Summary
Протокол, описанные здесь использует photolabeling подход у новорожденных мышей конкретно определить иммунные клетки, которые эмигрировать из толстой кишки экстра кишечных сайтов. Эта стратегия будет полезным для изучения взаимодействия хост микрофлора в начале жизни.
Abstract
Кишечных бактериальных сообществ устанавливаются в начале жизни и влияние развития иммунных клеток и функции. Новорожденных микробиоты подвержен многочисленных внешних воздействий, включая использование антибиотиков и диету, которая влияет на восприимчивость к воспалительных и аутоиммунных заболеваний. Расстройств, таких как воспалительные заболевания кишечника (IBD) характеризуется массовым притоком иммунных клеток кишечника. Однако иммунные клетки, обусловлено микробиоты дополнительно могут эмигрировать из кишечника влиять иммунные реакции на экстра кишечных сайтов. Таким образом существует необходимость выявления и характеризуют клетки, которые могут нести микробной сообщений на дистальном сайты из кишечника. Здесь мы описываем метод метка ячейки в толстой кишки новорожденных мышей в естественных условиях , позволяет их идентификации в экстра кишечных сайтов после миграции.
Introduction
У млекопитающих желудочно-кишечного тракта затаивает сотни видов бактерий, которые существуют в симбиотические отношения с узла1. Иммунные клетки присутствуют в местной обстановке обеспечить мирное сосуществование с этими микробами и создать защитный барьер против возбудителя вторжений. Таким образом двунаправленного взаимодействия между иммунные клетки и микробиоты имеют решающее значение для создания синантропных сообщества, воспитывает хост иммунной системы и устанавливает порог для иммунной реактивности патогенов. Изменения в микробного состава, или дисбактериоз, могут нарушить иммунного гомеостаза и возмущают регулирования цепей, которые сдерживают кишечных воспалений, привело к иммунной системы заболеваний как диабет 1 типа и IBD2,3 .
В период сразу после рождения — это уникальный развития окно, во время которого кишечного микробного общины начинают установить в то же время иммунной системы созревает4. Послеродовые микробиоты не является стабильным, с изменениями в составе сообщества, естественным и часто5. Иммунные клетки, которые взаимодействуют с микробиоты находятся в двух различных анатомических местах в кишечнике - lamina propria и кишечного эпителия6. Многочисленные виды иммунные клетки присутствуют в кишечнике, включая лимфоцитов (например, Т-клетки, клетки B и врожденной лимфоидных клеток), а также миелоидных клеток, (которые включают дендритные клетки, моноциты и макрофаги). Эти клетки, также известный как кроветворные клетки, выполняют множество функций, которые сохраняют кишечный барьер и поддержания гомеостаза.
Помимо своих регулирующих функций на кишечные участках иммунные клетки слизистой оболочки также могут нести микробной сообщений экстра кишечных сайты регулировать системного иммунитета7,8,9. Это вызывает растущий интерес исследования и подчеркивает необходимость методов для выявления иммунных клеток, которые мигрируют из кишечных тканей для того чтобы зондировать их функции. Протокол, сообщили здесь использует модель коммерчески доступных мыши, в котором photoconvertible флуоресцентный белок используется метка ячейки. Фамподакцизным мышей повсеместно выражают Зеленый флуоресцирующий белок Dendra2, которое необратимо переключен в красной флуоресценции после активации ультрафиолетового (УФ) света10. С помощью волоконно оптические канюля для доставки 405 нм свет в ободочную кишку новорожденных мышей, мы демонстрируем, что photoconverted гемопоэтических клеток, которые возникли в или транзитом через двоеточие можно найти в селезенке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные процедуры выполнялись с одобрения и в соответствии с институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в Massachusetts General Hospital.
Предупреждение: Этот протокол включает в себя использование класса 3b лазер (LG3). LG3 лазерный защитные очки должны всегда использоваться при эксплуатации этого лазера. Соответствующие руководящие принципы подготовки и безопасности необходимо соблюдать во избежание риска получения травм.
1. Проектирование и монтаж лазера
- Подключите светоизлучающих диодов (СИД) (405 нм, 19.3 МВт, 1400 мА, волокна в сочетании) Светодиодный драйвер через 4-контактный кабель разъем M8, который приходит придает к LED. Тщательно затяните винт, чтобы закрепить соединение.
