Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

वीवो में नवजात चूहों में टेम कोशिकाओं की प्रवासी क्षमता का आकलन करने के लिए बृहदांत्र में कोशिकाओं की Photolabeling

Published: August 10, 2018 doi: 10.3791/57929
Automatic Translation
1, 2, 2
1Center for Computational and Integrative Biology, Massachusetts General Hospital, 2Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital

Summary

प्रोटोकॉल यहां वर्णित नवजात चूहों में एक photolabeling दृष्टिकोण का इस्तेमाल विशेष रूप से प्रतिरक्षा कोशिकाओं है कि बृहदांत्र से अतिरिक्त आंत्र साइटों के लिए बसने की पहचान । इस रणनीति के शुरुआती जीवन में मेजबान-microbiome बातचीत का अध्ययन उपयोगी होगा.

Abstract

दर्जी बैक्टीरियल समुदायों के जीवन में जल्दी स्थापित कर रहे है और प्रभाव प्रतिरक्षा सेल विकास और समारोह । नवजात microbiota एंटीबायोटिक दवाओं के उपयोग और आहार है, जो स्व-प्रतिरक्षित और भड़काऊ रोगों के लिए संवेदनशीलता प्रभावों सहित कई बाहरी प्रभावों के लिए अतिसंवेदनशील है । इस तरह के भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी) के रूप में विकारों आंतों के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक विशाल आमद की विशेषता है । हालांकि, प्रतिरक्षा कोशिकाओं microbiota द्वारा वातानुकूलित अतिरिक्त आंतों साइटों पर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करने के लिए आंतों से बाहर बसने हो सकता है. इस प्रकार, वहां की पहचान करने और कोशिकाओं है कि आंतों से माइक्रोबियल संदेश बाहर की साइटों के लिए ले जा सकता है की विशेषता है । यहां, हम एक विधि का वर्णन करने के लिए vivo में नवजात चूहों के बृहदांत्र में कोशिकाओं लेबल है कि प्रवास के बाद अतिरिक्त आंत्र साइटों पर उनकी पहचान को सक्षम बनाता है ।

Introduction

स्तनधारी जठरांत्र संबंधी मार्ग बैक्टीरिया है कि मेजबान1के साथ एक सहजीवी संबंध में मौजूद की प्रजातियों के सैकड़ों बंदरगाह । स्थानीय वातावरण में मौजूद प्रतिरक्षा कोशिकाओं इन रोगाणुओं के साथ एक शांतिपूर्ण सह-अस्तित्व लागू करने और रोगज़नक़ हमलों के खिलाफ एक सुरक्षात्मक बाधा स्थापित । इस प्रकार, द्वि-प्रतिरक्षा कोशिकाओं और microbiota के बीच दिशात्मक बातचीत के लिए एक खाना खानेवाला समुदाय है कि मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली को शिक्षित और रोगजनकों के लिए प्रतिरक्षा जेट के लिए दहलीज सेट स्थापित महत्वपूर्ण हैं । माइक्रोबियल संरचना में परिवर्तन, या dysbiosis, प्रतिरक्षा homeostasis और perturb विनियामक सर्किट परेशान कर सकते है कि आंतों की सूजन जैसे प्रकार के रूप में प्रतिरक्षा-मध्यस्थता रोगों के लिए प्रमुख 1 मधुमेह और आईबीडी2,3 .

जंम के तुरंत बाद की अवधि एक अनूठा विकास खिड़की है जिसके दौरान आंतों माइक्रोबियल समुदायों को एक ही समय में स्थापित करने के लिए प्रतिरक्षा प्रणाली के4परिपक्व शुरू होता है । जन्मोत्तर microbiota स्थिर नहीं है, समुदाय संरचना में बदलाव के साथ स्वाभाविक रूप से और5बार होने वाली । प्रतिरक्षा कोशिकाओं है कि microbiota के साथ बातचीत आंत में दो विशिष्ट संरचनात्मक स्थानों में रहते हैं- लेमिना propria और आंत्र उपकला6. प्रतिरक्षा कोशिकाओं के कई प्रकार (जैसे टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, और जन्मजात लसीकावत् कोशिकाओं के रूप में) के रूप में अच्छी तरह से माइलॉयड कोशिकाओं (जो वृक्ष कोशिकाओं, monocytes, और मैक्रोफेज शामिल हैं) के रूप में लिम्फोसाइटों सहित आंत में मौजूद हैं । इन कोशिकाओं को भी टेम कोशिकाओं के रूप में जाना जाता है, कार्यों की एक भीड़ है कि आंतों बाधा को बनाए रखने और homeostasis का रखरखाव करते हैं ।

