Summary
הפרוטוקול המתואר כאן משתמשת בגישה photolabeling בעכברים היילוד במיוחד לזהות תאים חיסוניים להגר מן המעי הגס לאתרים במיוחד מעיים. אסטרטגיה זו יהיה מועיל ללמוד אינטראקציות מארח-microbiome בחיים מוקדם.
Abstract
קהילות חיידקי המעית נקבעו בשלב מוקדם בחיים ולהשפיע על התפתחות תאי המערכת החיסונית ותפקוד. Microbiota neonatal חשופה להשפעות חיצוניות רבות, כולל שימוש אנטיביוטיקה, דיאטה, אשר משפיעה על הרגישות אוטואימוניות ומחלות דלקתיות. הפרעות כגון דלקת המעי המחלה (מחלת המעי הדלקתי) מאופיינים על ידי המאסיבית של תאים חיסוניים למעיים. עם זאת, תאים חיסוניים מותנה microbiota אולי בנוסף להגר מחוץ למעיים. להשפיע על תגובות חיסוניות באתרי אקסטרה מעיים. לפיכך, יש צורך לזהות ולאפיין תאים עשויים להעביר מסרים חיידקים מהמעיים לאתרים דיסטלי. כאן, אנו מתארים שיטה תווית תאים במעי הגס של עכברים היילוד ויוו המאפשרת את הזיהוי שלהם באתרי אקסטרה מעיים לאחר ההעברה.
Introduction
מערכת העיכול יונקים בנמלים מאות מינים של חיידקים הקיימים במערכת יחסים סימביוטיים עם מארח1. תאים חיסוניים נוכח הסביבה המקומית שבה התרחשה לאכוף שוחר שלום עם החיידקים האלה ולהקים מחסום הגנה מפני פלישות הפתוגן. לפיכך, דו-כיוונית אינטראקציות בין תאים חיסוניים את microbiota הם קריטיים להקים קהילה commensal אשר מחנך את מערכת החיסון של הפונדקאי ומגדיר את סף תגובתיות מערכת החיסון פתוגנים. שינויים בשירותים מיקרוביאלי, או dysbiosis, להפריע את המערכת החיסונית הומאוסטזיס ואת perturb מעגלים רגולטוריות לרסן דלקות מעיים המוביל בתיווך החיסון למחלות כמו סוכרת מסוג 1, מחלת המעי הדלקתי2,3 .
תקופת מיד לאחר הלידה הוא חלון התפתחותי ייחודי שבמהלכו הקהילות מיקרוביאלית מעיים להתחיל להקים בו זמנית את מערכת החיסון מבשילה4. Microbiota לאחר הלידה אינה יציבה, עם משמרות הרכב הקהילה המתרחשים באופן טבעי, לעתים קרובות5. תאים חיסוניים המקיימים אינטראקציה עם microbiota שוכנים שני אנטומי מקומות נפרדים במעי - את פרופריה. מוסקולריס ו אפיתל המעי6. סוגים רבים של תאים חיסוניים נמצאים המעי, כולל לימפוציטים (כגון תאי T, תאים B ומולדת בתאי הלימפה) כמו גם התאים מיאלואידית (הכוללות תאים דנדריטים, ומונוציטים ו מקרופאגים). תאים אלה, ידוע גם בתאי hematopoietic, לבצע מספר רב של פונקציות לשמר את מחסום המעי ולשמור הומאוסטזיס.
בנוסף פונקציות התקינה שלהם באתרים מעיים, תאי המערכת החיסונית של רירית עשוי גם להעביר מסרים מיקרוביאלי לאתרים מעיים במיוחד כדי לווסת את החסינות מערכתית-7,-8,-9. זהו אזור גידול מחקר מעניין והוא מדגיש את הצורך שיטות לזהות תאים חיסוניים נודדים מתוך הרקמות מעיים על מנת לחקור את תפקידם. פרוטוקול דיווח כאן מנצל דגם העכבר זמינים מסחרית שבה החלבון הניאון photoconvertible הוא מנוצל לתאים תווית. פאםטוחנות עכברים מביעים ubiquitously של חלבון פלואורסצנטי ירוק Dendra2 זה בלתי הפיך נכנס למצב פלואורסצנטי אדום על הפעלה על ידי אולטרה סגול (UV) אור10. באמצעות הצינורית אופטיים סיבים כדי לספק אור 405 ננומטר לתוך המעי הגס של עכברים היילוד, נדגים כי ניתן למצוא תאים hematopoietic photoconverted, אשר מקורו או transited דרך המעי הגס הטחול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו עם האישור של ובציות על טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) בבית החולים הכללי במסצ'וסטס.
