Summary
O protocolo descrito aqui utiliza uma abordagem photolabeling em camundongos recém-nascidos para identificar especificamente as células do sistema imunológico que emigram do cólon para sites extra intestinais. Esta estratégia será útil para estudar interações do anfitrião-microbiome no início da vida.
Abstract
Comunidades de bactérias entéricas são estabelecidas no início da vida e influenciam a função e o desenvolvimento de células imunes. A microbiota neonatal é suscetível a inúmeras influências externas, incluindo o uso de antibióticos e dieta, que afeta a susceptibilidade a doenças auto-imunes e inflamatórias. Doenças como a doença intestinal inflamatória (IBD) caracterizam-se por um afluxo maciço de células do sistema imunológico para os intestinos. No entanto, células imunes, condicionadas pela microbiota podem adicionalmente emigrar fora os intestinos para influenciar as respostas imunes locais extra intestinal. Assim, há uma necessidade de identificar e caracterizar as células que podem transportar mensagens microbianas do intestino para sites distais. Aqui, descrevemos um método para células de rótulo no cólon de ratos recém-nascidos na vivo que permite a sua identificação nos sites extra intestinais após a migração.
Introduction
O trato gastrointestinal dos mamíferos abriga centenas de espécies de bactérias que podem existirem em uma relação simbiótica com o host1. As células do sistema imunológico presentes no meio local impor uma coexistência pacífica com estes micróbios e estabelecer uma barreira de proteção contra invasões de patógeno. Assim, bi-direcional interações entre as células do sistema imunológico e a microbiota são fundamentais para estabelecer uma comunidade comensal que educa o sistema imunológico do hospedeiro e define o limiar de reatividade imune a patógenos. Mudanças no microbiana composição, ou disbiose, pode perturbam a homeostase imune e perturbam circuitos regulamentares que conter inflamações intestinais, levando a imune-mediada doenças como a Diabetes tipo 1 e IBD2,3 .
O período imediatamente após o nascimento é uma única do desenvolvimento durante o qual as comunidades microbianas intestinais começam a estabelecer, ao mesmo tempo, o sistema imunológico amadurece4. A microbiota pós-Natal não é estável, com mudanças na composição da Comunidade ocorrendo naturalmente e frequentemente5. As células imunitárias que interagem com a microbiota residem em duas distintas anatômicas locais no intestino - a propria do lamina e o epitélio intestinal6. Vários tipos de células do sistema imunológico estão presentes no intestino, incluindo linfócitos (tais como as células T, células B e células linfoides inatas), bem como de células mieloides (que incluem os monócitos, macrófagos e células dendríticas). Estas células, também conhecido como células hematopoiéticas, executam uma variedade de funções que preservam a barreira intestinal e manter a homeostase.
Além de suas funções reguladoras locais intestinal, células do sistema imunológico da mucosa também podem efectuar microbianas mensagens aos sites extra intestinais para regular a imunidade sistêmica7,8,9. Esta é uma área de crescente interesse de pesquisa e destaca a necessidade de métodos para identificar as células imunes que migram fora tecidos intestinais, a fim de sondar a sua função. O protocolo relatado aqui utiliza um modelo de mouse disponíveis comercialmente em que uma proteína fluorescente photoconvertible é explorada para células de rótulo. PhAMextirpado ratos ubiquitously expressam uma proteína verde fluorescente Dendra2 que é irreversivelmente ligam para fluorescência vermelha após a ativação por ultravioleta (UV) luz10. Usando uma cânula de fibra óptica para fornecer luz de nm 405 no cólon de ratos recém-nascidos, demonstramos que photoconverted de células hematopoiéticas, que se originou em ou transitar através do cólon pode ser encontrado no baço.
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Protocol
Todos os procedimentos de animais foram realizados com a aprovação de acordo com o cuidado de Animal institucional e uso Comité (IACUC) no Hospital Geral de Massachusetts.
Atenção: Este protocolo envolve o uso de um laser de classe 3b (LG3). Óculos de segurança do laser de LG3 sempre devem ser usados quando este laser em funcionamento. Orientações adequadas de treinamento e segurança devem ser seguidas para evitar o risco de lesões.
1. projeto e montagem de Laser
- Se conectar o diodo emissor de luz (LED) (405 nm, 19,3 mW, 1400 mA, fibra-acoplado) para o LED driver via o cabo conector M8 de 4 pinos que vem anexado para o LED. Com cuidado, aperte o parafuso para fixar a conexão.