आंतों साइटों पर अपने विनियामक कार्यों के अलावा, श्लेष्मा की प्रतिरक्षा कोशिकाओं को भी अतिरिक्त आंत्र साइटों के लिए माइक्रोबियल संदेश ले जा सकता है प्रणालीगत प्रतिरक्षा7,8,9को विनियमित । यह अनुसंधान के बढ़ते हित का एक क्षेत्र है और प्रतिरक्षा कोशिकाओं है कि आंतों के ऊतकों से बाहर पलायन की पहचान करने के लिए तरीकों की जरूरत पर प्रकाश डाला गया ताकि उनके समारोह की जांच करने के लिए । प्रोटोकॉल यहां रिपोर्ट एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माउस मॉडल जिसमें एक photoconvertible फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए कोशिकाओं लेबल का दोहन किया जाता है का उपयोग करता है । फामआबकारी चूहों बैरे एक हरी फ्लोरोसेंट Dendra2 प्रोटीन है कि अचल पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश10द्वारा सक्रियण पर लाल प्रतिदीप्ति के लिए बंद है व्यक्त करते हैं । एक फाइबर ऑप्टिक प्रवेशनी का उपयोग करने के लिए नवजात चूहों के बृहदांत्र में ४०५ एनएम प्रकाश देने के लिए, हम प्रदर्शन करते है कि photoconverted टेम कोशिकाओं है, जो में उत्पंन किया है या बृहदांत्र के माध्यम से पारगमन तिल्ली में पाया जा सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं के अनुमोदन के साथ प्रदर्शन किया गया और के अनुपालन में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल में ।

चेतावनी: इस प्रोटोकॉल एक वर्ग के उपयोग शामिल है बी सी लेजर (LG3) । LG3 लेजर सुरक्षा चश्मे हमेशा इस्तेमाल किया जाना चाहिए जब इस लेजर ऑपरेटिंग । चोट के खतरे से बचने के लिए उपयुक्त प्रशिक्षण और सुरक्षा दिशानिर्देशों का पालन करना होगा ।

1. डिजाइन और लेजर के विधानसभा

  1. एलईडी प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) कनेक्ट (४०५ एनएम, १९.३ मेगावाट, १४०० mA, फाइबर युग्मित) एलईडी ड्राइवर के लिए 4 पिन M8 संबंधक केबल के माध्यम से जुड़ी है कि आता है । ध्यान से कनेक्शन जकड़ना पेंच कस ।
  2. एलईडी करने के लिए optogenetics पैच केबल संलग्न करने से पहले, वहाँ कोई दिखाई अवरोधों हैं सुनिश्चित करने के लिए प्रकाश के लिए एलईडी के कनेक्टर खोलने पकड़ो. छेद पर उड़ा यदि आवश्यक हो तो किसी भी अवरोधों को खत्म करने और खोलने में optogenetics पैच केबल डालें ।
  3. कनेक्टर आस्तीन के या तो अंत में प्रवेशनी डालने के द्वारा optogenetics पैच केबल के लिए फाइबर ऑप्टिक प्रवेशनी कनेक्ट । कनेक्टर आस्तीन के दूसरे छोर पैच केबल अनुलग्न करें ।  कनेक्शन को सुरक्षित करने के लिए पर्याप्त दबाव लागू करें, लेकिन प्रवेशनी में ऑप्टिकल फाइबर को मोड़ने या तोड़ने के लिए सावधान रहें ।
    नोट: नाजुक फाइबर ऑप्टिक प्रवेशनी सुरक्षात्मक टोपी के साथ कवर किया जाता है जब भी लेजर उपयोग में नहीं है ।
  4. लगातार लहर (CW) मोड के लिए एलईडी चालक 0 पर निरंतर समायोजन घुंडी और वर्तमान १.२ A के लिए सेट सीमा के साथ सेट करें ।

2. बृहदांत्र में कोशिकाओं के Photoconversion

नोट: पुरुष और महिला चूहों उनके जंम के बाद intracolonic ४०५ एनएम प्रकाश 1-2 दिन (ओं) को उजागर किया गया और उंर के 1 सप्ताह से पहले बलिदान दिया गया ।

  1. एक बिजली के आउटलेट के लिए एक पहुंच के साथ एक अंधेरे स्थान सुरक्षित । एलईडी ड्राइवर को आउटलेट में प्लग करें ।
    नोट: इस प्रक्रिया को ंयूनतम सफेद प्रकाश में किया जाता है परिवेश प्रकाश के लिए चूहों की एक लंबी जोखिम के रूप में कोशिकाओं के एक अवांछित photoconversion कारण हो सकता है । लाल बत्ती एक विकल्प के रूप में प्रयोग किया जाता है ।
    चेतावनी: निंनलिखित कदम एक जानवर संवेदनाहारी का उपयोग शामिल है । संवेदनाहारी के प्रशासन के एक वर्ग द्वितीय हूड में जगह लेता है या एक और उचित सफाई प्रणाली का उपयोग करके । संवेदनाहारी की साँस लेना चक्कर आना, तंद्रा, या यहां तक कि बेहोशी का कारण हो सकता है ।
  2. Anesthetize एक प्रेरण बॉक्स में १००% O2 में 4-5% isoflurane करने के लिए जोखिम से माउस । दृढ़ता से एक हिंद पंजा चुटकी (कोई जवाब नहीं) द्वारा संज्ञाहरण के उचित गहराई की पुष्टि करें । लगभग 2% isoflurane पर एक नाक शंकु के माध्यम से संज्ञाहरण बनाए रखें । एक उपयुक्त हूड या संवेदनाहारी सफ़ाई डिवाइस के उपयोग द्वारा isoflurane करने के लिए हैंडलर जोखिम को रोकें ।
  3. intracolonic एक्सपोजर के लिए anesthetized माउस की स्थिति 1 हाथ का उपयोग करके माउस के पीछे तर्जनी और अंगूठे के साथ धीरे scruff । पेट को बेनकाब करने के लिए माउस को चालू करें । पकड़ ढीला अगर माउस अपने गुलाबी रंग खोने के लिए शुरू होता है या यदि इसके श्वास दर धीमी गति से शुरू होता है । अंगूठी और छोटी उंगलियों के बीच माउस की पूंछ को सुरक्षित करें ।
  4. दूसरे हाथ से, प्रवेशनी से सुरक्षात्मक टोपी हटा दें । जबकि माउस के midline करने के लिए समानांतर प्रवेशनी की लंबी धुरी को बनाए रखने, धीरे बृहदांत्र में गुदा के माध्यम से फाइबर ऑप्टिक प्रवेशनी डालने इतना है कि ऑप्टिकल फाइबर के सभी 5 मिमी माउस के अंदर हैं ।
    नोट: यह प्रक्रिया धीरे और देखभाल के साथ किया जाता है के लिए नहीं बृहदांत्र दीवार छिद्र । मिनट के चढ़ाव और प्रवेशनी के घुमा पेट में उंनति एड्स ।
  5. सुरक्षा चश्मे डॉन और लेजर अधिकतम मूल्य (सभी तरह से दक्षिणावर्त) को वर्तमान वृद्धि हुई है । माउस की पारदर्शी पेट को देखकर यूवी प्रकाश की उपस्थिति की पुष्टि करें ।
    नोट: LG3 लेजर सुरक्षा चश्मे नाटकीय रूप से दृश्यता में कमी । एक सहयोगी है (सुरक्षात्मक उपकरण पहने हुए) काले चश्मे धारण और लेजर पर मोड़ में सहायता करते हैं ।
  6. 2 मिनट की कुल के लिए लेजर प्रकाश को बृहदांत्र बेनकाब । प्रवेशनी लगभग 1 मिमी हर 30 एस वापस प्रकाश को उजागर चमकदार क्षेत्र को अधिकतम करने के लिए । 2 मिनट के अंत में, लेजर बंद कर दें ।
  7. धीरे से माउस से प्रवेशनी निकालें । एक खाली गर्म पिंजरे में संज्ञाहरण से उबरने के बाद, घर पिंजरे में माउस वापस ।