התראה: פרוטוקול זה כרוכה בשימוש של class 3b לייזר (LG3). משקפי בטיחות לייזר LG3 תמיד חייב לשמש בעת הפעלת הלייזר הזה. חייב להיות במעקב הנחיות בטיחות והדרכה המתאימים כדי למנוע את הסיכון לפציעות.
1. עיצוב והרכבה של לייזר
- לחבר את דיודות פולטות אור (LED) (405 ננומטר, 19.3 mW, אמא 1400, מצמידים סיבים) LED הנהג באמצעות הכבל המחבר של 4 פינים M8 המגיע מחובר ה-LED. בזהירות להדק את הבורג כדי להדק את הקשר.
- לפני חיבור כבל תיקון ה optogenetics ה-LED, להחזיק את המחבר פתיחה של ה-LED עד האור כדי להבטיח שם הביתור לא נראה לעין. תנשוף על החור כדי למנוע כל הפרעה במידת הצורך, הכנס את כבל תיקון optogenetics לתוך הפתח.
- לחבר את הצינורית סיבים אופטיים הכבל תיקון optogenetics על-ידי הוספת את הצינורית אחד מהקצוות של השרוול המחבר. לצרף את הקצה השני של השרוול מחבר כבל תיקון. מספיק ללחוץ כדי לאבטח את הקשר אך הקפד לא לכופף או לפרוץ את סיב אופטי הצינורית.
הערה: הצינורית סיב אופטי סיבים שביר הוא מכוסה את המכסה המגן בכל פעם הלייזר אינו בשימוש. - הגדר את הנהג LED למצב (CW) רציף wave עם הידית התאמה רציפה-0 והגבול הנוכחי מוגדר כ- 1.2 א
2. Photoconversion של תאים במעי הגס
הערה: זכר ונקבה עכברים נחשפו intracolonic 405 ננומטר אור 1-2 ימים לאחר הלידה שלהם, הוקרבו לפני שבוע 1 של גיל.
- לאבטח ממיקום כהה עם גישה לשקע חשמל. הנהג LED מתחברים לשקע.
הערה: הליך זה מבוצע באור לבן מינימלית כמו חשיפה ממושכת של העכברים תאורת עלול לגרום photoconversion לא רצויים של תאים. אור אדום משמש כחלופה.
התראה: השלב הבא כרוכה בשימוש של חיה הרדמה. הממשל של ההרדמה מתבצעת בשכונה Class II או באמצעות מערכת הניקוי המתאים אחרת. שאיפת ההרדמה עלול לגרום סחרחורת, נמנום או אפילו חוסר הכרה. - עזים ומתנגד העכבר על ידי חשיפה לאיזופלוריין 4-5% 100% O2 בתיבת אינדוקציה. לאמת עומק נאותה של הרדמה על ידי בחוזקה צובט כפה האחוריות (ללא תגובה). לשמור על הרדמה באמצעות קונוס האף כ 2% איזופלוריין. למנוע חשיפה המטפל איזופלוריין על ידי שימוש של המנוע המתאים או התקן הניקוי הרדמה.
- מיקום העכבר anesthetized לחשיפה intracolonic באמצעות 1 יד על עורפה האחורי של העכבר בעדינות עם האגודל והאצבע. . תהפוך את העכבר כדי לחשוף את הבטן שחרר את אחיזת אם העכבר מתחיל. לאבד את צבעו ורוד או אם קצב הנשימות שלה מתחיל להאט. אבטח את הזנב של העכבר בין כביש הטבעת של האצבעות.
- עם היד השנייה, להסיר את המכסה המגן הצינורית. תוך שמירה על ציר הארוך של הצינורית במקביל קו האמצע של העכבר, הכנס בעדינות את הצינורית סיבים אופטיים דרך פי הטבעת לתוך המעי הגס כך כל 5 מ מ של סיבים אופטיים הם בתוך העכבר.
