Summary
Het hier beschreven protocol maakt gebruik van een photolabeling benadering bij pasgeboren muizen te specifiek immune cellen die van de dubbelpunt te naar extra intestinale sites emigreren te identificeren. Deze strategie zal worden nuttig zijn te onderzoeken van host-microbiome interacties in vroege leven.
Abstract
Darmen bacteriële Gemeenschappen zijn gevestigd vroeg in het leven en immuun cel ontwikkeling en functie beïnvloeden. De neonatale microbiota is gevoelig voor talrijke externe invloeden waaronder antibiotica gebruik en dieet, dat de gevolgen van de gevoeligheid voor auto-immuunziekten en inflammatoire ziekten. Stoornissen zoals Inflammatory Bowel Disease (IBD) worden gekenmerkt door een massale toevloed van immune cellen aan de darmen. Echter, kunnen immuuncellen geconditioneerd door de microbiota bovendien emigreren uit de darmen te beïnvloeden immuunresponsen bij extra-intestinale plaatsen. Er is dus een noodzaak om te identificeren en te karakteriseren cellen microbiële berichten van de darmen naar distale sites kunnen uitvoeren. Hier beschrijven we een methode om label cellen in de dikke darm van pasgeboren muizen in vivo waarmee hun identificatie op extra-intestinale sites na de migratie.
Introduction
De zoogdieren gastro-intestinale tractus havens honderden soorten bacteriën die aanwezig zijn in een symbiotische relatie met de host1. De immune cellen aanwezig in het lokale milieu dwingen een vreedzame coëxistentie met deze microben en stellen een beschermende barrière tegen pathogeen invasies. Dus, bi-directionele interacties tussen de immuun cellen en de microbiota zijn cruciaal voor het stellen van een commensale Gemeenschap die opleiden van het immuunsysteem van de gastheer en de drempel voor Immuunreactiviteit ingesteld voor ziekteverwekkers. Wijzigingen in de microbiële samenstelling, of dysbiosis, kan de immuun homeostase te verstoren en erover regelgevende circuits die bedwingen intestinale ontstekingen leiden tot immuun-gemedieerde aandoeningen zoals Type 1 Diabetes en IBD2,3 .
De periode onmiddellijk na de geboorte is een unieke developmental venster waarin de intestinale microbiële gemeenschappen beginnen om tegelijkertijd het immuunsysteem rijpt4. De postnatale microbiota is niet stabiel, met verschuivingen in de samenstelling van de Gemeenschap die van nature voorkomen en vaak5. De immune cellen die met de microbiota samenwerken bevinden zich in twee verschillende anatomische locaties in de darm - de lamina propria en het intestinaal epitheel6. Vele soorten immuuncellen zijn aanwezig in de darm, inclusief lymfocyten (zoals T-cellen, B-cellen en aangeboren lymfoïde cellen) alsmede myeloïde cellen (waaronder dendritische cellen, monocyten en macrofagen). Deze cellen, ook bekend als hematopoietische cellen, voeren een veelheid aan functies die behouden de intestinale barrière en homeostase te handhaven.
Naast hun regelgevende taken op intestinale sites, kunnen immune cellen van de mucosa ook overgaan tot microbiële berichten naar de extra-intestinale sites te reguleren van systemische immuniteit7,8,9. Dit is een gebied van groeiend belang van onderzoek en wijst op de noodzaak van methoden voor het identificeren van immune cellen die uit intestinale weefsels migreren om sonde van hun functie. Het protocol hier gemeld maakt gebruik van een commercieel beschikbare muismodel waarin een photoconvertible TL proteïne label cellen is benut. PhAMweggesneden muizen express overal een groen fluorescerend Dendra2 proteïne dat onomkeerbaar is overgestapt op rode fluorescentie na activatie door ultraviolet licht (UV)-10. Met behulp van een fiber optic canule om licht van 405 nm in de dikke darm van pasgeboren muizen, we laten zien dat photoconverted hematopoietische cellen, die is ontstaan in of doorgevoerd door de dikke darm kunnen worden gevonden in de milt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd met de goedkeuring van en in overeenstemming met de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) in de Massachusetts General Hospital.