3. आंतों लिम्फोसाइटों का अलगाव

  1. तैयार 1 है हांक संतुलित नमक समाधान/बछड़ा सीरम (HBSS/सीएस) बफर, उपकला पट्टी बफर के २०० मिलीलीटर, धो मीडिया के ५०० मिलीलीटर, और ethylenediaminetetraacetic एसिड की २०० मिलीलीटर (EDTA)-मुक्त धो मीडिया ।
    नोट: एजेंट वॉल्यूम 9 का एक नमूना आकार के लिए परिकलित की जाती हैं ।
    1. HBSS/cs बफ़र (HBSS; 5% cs) HBSS के ९५० मिलीलीटर करने के लिए सीएस के ५० मिलीलीटर जोड़कर बना । यह बर्फ पर स्टोर ।
    2. उपकला पट्टी बफर तैयार [HBSS; 5% सीएस; 1 मिमी dithiothreitol (डीटीटी); 5 मिमी EDTA; 15 मिमी 4-(2-Hydroxyethyl) पिपेराजीन-1-ethanesulfonic एसिड (HEPES) (पीएच ७.२-७.५)] सीएस के 10 मिलीलीटर जोड़कर, २०० µ एल के 1 एम डीटीटी, ०.५ मीटर EDTA के 2 मिलीलीटर, और 1 मीटर HEPES बफर के 3 मिलीलीटर १८५ मिलीलीटर च्या HBSS. एक ३७ ° c पानी स्नान में उपकला पट्टी बफर प्लेस ।
    3. वॉश मीडिया (HBSS; 1% cs; 1 mM EDTA) को जोड़कर सीएस के 5 एमएल और ०.५ मीटर EDTA के 1 एमएल को ४९४ एमएल के HBSS से बना कर । यह कमरे के तापमान पर स्टोर ।
    4. EDTA-फ्री वॉश मीडिया तैयार करें (HBSS; 1% cs; 15 mM HEPES) सीएस के 2 एमएल और 1 एम HEPES के 3 एमएल को जोड़कर १९५ मिलीलीटर की HBSS । यह कमरे के तापमान पर स्टोर ।
    5. एक FACS बफर बनाओ [1x फास्फेट बफर खारा (पंजाब) (पीएच = ७.२); 2% cs] पंजाब के ४९० मिलीलीटर के लिए सीएस के 10 मिलीलीटर जोड़कर । यह बर्फ पर स्टोर ।
  2. एक ६० x 10 mm कल्चरल डिश के अंदर एक ७० µm सेल छलनी रखकर टिशू कलेक्शन डिश तैयार करें । HBSS/cs बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें (HBSS; 5% सीएस बफर चरण 3.1.1 में बनाया और बर्फ पर संग्रहीत) पकवान के लिए और यह बर्फ पर जगह है ।
  3. Euthanize की अधिक मात्रा के माध्यम से माउस संवेदनाहारी के उचित सफाई का उपयोग कर isoflurane (एक लगभग 3 मिनट के प्रदर्शन के लिए > 4% isoflurane कक्ष हवा में या १००% हे2में) । सांस लेने और पलटा आंदोलन के स्पष्ट समाप्ति के बाद, दृढ़ता से एक हिंद पंजा चुटकी द्वारा गहरे दर्द के अभाव सत्यापित (संदंश का उपयोग अनुशंसित है) । या तो सर्जिकल कैंची या एक नया सीधे उस्तरा की एक जोड़ी का उपयोग कर एक decapitation के माध्यम से इच्छामृत्यु सुनिश्चित करें ।
    नोट: गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन के आकार और जानवर की उंर के कारण इस कदम के लिए अनुशंसित नहीं है । ये विधियां इच्छामृत्यु पर २०१३ AVMA दिशानिर्देशों के अनुरूप है और MGH IACUC द्वारा अनुमोदित की गई हैं ।
  4. पेट को खोलने के लिए साफ संदंश और कैंची का उपयोग कर बृहदांत्र फसल । माउस के पेट के 1 पक्ष को आंत को बेनकाब करने के लिए दर्शाते हैं । पहले यह सिर्फ बाहर (गुदा की ओर) अंधान्त्र को transecting द्वारा पूरे बृहदांत्र निकालें । फिर, जबकि दृढ़ता से संदंश के साथ बृहदांत्र लोभी, उपयोग कैंची मलाशय के लिए मूत्रमार्ग के माध्यम से कटौती करने के लिए । संभव के रूप में गुदा के करीब के रूप में बृहदांत्र काट । बृहदांत्र को हटाने के बाद तिल्ली हार्वेस्ट (कदम ४.१-४.२ नीचे देखें) ।
    नोट: photoconversion प्रोटोकॉल केवल लक्ष्य ~ नवजात के बृहदांत्र के 25% (फाइबर ऑप्टिक प्रवेशनी के 5 मिमी), पूरे बृहदांत्र कोशिका अलगाव में सहायता के लिए काटा जाता है ।
  5. संदंश का उपयोग करने की सामग्री को बृहदांत्र से बाहर धक्का और एक सूखी कागज तौलिया पर बृहदांत्र साफ । Homogenize एक संस्कृति पकवान के कवर पर एक पेस्ट में ठीक से बृहदांत्र काटना और फिर पेट्री डिश में सेल छलनी करने के लिए इस पेस्ट हस्तांतरण उस्तरा ब्लेड का उपयोग करके ऊतक ।
  6. छलनी करने के लिए एक साफ 8 मिमी लंबे चुंबकीय हलचल बार जोड़ें और एक 9 स्थिति चुंबकीय सरगर्मी थाली पर पकवान जगह है । ८०० rpm को चुंबकीय हलचल बार गति सेट और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं गर्मी । बफर छोड़ें और HBSS/cs (HBSS; 5% सीएस बफर चरण 3.1.1 में किए गए और बर्फ पर संग्रहीत) के 10 मिलीलीटर का उपयोग कर धो दोहराएं । धोने के अंत में बफर छोड़ें ।
  7. अलग कर देना के 10 मिलीलीटर जोड़कर उपकला कोशिकाओं को गर्म उपकला पट्टी बफर (HBSS; 5% CS; 1mM डीटीटी; 5 मिमी EDTA; 15mM HEPES [pH ७.२-७.५] बफर कि 3.1.2 चरण में किया गया था और एक ३७ ° c जल स्नान में संग्रहीत) सेल छलनी और 30 मिनट के लिए ८०० rpm पर हलचल में एक 3 7 ° c मशीन । मशीन के अंत में, एक साफ 15 मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए उपकला अंश में समृद्ध बफर हस्तांतरण.