הערה: הליך זה מתבצע לאט ובזהירות, לא כדי לנקב את הקיר חוקן. דקה נענוע ומתפתל של הצינורית עזרי קידום לתוך המעי הגס. - דון את משקפי בטיחות ולהגדיל את הלייזר הנוכחי לערך המרבי (כל הדרך עם כיוון השעון). לאשר הנוכחות של אור UV על ידי הסתכלות על הבטן שקוף של העכבר.
הערה: משקפי בטיחות לייזר LG3 באופן דרמטי להפחית הניראות. יש לסייע עמית (ללבוש ציוד מגן) עוטה את משקפי המגן, הפעלת הלייזר. - לחשוף את המעי הגס כדי אור לייזר עבור סכום כולל של 2 דק להחלפה הצינורית כ- 1 מ מ לכל 30 s כדי למקסם את האזור luminal חשוף לאור. בסוף 2 דקות, כבה את הלייזר.
- אט-אט להסיר את הצינורית של העכבר. לאחר התאוששות מהרדמה בכלוב חמים ריק, להחזיר את העכבר לכלוב הביתה.
3. בידוד של לימפוציטים מעיים
- להכנת 1 ליטר של ההאנק פתרון מאוזן מלח/עגל סרום (HBSS/CS) המאגר, 200 מ ל רצועת אפיתל המאגר, 500 מ"ל של שטיפת מדיה ו- 200 מ ל חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA)-ללא שטיפת המדיה.
הערה: אמצעי האחסון ריאגנט מחושבות עבור גודל דגימה של 9.- להפוך את המאגר HBSS/מדעי המחשב (HBSS; 5% CS) על-ידי הוספת 50 מ של CS עד 950 מ"ל של HBSS. אחסן אותו בקרח.
- הכנת המאגר רצועת אפיתל [HBSS CS 5% 1 מ dithiothreitol (DTT); 5 מ מ EDTA; 15 מ מ- 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazine-1-ethanesulfonic-חומצה (HEPES) (pH 7.2-7.5)] על-ידי הוספת 10 מ"ל של CS, 200 µL של 1 מ' DTT, 2 מ של EDTA 0.5 M ו- 3 מ של 1 מ' HEPES מאגר 185 מ של HBSS. מקום המאגר רצועת אפיתל באמבט מים 37 º C.
- להפוך את המדיה לשטוף (HBSS; 1% CS 1 מ"מ EDTA) על-ידי הוספת 5 מ ל CS 1 מ"ל של 0.5 M EDTA 494 מ של HBSS. אחסן אותו בטמפרטורת החדר.
- להכין ללא EDTA שטיפת המדיה (15 מ מ HEPES; HBSS; 1% CS) על-ידי הוספת 2 מ"ל של CS ו- 3 מ"ל של 1 מ' HEPES 195 מ של HBSS. אחסן אותו בטמפרטורת החדר.
- להפוך את מאגר FACS [1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) (ה-pH = 7.2); CS 2%] על-ידי הוספת 10 מ"ל של CS 490 מ של PBS. אחסן אותו בקרח.
- להכין את המאכל אוסף רקמה על-ידי הצבת מסננת תא מיקרומטר 70 בתוך לצלחת תרבות 60 x 10 מ מ. להוסיף 10 מ ל מאגר HBSS/מדעי המחשב (HBSS; מאגר CS 5% שבוצעו בשלב 3.1.1 ומאוחסנים על קרח) לצלחת ומניחים אותו על הקרח.
- המתת חסד את העכבר באמצעות מנת יתר של איזופלוריין בשאיפה באמצעות ניקוי המתאים של הרדמה (כ 3 דקות חשיפה > איזופלוריין 4% באוויר חדר או ב- 100% O2). לאחר הפסקת לכאורה של נשימה, רפלקס תנועה, לוודא העדר כאב עמוק על-ידי בחוזקה צובט כפה האחוריות (באמצעות מלקחיים מומלץ). ודא המתת החסד באמצעות עריפת ראש באמצעות זוג מספריים כירורגיים או תער חדש.
הערה: נקע בצוואר הרחם לא מומלץ בשלב זה עקב גודל גיל של החיה. שיטות אלה תואמים ההנחיות AVMA 2013 על המתת חסד ואושרו על-ידי IACUC MGH. - הקציר המעי הגס באמצעות מלקחיים נקי ומספריים כדי לפתוח את הבטן. משקפים את המעיים לצד 1 של הבטן של העכבר כדי לחשוף את המעי הגס. להסיר את כל המעי הגס על ידי הראשון transecting זה רק הדיסטלי (לכיוון פי הטבעת) כדי המעי. לאחר מכן, בזמן אוחז בחוזקה המעי הגס עם מלקחיים, להשתמש במספריים לחתוך דרך השופכה אל החלחולת. חותכים את המעי הגס כמו קרוב לפי הטבעת ככל האפשר. הקציר הטחול לאחר הסרת המעי הגס (ראה שלבים 4.1-4.2 להלן).