Let op: Dit protocol omvat het gebruik van een klasse 3b laser (LG3). LG3 laser veiligheidsbril moeten altijd worden gebruikt wanneer deze laser. Passende opleiding en veiligheid richtsnoeren moeten worden gevolgd om te voorkomen dat het risico van verwonding.
1. ontwerp en assemblage van Laser
- Sluit het licht afgevende diodes (LED) (405 nm, 19.3 mW, 1400 mA, vezel-coupled) tot de LED driver via de M8 4-pins connectorkabel die wordt geleverd die aangesloten is op de LED. Zorgvuldig draai de schroef vast om te bevestigen de verbinding.
- Voordat u de patch-kabel van de optogenetics aan de LED koppelt, houdt de connector openstelling van de LED voor het licht zodat er zich geen zichtbare obstakels. Klap op de hole te elimineren alle obstakels indien nodig en stop de optogenetics patch-kabel in de opening.
- De fiber optic canule verbinden met de optogenetics patch-kabel door het invoegen van de canule in beide uiteinden van de mouw van de connector. Sluit het andere uiteinde van de mouw van de verbindingslijn naar de patch-kabel. Genoeg pressiemiddelen te beveiligen van de verbinding, maar wees voorzichtig niet buigen of breken van de optische vezel in de canule.
Opmerking: De fragiele fiber optic canule is bedekt met het beschermkapje wanneer de laser niet gebruikt wordt. - De LED driver ingesteld op de continuous wave (CW) modus met de continue instelknop op 0 en de huidige limiet ter 1.2 A.
2. Photoconversion van de cellen in de dikke darm
Opmerking: Mannelijke en vrouwelijke muizen werden blootgesteld aan licht voor 405 nm intracolonic 1-2 dag(en) na hun geboorte en vóór 1 week oud werden geofferd.
- Veilig een donkere locatie met een toegang tot een stopcontact. De LED driver stekker in het stopcontact.
Opmerking: Deze procedure wordt uitgevoerd in de minimale wit licht omdat een langdurige blootstelling van de muizen aan het omgevingslicht leiden een ongewenste photoconversion van cellen tot kan. Rood licht wordt gebruikt als een alternatief.
Let op: De volgende stap impliceert het gebruik van een dier verdoving. De administratie van de verdoving plaatsvindt in een klasse II-kap of met behulp van een andere passende opruiming systeem. De inhalatie van de verdoving kan leiden tot duizeligheid, slaperigheid, of zelfs bewusteloosheid. - Anesthetize de muis door blootstelling aan 4-5% Isofluraan in 100% O2 in een inductie-vak. Controleer of u goede diepte van verdoving door knijpen stevig een hind poot (geen antwoord). Verdoving via een neus kegel bij ongeveer 2% Isofluraan handhaven. Te voorkomen dat handler Isofluraan door gebruik van een passende kap of verdoving opruiming apparaat.
- Standpunt de narcose muis voor de blootstelling van de intracolonic met behulp van 1 hand nekvel de achterkant van de muis voorzichtig met de wijsvinger en de duim. Zet de muis over de buik bloot te stellen. Los de grip als de muis begint te verliezen haar roze kleur of als haar ademhalingstarief begint te vertragen. Beveilig de staart van de muis tussen de ring en de kleine vingers.
- Met de andere hand, verwijder de beschermende dop van de canule. Behoud van de lengteas van de canule evenwijdig aan de middellijn van de muis, zachtjes invoegen de canule fiber optic via de anus in de dikke darm zodat alle 5 mm van de optische vezel in de muis.
Opmerking: Deze procedure is langzaam en met zorg niet aan perforate de Colon muur uitgevoerd. Minuut wiggling en draaien van de canule helpt de vooruitgang in de dikke darm. - Don de veiligheidsbril en verhogen van de laser huidige aan de maximale waarde (helemaal met de klok mee). Bevestig de aanwezigheid van UV-licht door te kijken naar de doorzichtige buik van de muis.