- Antes de fixar o cabo de remendo de optogenetics o LED, segure o conector não abertura do LED para a luz para assegurar-se lá são nenhuma obstrução visível. Sopre o furo para eliminar obstruções, se necessário e insira o cabo de remendo de optogenetics na abertura.
- Conecte a cânula de fibra óptica do cabo de remendo de optogenetics por inserir a cânula em cada extremidade da manga do conector. Fixe a outra extremidade da manga do conector para o cabo de remendo. Aplica pressão suficiente para garantir a conexão, mas tenha cuidado para não dobrar ou quebrar a fibra óptica da cânula.
Nota: A cânula de frágil da fibra óptica é coberta com a tampa de protecção sempre que o laser não está em uso. - Definir o driver de LED para o modo de onda contínua (CW) com o botão de ajuste contínuo em 0 e o limite atual definido como 1.2 A.
2. Photoconversion de células do cólon
Nota: Ratos machos e fêmeas foram expostos à intracolonic 405 nm luz 1-2 dia (s) após o seu nascimento e sacrificaram-se antes de 1 semana de idade.
- Assegurar um local escuro, com um acesso a uma tomada elétrica. O driver de LED ficha eléctrica.
Nota: Este procedimento é realizado na luz branca mínima como uma longa exposição dos ratos a luz ambiente pode causar um indesejado photoconversion das células. Luz vermelha é usada como uma alternativa.
Atenção: O passo seguinte envolve o uso de um anestésico de animal. A administração do anestésico tem lugar em um bairro de classe II ou usando outro sistema de eliminação adequado. A inalação de anestésico pode causar tonturas, sonolência ou até mesmo inconsciência. - Anestesia o mouse pela exposição aos 4-5% de isoflurano em 100% de O2 em uma caixa de indução. Verificar a profundidade apropriada da anestesia beliscando firmemente uma pata traseira (sem resposta). Manter a anestesia através de um cone de nariz em aproximadamente 2% de isoflurano. Evitar a exposição de manipulador de isoflurano pelo uso de um dispositivo de eliminação anestésico ou capuz adequado.
- Posicione o mouse anestesiado para a exposição de intracolonic usando 1 mão à nuca, as costas do mouse suavemente com o dedo indicador e o polegar. Vire o mouse para expor o abdome. Solte o punho se o rato começa a perder sua cor-de-rosa ou se sua taxa de respiração começa a desacelerar. Prenda o rabo do mouse entre o anel e os dedos pequenos.
- Com a outra mão, retire a capa protetora da cânula. Mantendo o longo eixo da cânula paralela à linha mediana do rato, Introduza cuidadosamente a cânula de fibra óptica através do ânus para o cólon para que todos os 5 mm da fibra óptica são dentro do mouse.
Nota: Este procedimento é realizado lentamente e com cuidado para não perfurar a parede do cólon. Minuto se mexer e torção da cânula auxilia o avanço para o cólon. - Não os óculos de segurança e aumentar a laser atual para o valor máximo (todo o caminho no sentido horário). Confirme a presença da luz UV de olhar para o abdômen translúcido do mouse.
Nota: Os óculos de segurança do laser LG3 dramaticamente diminuem a visibilidade. Tenho um colega (usando equipamentos de proteção) auxiliar na acoplando os óculos e ligar o laser. - Expor o cólon para a luz do laser para um total de 2 min. retirar a cânula de aproximadamente 1 mm a cada 30 s para maximizar a área luminal exposta à luz. No final de 2 min, desligue o laser.
- Remova lentamente a cânula do mouse. Depois de se recuperar da anestesia em uma gaiola vazia quente, retorne o rato da gaiola em casa.
3. isolamento de linfócitos Intestinal
- Preparar 1 L de tampão de soro (HBSS/CS) solução equilibrada sal/bezerro do Hank, 200 mL de tampão epitelial tira, 500 mL de mídia de lavagem e 200 mL de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)-lavagem de mídia livre.
Nota: Os volumes de reagente são calculados para um tamanho de amostra de 9.- Fazer o buffer HBSS/CS (HBSS; 5% CS) adicionando-se 50 mL de CS a 950 mL de HBSS. Armazená-lo no gelo.