הערה: בזמן פרוטוקול photoconversion רק מטרות ~ 25% של המעי הגס של היילוד (5 מ מ הצינורית סיבים אופטיים), המעי הגס כולו האיסוף כדי לסייע בבידוד התא. - ניקוי המעי הגס באמצעות מלקחיים כדי לדחוף את תוכן המעי הגס, על גבי מגבת נייר יבש. Homogenize הרקמה באמצעות סכיני קוצצים המעי הגס לתוך עיסה על השער של צלחת תרבות ואז להעביר את הדבק הזה מסננת תאים בצלוחית הפטרי.
- להוסיף פס מגנטי זמן מערבבים נקי 8 מ"מ ל מסננת ולמקם את המנה על צלחת 9-מיקום פגים. להגדיר את מהירות בר מגנטי מערבבים עד 800 סל ד, דגירה את התאים עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. לבטל את המאגר וחזור בכביסה באמצעות 10 מ"ל של HBSS/CS (את HBSS; מאגר CS 5% שבוצעו בשלב 3.1.1 ומאוחסנים על הקרח). לבטל את המאגר במשרד בסוף לשטוף.
- מביצועם בתאי אפיתל על-ידי הוספת 10 מ"ל של מאגר prewarmed רצועת אפיתל (HBSS את CS 5% 1 מ"מ DTT; 5 מ מ EDTA; 15 מ מ HEPES [pH 7.2-7.5] מאגר שבוצעו בשלב 3.1.2 ומאוחסנים באמבט מים 37 ° C) כדי מסננת התא ומערבבים במהירות של 800 סל ד למשך 30 דקות ב- 3 החממה 7 ° C. בסוף הדגירה, להעביר את המאגר המועשר השבר אפיתל אל צינור נקי 15 מ"ל.
הערה: אפיתל ותאים המשויך (תאי אפיתל המעי ו לימפוציטים אפיתל המעי) משתחררים לתוך המאגר, בעוד התאים שלמה פרופריה. מוסקולריס להישאר על מסננת התא במהלך שלב זה11.- Centrifuge מועשר מעיים אפיתל השבר (IELs)-700 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל של מאגר FACS. לאחסן אותו על הקרח לשימוש בשלב 3.15.
- לשטוף את השבר פרופריה. מוסקולריס בתוך מסננת התא 2 x עם HBSS/מדעי המחשב. כדי לעשות זאת, להוסיף 10 מ של פתרון HBSS/מדעי המחשב (HBSS; 5% CS מאגר שבוצע בשלב 3.1.1 שאוחסן בקרח) מסננת תא ומערבבים אותו ב- 800 סל ד במשך 5 דקות בתוך חממה 37 ° C. לבטל את המאגר לשטוף אחרי זה.
- לשטוף את הדגימה 2 x בתקשורת לשטוף. להוסיף 10 מ של שטיפת המדיה (HBSS; 1% CS 1 מ"מ EDTA מאגר שבוצעו בשלב 3.1.3 ומאוחסנים בטמפרטורת החדר) מסננת תא ומערבבים אותו ב- 800 סל ד למשך 15 דקות חממה 37 ° C. לבטל את המאגר לשטוף אחרי זה.
- לאחר השימוש בתקשורת לשטוף, לאחסן אותו על הקרח לשימוש בשלב 3.14.
- לשטוף את הדגימה 2 x עם HBSS/מדעי המחשב להוסיף 10 מ ל מאגר HBSS/מדעי המחשב (HBSS; 5% CS מאגר שבוצעו בשלב 3.1.1 שאוחסן בקרח) מסננת תא ולבחוש אותו ב 800 סל"ד למשך 5 דקות בתוך חממה 37 ° C. לבטל את המאגר לשטוף אחרי זה.