Opmerking: De LG3 laser veiligheidsbril drastisch verlagen zichtbaarheid. Heb een collega (dragen beschermingsmiddelen) helpen bij het aantrekken van de bril en draaien op de laser. - Blootstellen van de dikke darm aan de laser licht voor een totaal van 2 min. Withdraw de canule ongeveer 1 mm elke 30 s te maximaliseren van het luminal gebied blootgesteld aan het licht. Aan het einde van de 2 min, de laser uit te schakelen.
- Verwijder langzaam de canule van de muis. Na het herstellen van verdoving in een lege warme kooi, terugkeren u de muis naar de kooi.
3. isolatie van intestinale lymfocyten
- Bereiden 1 L voor de Henks evenwichtig zout oplossing/kalf serum (HBSS/CS) buffer, epitheliale strip buffer 200 mL, 500 mL wassen media en 200 mL ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA)-gratis wassen media.
Opmerking: De reagens volumes worden berekend voor een steekproefgrootte van 9.- Controleer de HBSS/CS buffer (HBSS; 5% CS) door toevoeging van 50 mL voor CS aan 950 mL HBSS. Opslaan op het ijs.
- Voorbereiden van de epitheliale strip buffer [HBSS 5% CS 1 mM dithiothreitol (DTT); 5 mM EDTA; 15 mM 4-(2-Hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic zuur (HEPES) (pH 7,2-7,5)] door het toevoegen van 10 mL voor CS, 200 µL van 1 M DTT 2 mL EDTA 0.5 M en 3 mL 1 M HEPES-buffer tot 185 mL van HBSS. Plaats de epitheliale strip-buffer in een waterbad 37 ° C.
- De wash-media (HBSS; 1% CS 1 mM EDTA) door toevoeging van 5 mL CS en 1 mL van de EDTA 0.5 M tot 494 mL van HBSS maken Opslaan bij kamertemperatuur.
- Bereiden de wash EDTA-vrije media (1% CS, HBSS; 15 mM HEPES) door toevoeging van 2 mL van CS en 3 mL 1 M HEPES 195 ml HBSS. Opslaan bij kamertemperatuur.
- Maken van een buffer FACS [1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (pH = 7.2); 2% CS] door het toevoegen van 10 mL voor CS aan 490 mL PBS. Opslaan op het ijs.
- Het weefsel collectie schotel voor te bereiden door het plaatsen van een 70 µm cel zeef binnen een cultuur schotel van 60 x 10 mm. Voeg 10 mL van HBSS/CS buffer (HBSS; 5% CS buffer in stap 3.1.1 hebt gemaakt en opgeslagen op ijs) aan de schotel en plaats deze op het ijs.
- Euthanaseren de muis via een overdosis van geïnhaleerde Isofluraan met behulp van passende opruiming van verdoving (een ongeveer 3 min Gasbedwelming met > 4% Isofluraan in de kamer lucht of in 100% O2). Na schijnbare stopzetting van ademhaling en beweging reflex, controleert u of het ontbreken van diepe pijn door knijpen stevig een hind poot (met behulp van Tang wordt aanbevolen). Zorgen de euthanasie via een onthoofding met een paar chirurgische schaar of een nieuwe scheermes.
Opmerking: Cervicale dislocatie is niet aanbevolen voor deze stap vanwege de omvang en de leeftijd van het dier. Deze methoden zijn in overeenstemming met de richtsnoeren AVMA 2013 inzake euthanasie en goedgekeurd door de MGH IACUC. - Oogst van de dikke darm met behulp van schone pincet en schaar te openen van de buik. Weerspiegelen de darmen aan 1 kant van de buik van de muis om de dikke darm bloot te stellen. De hele dikke darm te verwijderen door het eerste transecting het net distale (richting de anus) aan de blindedarm. Vervolgens, terwijl stevig grijpen de dikke darm met pincet, gebruik schaar te snijden via de urinebuis tot en met het rectum. Snijd de dikke darm als dicht bij de anus mogelijk. Oogst van de milt na het verwijderen van de dikke darm (Zie stappen 4.1-4.2 hieronder).