- Preparar o buffer tira epiteliais [HBSS; 5% CS 1 mM ditiotreitol (DTT); 5 mM EDTA; ácido de piperazina-1-etanesulfónico 15mm 4-(2-Hydroxyethyl) (HEPES) (pH 7,2-7,5)], adicionando 10 mL de CS, 200 µ l de 1 M DTT, 2 mL de EDTA 0,5 M e 3 mL de tampão HEPES de 1m para 185 mL de HBSS. Coloca o tampão tira epiteliais em banho maria a 37 ° C.
- Fazer a mídia de lavagem (HBSS; 1% CS 1 mM EDTA) adicionando-se 5 mL de CS e 1 mL de EDTA 0,5 M a 494 mL de HBSS. Armazená-lo em temperatura ambiente.
- Prepare a mídia de lavagem livre de EDTA (HBSS; 1% CS 15 mM HEPES), adicionando 2 mL de CS e 3 mL de 1 M HEPES a 195 mL de HBSS. Armazená-lo em temperatura ambiente.
- Fazer uma reserva de FACS [1 x salina tamponada fosfato (PBS) (pH = 7,2); 2% CS] adicionando 10 mL de CS a 490 mL de PBS. Armazená-lo no gelo.
- Prepare o prato de coleção de tecidos, colocando um filtro de célula 70 µm dentro de um prato de cultura 60 x 10 mm. Adicionar 10 mL de tampão HBSS/CS (HBSS; buffer de CS 5% feita na etapa 3.1.1 e armazenado no gelo) para o prato e coloque-o no gelo.
- Eutanásia o rato através de uma overdose de isoflurano inalado usando a eliminação adequada de anestésico (aproximadamente 3 min exposição a > 4% de isoflurano no ar ambiente ou em 100% O2). Após a aparente cessação da respiração e reflex movimento, verificar a ausência de dor profunda por beliscar firmemente uma pata traseira (usar fórceps é recomendado). Certifique-se a eutanásia através de uma decapitação usando um par de tesouras cirúrgicas ou uma navalha nova.
Nota: O deslocamento Cervical não é recomendado para esta etapa, devido ao tamanho e idade do animal. Esses métodos são coerentes com as orientações de AVMA 2013 sobre eutanásia e aprovaram pelo MGH IACUC. - Colheita do cólon usando pinça limpa e tesoura para abrir o abdômen. Refletem os intestinos para 1 lado do abdômen do rato para expor o cólon. Remover o cólon inteiro pela primeira cruza-lo apenas distal (na direção do ânus) para o ceco. Então, enquanto segurando firmemente o cólon com fórceps, utilize tesouras para cortar através da uretra até ao recto. Corte o cólon como perto do ânus quanto possível. Colheita do baço após a remoção do cólon (ver etapas 4.1-4.2 abaixo).
Nota: Enquanto o protocolo de photoconversion apenas alvos ~ 25% do cólon do recém-nascido (5 mm da cânula fibra óptica), todo o cólon é colhido para ajudar no isolamento da célula. - Limpeza do cólon usando fórceps para empurrar o conteúdo fora do cólon e em uma toalha de papel seca. Homogeneizar o tecido usando lâminas de barbear, pique finamente o cólon em um colar na capa de um prato de cultura e depois transferir esta pasta para o filtro de célula na caixa de Petri.
- Adicionar uma barra de agitação magnética tempo limpo 8 mm para o filtro e coloque o prato em um prato de agitador magnético 9 posições. Definir a velocidade de barra de agitação magnética para 800 rpm e incube as celulas por 5 min à temperatura ambiente. Descartar o buffer e repita a lavagem com 10 mL de HBSS/CS (o HBSS; buffer de CS 5% feita na etapa 3.1.1 e armazenado no gelo). Descarte o buffer no final da lavagem.
- Dissociar as células epiteliais, adicionando 10 mL de tampão de escaldadas tira epitelial (o HBSS; 5% CS 1mM DTT; 5mM EDTA; 15mM de tampão de HEPES [pH 7,2-7,5] que foi feita no passo 3.1.2 e armazenado em banho maria a 37 ° C) para o filtro de célula e mexa a 800 rpm por 30 min em um 3 Incubadora de 7 ° C. No final da incubação, transferi o buffer enriquecido na fração epitelial para um tubo limpo 15 mL.