    नोट: उपकला और संबंधित कोशिकाओं (आंत्र उपकला कोशिकाओं और आंतों उपकला लिम्फोसाइटों) बफर में जारी कर रहे हैं, जबकि बरकरार लेमिना propria में कोशिकाओं इस चरण11के दौरान सेल छलनी पर रहते हैं.
    1. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ७०० x g पर समृद्ध आंत्र उपकला अंश (आइईएल) केंद्रापसारक । supernatant त्यागें और FACS बफर के 1 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend । यह कदम ३.१५ में उपयोग के लिए बर्फ पर स्टोर ।
  8. HBSS के साथ सेल छलनी 2x के भीतर लेमिना propria अंश धो/ ऐसा करने के लिए, HBSS/CS समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ें (HBSS; 5% सीएस बफर कि बर्फ पर संग्रहीत किया गया है चरण 3.1.1 में किया गया) सेल छलनी करने के लिए और एक ३७ डिग्री सेल्सियस में 5 मिनट के लिए ८०० rpm पर यह हलचल । प्रत्येक धोने के बाद बफर छोड़ें ।
  9. धो मीडिया में नमूना 2x धो लो । धो मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें (HBSS; 1% CS; 1 mM EDTA बफर कि कदम 3.1.3 में किया गया था और कमरे के तापमान पर संग्रहीत) के लिए सेल छलनी और यह ८०० rpm में 15 मिनट के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में हलचल । प्रत्येक धोने के बाद बफर छोड़ें ।
    1. धोने मीडिया का उपयोग करने के बाद, यह कदम ३.१४ में उपयोग के लिए बर्फ पर स्टोर ।
  10. HBSS/सीएस के साथ नमूना 2x धो/HBSS/सीएस बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें (HBSS; 5% सीएस बफर चरण 3.1.1 है कि बर्फ पर संग्रहीत किया गया है में किए गए) सेल छलनी करने के लिए और एक ३७ डिग्री सेल्सियस में 5 मिनट के लिए ८०० rpm पर यह हलचल । प्रत्येक धोने के बाद बफर छोड़ें ।
  11. EDTA-मुक्त धोने बफर में ऊतक मशीन । EDTA-मुक्त वॉश बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें (HBSS; 1% CS; 15 मिमी HEPES बफर कि कदम 3.1.4 में किया और कमरे के तापमान पर संग्रहीत) करने के लिए सेल छलनी और चमचे के बिना कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए थाली मशीन । इस चरण के अंत में बफ़र को छोड़ें ।
  12. HBSS/सीएस के साथ नमूना 2x धो और एंजाइम समाधान तैयार करते हैं । HBSS/cs के 10 मिलीलीटर जोड़ें (HBSS; 5% सीएस बफर चरण 3.1.1 है कि बर्फ पर संग्रहीत किया गया है में बनाया) सेल छलनी करने के लिए बफर और एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में 10 मिनट के लिए ८०० rpm पर यह हलचल । प्रत्येक धोने के बाद बफर छोड़ें ।
    1. एंजाइम समाधान तैयार करें (EDTA-मुक्त धोने बफर; ०.१ मिलीग्राम/एमएल DNase मैं; १६७ mg/एमएल collagenase) दूसरी वाश अवधि के दौरान: जोड़ें 9 DNase के मिलीग्राम और 15 lyophilized collagenase के मिलीग्राम ९० एमएल के लिए EDTA-मुक्त धोने बफर । कमरे के तापमान पर समाधान की दुकान ।
  13. लेमिना propria लिम्फोसाइटों (LPLs) प्राप्त करने के लिए कोशिका छलनी में समाहित लेमिना propria अंश को पचा लें. एंजाइम समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ें (EDTA-मुक्त धोने बफर; ०.१ मिलीग्राम/एमएल DNase मैं; १६७ मिलीग्राम/एमएल collagenase कदम 3.12.1 में किए गए बफर और कमरे के तापमान पर संग्रहीत) सेल छलनी करने के लिए और यह ८०० rpm पर ४५ मिनट के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में हलचल ।
    नोट: LPLs एंजाइमी पाचन के बाद समाधान में जारी कर रहे हैं ।
    1. कोशिकाओं से युक्त एंजाइम समाधान लीजिए और एक नया सेल छलनी के माध्यम से यह एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में फिल्टर ।
  14. ठंड धोने मीडिया के 20 मिलीलीटर जोड़ें (HBSS; 1% सीएस; 1mM EDTA बफर कदम 3.1.3 में बनाया और 3.9.1 चरण में बर्फ पर संग्रहीत) को फ़िल्टर कोशिकाओं को एंजाइम समाधान में collagenase गतिविधि ब्लॉक । कमरे के तापमान पर 6 मिनट के लिए ७०० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक । supernatant त्यागें और FACS बफर के 1 मिलीलीटर में LPLs युक्त गोली resuspend ।
  15. गठबंधन IEL (से कदम 3.7.1) और LPL (३.१४ कदम से) भिंन और उंहें फ्लोरोसेंट-प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ दाग (5 कदम देखें) ।
    नोट: IEL और LPL अंश अलग से दाग हो सकता है अगर डिब्बे जानकारी वांछित है ।

