Summary
Le protocole décrit ici utilise une approche de photomarquage chez des souris nouveau-nées d’identifier spécifiquement les cellules immunitaires qui ont émigrent du côlon aux sites extra-intestinales. Cette stratégie sera utile pour étudier les interactions hôte-microbiome en début de vie.
Abstract
Les communautés bactériennes entériques sont établies tôt dans la vie et influencent la fonction et le développement des cellules immunitaires. Le microbiote néonatal est sensible à nombreuses influences externes, y compris l’utilisation d’antibiotiques et l’alimentation, qui a des répercussions susceptibilité à des maladies auto-immunes et inflammatoires. Désordres tels que le maladie inflammatoire de l’intestin (MII) sont caractérisés par un afflux massif de cellules immunitaires à l’intestin. Cependant, les cellules immunitaires conditionnées par la microflore peuvent en outre émigrer hors de l’intestin d’influer sur les réponses immunitaires aux sites extra-intestinales. Ainsi, il est nécessaire pour identifier et caractériser les cellules qui peuvent porter des messages microbiennes des intestins aux sites distales. Nous décrivons ici une méthode pour marquer les cellules dans le côlon des souris nouveau-nées in vivo permettant leur identification sur les sites extra-intestinales après la migration.
Introduction
Le tube digestif de mammifères héberge des centaines d’espèces de bactéries qui existent dans une relation symbiotique avec l’hôte1. Les cellules immunitaires présentes dans le milieu local appliquer une coexistence pacifique avec ces microbes et d’établissent une barrière protectrice contre les invasions de l’agent pathogène. Ainsi, bidirectionnel des interactions entre les cellules immunitaires et la microflore sont essentielles pour établir une communauté commensale qui sensibilise le système immunitaire et définit le seuil de réactivité immunitaire aux agents pathogènes. Modifications dans la boîte de composition ou dysbiose, microbienne perturbent l’homéostasie immunitaire et perturbent les circuits réglementaires qui répriment les inflammations intestinales menant à médiation immunitaire maladies comme le diabète de Type 1 et de l’EIA,2,3 .
La période immédiatement après que la naissance est une unique fenêtre du développement au cours de laquelle les communautés microbiennes intestinales commencent à mettre en place en même temps le système immunitaire mûrit4. Le microbiote postnatal n’est pas stable, les changements dans la composition de la communauté qui se trouve naturellement et souvent5. Les cellules immunitaires qui interagissent avec le microbiote résident dans deux sites anatomiques distinctes dans l’intestin - la lamina propria et l' épithélium intestinal6. Nombreux types de cellules immunitaires sont présents dans l’intestin, y compris les lymphocytes (telles que les lymphocytes T, lymphocytes B et les cellules lymphoïdes innées) ainsi que des cellules myéloïdes (qui comprennent les macrophages, les monocytes et les cellules dendritiques). Ces cellules, également connu sous le nom de cellules hématopoïétiques, effectuent une multitude de fonctions qui préservent la barrière intestinale et de maintenir l’homéostasie.
En plus de leurs fonctions de réglementation aux sites intestinales, cellules immunitaires de la muqueuse peuvent aussi porter des messages microbiennes aux sites extra-intestinales de réglementer l’immunité systémique7,8,9. C’est un domaine d’intérêt croissant de recherche et met en évidence la nécessité de méthodes identifier les cellules immunitaires qui migrent hors de tissus intestinaux afin de sonder leur fonction. Le protocole indiqué ici utilise un modèle de souris disponibles dans le commerce qui consiste à exploiter une protéine fluorescente et pour marquer les cellules. PhAMexcisés souris ubiquitaire expriment une protéine fluorescente verte de Dendra2 qui est irréversiblement en fluorescence rouge lors de l’activation par ultraviolet (UV) léger10. À l’aide d’une canule de fibre optique pour livrer 405 lumière nm dans le côlon des souris nouveau-nées, nous démontrons que photoconverted les cellules hématopoïétiques, qui ont étaient originaires ou ont transité par le colon se trouve dans la rate.