- Перед присоединением Оптогенетика патч-кабель к LED, удерживая соединитель до открытия светодиод свет, чтобы обеспечить там являются никаких видимых препятствий. Удар на отверстие для устранения любых препятствий, в случае необходимости и вставьте Оптогенетика патч-кабель в отверстие.
- Подключите волоконно оптические канюля для патч-кабель Оптогенетика, вставив канюли в любом конце соединительная муфта. Подсоедините другой конец соединительная муфта для патч-кабель. Придайте давление, достаточное для безопасного соединения, но будьте осторожны, чтобы не согнуть или сломать оптического волокна в канюлю.
Примечание: Хрупкие волокна оптические канюля покрыта защитный колпачок когда лазер не используется. - Установите драйвер светодиода непрерывная волна (CW) режим с непрерывной регулировочной на 0 и текущий предел равным 1,2 а.
2. Photoconversion клеток в толстой кишке
Примечание: Мужские и женские мышей были подвержены intracolonic 405 нм свет 1-2 дней после их рождения и были принесены в жертву до недельного возраста.
- Закрепите темных местоположения с доступом к электрической розетке. Подключите к розетке светодиодный драйвер.
Примечание: Эта процедура выполняется в минимальной белый свет как длительного воздействия мышей рассеянный свет может вызвать нежелательные photoconversion клеток. Красный свет используется в качестве альтернативы.
Предупреждение: Следующий шаг предполагает использование анестезии животного. Администрация анестетиков происходит в капюшоне II класса или с помощью другой соответствующей очистки системы. Ингаляционная анестезия может вызвать головокружение, сонливость или даже потеря сознания. - Анестезировать мыши подвержением к 4-5% изофлюрановая в 100% O2 в поле индукции. Проверьте правильное глубины анестезии, твердо щипать задние лапы (нет ответа). Поддержание анестезии через носовой конус на приблизительно 2% изофлюрановая. Предотвращения воздействия обработчик изофлюрановая путем использования соответствующей капот или цистит очистки устройства.
- Позиции наркотизированных мыши для intracolonic воздействия с помощью 1 руку загривок задней части мыши нежно с указательным и большим пальцем. Переверните мышь подвергать живота. Отвинтите захват, если мышь начинает терять свой розовый цвет или если его частота дыхания начинает замедляться. Закрепите хвост мыши между кольцом и пальчиками.
- С другой стороны удалите защитный колпачок из канюли. При сохранении длинной оси канюля параллельно мыши срединной линии, аккуратно вставьте волоконно оптические канюля через анус в толстую кишку, так что все 5 мм оптического волокна внутри мыши.
Примечание: Эта процедура выполняется медленно и с осторожностью, чтобы не перфорации кишечника стены. Минуту шевелить и скручивания канюлю СПИДа по улучшению в ободочную кишку. - Надеть защитные очки и увеличить лазерного текущее максимальное значение (до упора по часовой стрелке). Подтвердите наличие УФ-излучения, глядя на полупрозрачный брюшко мыши.
Примечание: LG3 лазерной безопасности очки резко уменьшить видимость. У коллеги (ношение защитного оборудования) помощь в надевать очки и включения лазера. - Разоблачить двоеточие для лазерного света для в общей сложности 2 мин снять канюлю примерно 1 мм каждые 30 s для максимизации области Люминал, на свету. В конце 2 мин выключите лазер.
- Медленно извлеките катетер из мыши. После восстановления от анестезии в пустой теплой клетке, вернуться домой клетку мыши.
3. изоляция кишечных лимфоцитов
- Подготовка 1 Л Хэнк сбалансированный соли раствора/теленка сыворотки (HBSS/CS) буфера, 200 мл эпителиальных полосы буфера, 500 мл мыть СМИ и 200 мл Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)-бесплатная стирка СМИ.
Примечание: Объемы реагентов рассчитаны на выборке из 9.- Сделайте в HBSS/CS буфер (HBSS; 5% CS), добавляя 50 мл CS до 950 мл HBSS. Храните его на льду.