Opmerking: Terwijl het photoconversion-protocol alleen is getarget op ~ 25% van de baby's dikke darm (5 mm van de fiber optic canule), wordt de hele dikke darm geoogst om te helpen bij de isolatie van de cel. - Reinigen van de dikke darm met behulp van de verlostang om te duwen de inhoud uit de dikke darm en op een droge papieren handdoek. Meng het weefsel door het gebruik van scheermesjes voor fijn hakken de dikke darm tot een pasta op de cover van een cultuur schotel en breng deze plakken naar de zeef van de cel in de petrischaal.
- Voeg een schone 8 mm lang magnetische roer bar naar de zeef en zet de schotel op een plaat 9-positie magneetroerder. Zet de magnetische roer bar snelheid naar 800 rpm en Incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Negeren van de buffer en herhaal het wassen met behulp van 10 mL HBSS/CS (de HBSS; 5% CS buffer in stap 3.1.1 hebt gemaakt en opgeslagen op ijs). Gooi de buffer aan het einde van the wash.
- Distantiëren van de epitheliale cellen door het toevoegen van 10 mL voorverwarmde epitheliale strip buffer (de HBSS 5% CS 1mM DTT; 5mM EDTA; 15mM [pH 7,2-7,5] HEPES-buffer die werd gemaakt in stap 3.1.2 en opgeslagen in een waterbad 37 ° C) aan de cel zeef en roer bij 800 rpm gedurende 30 min. in een 3 7 ° C incubator. Aan het eind van de incubatie, overdracht van de buffer in de epitheliale fractie tot een schone 15 mL koker verrijkt.
Opmerking: Het epitheel en bijbehorende cellen (intestinale epitheliaale cellen en de intestinale epitheliale lymfocyten) worden vrijgegeven in de buffer, terwijl de cellen in de intact lamina propria op de cel zeef tijdens deze stap11 blijven.- Centrifugeer de verrijkte intestinale epitheliale breuk (IELs) bij 700 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 1 mL FACS buffer. Opslaan op het ijs voor gebruik in stap 3.15.
- Wassen van de lamina propria breuk binnen de cel zeef 2 x met HBSS/CS. Om dit te doen, voeg 10 mL van oplossing HBSS/CS (HBSS; 5% CS buffer die werd gemaakt in stap 3.1.1 die is opgeslagen op het ijs) naar de cel zeef en roer het bij 800 rpm gedurende 5 min. in een 37 ° C incubator. Gooi de buffer na elke wasbeurt.
- Wassen van het monster 2 x wassen media. Voeg 10 mL van wassen media (HBSS; 1% CS 1 mM EDTA-buffer die werd gemaakt in stap 3.1.3 en opgeslagen bij kamertemperatuur) naar de cel zeef en roer het bij 800 rpm gedurende 15 min. in een 37 ° C incubator. Gooi de buffer na elke wasbeurt.
- Na het gebruik van de media van wassen, op het ijs voor het gebruik in stap 3.14 is opgeslagen.
- Wassen van het monster 2 x met HBSS/CS. Voeg 10 mL van HBSS/CS buffer (HBSS; 5% CS buffer gemaakt in stap 3.1.1 die is opgeslagen op het ijs) naar de cel zeef en roer het bij 800 rpm gedurende 5 min. in een 37 ° C incubator. Gooi de buffer na elke wasbeurt.
- Incubeer het weefsel in EDTA-vrij was buffer. Voeg 10 mL van de EDTA-vrij was buffer (1% CS, HBSS; 15 mM HEPES-buffer die werd gemaakt in stap 3.1.4 en opgeslagen bij kamertemperatuur) naar de cel zeef en de plaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur zonder roeren uit te broeden. Gooi de buffer aan het eind van deze stap.
- Wassen van het monster 2 x met HBSS/CS en de enzym-oplossing te bereiden. Voeg 10 mL van HBSS/CS (HBSS; 5% CS buffer gemaakt in stap 3.1.1 die is opgeslagen op het ijs) buffer naar de cel zeef en roer het bij 800 rpm gedurende 10 minuten in een 37 ° C incubator. Gooi de buffer na elke wasbeurt.