- דגירה הרקמה במאגר שטיפה נטולי EDTA. להוסיף 10 מ ל מאגר שטיפה נטולי EDTA (HBSS; 1% CS; 15 מ מ HEPES מאגר שבוצעו בשלב 3.1.4 ומאוחסנים בטמפרטורת החדר) מסננת תא, דגירה את הצלחת. בשביל 10 דקות בטמפרטורת החדר, ללא ערבוב. לבטל את המאגר בסופו של שלב זה.
- לשטוף את הדגימה 2 x עם HBSS/מדעי המחשב ולהכין את הפתרון אנזים. להוסיף 10 מ של HBSS/CS (HBSS; 5% CS מאגר שבוצעו בשלב 3.1.1 שאוחסן בקרח) מאגר כדי מסננת התא ומערבבים אותו ב- 800 סל ד 10 דקות בתוך חממה 37 ° C. לבטל את המאגר לשטוף אחרי זה.
- להכין את הפתרון אנזים (ללא EDTA לשטוף מאגר; 0.1 מ"ג/מ"ל DNase אני; collagenase 167 מ"ג/מ"ל) בתקופת שטיפת שני: להוסיף 9 מ ג של DNase ו- 15 מ ג של collagenase lyophilized עד 90 מ"ל של EDTA ללא לשטוף את מאגר. אחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר.
- לעכל את השבר פרופריה. מוסקולריס הכלול מסננת התא כדי להשיג פרופריה. מוסקולריס לימפוציטים (LPLs). להוסיף 10 מ של הפתרון אנזים (EDTA ללא שטיפת מאגר; 0.1 מ"ג/מ"ל DNase אני; 167 מ"ג/מ"ל collagenase מאגר שבוצעו בשלב 3.12.1, בטמפרטורת החדר) על מסננת התא ולבחוש אותו ב- 800 סל ד למשך 45 דקות בחממה 37 ° C.
הערה: LPLs משתחררים אל הפתרון לאחר עיכול אנזימטי.- לאסוף את הפתרון אנזים המכילות את התאים ולסנן אותו דרך מסננת תא חדש לתוך צינור חרוטי 50 מ.
- הוסף 20 מ של כביסה קרה מדיה (את HBSS; 1% CS 1 מ"מ EDTA מאגר תוצרת בשלב 3.1.3 ומאוחסן על הקרח בשלב 3.9.1) לתאים מסוננים כדי לחסום את פעילות collagenase בפתרון אנזים. Centrifuge את הצינור ב 700 g x עבור 6 דקות בטמפרטורת החדר. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend את גלולה המכילה LPLs ב 1 מ"ל של מאגר FACS.
- לשלב את אישור IEL (מתוך שלב 3.7.1) ושברים LPL (מתוך שלב 3.14) ו תכתים אותם עם פלורסנט מצומדת נוגדנים לניתוח cytometric זרימה (ראה שלב 5).
הערה: שברים אישור IEL ו- LPL ייתכן מוכתם בנפרד אם מידע תא רצוי.
4. בידוד של לימפוציטים מן הטחול
- הכינו את הצינור איסוף על-ידי הוספת µL 500 FACS מאגר לתוך צינור microcentrifuge. לאחסן אותו על הקרח.
- לאחר הסרת המעי הגס (שלב 3.4), למסוק את הטחול כולו ולמקם אותו בצינור אוסף. אחסן את הרקמה על קרח.
- באמצעות מהמגן של רקמות חשמלי, homogenize הטחול צינור microcentrifuge עבור 1 מינימלית צנטריפוגה המדגם-g x 300 [צנטריפוגה מיקרו] עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, לשאוב את תגובת שיקוע.
- לבצע את פירוק תאי הדם האדומים על ידי resuspending לדוגמה ב- 500 µL אמוניום כלוריד-אשלגן (ACK) פירוק מאגר ליזום מוות של תאים על-ידי פירוק osmotic. לאפשר את הדגימה דגירה 1-2 דקות בטמפרטורת החדר, ואז resuspend אותו ב- µL 725 FACS המאגר.
- Centrifuge המדגם-g x 300 [צנטריפוגה מיקרו] עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, לשאוב את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר ב 500 µL מאגר FACS ולסנן אותו דרך מסננת תא 40 µm לתוך צינור microcentrifuge. להעביר את הדגימה כל צינור microcentrifuge, את הכתם עם פלורסנט מצומדת נוגדנים לניתוח cytometric זרימה (ראה שלב 5).