- Подготовить эпителиальных полосы буфера [HBSS; 5% CS; 1 мм Дитиотреитол (DTT); ЭДТА 5 мм и 15 мм 4-(2-Hydroxyethyl) пиперазина-1-ethanesulfonic кислота (HEPES) (рН 7,2-7.5)], добавив 10 мл CS, промаркированные DTT 1 М, 2 мл 0,5 М ЭДТА и 3 мл 1 М HEPES буфера до 185 мл в HBSS. Место эпителиальных полосы буфера в ванну воды 37 ° C.
- Сделайте мыть СМИ (HBSS; 1% CS 1 мм ЭДТА), добавив 5 мл CS и 1 мл 0,5 М ЭДТА 494 мл HBSS. Храните при комнатной температуре.
- Подготовьте ЭДТА бесплатная стирка СМИ (HBSS; 1% CS; 15 мм HEPES) путем добавления 2 мл CS и 3 мл 1 м HEPES 195 мл HBSS. Храните при комнатной температуре.
- Сделать СУИМ буфера [1 x-фосфатный буфер (PBS) (рН = 7.2); 2% CS] путем добавления 10 мл CS 490 мл ФСБ. Храните его на льду.
- Приготовить блюдо ткани коллекции, поместив стрейнер 70 мкм клеток внутри культуры блюдо 60 x 10 мм. Добавить 10 мл HBSS/CS буфера (HBSS; 5% CS буфер в действии 3.1.1 и хранятся на льду) на блюдо и поместить его на льду.
- Усыпить мыши через передозировка вдыхаемого изофлюрановая, используя соответствующую очистку анестетика (примерно 3 мин подверженности > 4% изофлюрановая воздуха в помещении или в 100% O2). После очевидной прекращение дыхания и рефлекторных движения, проверить отсутствие глубокой боли, крепко сжимая задние лапы (с помощью щипцов рекомендуется). Обеспечить эвтаназии через обезглавливание, используя хирургические ножницы или новой бритвой.
Примечание: Шейки матки вывих не рекомендуется для этот шаг из-за размера и возраста животного. Эти методы согласуются с руководящими принципами AVMA 2013 эвтаназии и одобрен MGH IACUC. - Урожай толстой кишки с использованием чистого щипцами и ножницы для открытия живота. Отражать кишечника в 1 сторону мыши живота подвергать толстой кишки. Удалите весь толстой кишки, первый transecting, он просто дистального (в сторону ануса) до слепой кишки. Затем при этом твердо захватывая толстой кишки с щипцами, используйте ножницы, чтобы вырезать через уретру к прямой кишке. Вырежьте Колон как вблизи ануса как можно скорее. Урожай селезенке после удаления толстой кишки (см. шаги 4.1-4.2 ниже).
Примечание: в то время как протокол photoconversion только цели ~ 25% новорожденных толстой кишки (5 мм волокна оптические канюли), всей толстой кишки собирают для помощи в изоляции клеток. - Очистите двоеточие, используя пинцет подтолкнуть содержимое из толстой кишки и на сухой салфеткой. Однородный ткани с помощью лезвия мелко нарезать толстой кишки в пасту на обложке культуры блюдо и затем передать эту пасту на клетки ситечко в чашке Петри.
- Добавить панель чистой 8 мм длиной магнитные перемешать в ситечко и поместите блюдо на пластине 9-позиция магнитной мешалкой. Установите скорость бар магнитные перемешать до 800 об/мин и инкубации клеток для 5 мин при комнатной температуре. Сбросить буфер и повторите мыть с помощью 10 мл HBSS/CS (HBSS; 5% CS буфер в действии 3.1.1 и хранятся на льду). Сбросить буфер в конце стирки.
- Отделить эпителиальных клеток, добавив 10 мл подогретую эпителиальных полосы буфера (HBSS; 5% CS 1 мм DTT; 5 мм ЭДТА; буфер HEPES [pH 7,2-7.5] 15 мм, что было сделано в шаге 3.1.2 и хранятся в ванну воды 37 ° C) для ячейки сита и перемешать на 800 об/мин за 30 мин в 3 7 ° C инкубатор. В конце инкубации передачи буфера, обогащенный эпителиальных дробь к чистой 15 мл.