- Bereid de oplossing van het enzym (EDTA-gratis wassen buffer; 0,1 mg/mL DNase ik; 167 mg/mL collagenase) tijdens de tweede zittijd wassen: 9 mg toevoegen van DNase ik en 15 mg gelyofiliseerd collagenase aan 90 mL EDTA-gratis wassen buffer. De oplossing op kamertemperatuur worden opgeslagen.
- De Fractie van de lamina propria opgenomen in de zeef van de cel te verkrijgen van de lamina propria lymfocyten (LPLs) te verteren. Voeg 10 mL van de oplossing van het enzym (het EDTA-gratis was buffer; 0,1 mg/mL DNase ik; 167 mg/mL collagenase buffer in stap 3.12.1 hebt gemaakt en opgeslagen op kamertemperatuur) naar de cel zeef en roer het bij 800 rpm gedurende 45 min. in een 37 ° C incubator.
Opmerking: LPLs worden vrijgegeven in de oplossing na de enzymatische spijsvertering.- De enzym-oplossing met de cellen die verzamelen en filtreer het door een nieuwe cel zeef in een conische tube van 50 mL.
- Voeg 20 mL koud wassen media (de HBSS 1% CS; 1mM EDTA buffer gemaakt in stap 3.1.3 en opgeslagen op ijs in stap 3.9.1) naar de gefilterde cellen te blokkeren van de activiteit van de collagenase in de enzym-oplossing. Centrifugeer de buis bij 700 x g gedurende 6 min bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met LPLs in 1 mL FACS buffer.
- Combineer de IEL (uit stap 3.7.1) en de LPL (uit stap 3.14) breuken en vlekken hen met TL-geconjugeerde antilichamen voor de stroom cytometrische analyse (zie stap 5).
Opmerking: IEL en LPL breuken kunnen worden gekleurd afzonderlijk als compartiment informatie gewenst is.
4. isolatie van lymfocyten van de milt
- De collectie buis voor te bereiden door 500 µL van FACS buffer toe te voegen in een microcentrifuge buis. Opslaan op het ijs.
- Na het verwijderen van de dikke darm (stap 3.4), oogst de hele milt en plaats deze in de collectie buis. Bewaar het weefsel op het ijs.
- Met behulp van een elektrische weefsel homogenizer, meng de milt in een microcentrifuge buis voor ongeveer 1 min. Centrifuge het monster bij 300 x g [micro-centrifuge] gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en aspirate uit het supernatant.
- De lysis van de rode bloedcellen door het monster in 500 µL van ammonium-chloride-kalium (ACK) lysis buffer voor het inleiden van de celdood van lysis van de osmotische resuspending uitvoeren Toestaan dat de steekproef Incubeer 1-2 minuten bij kamertemperatuur en resuspendeer het vervolgens in 725 µL van FACS buffer.
- Centrifugeer het monster bij 300 x g [micro-centrifuge] gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en aspirate uit het supernatant. Resuspendeer de pellet in 500 µL van FACS buffer en filtreer het door een zeef van 40 µm cel in een nieuwe microcentrifuge buis. Het gehele monster overbrengen in een nieuwe microcentrifuge-buis en vlek het met TL-geconjugeerde antilichamen voor de stroom cytometrische analyse (zie stap 5).
5. identificatie van Dendra-r+ cellen met behulp van Stroom Cytometry
- Centrifugeer de IEL/LPL en milt monsters bij 300 x g [micro-centrifuge] gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en aspirate uit het supernatant.
- Resuspendeer de pellets in 100 µL van antilichaam kleuring mix. Het antilichaam kleuring mix door toevoeging van 1 µL van anti-CD45 fluorescently-geconjugeerde antilichaam aan 100 µL van FACS buffer per monster te bereiden.
Opmerking: Het is belangrijk dat de Titreer de antilichamen die gebruikt voor de stroom cytometry voorafgaand aan het experiment om te bepalen van de optimale concentratie waar bindende verzadiging optreedt. - Incubeer de monsters gedurende 35 min. op ijs (in een donkere locatie).