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Protocol
Toutes les procédures d’animaux ont été effectués avec l’approbation d’et dans le respect de l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) au Massachusetts General Hospital.
ATTENTION : Ce protocole implique l’utilisation d’un laser de classe 3 b (LG3). Lunettes de protection laser LG3 doivent toujours être utilisés lors de l’utilisation de ce laser. Des directives appropriées de formation et de la sécurité doivent être respectées pour éviter les risques de blessures.
1. conception et montage de Laser
- Raccorder la diode électroluminescente (LED) (405 nm, 19,3 mW, 1400 mA, couplé fibre) la LED driver via le câble de connecteur M8 4 broches qui vient est attaché à la LED. Bien serrer la vis pour fixer la connexion.
- Avant de raccorder le câble de raccordement d’optogenetics à la LED, tenir le connecteur d’ouverture de la LED à la lumière pour s’assurer il y a aucun obstacle visible. Coup sur le trou pour éliminer tout obstacle si nécessaire et insérer le câble de raccordement d’optogenetics dans l’ouverture.
- Connectez la canule de fibre optique pour le câble de raccordement optogenetics en y insérant la canule ou l’autre extrémité du manchon connecteur. Raccordez l’autre extrémité du manchon connecteur pour le câble de raccordement. Appliquer la pression nécessaire pour sécuriser la connexion, mais veillez à ne pas plier ou casser la fibre optique dans la canule.
Remarque : La canule de fragiles fibre optique est couvert avec le capuchon de protection chaque fois que le laser n’est pas en cours d’utilisation. - Le mode d’onde continue (CW) avec la molette de réglage en continu à 0 et la limite actuelle fixée à 1,2 A. la valeur du pilote de LED
2. Photoconversion de cellules dans le côlon
Remarque : Les souris mâles et femelles ont été exposées à la colique 405 nm lumière 1-2 jour (s) après leur naissance et ont été sacrifiés avant 1 semaine d’âge.
- Sécuriser un endroit sombre avec un accès à une prise électrique. Branchez le conducteur de LED.
Remarque : Cette procédure est effectuée dans la lumière blanche minime, car une exposition prolongée des souris à la lumière ambiante peut-être causer une photoconversion non désirée des cellules. La lumière rouge est utilisée comme une alternative.
ATTENTION : L’étape suivante implique l’utilisation d’un anesthésique animal. L’administration de l’anesthésie se déroule sous une hotte de classe II ou en utilisant un autre système de nettoyage approprié. L’inhalation de l’anesthésique peut causer des étourdissements, somnolence ou même l’inconscience. - Anesthésier la souris par l’exposition à l’isoflurane 4-5 % à 100 % d’O2 dans une boîte d’induction. Vérifiez la bonne profondeur de l’anesthésie en pinçant fermement une patte arrière (pas de réponse). Maintenir l’anesthésie par un cône de nez à environ 2 % isoflurane. Éviter l’exposition des gestionnaire d’isoflurane par utilisation d’une hotte appropriée ou un anesthésique périphérique antiradicalaire.
- Positionnez la souris anesthésiée pour l’exposition de colique en utilisant 1 main à la peau du cou au dos de la souris doucement avec le pouce et l’index. Retourner la souris afin d’exposer l’abdomen. Desserrer l’étau si la souris commence à perdre sa couleur rose ou si son rythme de la respiration commence à ralentir. Fixer la queue de la souris entre l’anneau et les petits doigts.
- Avec l’autre main, retirez le capuchon protecteur de la canule. Tout en conservant l’axe long de la canule parallèle à la ligne médiane de la souris, introduire doucement la canule de fibre optique à travers l’anus dans le côlon afin que tous les 5 mm de la fibre optique sont à l’intérieur de la souris.
Remarque : Cette procédure est effectuée lentement et avec soin à ne pas perforer la paroi du côlon. Minutes en remuant et le vrillage de la canule facilite l’avancement dans le côlon. - Enfiler les lunettes de sécurité et augmenter le laser actuel à la valeur maximale (tout le chemin vers la droite). Confirmer la présence de la lumière UV en regardant l’abdomen translucide de la souris.