Примечание: Эпителия и связанные клетки (клеток кишечного эпителия и кишечного эпителия лимфоцитов) выпускаются в буфер, в то время как клетки в неповрежденной lamina propria остаются на сито клеток во время этого шага11.- Центрифуга обогащенного кишечного эпителия фракции (IELs) на 700 g x 5 мин при комнатной температуре. Отменить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл буфера СУИМ. Храните его на льду для использования на этапе 3.15.
- Вымойте lamina propria фракция в пределах ячейки сито 2 x с HBSS/CS. Чтобы сделать это, добавьте 10 мл раствора HBSS/CS (HBSS; буфера CS 5%, что было сделано в шаге 3.1.1, который был сохранен на льду) клеток ситечко и размешать на 800 об/мин за 5 мин в инкубаторе 37 ° C. Сбросить буфер после каждой стирки.
- Вымойте образца 2 x в средствах массовой информации мыть. Добавить 10 мл мыть СМИ (HBSS; 1% CS 1 мм ЭДТА буфера, что было сделано в шаге 3.1.3 и хранятся при комнатной температуре) в ячейку ситечко и размешать на 800 об/мин за 15 мин в инкубаторе 37 ° C. Сбросить буфер после каждой стирки.
- После использования вымойте СМИ, храните его на льду для использования на этапе 3.14.
- Вымойте образца 2 x с HBSS/CS. Добавить 10 мл HBSS/CS буфера (HBSS; 5% CS буфер в действии 3.1.1, который был сохранен на льду) в ячейку ситечко и размешать на 800 об/мин за 5 мин в инкубаторе 37 ° C. Сбросить буфер после каждой стирки.
- Инкубируйте ткани в ЭДТА бесплатная стирка буфера. Добавить 10 мл ЭДТА бесплатная стирка буфера (HBSS; 1% CS; 15 мм HEPES буфера, что было сделано в шаге 3.1.4 и хранятся при комнатной температуре) в ячейку ситечко и инкубировать пластину для 10 мин при комнатной температуре без перемешивания. Сбросить буфер в конце этого шага.
- Вымойте образца 2 x с HBSS/CS и подготовить решение фермента. Добавить 10 мл HBSS/CS (HBSS; 5% CS буфер в действии 3.1.1, который был сохранен на льду) буфер для ячейки сита и размешать на 800 об/мин за 10 мин в инкубаторе 37 ° C. Сбросить буфер после каждой стирки.
- Приготовляют раствор фермента (ЭДТА бесплатный мыть буфер; 0,1 мг/мл DNase; коллагеназы 167 мг/мл) в течение второго периода мыть: добавить 9 мг из DNase I и 15 мг лиофилизированных коллагеназы по 90 мл ЭДТА-Free мыть буфера. Хранят раствор при комнатной температуре.
- Дайджест lamina propria дроби, содержащихся в ячейку ситечко для получения lamina propria лимфоцитов (LPLs). Добавить 10 мл раствора фермента (ЭДТА бесплатно мыть буфер; 0,1 мг/мл DNase I; 167 мг/мл коллагеназы буфер в действии 3.12.1 и хранятся при комнатной температуре) к ячейке сетчатый фильтр и размешать на 800 об/мин 45 мин в инкубаторе 37 ° C.
Примечание: LPLs выпускаются в раствор после ферментативного пищеварения.- Собирать фермента раствор, содержащий ячейки и процеживают через стрейнер новых клеток в 50 мл Конические трубки.
- Добавьте 20 мл холодного мыть СМИ (HBSS; 1% CS; 1 мм ЭДТА буфера в шаге 3.1.3 и хранимых на льду на шаге 3.9.1) отфильтрованные клеток, чтобы блокировать коллагеназы активность фермента решения. Центрифуга трубки на 700 g x 6 мин при комнатной температуре. Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы, содержащие LPLs в 1 мл буфера СУИМ.
- Объединить IEL (из шага 3.7.1) и LPL (от шага 3.14) фракций и линяют с флуоресцентных конъюгированных антител для анализа потока гранулярных (см. шаг 5).
Примечание: IEL и LPL фракций могут отдельно витражи, если информация отсека.
4. изоляция лимфоцитов из селезенки
- Подготовьте коллекцию трубки, добавив 500 мкл буфера СУИМ в пробки microcentrifuge. Храните его на льду.
- После удаления толстой кишки (шаг 3.4), урожай весь селезенки и поместите его в коллекции трубки. Магазин ткани на льду.
