+ celler ble oppdaget i milten 3 til 5 dager etter photoconversion, som indikerer ekstra intestinal migrering av blodkreft cellene.
Det hastighetsbegrensning steget for denne analysen er en brøkdel av colonic området som er eksponert for 405 nm lys. Skjørhet nyfødte kolon og tilstedeværelsen av avføring, begrense men minimal på dette tidlig alder, lengden på fiber optisk kanyle som kan settes. Tidligere eksperimenter, kan en lengre kanyle ikke lykkes settes mer enn 5 mm. Smøremidler ble unngått på grunn av risikoen på variabel lett begravet av laserstrålen. Ytre bevegelse av kanyle hver 30 s hjalp maksimere colonic området utsatt for laserlys. Viktigst, en kanyle med en stor NA verdi (NA = 0,5) ble brukt til å generere et stort membran av lys i tykktarmen.
Denne protokollen blitt standardisert for nyfødte (dag 0 - 2) PhAMforbrukeravgift pups. Gitt endringer i innhold og lengden av kolon med alder av mus, må teknikken optimaliseres tilsvarende når du bruker eldre pups. Hovedsakelig, vil endringer den totale varigheten av photoconversion og lengden på innsetting av fiber optisk kanyle være nødvendig.
Denne tilnærmingen å forstå hos celler i tykktarmen er tilrettelagt av flyt cytometric analyse. Flere parameter flowcytometri videre kan brukes til å identifisere og fenotypen trekkfugl immun cellen typer innenfor CD45+ celle delsett. Dendra2-r+ celler kan også sorteres etter FACS for nedstrøms programmer som gene expression profilering eller Proteomikk analyser. Mens rettet til forståelsen av blodkreft celle undergrupper i tykktarmen i denne studien, kan metoden tilpasses for å studere mobilnettet migrasjon fra flere vev steder inkludert hjernen og huden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Nitya Jain ble støttet av en NIH/NIAID karriere overgangen Award 1K22AI116661-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser | |||
| Light Emitting Diode (LED) | THORLABS | M405FP1 | CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 |
| LED driver | THORLABS | LEDD1B | Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 |
| Optogenetics patch cable | THORLABS | M87L01 | 1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454 |
| Fiber optic cannula | Doric lenses | MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 | 5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036 |
| Power supply | THORLABS | KPS101 | Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 |
| LG3 laser safety goggles | THORLABS | LG3 | Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 |
| Red light | Electron Microscopy Sciences | 74327-10 | 15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences |
| Intestinal cell isolation | |||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3 |
| 1X HBSS | Gibco | 14025076 | Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 |
| Calf Serum | Hyclone AZM | 197696 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 |
| DTT | Sigma | 10197777001 | CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US |
| HEPES | Gibco | 15630080 | 1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 |
| Petri dish | Corning | 353004 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F |
| 70 micron cell strainer | Falcon | 352350 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712 |
| Micro magnetic stir bar | Fisherbrand | 1451364 | Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364 |
| Magnetic stir plate | Corning Laboratory Stirrers | 440826 | https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE |
| Collagenase | Roche | 5401020001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE |
| DNase I | Sigma | 10104159001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US |
| 1X PBS | Gibco | 20012-027 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 |
| Pipet aid | Thermo Scientific | 14387165 | https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357530 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357515 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 15 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339651 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339653 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| Single cell suspension | |||
| Eppendorf tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx |
| Tissue homogenizer | Kimble | K7495400000 | Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000 |
| Homogenizer tips | Kimble | 7495210590 | Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| Antibodies | |||
| BV786 anti-mouse CD45 | BD | 564225 | Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 |
| Live/Dead | Invitrogen | L34962 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962 |
| Other | |||
| Razor blades | VWR | 55411-050 | Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades |
References
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489, 231-241 (2012).
- Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes. Journal of Immunology. 198, 590-595 (2017).
- Mathis, D., Benoist, C. Microbiota and autoimmune disease: the hosted self. Cell Host Microbe. 10, 297-301 (2011).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46, 350-363 (2017).
- Jain, N., Walker, W. A. Diet and host-microbial crosstalk in postnatal intestinal immune homeostasis. Nature Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 12, 14-25 (2015).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews in Immunology. 14, 667-685 (2014).
- Macpherson, A. J., Uhr, T. Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria. Science. 303, 1662-1665 (2004).
- Mowat, A. M. Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens. Nature Reviews in Immunology. 3, 331-341 (2003).
- Diehl, G. E., et al. Microbiota restricts trafficking of bacteria to mesenteric lymph nodes by CX(3)CR1(hi) cells. Nature. 494 (3), 116-120 (2013).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50, 833-843 (2012).
- Conway, K. L., et al. ATG5 regulates plasma cell differentiation. Autophagy. 9, 528-537 (2013).
- Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii. Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).
- Guo, X., Muite, K., Wroblewska, J., Fu, Y. X. Purification and Adoptive Transfer of Group 3 Gut Innate Lymphoid Cells. Methods in Molecular Biology. 1422, 189-196 (2016).
- Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).