4. तिल्ली से लिम्फोसाइटों का अलगाव

  1. एक microcentrifuge ट्यूब में FACS बफर के ५०० µ एल जोड़कर संग्रह ट्यूब तैयार करें । यह बर्फ पर स्टोर ।
  2. बृहदांत्र (चरण ३.४) को हटाने के बाद, फसल पूरी तिल्ली और यह संग्रह ट्यूब में जगह है । बर्फ पर ऊतक की दुकान ।
  3. एक बिजली के ऊतकों homogenizer का उपयोग करना, homogenize तिल्ली एक microcentrifuge ट्यूब में लगभग 1 मिनट के लिए ३०० एक्स जी पर नमूना केंद्रापसारक [माइक्रो केंद्रापसारक] कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए और महाप्राण बंद supernatant.
  4. आसमाटिक lysis द्वारा सेल मौत शुरू करने के लिए अमोनियम-क्लोराइड-पोटेशियम (ले) lysis बफर के ५०० µ एल में नमूना resuspend द्वारा लाल रक्त कोशिका lysis प्रदर्शन करते हैं । नमूना कमरे के तापमान पर 1-2 मिनट की मशीन के लिए अनुमति दें और फिर यह FACS बफर के ७२५ µ एल में resuspend ।
  5. ३०० x जी पर नमूना केंद्रापसारक [माइक्रो केंद्रापसारक] 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर और महाप्राण बंद supernatant । FACS बफर के ५०० µ एल में गोली resuspend और एक ४० µm सेल छलनी के माध्यम से यह एक नया microcentrifuge ट्यूब में फिल्टर । एक नया microcentrifuge ट्यूब करने के लिए पूरे नमूने हस्तांतरण और प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए फ्लोरोसेंट संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ दाग (कदम 5 देखें) ।