- С помощью электрического ткани гомогенизатор, гомогенизировать селезенки в microcentrifuge трубку в течение приблизительно 1 мин центрифуги образца на 300 x g [микро центрифуги] 5 мин при комнатной температуре и аспирата покинуть супернатант.
- Выполните Лизис эритроцитов, resuspending образца в 500 мкл буфера lysis аммония хлорид калия (ACK) инициировать смерть клетки, осмотической лизис. Разрешить в примере инкубировать 1-2 мин при комнатной температуре и затем Ресуспензируйте в 725 мкл буфера СУИМ.
- Центрифуга для образца на 300 x g [микро центрифуги] 5 мин при комнатной температуре и аспирата покинуть супернатант. Ресуспензируйте гранулы в 500 мкл буфера СУИМ и процеживают через стрейнер клеток 40 мкм в новые пробки microcentrifuge. Передать новые пробки microcentrifuge весь образец и выведение его с флуоресцентных конъюгированных антител для анализа потока гранулярных (см. шаг 5).
5. Идентификация Дендра r+ клетки с помощью потока цитометрии
- Центрифугуйте образцы IEL/LPL и селезенки на g [микро центрифуги] 300 x 5 мин при комнатной температуре и аспирата покинуть супернатант.
- Ресуспензируйте гранулы в 100 мкл антитело пятная микс. Подготовьте антитело пятная смесь, добавив 1 мкл анти CD45 дневно конъюгированных антител 100 мкл буфера СУИМ на сэмпл.
Примечание: Важно Титруйте антитела, которые используются для проточной цитометрии до эксперимента для определения оптимальной концентрации, где происходит привязка насыщения. - Проинкубируйте образцы для 35 мин на льду (в темном месте).
- Ресуспензируйте образцы в 300 мкл буфера СУИМ и центрифуги их на g [микро центрифуги] 300 x 5 мин при комнатной температуре. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте образцы в 325 мкл буфера СУИМ. Анализ образцов на проточный цитометр.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Волоконно оптический кабель был использован для доставки 405 нм свет в двоеточия 2 - дневных Фамподакцизным мышей. В предыдущих экспериментах 30 s воздействия преисполнено решимости дать максимальную photoconversion клеток толстой кишки с минимальными цитотоксичности (рис. 1А). Таким образом последовательные 30 s воздействия различных сегментов толстой кишки были проведены, как описано в протоколе. После лазерного облучения сразу же были умерщвлены мышей, и photoconversion клеток было определено. Одноклеточных препаратов всего кишечника ткани окрашивали антитело проспряганное люминесцентные анти CD45 и был проведен анализ гранулярных потока для обнаружения photoconversion. Нереализованный белка Dendra2-зеленый (Дендра g) имеет возбуждения и выбросов Максима 490 и 553 Нм соответственно и может быть обнаружен в FITC канал, тогда как photoconverted белка Dendra2-красный (Дендра r) имеет возбуждения и выбросов Максима 507 и 573 Нм соответственно и могут быть обнаружены в канале PE проточный цитометр. После того, как бесповоротно перешли на его красной форме, Dendra2 очень фотостабилен и полезным для долгосрочного отслеживания приложений.
Не Дендра r+ клетки были обнаружены в unlasered мышей ( слевана рисунке 1B ). Однако, 405 нм освещенности привело собственный Дендра r+ клеточных популяций в CD45neg и CD45+ клетки отсеков (рис. 1Б право). Чтобы определить, если протокол толстой photoconversion привела к фон маркировки клеток на экстра кишечных сайты, мы собрали селезенки от недавно photoconverted мышей (T = 0) и assayed для Дендра r+ клеток путем проточной цитометрии. Не Дендра r+ клетки были обнаружены в CD45neg или CD45+ клетки отсеков (рис. 1C), предполагая, что внутри кишечное лазерный луч не проникают достаточно фотометке клеток в селезенке. Таким образом, любой Дендра r+ клетки обнаружены в селезенке после предоставления времени для миграции (T = 3d, 5d) следует возникла из толстой кишки.