5. זיהוי של Dendra-r+ תאים באמצעות Flow Cytometry
- Centrifuge הדגימות LPL/אישור IEL וה טחול ב g 300 x [צנטריפוגה מיקרו] למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, לשאוב את תגובת שיקוע.
- Resuspend כדורי ב- 100 µL של נוגדן מכתים מיקס. להכין נוגדן מכתים לערבב על-ידי הוספת 1 µL של נוגדן anti-CD45 מצומדת fluorescently µL 100 FACS מאגר עבור דגימה.
הערה: חשוב titrate נוגדנים המשמש את cytometry זרימה לפני הניסוי כדי לקבוע ריכוז אופטימלי בו מחייב רוויה מתרחשת. - דגירה בדגימות במשך 35 דקות על קרח (במיקום כהה).
- Resuspend את הדגימות ב- 300 µL מאגר FACS, centrifuge אותם ב g 300 x [צנטריפוגה מיקרו] למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend את הדגימות בשנת 325 µL מאגר FACS. לנתח את הדוגמאות על cytometer זרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כבל סיבים אופטיים שימש כדי לספק אור 405 ננומטר לתוך נקודתיים של עכבריםטוחנות PhAM 2 - בן יום. בניסויים הקודמים, חשיפה של 30 נקבע לתת photoconversion מקסימלי של המעי הגס תאים עם cytotoxicity מינימלי (איור 1א'). לכן, רציפים-30 s חשיפות של חלקים שונים של המעי הגס בוצעו כמפורט בפרוטוקול. בעקבות החשיפה לייזר, העכברים היו מורדמים מיד, photoconversion של התאים נקבע. תא בודד ההכנות של רקמת מעי סה כ היו מוכתמים נוגדן anti-CD45 מצומדת פלורסנט ובוצע ניתוח cytometric זרימה לאתר photoconversion. חלבון ירוק-Dendra2 (Dendra-g) אשר יש עירור, פליטה maxima ב nm 490 ו 553 בהתאמה, ניתן להבחין בערוץ FITC, ואילו photoconverted Dendra2-אדום (Dendra-r) חלבון יש עירור, פליטה maxima nm 507, 573 בהתאמה, עשוי להתגלות בערוץ PE של cytometer זרימה. ברגע בלתי הפיך החליף לצורתו אדום, Dendra2 הוא מאוד photostable שימושי עבור יישומי מעקב לטווח ארוך.
תאים Dendra-r+ לא אותרו בעכברים unlasered (איור 1B שמאלה). עם זאת, 405 ננומטר לאור החשיפה הביא ברורים אוכלוסיות תא Dendra-r+ CD45neg והן CD45+ תא תאים (איור 1B נכון). כדי לקבוע אם פרוטוקול photoconversion שטיפת המעי הגס גרמו תיוג הרקע של תאים באתרי אקסטרה מעיים, קצרנו טחולים מ לאחרונה photoconverted עכברים (T = 0), לבדיקה עבור Dendra-r+ תאים על-ידי cytometry זרימה. אף תא Dendra-r+ התגלו CD45שלילי או CD45+ תא תאים (איור 1C), רומז כי קרן הלייזר אינטרה-חוקן שלא חדרו מספיק כדי photolabel תאי הטחול. לפיכך, תאים Dendra-r+ זוהה הטחול לאחר המאפשר זמן ההעברה (T = 3d, 5d) צריך להיות שמקורם מן המעי הגס.
איור 1 : אין ויוו photoconversion של רקמת מעי. תאים של המעי הגס של הגוריםטוחנות PhAM 2 - בן יום נחשפו לאור אינטרה-חוקן 405 ננומטר ל 30 s כמתואר. את photoconversion ואת תיוג של התאים היו נחושים מיד לאחר הניתוח (T = 0) על ידי ניתוח cytometric זרימה של תא בודד ההכנות של רקמת מעי, הטחול. (א) מגרש נקודה זו הזרימה נציג cytometric מציגה את הביטוי של CD45 (x-ציר), צביעה של לצבוע חי-מת (y-ציר) בתוך תא בודד גלמי נקודתיים של שליטה ועכברים lasered. פאנלים B ו- C הם זרימת נציג cytometric נקודה מגרש שכבות המציגות את הביטוי של החלבון Dendra2-ירוק (Dendra2-g, ציר אופקי), חלבון Dendra2-אדום (Dendra2-r, אנכי ציר) בשליטה-סמויה, חשופים CD45+ (hematopoietic) CD45מינוס (שאינם hematopoietic) תאי (B) המעי הגס ופי (C) הטחול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
נתונים ניסוי טיפוסי photoconversion לזהות תאים נודדים הטחול מוצגים באיור2. Photoconversion של התאים נקודתיים של עכבריםטוחנות PhAM 2 - בן יום בוצעה כמו באיור 1. עכברים היו מורדמים 3 ו- 5 ימים לאחר החשיפה, הנוכחות של תאים Dendra-r+ הטחול נקבע על ידי cytometry זרימה. היו שם אין תאים Dendra-r+ CD45neg תא המשנה, עקבי עם הנוף כי התאיםneg CD45 הם בעיקר אפיתל והתאים מבנית של המעי. כמה CD45+ hematopoietic תאי ביטא Dendra-r, רומז כי הם היו כבר photoconverted במעי הגס, הועברו הטחול.