Nota: O epitélio e o associado células (células epiteliais intestinais e os linfócitos epiteliais intestinais) são liberadas para o buffer, enquanto as células no intacto do propria do lamina permanecem no filtro célula durante esta etapa11.- Centrifugue a fração epitelial intestinal (LAL) enriquecida a 700 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de tampão de FACS. Armazená-lo no gelo para uso na etapa 3.15.
- Lave a fração propria do lamina dentro do filtro célula 2 x com HBSS/CS. Para fazer isso, adicionar 10 mL de solução HBSS/CS (HBSS; reserva de CS de 5% que foi feita na etapa 3.1.1 foi armazenado no gelo) para o filtro de célula e agite-a 800 rpm por 5 min em uma incubadora de 37 ° C. Descarte o buffer depois de cada lavagem.
- Lavar a amostra 2 x em meios de lavagem. Adicionar 10 mL de mídia de lavagem (HBSS; 1% CS; reserva de EDTA 1 mM que foi feita no passo 3.1.3 e armazenada à temperatura ambiente) para o filtro de célula e agite-a 800 rpm por 15 min em uma incubadora de 37 ° C. Descarte o buffer depois de cada lavagem.
- Depois de usar a mídia de lavagem, armazená-lo no gelo para o uso na etapa 3.14.
- Lavar a amostra 2 x com HBSS/CS. adicionar 10 mL de tampão HBSS/CS (HBSS; 5% CS buffer feitas na etapa 3.1.1 foi armazenado no gelo) para o filtro de célula e agite-a 800 rpm por 5 min em uma incubadora de 37 ° C. Descarte o buffer depois de cada lavagem.
- Incube o tecido em EDTA livre de tampão de lavagem. Adicionar 10 mL de tampão de lavagem livre de EDTA (HBSS; 1% CS; tampão HEPES de 15 mM que foi feito no passo 3.1.4 e armazenado à temperatura ambiente) para o filtro de célula e incubar a placa por 10 min à temperatura ambiente sem agitação. Descarte o buffer no final desta etapa.
- Lavar a amostra 2 x com HBSS/CS e preparar a solução de enzima. Adicionar 10 mL de HBSS/CS (HBSS; buffer de CS 5% feita na etapa 3.1.1 foi armazenado no gelo) do buffer para o filtro de célula e agite-a 800 rpm por 10 minutos em uma incubadora de 37 ° C. Descarte o buffer depois de cada lavagem.
- Preparar a solução de enzima (EDTA livre lava tampão; 0,1 mg/mL DNase I; colagenase 167 mg/mL) durante o segundo período de lavagem: adicione 9 mg de DNase eu e 15 mg de liofilizado colagenase a 90 mL de EDTA livre wash buffer. Armazene a solução à temperatura ambiente.
- Digeri a fração propria do lamina contida no filtro célula obter propria do lamina linfócitos (LPLs). Adicionar 10 mL da solução de enzima (o EDTA livre o tampão de lavagem; 0,1 mg/mL DNase I; 167 mg/mL de tampão de colagenase feitas na etapa 3.12.1 e armazenados à temperatura ambiente) para o filtro de célula e agite-a 800 rpm por 45 min em uma incubadora de 37 ° C.
Nota: LPLs são liberados para a solução após a digestão enzimática.- Recolher a solução de enzima que contém as células e filtrar através de um novo filtro de célula para um tubo cónico de 50 mL.
- Adicione 20 mL de lavagem frio mídia (o HBSS; 1% CS; 1mM EDTA amortecedor feita na etapa 3.1.3 e armazenado no gelo na etapa 3.9.1) para as células filtradas para bloquear a atividade de colagenase na solução enzimática. Centrifugar o tubo a 700 x g, durante 6 min à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado contendo LPLs em 1 mL de tampão de FACS.
- Combine o IEL (da etapa 3.7.1) e as frações LPL (da etapa 3.14) e manchá-las com anticorpos conjugados fluorescentes para a análise do fluxo cytometric (Veja passo 5).
Nota: IEL e LPL frações podem ser manchadas separadamente se desejar informações de compartimento.
4. isolamento de linfócitos do baço
- Prepare o tubo de coleta adicionando 500 µ l de tampão de FACS em um tubo de microcentrifugadora. Armazená-lo no gelo.
- Após a remoção do cólon (passo 3.4), colher o baço inteiro e coloque-o no tubo de coleta. Armazene o tecido no gelo.