- Resuspendeer de monsters in 300 µL van FACS buffer en centrifugeer ze bij 300 x g [micro-centrifuge] gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de monsters in 325 µL van FACS buffer. Analyseer de monsters op een stroom cytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een glasvezel kabel werd gebruikt voor het leveren van 405 nm licht in de dubbele punten van 2 - dagen oude PhAMweggesneden muizen. In eerdere experimenten, was een 30 s blootstelling vastbesloten om het geven van een maximale photoconversion van cellen van de dikke darm met minimale cytotoxiciteit(Figuur 1). Daarom, sequentiële 30 s blootstelling aan verschillende segmenten van de dikke darm werden uitgevoerd zoals beschreven in het protocol. Nadat de laser is blootgesteld, de muizen werden onmiddellijk euthanized, en de photoconversion van de cellen werd bepaald. Eencellige preparaten van het totale Colon weefsel werden gekleurd met anti-CD45 TL-geconjugeerde antilichaam en de stroom cytometrische analyse werd uitgevoerd om te detecteren van photoconversion. Onbekeerde Dendra2-groen (Dendra-g) eiwit excitatie en emissie-maxima tot 490 en 553 nm respectievelijk en kan worden gedetecteerd in de FITC-kanaal, terwijl photoconverted Dendra2-rood (Dendra-r) eiwit excitatie en emissie-maxima op 507 en 573 nm heeft respectievelijk en kan worden gedetecteerd in de PE-kanaal van een stroom cytometer. Zodra u overgeschakeld onherroepelijk zijn rode vorm, Dendra2 is zeer photostable en nuttig voor lange termijn tracking-toepassingen.
Geen Dendra-r+ cellen werden ontdekt in unlasered muizen (Figuur 1B links). Echter, 405 nm lichte blootstelling resulteerde in verschillende Dendra-r+ cel populaties in zowel de CD45 de CD45,neg + cel compartimenten (Figuur 1B recht). Om te bepalen als het Colon photoconversion protocol geleid tot de etikettering van de achtergrond van cellen op extra-intestinale sites, we geoogst milt van nieuw photoconverted muizen (T = 0) en vehiculumcontrolegroep voor Dendra-r+ door stroom cytometry cellen. Geen Dendra-r+ cellen werden ontdekt in de CD45,neg of CD45+ cel compartimenten (Figuur 1C), wat suggereert dat de intra-Colon laserstraal genoeg om photolabel cellen in de milt niet deed doordringen. Dus, geen Dendra-r+ -cellen die zijn ontdekt in de milt, na die tijd voor de migratie (T = 3d, 5d) moet hebben afkomstig is van de dikke darm.
Figuur 1 : In vivo photoconversion van Colon weefsel. Cellen van de dikke darm van 2 - dagen oude PhAMweggesneden pups waren blootgesteld aan intra-Colon 405 nm licht voor 30 s zoals beschreven. De photoconversion en de etikettering van de cellen waren vastbesloten onmiddellijk na de ingreep (T = 0) door een flow cytometrische analyse van eencellige bereidingen van het Colon weefsel en de milt. (A) dit representatieve stroom cytometrische dot perceel toont de uitdrukking van CD45 (x-as) en de verkleuring van de leven-dood kleurstof (y-as) bij eencellige voorbereidingen van de dubbele punten van controle en lasered muizen. Panelen B en C zijn vertegenwoordiger stroom cytometrische dot perceel overlays waaruit de expressie van het eiwit Dendra2-groen (Dendra2-g, horizontale-as) en Dendra2-rood eiwit (Dendra2-r, verticaal-as) in onbelicht, controle en blootgesteld CD45+ (hematopoietische) en CD45,neg (niet-hematopoietische) cellen in (B) de dubbelpunt en het ()C) de milt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Gegevens uit een experiment van de typische photoconversion grote afstanden trekkende cellen in de milt worden geïdentificeerd zijn afgebeeld in Figuur 2. De photoconversion van de cellen in de dubbele punten van 2 - dagen oude PhAMweggesneden muizen werd uitgevoerd zoals in Figuur 1. Muizen werden euthanized 3 en 5 dagen na de blootstelling en de aanwezigheid van Dendra-r+ cellen in de milt werd bepaald door stroom cytometry. Er waren geen Dendra-r+ cellen in de CD45neg cel subset, consistent zijn met de opvatting dat de CD45neg cellen voornamelijk epitheliale zijn en andere structurele cellen van de darm. Sommige CD45+ hematopoietische cellen uitgedrukt Dendra-r, suggereren dat ze had al photoconverted in de dikke darm en gemigreerd naar de milt.