איור 2 : CD45+ תאים hematopoietic להגר מן המעי הגס הטחול. היילוד (יום 0 - 2) PhAMטוחנות עכברים נחשפו לאור 405 ננומטר לחלבון photoconvert Dendra2 על ידי חשיפה אינטרה-חוקן. Cytometry זרימה נציג מראים את הביטוי של החלבון Dendra2-ירוק (Dendra2-g, הציר האופקי) וחלבון Dendra2-אדום (Dendra2-r, אנכי ציר) CD45שלילי , CD45+ תאי הטחול של עכברים בת 5 ימים שלא נחשפו ו חשוף עכברים נותחו 3 ו- 5 ימים (T = 3d, 5d) לאחר photoconversion. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זיהוי ואפיון של תאים אינטראקציה עם והם מושפעים את microbiota במעי הגס הם חשובים, צריך להקל על ההבנה של איך מועבר מידע microenvironment הרירית לשאר חלקי הגוף. שיטה אחת ללמוד נדידת תאים הקשורים הבטן דורש את הבידוד של תאים הקשורים בטן ואחריו העברה המאמצת לתוך עכברים הנמען כדי לקבוע דפוסי רקמה-יונת שלהן לתפקד12,13. גישה זו היא מוגבלת, שכן רק סוגי תאים מסוים הועברו מהמינה. יתר על כן, חפצים הנובע בידודו של תאים מן הרקמות ואת תהליך טיהור שעלולות להפריע ויוו תהליך הנדידה. לאחרונה, פרוטוקול photoconversion אנדוסקופי לסמן תאים מעיים באמצעות עכברים קאךה היה דווח על14. במחקר זה נמצא רחבה בבני אדם וחריגה מן המעי של עכברים בוגרים.
הדו ח שלנו מתאר שיטה תווית תאים במעי הגס של עכברים היילוד ולעקוב להגירתם מעיים במיוחד לאתרים כמו הטחול. העכברטוחנות PhAM מבטא ubiquitously photoconvertible ירוק ניאון Dendra2 חלבון זה בלתי הפיך נכנס למצב פלואורסצנטי אדום על ההפעלה שלה על ידי אור UV. חשיפת נקודתיים של עכברים היילוד 405 ננומטר אור המסומנות בשני CD45+ hematopoietic CD45neg תאים שאינם hematopoietic. CD45+Dendra2-אדום+ תאים אותרו הטחול 3 עד 5 ימים לאחר photoconversion, המציין את ההעברה במיוחד מעיים של תאים hematopoietic.
השלב הגבלת קצב עבור assay הזה הוא השבר של אזור המעי הגס נחשף לאור 405 ננומטר. את השבריריות של המעי הגס היילוד ואת נוכחותם של שרפרף, אמנם מינימלית בגיל הזה, להגביל את משך הצינורית סיב אופטי סיבים שניתן להוסיף. בניסויים הקודמים, בצינורית יותר לא היתה אפשרות בהצלחה להוסיפה יותר מ 5 מ מ. חומרי סיכה היית נמנע בשל הסכנה של השבירה האור משתנה של קרן הלייזר. תנועת הצינורית החוצה כל 30 s עזר להגדיל את אזור המעי הגס נחשפים אור הלייזר. חשוב, בצינורית עם ערך נה גדול (NA = 0.5) שימש ליצירת קונוס רחב של אור במעי הגס.