- Usando um homogeneizador de elétrica, homogeneizar o baço em um tubo de microcentrifugadora de aproximadamente 1 min. centrifugar a amostra a 300 x g [micro centrífuga] durante 5 min à temperatura ambiente e Aspire fora o sobrenadante.
- Realizar a lise dos glóbulos vermelhos por resuspending a amostra em 500 µ l de tampão de lise de amónio-cloreto-potássio (ACK) para iniciar a morte celular por lise osmótica. Permitir que a amostra incubar 1-2 min à temperatura ambiente e então ele Resuspenda em 725 µ l de tampão de FACS.
- Centrifugar a amostra a 300 x g [micro centrífuga] durante 5 min à temperatura ambiente e Aspire fora o sobrenadante. Resuspenda o pellet em 500 µ l de tampão de FACS e filtrar através de um filtro de célula de 40 µm para um novo tubo de microcentrifugadora. Transferir toda a amostra para um tubo de microcentrifugadora novo e manchá-la com anticorpos conjugados fluorescentes para a análise do fluxo cytometric (Veja passo 5).
5. identificação de Dendra-r+ citometria de fluxo utilizando células
- Centrifugar as amostras IEL/LPL e baço a 300 x g [micro centrífuga] durante 5 min à temperatura ambiente e Aspire fora o sobrenadante.
- Resuspenda as pelotas em 100 µ l de anticorpo que mancha a mistura. Prepare o anticorpo que mancha a mistura adicionando 1 µ l de conjugado fluorescente anti-CD45 anticorpo a 100 µ l de tampão de FACS por amostra.
Nota: É importante dosear os anticorpos usados para a citometria de fluxo antes do experimento para determinar a concentração ideal onde ocorre a saturação de vinculação. - Incube as amostras para 35 min no gelo (em um local escuro).
- Resuspenda as amostras em 300 µ l de tampão de FACS e centrifugá-los a 300 x g [micro centrífuga] durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as amostras em 325 µ l de tampão de FACS. Analise as amostras em um citômetro de fluxo.
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Representative Results
Um cabo de fibra óptica foi usado para lançar 405 luz nm para os dois-pontos de 2 - velho dias PhAMextirpado ratos. Em experimentos anteriores, determinou-se uma exposição de 30 s para dar uma photoconversion máxima de células do cólon com mínima citotoxicidade (Figura 1A). Portanto, sequencial 30 exposições de s de diferentes segmentos do cólon foram realizadas conforme descrito no protocolo. Após a exposição do laser, os ratos foram sacrificados imediatamente e determinou-se a photoconversion das células. Preparações de célula única do tecido do cólon total estavam manchadas com anticorpo conjugado fluorescente anti-CD45 e a análise de fluxo cytometric foi realizada para detectar photoconversion. Não convertidos Dendra2-verde (Dendra-g) de proteína tem maxima de excitação e emissão a 490 e 553 nm respectivamente e pode ser detectada no canal FITC, Considerando que photoconverted proteína Dendra2-vermelho (Dendra-r) tem a maxima de excitação e emissão em 507 e 573 nm respectivamente e podem ser detectadas no canal do PE de um citômetro de fluxo. Uma vez que irreversivelmente mudou para sua forma vermelha, Dendra2 é altamente fotoestável e útil para aplicativos de acompanhamento a longo prazo.
Não há células Dendra-r+ foram detectadas em camundongos unlasered (Figura 1B esquerda). No entanto, a exposição à luz de 405 nm resultou em distintas populações de células Dendra-r+ em ambos os CD45neg e CD45+ compartimentos (Figura 1B direito) da pilha. Para determinar se o protocolo de photoconversion Colônica resultou na rotulagem de fundo das células em locais extra intestinais, colhemos baços de recém photoconverted ratos (T = 0) e analisada para Dendra-r+ células por citometria de fluxo. Não há células Dendra-r+ foram detectadas no CD45neg ou CD45+ célula compartimentos (Figura 1C), sugerindo que o feixe de laser intra-Colônica não penetrou o suficiente para as células de photolabel no baço. Assim, quaisquer células Dendra-r+ detectadas no baço após permitir tempo para a migração (T = 3d, 5D) deve ter originado a partir do cólon.