5. Dendra-r+ कोशिकाओं की पहचान फ्लो Cytometry का उपयोग कर

  1. IEL/LPL और तिल्ली के नमूनों पर ३०० x g [माइक्रो केंद्रापसारक] 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर और महाप्राण बंद supernatant ।
  2. एंटीबॉडी धुंधला मिश्रण के १०० µ एल में छर्रों resuspend । नमूना प्रति एंटीबॉडी बफर के १०० µ एल के लिए फ्लोरोसेंट-संयुग्मित विरोधी CD45 FACS के 1 µ एल जोड़कर एंटीबॉडी धुंधला मिश्रण तैयार करें ।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है करने के लिए उपयोग करने से पहले प्रवाह cytometry के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी अनुमापन जहां बाध्यकारी संतृप्ति होता है इष्टतम एकाग्रता निर्धारित करने के लिए ।
  3. बर्फ पर ३५ मिनट के लिए नमूनों की मशीन (एक अंधेरे स्थान में) ।
  4. FACS बफर के ३०० µ एल में नमूने resuspend और उंहें ३०० x जी पर केंद्रापसारक [माइक्रो केंद्रापसारक] कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए । महाप्राण supernatant और FACS बफर के ३२५ µ एल में नमूनों को फिर से सस्पेंड । एक प्रवाह cytometer पर नमूनों का विश्लेषण ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एक फाइबर ऑप्टिक केबल 2 दिन पुराने फामआबकारी चूहों की कालोनियों में ४०५ एनएम प्रकाश देने के लिए इस्तेमाल किया गया था । पिछले प्रयोगों में, एक 30 एस जोखिम ंयूनतम cytotoxicity (चित्रा 1ए) के साथ बृहदांत्र कोशिकाओं के एक अधिक से अधिक photoconversion देने के लिए निर्धारित किया गया था । इसलिए, क्रमिक 30 s एक्सपोज़र बृहदांत्र के विभिंन खंडों में किए गए के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित है । लेजर एक्सपोजर के बाद, चूहे तुरंत euthanized थे, और कोशिकाओं के photoconversion निर्धारित किया गया था । एकल सेल की तैयारी कुल बृहदांत्र ऊतक फ्लोरोसेंट-संयुग्मित विरोधी CD45 एंटीबॉडी और प्रवाह cytometric विश्लेषण के साथ दाग थे photoconversion का पता लगाने के लिए किया गया था । अनकनवर्टेड Dendra2-ग्रीन (Dendra-g) प्रोटीन में उत्तेजना और उत्सर्जन maxima क्रमशः ४९० और ५५३ एनएम है और FITC चैनल में पता लगाया जा सकता है, जबकि photoconverted Dendra2-रेड (Dendra-r) प्रोटीन है उत्तेजना और उत्सर्जन maxima पर ५०७ और ५७३ एनएम क्रमशः और एक प्रवाह cytometer के पीई चैनल में पता लगाया जा सकता है । एक बार अचल अपने लाल रूप में बंद, Dendra2 अत्यधिक photostable और लंबी अवधि के ट्रैकिंग अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी है ।

कोई Dendra-r+ कोशिकाओं unlaser्ड चूहों में पाया गया (चित्रा 1बी छोड़ दिया). हालांकि, ४०५ एनएम प्रकाश जोखिम अलग Dendra-आर+ दोनों CD45नेग और CD45+ सेल डिब्बों में सेल आबादी (चित्रा 1बी सही) में हुई । निर्धारित करने के लिए यदि बृहदांत्र photoconversion प्रोटोकॉल की पृष्ठभूमि में अतिरिक्त आंत्र साइटों पर कोशिकाओं के लेबल, हम नए photoconverted चूहों से तिल्ली काटा (टी = 0) और Dendra के लिए परख-आर+ कोशिकाओं प्रवाह cytometry द्वारा । कोई Dendra-r+ कोशिकाओं CD45नेग या CD45+ सेल डिब्बों (चित्रा 1सी) में पता लगाया गया था, सुझाव है कि इंट्रा कालोनी लेजर बीम तिल्ली में photolabel कोशिकाओं के लिए पर्याप्त घुसना नहीं था । इस प्रकार, माइग्रेशन (T = 3d, 5d) के लिए समय की अनुमति देने के बाद तिल्ली में पाया गया कोई भी Dendra-r+ कक्ष कोलन से उत्पंन होना चाहिए ।

Figure 1
चित्रा 1 : वीवो में photoconversion ऊतक । 2 दिन पुराने फामआबकारी पिल्ले से पेट की कोशिकाओं को 30 एस के लिए इंट्रा कॉलोनी ४०५ एनएम प्रकाश के रूप में वर्णित के रूप में उजागर किया गया । photoconversion और कोशिकाओं के लेबल की प्रक्रिया के बाद तुरंत निर्धारित किया गया था (टी = 0) एक प्रवाह cytometric द्वारा बृहदांत्र ऊतक और तिल्ली की एकल सेल की तैयारी का विश्लेषण. (क) यह प्रतिनिधि फ्लो cytometric डॉट प्लाट CD45 (एक्स-एक्सिस) की अभिव्यक्ति और नियंत्रण और लेसरित चूहों की कॉलोनियों से एकल-कोशिका तैयारियों में जीवित मृत डाई (वाई-अक्ष) के दाग को दिखाता है. पैनलों बी और सी प्रतिनिधि प्रवाह cytometric डॉट भूखंड ओवरले जो Dendra2 की अभिव्यक्ति दिखा रहे हैं-हरे प्रोटीन (Dendra2-जी, क्षैतिज अक्ष) और Dendra2-लाल प्रोटीन (Dendra2-r, कार्यक्षेत्र-अक्ष) नियंत्रण में उजागर और उजागर CD45+ (टेम) और CD45नेग (गैर टेम) कोशिकाओं में (ख) बृहदांत्र और (ग) तिल्ली । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