Figuur 2 : CD45+ hematopoietische cellen migreren vanuit de darm naar de milt. Pasgeborene (dag 0 - 2) PhAMweggesneden muizen werden blootgesteld aan licht van 405 nm aan photoconvert Dendra2 proteïne door intra-Colon blootstelling. De representatieve stroom cytometry percelen Toon de expressie van het eiwit Dendra2-groen (Dendra2-g, horizontale-as) en Dendra2-rood eiwit (Dendra2-r, verticaal-as) in CD45,neg en CD45+ milt cellen van onbelicht 5-dagen oude muizen en blootgesteld muizen geanalyseerd op 3 en 5 dagen (T = 3d, 5d) na de photoconversion. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De identificatie en karakterisering van cellen die communiceren met en worden beïnvloed door de microbiota in de dikke darm zijn belangrijk en moeten vergemakkelijken begrip van hoe de informatie van de mucosal communicatie is doorgegeven aan de rest van het lichaam. Een methode voor het bestuderen van de darm-gerelateerde cel migratie vereist het isolement van de darm-geassocieerde cellen, gevolgd door een adoptief overdracht naar geadresseerden muizen om te bepalen hun weefsel-homing patronen en12,13te functioneren. Deze aanpak is beperkt, aangezien alleen de specifieke celtypes die werden overgedragen kunnen worden bijgehouden. Verder, artefacten als gevolg van het isolement van de cellen van de weefsels en het zuiveringsproces kunnen belemmeren de trekkende proces in vivo . Meer recentelijk, een Endoscopische photoconversion protocol bij label intestinale cellen met behulp van Kaede muizen gerapporteerde14was. Deze studie bleek dat een brede mensenhandel van leukocyten en naar de darm volwassen muizen.
Ons verslag beschrijft een methode naar label cellen in de dikke darm van pasgeboren muizen en bijhouden van hun migratie naar extra intestinale sites zoals de milt. De PhAMweggesneden muis spreekt overal van een photoconvertible groen fluorescente Dendra2 eiwit dat onomkeerbaar is overgestapt op rode fluorescentie bij de activering door UV-licht. De blootstelling van de dubbele punten van pasgeboren muizen aan licht van 405 nm label beide CD45+ hematopoietische en CD45neg niet-hematopoietische cellen. CD45+Dendra2-rode+ cellen werden ontdekt in de milt 3 tot 5 dagen na de photoconversion, die de extra-intestinale migratie van hematopoietische cellen aangeeft.
De snelheidslimieten stap voor deze test is de breuk van het Colon gebied dat wordt blootgesteld aan licht van 405 nm. De kwetsbaarheid van de pasgeboren dikke darm en de aanwezigheid van ontlasting, beperken zij het minimale op deze jonge leeftijd, de lengte van de fiber optic canule die kan worden ingevoegd. In eerdere experimenten, kon een langere canule niet met succes toegevoegd meer dan 5 mm. Smeermiddelen werden vermeden vanwege het risico van de variabele lichtbreking van de laserstraal. De uiterlijke beweging van de canule iedere 30 s geholpen maximaliseren van het Colon gebied blootgesteld aan de laserlicht. Nog belangrijker is, een canule met een hoge waarde van de nb (NB = 0,5) werd gebruikt voor het genereren van een brede kegel van licht in de dikke darm.
Dit protocol is gestandaardiseerd voor pasgeborene (dag 0 - 2) PhAMweggesneden pups. Gezien de veranderingen in de inhoud en lengte van de dikke darm met de leeftijd van de muizen, zal de techniek moeten dienovereenkomstig worden geoptimaliseerd bij het gebruik van oudere pups. In de eerste plaats, zal wijzigingen in de totale duur van de photoconversion en de lengte van het inbrengen van de fiber optic canule noodzakelijk zijn.