Рисунок 1 : В естественных условиях photoconversion толстой ткани. Клетки кишечника от 2 - дневных Фамподакцизным щенков были подвержены интра кишечное 405 нм света для 30 s как описано. Сразу же после процедуры были определены photoconversion и маркировки клеток (T = 0) на основе анализа потока гранулярных одноклеточных препаратов толстой ткани и селезенки. (A) Этот представитель потока гранулярных точка сюжет показывает выражение CD45 (x-оси) и пятнать жить мертвый краситель (y-ось) в подготовке одной ячейки от двоеточия управления и гравированных мышей. Панели, B и C , представитель потока гранулярных точка участок накладками, которые показывают экспрессии белка Dendra2-зеленый (Dendra2-g, горизонтальной оси) и белка Dendra2-красный (Dendra2-r, вертикальной оси) в неэкспонированные управления и подвергаются CD45+ (гемопоэтических) и CD45neg (не гемопоэтических) клетки (B) толстой кишки и (C) селезенки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Данные от типичных photoconversion эксперимента для определения мигрирующих клеток в селезенке показано на рисунке 2. Photoconversion клетки в двоеточия 2 - дневных Фамподакцизным мышей была выполнена как показано на рисунке 1. Мышей были умерщвлены 3 и 5 дней после воздействия и наличие Дендра r+ клеток в селезенке определяется проточной цитометрии. Существовали не Дендра r+ клетки в CD45neg клеток подмножество, согласуется с мнением, что клеткиneg CD45 преимущественно эпителия и других структурных клеток кишечника. Некоторых CD45+ гемопоэтических клеток выразил Дендра r, предполагая, что они были photoconverted в толстой кишке и мигрировали в селезенке.
Рисунок 2 : CD45+ гемопоэтические клетки мигрируют из толстой кишки к селезенке. Новорожденных (день 0 - 2) Фамподакцизным мышей подвергаются 405 нм свет photoconvert Dendra2 белка интра кишечное воздействием. Представитель потока цитометрии участки Показать экспрессии белка Dendra2-зеленый (Dendra2-g, горизонтальной оси) и белка Dendra2-красный (Dendra2-r, вертикальной оси) в CD45neg и CD45+ клеток селезенки неэкспонированные 5-дней old мышей и подвергаются мышей, проанализированы на 3 и 5 дней (T = 3d, 5d) после photoconversion. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Определение и характеристика клеток, которые взаимодействуют с и находятся под влиянием микрофлору в толстой кишке имеют важное значение и должно способствовать пониманию как информация от слизистой микроокружения ретранслируется на остальную часть тела. Один из методов обучения гут связанные ячейки миграции требует изоляции кишечнике связанных ячеек следуют приемных передачи в получателей мышей, чтобы определить их моделей тканей самонаведения и функционируют12,13. Этот подход ограничен, как только те типы ячеек, которые были переведены могут быть отслежены. Кроме того артефакты в результате изоляции клетки тканей и процесс очистки может помешать в vivo миграционного процесса. Совсем недавно эндоскопическая photoconversion протокол к этикетке кишечных клетки, с помощью мыши Каэдэ был сообщил14. Это исследование показало, широкого оборота лейкоцитов от кишечника и взрослых мышей.
Наш доклад описывает метод для метки клеток в толстой кишке новорожденных мышей и отслеживать их миграции в экстра кишечных сайты, такие как селезенке. Фамподакцизным мыши повсеместно выражает photoconvertible Зеленый флуоресцентный белок Dendra2, необратимо переключен в красной флуоресценции после его активации УФ светом. Воздействие двоеточия новорожденных мышей 405 нм света помечены как CD45+ кроветворные и CD45neg не гемопоэтических клеток. CD45+Dendra2-красный+ клетки были обнаружены в селезенке 3 до 5 дней после photoconversion, указывающее экстра кишечных миграции гемопоэтических клеток.
Ограничения скорости шаг для этот assay это часть области кишечника, которая подвергается воздействию света 405 нм. Хрупкость новорожденных Колон и наличие стула, хотя и минимальным в этом раннем возрасте, ограничить длину волокна оптические канюля, который может быть вставлен. В предыдущих экспериментах больше канюля может не вставляться успешно более чем 5 мм. Смазочные материалы были избегать из-за риска переменной преломление света, лазерного луча. Наружу движение катетер каждые 30 s помогает максимизировать области кишечника, лазерный свет. Важно отметить, что канюля с большим значением NA (NA = 0,5) был использован для создания широкий конус света в толстой кишке.