פרוטוקול זה יש כבר סטנדרטית עבור היילוד (יום 0 - 2) PhAMטוחנות הגורים. לאור השינויים תוכן ואורך של המעי הגס עם הגיל של העכברים, הטכניקה יצטרך להיות ממוטבים בהתאם בעת שימוש גורים בוגרים. בעיקר, שינויים משך הפעילות הכולל את photoconversion ואת האורך של החדרת הצינורית סיבים אופטיים יהיה צורך.
גישה זו להבנת ההתנהגות הנדידה של תאים במעי הגס בהנחייתם של ניתוח תזרים cytometric. Cytometry זרימה מרובה פרמטר עשוי לשמש עוד יותר כדי לזהות וסוגי פנוטיפ התא מהגרות עבודה המועסקות חיסוניים בתוך CD45+ תא משנה. תאים Dendra2-r+ אולי גם ניתן למיין על ידי FACS ליישומים במורד הזרם כגון ניתוחים פרופיל או פרוטאומיקס של ביטוי גנים. בעוד ביים להבנה של קבוצות משנה תא hematopoietic במעי הגס במחקר זה, השיטה שעשוי להיות מותאם ללמוד ההעברה הסלולר מאתרים נוספים רקמת המוח כולל את העור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
Nitya Jain נתמכה על ידי NIH/NIAID הקריירה המעבר פרס 1K22AI116661-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser | |||
| Light Emitting Diode (LED) | THORLABS | M405FP1 | CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 |
| LED driver | THORLABS | LEDD1B | Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 |
| Optogenetics patch cable | THORLABS | M87L01 | 1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454 |
| Fiber optic cannula | Doric lenses | MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 | 5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036 |
| Power supply | THORLABS | KPS101 | Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 |
| LG3 laser safety goggles | THORLABS | LG3 | Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 |
| Red light | Electron Microscopy Sciences | 74327-10 | 15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences |
| Intestinal cell isolation | |||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3 |
| 1X HBSS | Gibco | 14025076 | Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 |
| Calf Serum | Hyclone AZM | 197696 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 |
| DTT | Sigma | 10197777001 | CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US |
| HEPES | Gibco | 15630080 | 1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 |
| Petri dish | Corning | 353004 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F |
| 70 micron cell strainer | Falcon | 352350 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712 |
| Micro magnetic stir bar | Fisherbrand | 1451364 | Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364 |
| Magnetic stir plate | Corning Laboratory Stirrers | 440826 | https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE |
| Collagenase | Roche | 5401020001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE |
| DNase I | Sigma | 10104159001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US |
| 1X PBS | Gibco | 20012-027 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 |
| Pipet aid | Thermo Scientific | 14387165 | https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357530 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357515 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 15 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339651 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339653 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| Single cell suspension | |||
| Eppendorf tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx |
| Tissue homogenizer | Kimble | K7495400000 | Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000 |
| Homogenizer tips | Kimble | 7495210590 | Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| Antibodies | |||
| BV786 anti-mouse CD45 | BD | 564225 | Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 |
| Live/Dead | Invitrogen | L34962 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962 |
| Other | |||
| Razor blades | VWR | 55411-050 | Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades |
References
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489, 231-241 (2012).
- Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes. Journal of Immunology. 198, 590-595 (2017).
- Mathis, D., Benoist, C. Microbiota and autoimmune disease: the hosted self. Cell Host Microbe. 10, 297-301 (2011).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46, 350-363 (2017).
- Jain, N., Walker, W. A. Diet and host-microbial crosstalk in postnatal intestinal immune homeostasis. Nature Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 12, 14-25 (2015).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews in Immunology. 14, 667-685 (2014).
- Macpherson, A. J., Uhr, T. Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria. Science. 303, 1662-1665 (2004).
- Mowat, A. M. Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens. Nature Reviews in Immunology. 3, 331-341 (2003).
- Diehl, G. E., et al. Microbiota restricts trafficking of bacteria to mesenteric lymph nodes by CX(3)CR1(hi) cells. Nature. 494 (3), 116-120 (2013).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50, 833-843 (2012).
- Conway, K. L., et al. ATG5 regulates plasma cell differentiation. Autophagy. 9, 528-537 (2013).
- Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii. Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).
- Guo, X., Muite, K., Wroblewska, J., Fu, Y. X. Purification and Adoptive Transfer of Group 3 Gut Innate Lymphoid Cells. Methods in Molecular Biology. 1422, 189-196 (2016).
- Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).