Deze aanpak voor het begrip van het trekgedrag van cellen in de dikke darm wordt vergemakkelijkt door flow cytometrische analyse. Multi-parameter stroom cytometry verder kan worden gebruikt om te identificeren en fenotype de migrerende immuun cel typen binnen de CD45+ cel deelverzameling. Dendra2-r+ cellen kunnen ook worden gesorteerd op FACS voor downstream toepassingen zoals gen expressie profilering of proteomics analyses. Terwijl gericht op het begrip van hematopoietische cel deelverzamelingen in de dubbele punt in deze studie, kan de methode worden aangepast om te bestuderen van cellulaire migratie van extra weefsel sites, inclusief de hersenen en de huid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Nitya Jain werd gesteund door een NIH/NIAID Career Transition Award 1K22AI116661-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser | |||
| Light Emitting Diode (LED) | THORLABS | M405FP1 | CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 |
| LED driver | THORLABS | LEDD1B | Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 |
| Optogenetics patch cable | THORLABS | M87L01 | 1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454 |
| Fiber optic cannula | Doric lenses | MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 | 5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036 |
| Power supply | THORLABS | KPS101 | Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 |
| LG3 laser safety goggles | THORLABS | LG3 | Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 |
| Red light | Electron Microscopy Sciences | 74327-10 | 15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences |
| Intestinal cell isolation | |||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3 |
| 1X HBSS | Gibco | 14025076 | Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 |
| Calf Serum | Hyclone AZM | 197696 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 |
| DTT | Sigma | 10197777001 | CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US |
| HEPES | Gibco | 15630080 | 1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 |
| Petri dish | Corning | 353004 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F |
| 70 micron cell strainer | Falcon | 352350 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712 |
| Micro magnetic stir bar | Fisherbrand | 1451364 | Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364 |
| Magnetic stir plate | Corning Laboratory Stirrers | 440826 | https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE |
| Collagenase | Roche | 5401020001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE |
| DNase I | Sigma | 10104159001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US |
| 1X PBS | Gibco | 20012-027 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 |
| Pipet aid | Thermo Scientific | 14387165 | https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357530 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357515 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 15 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339651 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339653 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| Single cell suspension | |||
| Eppendorf tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx |
| Tissue homogenizer | Kimble | K7495400000 | Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000 |
| Homogenizer tips | Kimble | 7495210590 | Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| Antibodies | |||
| BV786 anti-mouse CD45 | BD | 564225 | Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 |
| Live/Dead | Invitrogen | L34962 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962 |
| Other | |||
| Razor blades | VWR | 55411-050 | Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades |
References
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489, 231-241 (2012).
- Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes. Journal of Immunology. 198, 590-595 (2017).
- Mathis, D., Benoist, C. Microbiota and autoimmune disease: the hosted self. Cell Host Microbe. 10, 297-301 (2011).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46, 350-363 (2017).
- Jain, N., Walker, W. A. Diet and host-microbial crosstalk in postnatal intestinal immune homeostasis. Nature Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 12, 14-25 (2015).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews in Immunology. 14, 667-685 (2014).
- Macpherson, A. J., Uhr, T. Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria. Science. 303, 1662-1665 (2004).
- Mowat, A. M. Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens. Nature Reviews in Immunology. 3, 331-341 (2003).
- Diehl, G. E., et al. Microbiota restricts trafficking of bacteria to mesenteric lymph nodes by CX(3)CR1(hi) cells. Nature. 494 (3), 116-120 (2013).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50, 833-843 (2012).
- Conway, K. L., et al. ATG5 regulates plasma cell differentiation. Autophagy. 9, 528-537 (2013).
- Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii. Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).
- Guo, X., Muite, K., Wroblewska, J., Fu, Y. X. Purification and Adoptive Transfer of Group 3 Gut Innate Lymphoid Cells. Methods in Molecular Biology. 1422, 189-196 (2016).
- Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).