Этот протокол был стандартизирован для новорожденного (день 0 - 2) Фамподакцизным щенков. С учетом изменений в содержание и длина толстой кишки с возрастом мышей, техника должны быть оптимизированы соответственно при использовании старых щенков. Прежде всего необходимо будет изменения общей продолжительности photoconversion и длина вставки канюля оптического волокна.
Этот подход к пониманию мигрирующих поведение клеток в толстой кишке облегчается гранулярных анализа потока. Многопараметрический проточной цитометрии может далее использоваться для идентификации и фенотип мигрантов иммунных клеток типов в пределах CD45+ клетки подмножества. Dendra2-r+ клетки также могут быть отсортированы по СУИМ для вниз по течению приложений, таких как выражение гена профилирования или протеомики анализов. Хотя направлен на понимание подмножеств гемопоэтических клеток в толстой кишке в этом исследовании, метод может быть адаптированы для изучения клеточной миграции из сайтов дополнительные ткани, включая мозг и кожи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Нитья Jain было поддержано NIH/NIAID карьеры переход премии 1K22AI116661-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser | |||
| Light Emitting Diode (LED) | THORLABS | M405FP1 | CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 |
| LED driver | THORLABS | LEDD1B | Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 |
| Optogenetics patch cable | THORLABS | M87L01 | 1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454 |
| Fiber optic cannula | Doric lenses | MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 | 5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036 |
| Power supply | THORLABS | KPS101 | Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 |
| LG3 laser safety goggles | THORLABS | LG3 | Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 |
| Red light | Electron Microscopy Sciences | 74327-10 | 15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences |
| Intestinal cell isolation | |||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3 |
| 1X HBSS | Gibco | 14025076 | Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 |
| Calf Serum | Hyclone AZM | 197696 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 |
| DTT | Sigma | 10197777001 | CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US |
| HEPES | Gibco | 15630080 | 1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 |
| Petri dish | Corning | 353004 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F |
| 70 micron cell strainer | Falcon | 352350 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712 |
| Micro magnetic stir bar | Fisherbrand | 1451364 | Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364 |
| Magnetic stir plate | Corning Laboratory Stirrers | 440826 | https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE |
| Collagenase | Roche | 5401020001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE |
| DNase I | Sigma | 10104159001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US |
| 1X PBS | Gibco | 20012-027 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 |
| Pipet aid | Thermo Scientific | 14387165 | https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357530 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357515 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 15 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339651 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339653 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| Single cell suspension | |||
| Eppendorf tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx |
| Tissue homogenizer | Kimble | K7495400000 | Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000 |
| Homogenizer tips | Kimble | 7495210590 | Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| Antibodies | |||
| BV786 anti-mouse CD45 | BD | 564225 | Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 |
| Live/Dead | Invitrogen | L34962 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962 |
| Other | |||
| Razor blades | VWR | 55411-050 | Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades |
References
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489, 231-241 (2012).
- Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes. Journal of Immunology. 198, 590-595 (2017).
- Mathis, D., Benoist, C. Microbiota and autoimmune disease: the hosted self. Cell Host Microbe. 10, 297-301 (2011).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46, 350-363 (2017).
- Jain, N., Walker, W. A. Diet and host-microbial crosstalk in postnatal intestinal immune homeostasis. Nature Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 12, 14-25 (2015).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews in Immunology. 14, 667-685 (2014).
- Macpherson, A. J., Uhr, T. Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria. Science. 303, 1662-1665 (2004).
- Mowat, A. M. Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens. Nature Reviews in Immunology. 3, 331-341 (2003).
- Diehl, G. E., et al. Microbiota restricts trafficking of bacteria to mesenteric lymph nodes by CX(3)CR1(hi) cells. Nature. 494 (3), 116-120 (2013).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50, 833-843 (2012).
- Conway, K. L., et al. ATG5 regulates plasma cell differentiation. Autophagy. 9, 528-537 (2013).
- Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii. Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).
- Guo, X., Muite, K., Wroblewska, J., Fu, Y. X. Purification and Adoptive Transfer of Group 3 Gut Innate Lymphoid Cells. Methods in Molecular Biology. 1422, 189-196 (2016).
- Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).