Figura 1 : Na vivo photoconversion do tecido do cólon. As células do cólon de 2 - velho dias PhAMextirpado filhotes foram expostas à luz de nm 405 intra-Colônica por 30 s conforme descrito. Determinaram-se a photoconversion e a rotulagem das células imediatamente após o procedimento (T = 0) por uma análise de fluxo cytometric de preparações de célula única do tecido do cólon e do baço. (A), este enredo de ponto representativo fluxo cytometric mostra a expressão de CD45 (x-eixo) e a coloração do corante ao vivo-morto (y-eixo) em preparações de célula única dos dois pontos de controle e ratos lasered. Painéis B e C são representativas do fluxo cytometric ponto enredo as sobreposições que mostram a expressão da proteína verde-Dendra2 (Dendra2-g, eixo horizontal) e proteína Dendra2-vermelho (Dendra2-r, eixo vertical) em não-impressionados, controle e expostos a CD45+ (hematopoiéticas) e CD45neg (não-hematopoiéticas) em (B) células do cólon e (C) o baço. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Dados de um experimento típico photoconversion para identificar células migratórias no baço são mostrados na Figura 2. O photoconversion das células nos dois pontos de 2 - velho dias PhAMextirpado ratos foi realizada como na Figura 1. Os ratos foram sacrificados 3 e 5 dias após a exposição e a presença de células Dendra-r+ no baço foi determinada por citometria de fluxo. Havia nenhuma célula Dendra-r+ no CD45neg célula subconjunto, consistente com a opinião de que as células deneg CD45 são principalmente epiteliais e outras células estruturais do intestino. Alguns CD45+ células hematopoiéticas expressaram Dendra-r, sugerindo que eles tinham sido photoconverted no cólon e migrou para o baço.
Figura 2 : CD45+ células hematopoiéticas migram do cólon para o baço. Ratos deextirpado PhAM recém-nascido (dia 0 - 2) foram expostos à luz 405 nm photoconvert Dendra2 proteína pela exposição intracolônica. As parcelas de citometria de fluxo representativo mostram a expressão da proteína verde-Dendra2 (Dendra2-g, eixo horizontal) e proteína Dendra2-vermelho (Dendra2-r, eixo vertical) em CD45neg e CD45+ células de baço de ratos de 5 dias de idade não expostos e expostos ratos analisados em 3 e 5 dias (T = 3d, 5D) após o photoconversion. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A identificação e caracterização de células que interagem com e são influenciados pela microbiota do cólon são importantes e devem facilitar a compreensão de como a informação do microambiente da mucosa é retransmitida para o resto do corpo. Um método para estudar a migração celular relacionados ao intestino requer o isolamento de células associada a barriga, seguido por uma transferência adotiva em camundongos destinatários para determinar os padrões de tecido-homing e funcionar12,13. Esta abordagem é limitada, como apenas os tipos de células específicas que foram transferidos poderão ser rastreados. Além disso, artefatos resultantes do isolamento das células de tecidos e o processo de purificação podem impedir que o processo migratório na vivo . Mais recentemente, um protocolo de photoconversion endoscópica para rotular as células intestinais, usando ratos Kaede foi relatado14. Este estudo encontrou um amplo tráfico de leucócitos de e para o intestino em ratos adultos.
Nosso relatório descreve um método para células de rótulo no cólon de ratos recém-nascidos e rastrear sua migração para locais extra intestinais tais como o baço. PhAMextirpado mouse ubiquitously expressa uma proteína Dendra2 photoconvertible verde fluorescente que é irreversivelmente ligam para fluorescência vermelha após sua ativação pela luz UV. A exposição de dois-pontos de ratos recém-nascidos a 405 nm de luz rotulado ambos CD45+ hematopoiéticas e células não-hematopoiéticas doneg CD45. CD45++ Dendra2-vermelho células foram detectadas no baço, 3 a 5 dias após a photoconversion, indicando a migração extra intestinal de células hematopoiéticas.
O passo limitante para este ensaio é a fração da área do cólon que é exposta a 405 nm luz. A fragilidade do recém-nascido cólon e a presença de fezes, embora mínima nesta idade precoce, limitar o comprimento da cânula de fibra óptica que pode ser inserido. Em experimentos anteriores, uma cânula mais pode não ser com êxito inserida mais de 5 mm. Lubrificantes foram evitadas devido ao risco da refração de luz variável do raio laser. O movimento para fora da cânula cada 30 s ajudou a maximizar a área do cólon exposta à luz do laser. Importante, uma cânula com um grande valor de ND (ND = 0.5) foi usado para gerar um grande cone de luz no cólon.