तिल्ली में प्रवासी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए एक ठेठ photoconversion प्रयोग से डेटा चित्रा 2में दिखाया गया है । photoconversion की कालोनियों में कोशिकाओं का 2 दिन पुराना फामआबकारी चूहों के रूप में चित्रा 1के रूप में सम्पन्न हुआ । चूहों euthanized 3 और 5 दिनों के बाद जोखिम और तिल्ली में Dendra-r+ कोशिकाओं की उपस्थिति प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित किया गया था । CD45नेग कक्ष सबसेट में कोई Dendra-r+ कक्ष नहीं थे, दृश्य के अनुरूप है कि CD45नेग कोशिकाओं को मुख्य रूप से आंत के उपकला और अन्य संरचनात्मक कोशिकाओं रहे हैं. कुछ CD45+ टेम कोशिकाओं Dendra-r व्यक्त किया, सुझाव है कि वे बृहदांत्र में photoconverted गया था और तिल्ली के लिए चले गए ।

Figure 2
चित्रा 2 : CD45+ टेम कोशिकाओं को बृहदांत्र से तिल्ली के लिए विस्थापित । नवजात (day 0-2) फामआबकारी चूहों से ४०५ एनएम प्रकाश को इंट्रा-कोलन एक्सपोजर द्वारा photoconvert Dendra2 प्रोटीन से अवगत कराया गया । प्रतिनिधि प्रवाह cytometry भूखंडों Dendra2-हरे प्रोटीन की अभिव्यक्ति दिखाने के (Dendra2-जी, क्षैतिज अक्ष) और Dendra2-लाल प्रोटीन (Dendra2-r, कार्यक्षेत्र-अक्ष) CD45नेग में और CD45+ तिल्ली की कोशिकाओं उजागर 5-दिन पुराने चूहों और उजागर चूहों photoconversion के बाद 3 और 5 दिनों (टी = 3 डी, 5d) पर विश्लेषण किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

पहचान और कोशिकाओं है कि के साथ बातचीत और बृहदांत्र में microbiota से प्रभावित है के लक्षण वर्णन महत्वपूर्ण है और श्लैष्मिक microenvironment से कैसे जानकारी शरीर के आराम करने के लिए relayed है की समझ की सुविधा होनी चाहिए । आंत से संबंधित सेल प्रवास का अध्ययन करने के लिए एक तरीका है आंत से संबंधित कोशिकाओं के अलगाव की आवश्यकता है प्राप्तकर्ता चूहों में एक दत्तक हस्तांतरण के बाद उनके ऊतक-होमिंग पैटर्न और समारोह12,13निर्धारित करने के लिए । यह approach सीमित है, क्योंकि स्थानांतरित किए गए केवल विशिष्ट कक्ष प्रकारों को ट्रैक किया जा सकता है । इसके अलावा, कलाकृतियों ऊतकों और शुद्धि प्रक्रिया से कोशिकाओं के अलगाव से उत्पंन vivo प्रवासी प्रक्रिया में बाधा हो सकती है । हाल ही में, एक इंडोस्कोपिक photoconversion प्रोटोकॉल आंत्र कोशिकाओं Kaede चूहों का उपयोग कर लेबल करने के लिए14सूचना दी गई थी । इस अध्ययन में वयस्क चूहों में आंत से और ल्यूकोसाइट्स की व्यापक तस्करी पाई गई.

हमारी रिपोर्ट नवजात चूहों के बृहदांत्र में कोशिकाओं लेबल और तिल्ली जैसे अतिरिक्त आंत्र साइटों के लिए उनके प्रवास को ट्रैक करने के लिए एक विधि का वर्णन है । फामआबकारी माउस बैरे एक photoconvertible हरी फ्लोरोसेंट Dendra2 प्रोटीन है कि अचल यूवी प्रकाश द्वारा अपने सक्रियण पर लाल प्रतिदीप्ति के लिए बंद है व्यक्त करता है । ४०५ एनएम प्रकाश के लिए नवजात चूहों की कालोनियों के जोखिम दोनों CD45+ टेम और CD45नेग गैर टेम कोशिकाओं लेबल । CD45+Dendra2-लाल+ कोशिकाओं photoconversion के बाद तिल्ली 3 से 5 दिनों में पाया गया, टेम कोशिकाओं के अतिरिक्त आंत्र प्रवास का संकेत.

दर-इस परख के लिए कदम सीमित कालोनी क्षेत्र है कि ४०५ एनएम प्रकाश के संपर्क में है के अंश है । नवजात बृहदांत्र की कमजोरी और मल की उपस्थिति, हालांकि इस कम उंर में ंयूनतम, फाइबर ऑप्टिक प्रवेशनी कि डाला जा सकता है की लंबाई सीमा । पिछले प्रयोगों में, एक लंबा प्रवेशनी 5 मिमी से अधिक सफलतापूर्वक सम्मिलित नहीं किया जा सका ।  चिकनाई लेजर बीम के परिवर्तनीय प्रकाश अपवर्तन के जोखिम के कारण परहेज कर रहे थे. प्रवेशनी के जावक आंदोलन हर 30 एस में मदद की बृहदांत्र लेजर प्रकाश को उजागर क्षेत्र को अधिकतम । महत्वपूर्ण बात, एक बड़ी ना मान (na = ०.५) के साथ एक प्रवेशनी बृहदांत्र में प्रकाश की एक विस्तृत शंकु उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

इस प्रोटोकॉल को नवजात (day 0-2) फामएक्साइज पिल्लई के लिए मानकीकृत किया गया है । सामग्री और चूहों की उम्र के साथ बृहदांत्र की लंबाई में परिवर्तन को देखते हुए, तकनीक तदनुसार अनुकूलित जब पुराने पिल्ले का उपयोग करना होगा । मुख्य रूप से, photoconversion की कुल अवधि में संशोधनों और फाइबर ऑप्टिक प्रवेशनी के सम्मिलन की लंबाई आवश्यक हो जाएगा.