Remarque : Les lunettes de protection laser LG3 diminuent considérablement la visibilité. Avoir un collègue (équipement de protection usure) aider à enfiler les lunettes et allumer le laser. - Exposer le côlon à la lumière du laser pour un total de 2 min. Retirer la canule de 1 mm environ toutes les 30 s pour maximiser la zone luminale exposée à la lumière. À la fin de 2 min, éteindre le laser.
- Retirez lentement la canule de la souris. Après avoir récupéré de l’anesthésie dans une cage vide chaude, retourner la souris à la cage.
3. isolement des Lymphocytes intestinaux
- Préparer 1 L de tampon de sérum (HBSS/CS) de Hank Balanced Salt Solution/veaux, 200 mL de tampon de bande épithéliales, 500 mL de lavage médias et 200 mL d’acide tétraacétique (EDTA)-lavage médias libres.
Remarque : Les volumes de réactifs sont calculés pour un échantillon de taille 9.- Faire le tampon HBSS/CS (HBSS ; CS 5 %) en ajoutant 50 mL de CS à 950 mL de HBSS. Conservez-le sur glace.
- Préparer le tampon bande épithéliales [HBSS CS 5 % ; 1 mM le dithiothréitol (DTT) ; 5 mM EDTA ; 15 mM 4-(2-Hydroxyethyl) pipérazine-1-ethanesulfonic acide (HEPES) (pH 7,2 à 7,5)] en ajoutant 10 mL de CS, 200 µL de TNT, 2 mL d’EDTA 0,5 M et 3 mL d’un tampon HEPES 1 M 1 M à 185 mL du HBSS. Placer le tampon bande épithéliales dans un bain-marie à 37 ° C.
- Faire le support de lavage (1 % CS, HBSS ; 1 mM EDTA) en ajoutant 5 mL de CS et 1 mL d’EDTA 0,5 M à 494 mL de HBSS. Conserver à température ambiante.
- Préparer les médias de lavage sans EDTA (HBSS ; CS 1 % ; 15 mM HEPES) en ajoutant 2 mL de CS et 3 mL de 1 M HEPES à 195 mL de HBSS. Conserver à température ambiante.
- Faire un tampon de FACS [1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (pH = 7,2) ; CS 2 %] en ajoutant 10 mL de CS à 490 mL de PBS. Conservez-le sur glace.
- Préparer le plat de collection de tissu en plaçant une passoire de cellule 70 µm à l’intérieur d’une boîte de Petri de 60 x 10 mm. Ajouter 10 mL de tampon HBSS/CS (HBSS ; 5 % un tampon CS effectuée à l’étape 3.1.1 et stockés sur la glace) pour le plat et placez-le sur la glace.
- Euthanasier la souris via une surdose d’isoflurane inhalé à l’aide de nettoyage appropriés de l’anesthésique (une exposition d’environ 3 min à > isoflurane 4 % dans l’air ambiant ou à 100 % de O2). Après un arrêt apparent de la respiration et mouvement-reflex, vérifier l’absence de douleur profonde en pinçant fermement une patte arrière (à l’aide de forceps est recommandé). S’assurer que l’euthanasie via une décapitation en utilisant une paire de ciseaux chirurgicaux ou un nouveau rasoir.
Remarque : La dislocation cervicale n’est pas recommandée pour cette étape en raison de la taille et l’âge de l’animal. Ces méthodes sont compatibles avec les orientations de AVMA 2013 sur l’euthanasie et approuvés par l’IACUC MGH. - Récolter le côlon à l’aide de ciseaux et pinces propres à ouvrir l’abdomen. Refléter les intestins sur 1 côté de l’abdomen de la souris pour exposer le côlon. Retirer le côlon tout en premier ensuite il juste distale (vers l’anus) pour le caecum. Puis, tout en tenant fermement le côlon avec une pince, utiliser des ciseaux pour couper à travers l’urètre au rectum. Couper le côlon comme à proximité de l’anus que possible. Récolter la rate après avoir enlevé le côlon (voir étapes 4.1-4.2 ci-dessous).
Remarque : Alors que le protocole de photoconversion cible uniquement environ 25 % du côlon du nouveau-né (5 mm de la canule de fibre optique), tout le côlon est récolté afin d’aider à l’isolement cellulaire. - Nettoyer le côlon à l’aide de pinces à pousser le contenu hors du côlon et sur une serviette en papier sec. Homogénéiser le tissu en utilisant des lames de rasoir pour hacher finement le côlon en une pâte sur le couvercle d’une boîte de Petri et puis transférer cette pâte à la crépine de la cellule dans la boîte de Pétri.
- Ajouter un propre 8 mm long magnétique à la crépine et placer le plat sur une plaque de 9 broches agitateur magnétique. Régler la vitesse de bar agitation magnétique à 800 tr/min et incuber les cellules pendant 5 min à température ambiante. Jeter le tampon et répéter le lavage à l’aide de 10 mL de HBSS/CS (le HBSS, tampon de CS 5 % effectuée à l’étape 3.1.1 et stockés sur la glace). Jeter le tampon à la fin du cycle de lavage.
- Dissocier les cellules épithéliales en ajoutant 10 mL de tampon préchauffée bande épithéliales (le HBSS ; 5 % CS ; 1 millimètre DTT ; 5mM EDTA ; un tampon HEPES [pH 7,2 à 7,5] 15mM qui a été fait à l’étape 3.1.2 et stocké dans un bain-marie à 37 ° C) à la crépine de la cellule et remuez à 800 tr/min pendant 30 min dans un 3 Incubateur de 7 ° C. À la fin de l’incubation, transférer le tampon enrichi dans la fraction épithéliale dans un tube propre de 15 mL.
Remarque : L’épithélium et cellules associées (cellules épithéliales intestinales et les lymphocytes épithéliales intestinales) sont libérées dans la mémoire tampon, tandis que les cellules dans la intact lamina propria restent sur le tamis de la cellule au cours de cette étape11.- Centrifuger la fraction épithéliale intestinale (intraépithéliaux) enrichie à 700 x g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 1 mL de tampon de FACS. Le stocker sur la glace pour une utilisation à l’étape 3.15.
- Laver la fraction de la lamina propria dans la crépine de la cellule 2 x avec HBSS/CS. Pour ce faire, ajouter 10 mL de solution HBSS/CS (HBSS ; tampon de CS 5 % qui a été faite à l’étape 3.1.1 qui a été stockée sur glace) à la crépine de la cellule et remuez-le à 800 tr/min pendant 5 min dans un incubateur à 37 ° C. Jeter le tampon après chaque lavage.
- Laver l’échantillon 2 x dans les médias de lavage. Ajouter 10 mL de lavage médias (HBSS ; 1 % CS, tampon de EDTA 1 mM qui a été fait à l’étape 3.1.3 et stocké à température ambiante) à la crépine de la cellule et remuez-le à 800 tr/min pendant 15 min dans un incubateur à 37 ° C. Jeter le tampon après chaque lavage.
- Après avoir utilisé les médias de lavage, le stocker sur la glace pour l’utiliser à l’étape 3.14.
- Laver l’échantillon 2 x avec HBSS/CS. Ajouter 10 mL de tampon HBSS/CS (HBSS ; tampon CS 5 % effectuée à l’étape 3.1.1 qui a été stockée sur glace) à la crépine de la cellule et remuez-le à 800 tr/min pendant 5 min dans un incubateur à 37 ° C. Jeter le tampon après chaque lavage.
- Incuber le tissu dans le tampon de lavage sans EDTA. Ajouter 10 mL de tampon de lavage sans EDTA (un tampon HEPES 15 mM qui a été fait à l’étape 3.1.4 et stocké à température ambiante, HBSS ; CS 1 %) à la crépine de la cellule et incuber la plaque pendant 10 min à température ambiante sans remuer. Jeter le tampon à la fin de cette étape.
- Laver l’échantillon 2 x avec HBSS/CS et préparer la solution d’enzyme. Ajouter 10 mL de HBSS/CS (HBSS, tampon de CS 5 % effectuée à l’étape 3.1.1 qui a été stockée sur glace) de la mémoire tampon à la crépine de la cellule et remuez-le à 800 tr/min pendant 10 min dans un incubateur à 37 ° C. Jeter le tampon après chaque lavage.
- Préparer la solution d’enzyme (sans EDTA laver tampon ; 0,1 mg/mL DNase I ; collagénase 167 mg/mL) pendant la deuxième période de lavage : ajouter 9 mg de DNase I et 15 mg de collagénase lyophilisée pour 90 mL d’EDTA-free laver tampon. Conserver la solution à température ambiante.
- Digérer la fraction de la lamina propria contenue dans la crépine de la cellule pour obtenir des lymphocytes (LPLs) de la lamina propria . Ajouter 10 mL de la solution d’enzyme (l’EDTA exempt de tampon de lavage ; 0,1 mg/mL DNase I ; 167 mg/mL de tampon de collagénase effectuée à l’étape 3.12.1 et stockés à température ambiante) à la crépine de la cellule et remuez-le à 800 tr/min pendant 45 min dans un incubateur à 37 ° C.
NOTE : LPLs sont libérées dans la solution après digestion enzymatique.- Recueillir la solution enzymatique contenant les cellules et la filtrer à travers un tamis de cellules nouvelles dans un tube conique de 50 mL.
- Ajouter 20 mL de support de lavage à froid (le HBSS ; CS 1 % ; EDTA 1mM tampon fait à l’étape 3.1.3 et stockée sur glace à l’étape 3.9.1) aux cellules filtrées pour bloquer l’activité de la collagénase dans la solution d’enzyme. Centrifuger le tube à 700 x g pendant 6 min à température ambiante. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot contenant LPLs dans 1 mL de tampon de FACS.
- Combiner la Lei (de l’étape 3.7.1) et les fractions LPL (de l’étape 3.14) et leur tache avec l’anticorps conjugué fluorescent pour la cytométrie (voir étape 5).
NOTE : IEL et LPL fractions peuvent être colorées séparément si vous désirez informations compartiment.
4. isolement des Lymphocytes de la rate
- Préparer le tube de prélèvement en ajoutant 500 µL de tampon de FACS dans un tube de microcentrifuge. Le stocker sur la glace.
- Après avoir enlevé le côlon (étape 3.4), la rate toute la récolte et le placer dans le tube de prélèvement. Stocker le tissu sur la glace.
- À l’aide d’un homogénéisateur tissu électrique, homogénéiser la rate dans un tube de microcentrifuge pendant environ 1 min. Centrifuger l’échantillon à 300 g [micro centrifugeuse] pendant 5 min à température ambiante et aspirer hors le surnageant.
- Effectuer la lyse des globules rouges en resuspendant l’échantillon dans 500 µL de tampon de lyse (ACK) de chlorure d’ammonium-potassium à déclencher la mort cellulaire par lyse osmotique. Laisser l’échantillon à incuber 1 à 2 min à température ambiante et ensuite il resuspendre dans 725 µL de tampon de FACS.
- Centrifuger l’échantillon à 300 g [micro centrifugeuse] pendant 5 min à température ambiante et aspirer hors le surnageant. Resuspendre le culot dans 500 µL de tampon de FACS et filtrez-le à travers une passoire de cellule de 40 µm dans un nouveau tube de microcentrifuge. Transférer la totalité de l’échantillon dans un tube de microcentrifuge nouvelle et souiller avec l’anticorps conjugué fluorescent pour la cytométrie (voir étape 5).
5. identification de Dendra-r+ des cellules à l’aide de Flow Cytometry
- Centrifuger les échantillons IEL/LPL et rate à 300 g [micro centrifugeuse] pendant 5 min à température ambiante et aspirer hors le surnageant.
- Remettre en suspension les pellets dans 100 µL d’anticorps mix de coloration. Préparer l’anticorps souillant le mélange en ajoutant 1 µL d’anticorps anti-CD45 conjugué fluorescent à 100 µL de tampon de FACS par échantillon.
Remarque : Il est important titrer les anticorps utilisés pour la cytométrie en flux avant l’expérience pour déterminer la concentration optimale où lie la saturation se produit. - Incuber les échantillons pendant 35 minutes sur la glace (dans un endroit sombre).
- Remettre en suspension les échantillons dans 300 µL de tampon de FACS et les centrifuger à 300 g [micro centrifugeuse] pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les échantillons dans 325 µL de tampon de FACS. Analyse des échantillons sur un cytomètre en flux.
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Representative Results
Un câble à fibre optique a été utilisé pour livrer le 405 lumière nm dans les colones de 2 - jours ans PhAMexcisés souris. Dans des expériences antérieures, une exposition de s 30 était déterminé à donner une photoconversion maximale des cellules du côlon avec un minimum cytotoxicité (Figure 1A). Par conséquent, séquentiels 30 expositions de s des différents segments du côlon ont été réalisées comme décrit dans le protocole. Suite à l’exposition de laser, les souris ont été immédiatement euthanasiés, et la photoconversion des cellules a été déterminée. Unicellulaire préparations du tissu colique total ont été colorées avec de l’anticorps conjugué fluorescent anti-CD45 et la cytométrie a été réalisée afin de détecter les photoconversion. Protéine de Dendra2-vert (Dendra-g) non converti a maxima d’excitation et d’émission à 490 et 553 nm respectivement et peut être détectée dans le canal de la FITC, tandis que photoconverted protéine Dendra2-rouge (Dendra-r) a maxima d’excitation et d’émission à 507 et 573 nm respectivement et peut être détectée dans le canal de PE d’un cytomètre en flux. Une fois passé irréversiblement à sa forme rouge, Dendra2 est hautement photostable et utile pour les applications de suivi à long terme.
Aucune cellule de Dendra-r+ ont été détectés chez les souris unlasered ( gauchedela Figure 1B ). Cependant, une exposition lumineuse de 405 nm a entraîné des populations distinctes de cellule de Dendra-r+ dans le CD45neg et CD45+ compartiments (Figure 1B droit) de cellules. Pour déterminer si le protocole de photoconversion du côlon est le résultat dans l’étiquetage d’arrière-plan des cellules dans les sites extra-intestinales, nous avons récolté des rates de nouvellement photoconverted souris (T = 0) et dosés Dendra-r+ cellules par cytométrie en flux. Aucune cellule de Dendra-r+ ont été détectés dans le CD45neg ou CD45+ cell compartiments (Figure 1C), ce qui suggère que le faisceau laser intra-colique n’ont pas pénétré assez pour photomarque les cellules de la rate. Ainsi, les cellules de Dendra-r+ détectés dans la rate, après avoir accordé un délai pour la migration (T = 3d, 5D) doivent provenir du colon.
Figure 1 : In vivo photoconversion de tissu colique. Les cellules du côlon de 2 - jours ans PhAMexcisés petits ont été exposées à la lumière de nm 405 intra-colique pendant 30 s comme décrit. La photoconversion et le marquage des cellules ont été déterminées immédiatement après l’intervention (T = 0) par une cytométrie de préparations unicellulaire des tissus du côlon et de la rate. (A), cette parcelle de dot cytométrie en flux représentatif montre l’expression de CD45 (x-axis) et la coloration de la teinture de vivre-morts (y-axe) dans des préparations de cellule unique depuis le colons de contrôle et de la souris lasered. Séries B et C sont des flux représentatif par cytométrie en flux point intrigue superpositions qui montrent l’expression de la protéine Dendra2-vert (Dendra2-g, axe horizontal) et la protéine Dendra2-rouge (Dendra2-r, axe vertical) en contrôle-vierges et exposés de CD45+ (hématopoïétiques) et les cellules CD45neg (non hématopoïétiques) en (B) du colon et ()C) la rate. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Données d’une expérience typique de photoconversion pour identifier les cellules migratrices dans la rate sont indiquées à la Figure 2. La photoconversion des cellules dans les colones de 2 - jours ans PhAMexcisés souris s’est déroulée comme dans la Figure 1. Souris ont été euthanasiés 3 et 5 jours après l’exposition et la présence de cellules de Dendra-r+ dans la rate a été déterminée par cytométrie en flux. Il y avait aucune cellule de Dendra-r+ dans le sous-ensemble de CD45neg cell, compatible avec l’hypothèse que les cellules deneg CD45 sont principalement épithéliales et autres cellules structurelles de l’intestin. Certains CD45+ cellules hématopoïétiques expriment Dendra-r, ce qui laisse supposer qu’ils avaient été photoconverted dans le côlon et migré vers la rate.
Figure 2 : CD45+ migrent les cellules hématopoïétiques du colon à la rate. Nouveau-né (jour 0 - 2) PhAMexcisés souris ont été exposées à la lumière 405 nm à photoconvert Dendra2 protéine par exposition intra-colique. Les parcelles de cytométrie de flux représentant montrent l’expression de la protéine Dendra2-vert (Dendra2-g, axe horizontal) et la protéine Dendra2-rouge (Dendra2-r, axe vertical) en CD45neg et CD45+ cellules spléniques de souris non exposées d’âgés de 5 jours et exposé des souris analysées à 3 et 5 jours (T = 3d, 5D) après la photoconversion. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’identification et la caractérisation de cellules qui interagissent avec et sont influencés par la microflore du côlon sont importants et devraient faciliter la compréhension de comment les informations depuis le microenvironnement de la muqueuse sont relayées au reste du corps. Une méthode pour l’étude de la migration cellulaire axés sur l’intestin nécessite l’isolement de cellules associées aux intestin suivie d’un transfert adoptif dans des souris destinataires pour déterminer leurs habitudes de tissu-homing et fonction12,13. Cette approche est limitée, car seulement les types de cellules spécifiques qui ont été transférés peuvent être l’objet d’un suivi. En outre, artefacts résultant de l’isolement des cellules les tissus et le processus de purification peuvent entraver le processus migratoire en vivo . Plus récemment, un protocole de photoconversion endoscopique d’étiqueter les cellules de l’intestin des souris Kaede était signalé14. Cette étude a révélé un large traite des leucocytes vers et à partir de l’intestin chez la souris adulte.
Notre rapport décrit une méthode pour marquer les cellules dans le côlon des souris nouveau-nées et suivre leur migration vers des sites extra-intestinales tels que la rate. La souris deexcisés PhAM ubiquitaire exprime une protéine verte et fluorescente Dendra2 qui est irréversiblement en fluorescence rouge lors de son activation par la lumière UV. L’exposition des points-virgules des souris nouveau-nées à la 405 nm lumière marqué deux CD45+ hématopoïétiques et des cellules non hématopoïétiques de CD45neg . CD45++ Dendra2-rouge des cellules ont été détectés dans la rate de 3 à 5 jours après la photoconversion, indiquant la migration extra-intestinales de cellules hématopoïétiques.
L’étape cinétiquement limitante pour cet essai est la fraction de la zone du côlon qui est exposée à 405 nm lumière. La fragilité du nouveau-né côlon et la présence de selles, quoique minime à cet âge précoce, limiter la longueur de la canule de fibre optique qui peut être insérée. Dans des expériences antérieures, une canule plue impossible avec succès d’insérer plus de 5 mm. Lubrifiants ont été évitées en raison du risque de la réfraction de lumière variable du faisceau laser. Le mouvement vers l’extérieur de la canule toutes les 30 s a contribué à maximiser la colique zone exposée à la lumière du laser. Ce qui est important, une canule avec une valeur élevée de NA (NA = 0,5) a été utilisé pour générer un large cône de lumière dans le côlon.
Ce protocole a été normalisé pour nouveau-né (jour 0 - 2) PhAMexcisés chiots. Étant donné les changements dans le contenu et la longueur du côlon à l’âge des souris, la technique devra être optimisé en conséquence lors de l’utilisation de chiots plus âgés. Principalement, les modifications de la durée totale de la photoconversion et la longueur de l’insertion de la canule de fibre optique sera nécessaires.
Cette approche pour comprendre le comportement migratoire des cellules dans le côlon est facilitée par l’analyse en cytométrie en flux. Multiparamétriques cytométrie peut encore servir à identifier et le phénotype des cellules immunitaires migrants tape dans le CD45+ sous-ensemble de cellules. Les cellules Dendra2-r+ peuvent également être triés par FACS pour des applications en aval comme gene expression profiling ou protéomique analyses. Alors qu’il est dirigé vers la compréhension des sous-ensembles de cellules hématopoïétiques dans le côlon dans cette étude, la méthode peut être adaptée afin d’étudier la migration cellulaire provenant de sites de tissus supplémentaires y compris le cerveau et la peau.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nitya Jain a été soutenu par une bourse de Transition de carrière de NIH/NIAID 1K22AI116661-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser | |||
| Light Emitting Diode (LED) | THORLABS | M405FP1 | CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 |
| LED driver | THORLABS | LEDD1B | Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 |
| Optogenetics patch cable | THORLABS | M87L01 | 1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454 |
| Fiber optic cannula | Doric lenses | MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 | 5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036 |
| Power supply | THORLABS | KPS101 | Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 |
| LG3 laser safety goggles | THORLABS | LG3 | Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 |
| Red light | Electron Microscopy Sciences | 74327-10 | 15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences |
| Intestinal cell isolation | |||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3 |
| 1X HBSS | Gibco | 14025076 | Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 |
| Calf Serum | Hyclone AZM | 197696 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 |
| DTT | Sigma | 10197777001 | CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US |
| HEPES | Gibco | 15630080 | 1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 |
| Petri dish | Corning | 353004 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F |
| 70 micron cell strainer | Falcon | 352350 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712 |
| Micro magnetic stir bar | Fisherbrand | 1451364 | Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364 |
| Magnetic stir plate | Corning Laboratory Stirrers | 440826 | https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE |
| Collagenase | Roche | 5401020001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE |
| DNase I | Sigma | 10104159001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US |
| 1X PBS | Gibco | 20012-027 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 |
| Pipet aid | Thermo Scientific | 14387165 | https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357530 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357515 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 15 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339651 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339653 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| Single cell suspension | |||
| Eppendorf tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx |
| Tissue homogenizer | Kimble | K7495400000 | Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000 |
| Homogenizer tips | Kimble | 7495210590 | Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| Antibodies | |||
| BV786 anti-mouse CD45 | BD | 564225 | Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 |
| Live/Dead | Invitrogen | L34962 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962 |
| Other | |||
| Razor blades | VWR | 55411-050 | Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades |
References
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489, 231-241 (2012).
- Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes. Journal of Immunology. 198, 590-595 (2017).
- Mathis, D., Benoist, C. Microbiota and autoimmune disease: the hosted self. Cell Host Microbe. 10, 297-301 (2011).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46, 350-363 (2017).
- Jain, N., Walker, W. A. Diet and host-microbial crosstalk in postnatal intestinal immune homeostasis. Nature Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 12, 14-25 (2015).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews in Immunology. 14, 667-685 (2014).
- Macpherson, A. J., Uhr, T. Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria. Science. 303, 1662-1665 (2004).
- Mowat, A. M. Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens. Nature Reviews in Immunology. 3, 331-341 (2003).
- Diehl, G. E., et al. Microbiota restricts trafficking of bacteria to mesenteric lymph nodes by CX(3)CR1(hi) cells. Nature. 494 (3), 116-120 (2013).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50, 833-843 (2012).
- Conway, K. L., et al. ATG5 regulates plasma cell differentiation. Autophagy. 9, 528-537 (2013).
- Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii. Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).
- Guo, X., Muite, K., Wroblewska, J., Fu, Y. X. Purification and Adoptive Transfer of Group 3 Gut Innate Lymphoid Cells. Methods in Molecular Biology. 1422, 189-196 (2016).
- Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).