Este protocolo tem sido padronizado para recém-nascido (dia 0 - 2) PhAMextirpado filhotes. Tendo em conta as alterações no conteúdo e comprimento do cólon com a idade dos ratos, a técnica terá que ser otimizado em conformidade ao usar filhotes mais velhos. Principalmente, as modificações para a duração total do photoconversion e o comprimento da inserção da cânula fibra óptica será necessárias.
Esta abordagem para compreender o comportamento migratório de células do cólon é facilitada pela análise do fluxo cytometric. Citometria de fluxo multiparâmetro pode ainda ser usada para identificar e fenótipo célula imune migrante tipos dentro a CD45+ subconjunto de células. Células Dendra2-r+ também podem ser classificadas pela FACS para aplicações a jusante, tais como análises de perfis ou proteômica de expressão de gene. Enquanto dirigido para a compreensão dos subconjuntos de células hematopoiéticas no cólon neste estudo, o método pode ser adaptado para estudar a migração celular de sites adicionais de tecido, incluindo o cérebro e a pele.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Nitya Junior foi apoiado por um prêmio de transição de carreira NIAID/NIH 1K22AI116661-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser | |||
| Light Emitting Diode (LED) | THORLABS | M405FP1 | CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 |
| LED driver | THORLABS | LEDD1B | Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 |
| Optogenetics patch cable | THORLABS | M87L01 | 1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454 |
| Fiber optic cannula | Doric lenses | MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 | 5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036 |
| Power supply | THORLABS | KPS101 | Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 |
| LG3 laser safety goggles | THORLABS | LG3 | Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 |
| Red light | Electron Microscopy Sciences | 74327-10 | 15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences |
| Intestinal cell isolation | |||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3 |
| 1X HBSS | Gibco | 14025076 | Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 |
| Calf Serum | Hyclone AZM | 197696 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 |
| DTT | Sigma | 10197777001 | CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US |
| HEPES | Gibco | 15630080 | 1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 |
| Petri dish | Corning | 353004 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F |
| 70 micron cell strainer | Falcon | 352350 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712 |
| Micro magnetic stir bar | Fisherbrand | 1451364 | Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364 |
| Magnetic stir plate | Corning Laboratory Stirrers | 440826 | https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE |
| Collagenase | Roche | 5401020001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE |
| DNase I | Sigma | 10104159001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US |
| 1X PBS | Gibco | 20012-027 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 |
| Pipet aid | Thermo Scientific | 14387165 | https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357530 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357515 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 15 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339651 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339653 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| Single cell suspension | |||
| Eppendorf tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx |
| Tissue homogenizer | Kimble | K7495400000 | Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000 |
| Homogenizer tips | Kimble | 7495210590 | Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| Antibodies | |||
| BV786 anti-mouse CD45 | BD | 564225 | Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 |
| Live/Dead | Invitrogen | L34962 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962 |
| Other | |||
| Razor blades | VWR | 55411-050 | Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades |
References
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489, 231-241 (2012).
- Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes. Journal of Immunology. 198, 590-595 (2017).
- Mathis, D., Benoist, C. Microbiota and autoimmune disease: the hosted self. Cell Host Microbe. 10, 297-301 (2011).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46, 350-363 (2017).
- Jain, N., Walker, W. A. Diet and host-microbial crosstalk in postnatal intestinal immune homeostasis. Nature Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 12, 14-25 (2015).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews in Immunology. 14, 667-685 (2014).
- Macpherson, A. J., Uhr, T. Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria. Science. 303, 1662-1665 (2004).
- Mowat, A. M. Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens. Nature Reviews in Immunology. 3, 331-341 (2003).
- Diehl, G. E., et al. Microbiota restricts trafficking of bacteria to mesenteric lymph nodes by CX(3)CR1(hi) cells. Nature. 494 (3), 116-120 (2013).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50, 833-843 (2012).
- Conway, K. L., et al. ATG5 regulates plasma cell differentiation. Autophagy. 9, 528-537 (2013).
- Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii. Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).
- Guo, X., Muite, K., Wroblewska, J., Fu, Y. X. Purification and Adoptive Transfer of Group 3 Gut Innate Lymphoid Cells. Methods in Molecular Biology. 1422, 189-196 (2016).
- Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).