इस दृष्टिकोण बृहदांत्र में कोशिकाओं के प्रवासी व्यवहार को समझने के लिए प्रवाह cytometric विश्लेषण द्वारा सुविधा है । बहु-पैरामीटर प्रवाह cytometry को पहचानने और CD45+ कक्ष सबसेट में प्रवासी प्रतिरक्षा कक्ष प्रकार phenotype करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । Dendra2-r+ कोशिकाओं को भी इस तरह के जीन अभिव्यक्ति रूपरेखा या प्रोटियोमिक् विश्लेषण के रूप में बहाव अनुप्रयोगों के लिए FACS द्वारा हल किया जा सकता है । इस अध्ययन में बृहदांत्र में टेम सेल सबसेट की समझ के लिए निर्देशित करते हुए, विधि मस्तिष्क और त्वचा सहित अतिरिक्त ऊतक साइटों से सेलुलर प्रवास का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

नित्यकर्म जैन को एक NIH/NIAID कैरियर संक्रमण पुरस्कार 1K22AI116661-01 द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laser
Light Emitting Diode (LED) THORLABS M405FP1 CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1
LED driver THORLABS LEDD1B Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616
Optogenetics patch cable THORLABS M87L01 1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454
Fiber optic cannula Doric lenses  MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036
Power supply THORLABS KPS101 Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101
LG3 laser safety goggles  THORLABS LG3 Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523
Red light  Electron Microscopy Sciences 74327-10 15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences
Intestinal cell isolation
Isoflurane Patterson Veterinary 07-893-1389 CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood.  https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3
1X HBSS Gibco 14025076 Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076
Calf Serum Hyclone AZM 197696
EDTA Invitrogen 15575020 0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020
DTT Sigma 10197777001 CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en&region=US
HEPES Gibco 15630080 1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080
Petri dish Corning 353004 https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F
70 micron cell strainer Falcon 352350 https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712
Micro magnetic stir bar Fisherbrand 1451364 Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364
Magnetic stir plate Corning Laboratory Stirrers 440826 https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE
Collagenase Roche 5401020001 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&region=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE
DNase I Sigma 10104159001 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en&region=US
1X PBS Gibco 20012-027 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027
Pipet aid Thermo Scientific 14387165 https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165
10 mL serological pipet Falcon 357530 https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659
25 mL serological pipet Falcon 357515 https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659
15 mL conical centrifuge tube Thermo Scientific 339651 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650
50 mL conical centrifuge tube Thermo Scientific 339653 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650
Single cell suspension
Eppendorf tubes Seal-Rite 1615-5500 Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx
Tissue homogenizer  Kimble K7495400000 Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000
Homogenizer tips  Kimble 7495210590 Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590
ACK lysing buffer Gibco A10492-01 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01
40 micron cell strainer Falcon 08-771-1 https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711
Antibodies
BV786 anti-mouse CD45  BD 564225 Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225
Live/Dead Invitrogen L34962 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962
Other
Razor blades VWR 55411-050 Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489, 231-241 (2012).
  2. Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes. Journal of Immunology. 198, 590-595 (2017).
  3. Mathis, D., Benoist, C. Microbiota and autoimmune disease: the hosted self. Cell Host Microbe. 10, 297-301 (2011).
  4. Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46, 350-363 (2017).
  5. Jain, N., Walker, W. A. Diet and host-microbial crosstalk in postnatal intestinal immune homeostasis. Nature Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 12, 14-25 (2015).
  6. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews in Immunology. 14, 667-685 (2014).
  7. Macpherson, A. J., Uhr, T. Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria. Science. 303, 1662-1665 (2004).
  8. Mowat, A. M. Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens. Nature Reviews in Immunology. 3, 331-341 (2003).
  9. Diehl, G. E., et al. Microbiota restricts trafficking of bacteria to mesenteric lymph nodes by CX(3)CR1(hi) cells. Nature. 494 (3), 116-120 (2013).
  10. Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50, 833-843 (2012).
  11. Conway, K. L., et al. ATG5 regulates plasma cell differentiation. Autophagy. 9, 528-537 (2013).
  12. Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii. Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).
  13. Guo, X., Muite, K., Wroblewska, J., Fu, Y. X. Purification and Adoptive Transfer of Group 3 Gut Innate Lymphoid Cells. Methods in Molecular Biology. 1422, 189-196 (2016).
  14. Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).

Tags

सेिा अंक १३८ श्लैष्मिक इम्यूनोलॉजी मस musculus कोलन नवजात उन्मुक्ति प्रवास photoconversion Dendra2
<em>वीवो में</em> नवजात चूहों में टेम कोशिकाओं की प्रवासी क्षमता का आकलन करने के लिए बृहदांत्र में कोशिकाओं की Photolabeling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Porter, C., Ennamorati, M., Jain, N. … More

Porter, C., Ennamorati, M., Jain, N. In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice. J. Vis. Exp. (138), e57929, doi:10.3791/57929 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter