Summary
Burada açıklanan protokol photolabeling yaklaşım yeni doğan farelerde özellikle kolon ekstra bağırsak sitelere göç bağışıklık hücreleri tanımlamak için kullanır. Bu stratejinin ana bilgisayar-microbiome erken hayat etkileşimlerde eğitim yararlı olacaktır.
Abstract
Enterik bakteri toplulukları erken yaşta kurulur ve bağışıklık hücre gelişimi ve işlevini etkiler. Yenidoğan microbiota antibiyotik kullanımı ve diyet, otoimmün ve inflamatuvar hastalıklara yatkınlık etkileri de dahil olmak üzere çok sayıda dış etkilere maruz kalabilir. Bozuklukları inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) gibi bağırsak için bağışıklık hücreleri büyük akını ile karakterizedir. Ancak, bağışıklık hücreleri tarafından microbiota şartına ayrıca bağışıklık yanıtı ekstra bağırsak sitelerdeki etkilemek için bağırsaklar dışarı göç. Böylece, tanımlamak ve bağırsak mikrobiyal iletilerden distal sitelere taşıyabilir hücreleri ayırdetmek için gerek yoktur. Burada, ekstra bağırsak sitelerde kimlik geçişten sonra sağlar yeni doğan fareler vivo içinde kolon etiket hücrelere bir yöntem açıklanmaktadır.
Introduction
Memeli gastrointestinal sistem ana makine1ile simbiyotik bir ilişki bulunmaktadır bakteri türleri yüzlerce liman. Yerel ortamda mevcut bağışıklık hücreleri ile bu mikropların barışçıl kullanımını zorlayın ve patojen akınları karşı koruyucu bir bariyer oluşturmak. Böylece, bağışıklık hücreleri ve microbiota arasındaki çift yönlü etkileşimler ana bağışıklık sistemi eğitir ve patojenler için bağışıklık reaktivite eşiğini ayarlar komensal bir topluluk kurmak için kritik öneme sahiptir. Mikrobiyal kompozisyon veya dysbiosis, can değişimler bağışıklık homeostazı rahatsız ve huzursuz bağırsak iltihapları2,3 tip 1 diyabet ve IBD gibi hastalıklar immün aracılı önde gelen dizginlemek düzenleyici devreler .
Sonra hemen Doğum sırasında aynı zamanda bağışıklık sistemini kurmak bağırsak mikrobiyal topluluklar başlar benzersiz bir gelişimsel pencere dönemi4olgunlaşır. Postnatal microbiota istikrarlı, vardiyalar halinde doğal olarak meydana gelen topluluk kompozisyon ve sık sık5ile değil. İki farklı anatomik konumda bağırsak - lamina propria ve bağırsak epitel6microbiota ile etkileşim bağışıklık hücreleri bulunur. Çeşitli tiplerde bağışıklık hücreleri lenfositler (T hücreleri, B hücreleri ve doğuştan gelen lenfoid hücre gibi) (hangi katmak dendritik hücreler, monosit ve makrofajlar) myeloid hücrelerin yanı sıra dahil bağırsak, mevcut. Bu hücreler, olarak da bilinen hematopoetik hücreler, çok sayıda bağırsak bariyer korumak ve homeostazı korumak işlevler gerçekleştirin.
Bağırsak siteleri kendi düzenleyici işlevlerine ek olarak, mukoza bağışıklık hücreleri sistemik dokunulmazlık7,8,9düzenleyen mikrobiyal iletileri ekstra bağırsak sitelere de taşıyabilir. Bu araştırma ilgi alanıdır ve onların işlevini prob için bağırsak dokusu dışında geçirmek bağışıklık hücreleri tanımlamak yöntemleri ihtiyacını vurgular. Rapor burada protokol photoconvertible floresan protein etiket hücrelere istismar edilir bir ticari olarak mevcut fare modeli kullanır. PhAMeksize fareler ubiquitously ultraviyole (UV) ışık10tarafından geri dönüşümsüz etkinleştirme üzerine kırmızı floresans için açık yeşil bir floresan Dendra2 protein hızlı. Yeni doğan farelerin kolon 405 nm ışık sağlamak için fiber optik kanül kullanarak, kaynaklı veya kolon aktarıldığı photoconverted hematopoetik hücreler, dalak bulunabilir göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan yordamları ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Massachusetts General Hospital onayı ile gerçekleştirilmiştir.
Dikkat: Bu protokol bir sınıf 3b lazer (LG3) kullanımını gerektirir. LG3 lazer koruyucu gözlük her zaman bu lazer çalışırken kullanılması gerekir. Yaralanma riskini önlemek için uygun eğitim ve güvenlik yönergelere uyulmalıdır.
1. tasarım ve lazer montajı
- Işık yayan diyot (LED) bağlanmak (405 nm, 19,3 mW, 1400 mA, fiber birleştiğinde) LED sürücü üzerinden için LED için gelir 4 pinli M8 bağlantı kablosu bağlı. Dikkatli bir şekilde bağlantı tutturmak için sıkıştırın.
- Optogenetics bağlantı kablosu için LED eklemeden önce bağlayıcı tutun LED kadar açılış orada emin olmak için ışık görünür hiçbir engel vardır. Eğer gerekli herhangi bir engelleri ortadan kaldırmak ve optogenetics bağlantı kablosu ataşını delik üfle.
- Fiber optik kanül kanül bağlayıcı kol bir ucunu ekleyerek optogenetics bağlantı kablosu bağlayın. Bağlayıcı kol diğer ucunu bağlantı kablosu takın. Güvenli bağlantı ama değil viraj veya fiber optik kanül kırmak için dikkatli olmak için yeterli basınç uygulayın.
Not: her ne zaman lazer kullanmak değildir kırılgan fiber optik kanül koruyucu başlığı ile kaplıdır. - LED sürücü 0 ile 1.2 A. ayarlanmış geçerli sınırı sürekli ayar düğmesi ile sürekli dalga (CW) moduna ayarla
2. Photoconversion iki nokta üst üste hücrelerinin
Not: Erkek ve dişi fareler intracolonic 405 nm ışık için 1-2 gün sonra kendi Doğum maruz kaldılar ve yaş 1 hafta önce kurban edildi.
- Karanlık bir yerde bir elektrik prizine bir erişim ile güvenli. LED sürücü sokunuz.
Not: ortam ışığı farelerin uzun bir pozlama istenmeyen bir photoconversion hücrelerinin neden olabilir gibi bu yordamı en az beyaz ışık içinde gerçekleştirilir. Kırmızı ışık alternatif olarak kullanılır.
Dikkat: Aşağıdaki adımı bir hayvan anestezik kullanımını gerektirir. Anestezi Yönetimi Sınıf II başlıklı veya başka bir uygun atma sistemi kullanılarak gerçekleşir. İnhalasyon anestezi baş dönmesi, uyuşukluk veya hatta bilinç kaybı neden olabilir. - 4-%5 isoflurane % 100 O2 bir indüksiyon kutusunda maruz fare anestezi. Uygun anestezi derinliği sıkıca arka pençe (cevap yok) pinching tarafından doğrulayın. Anestezi burun konisi, yaklaşık % 2 isoflurane üzerinden korumak. İşleyici isoflurane bir uygun başlık veya anestezik atma aygıt kullanımı ile etkilenmemek.
- İntracolonic maruz imzalat fare scruff fare arkası için 1 el yavaşça işaret parmağı ve başparmak ile kullanarak yerleştirin. Karın ortaya çıkarmak için fareyi çevirin. Fare pembe rengini kaybetmeye başlar yoksa onun solunum hızı yavaş başlar kavrama gevşetin. Fare kuyruğu halka ve küçük parmaklar arasındaki güvenli.
- Diğer elini de koruyucu başlığı kanül kaldırın. Süre paraca desteklemek fare orta hat için paralel kanül uzun ekseninin hafifçe yerleştirin fiber optik kanül anüs yoluyla kolon böylece tüm 5 mm Fiber optik fare içinde.
Not: Bu yordam yavaş yavaş ve kolon duvar sorgulamaktı değil özenle yapılır. Kıpır kıpır ve kanül büküm dakika içine kolon ilerleme yardımcı olur. - Koruyucu gözlük don ve maksimum değerine (sonuna kadar saat yönünde) geçerli lazer artırmak. UV ışık varlığı fare karın yarı saydam bakarak onaylayın.
Not: LG3 lazer koruyucu gözlük görünürlüğünü önemli ölçüde azaltır. Var bir meslektaşım (giyiyor koruyucu donanım) gözlük donning ve yardımcı üzerine lazer dönüm. - 2 dk. geri kanül yaklaşık 1 mm toplam lazer ışığı kolona her 30 maruz ışığa maruz luminal alanı en üst düzeye çıkarmak için s. Lazer 2 dk sonunda devre dışı.
- Yavaş yavaş kanül fare kaldırın. Anestezi boş bir sıcak kafeste üzerinden geri aldıktan sonra fare ev kafese geri.
3. yalıtım bağırsak lenfositler
- Hank'in dengeli tuz çözüm/buzağı serum (HBSS/CS) arabelleği 1 L, epitel şerit arabellek 200 mL, 500 mL yıkama medya ve ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) 200 mL hazırlamak-ücretsiz yıkama medya.
Not: Reaktif birimleri 9 Örneklem büyüklüğü için hesaplanır.- HBSS/CS tampon (HBSS; %5 CS) HBSS için 950 mL 50 mL CS ekleyerek getirin. Onu buza saklayın.
- [HBSS; %5 CS; 1 mM dithiothreitol (DTT); 5 mM EDTA; 15 mM 4-(2-Hydroxyethyl) piperazin-1-ethanesulfonic asit (HEPES) (pH 7.2-7,5)] epitel şerit arabellek için 185 mL CS, 1 M DTT, 0,5 M EDTA 2 mL ve 1 M HEPES tampon 3 mL 200 µL 10 mL ekleyerek hazırlamak HBSS. 37 ° C su banyosu epitel şerit arabellekte bir yer.
- (HBSS; % 1 CS; 1 mM EDTA) yıkama medya CS 5 mL ve 1 mL 0.5 M EDTA HBSS 494 mL için ekleyerek getirin. Oda sıcaklığında saklayın.
- EDTA içermeyen yıkama medya (HBSS; % 1 CS; 15 mM HEPES) 195 mL HBSS 2 mL CS ve 3 mL 1 m HEPES ekleyerek hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın.
- Bir FACS tampon yapmak [1 fosfat tamponlu tuz (PBS) x (pH 7.2 =); % 2 CS] CS 10 mL PBS için 490 mL ekleyerek. Onu buza saklayın.
- Doku toplama yemek bir 70 µm hücre süzgeç bir 60 x 10 mm Kültür çanak koyarak hazırlamak. Yemek için HBSS/CS tampon (HBSS; 3.1.1. adımda yapılan ve buz üzerinde depolanan % 5 CS arabellek) 10 mL ekleyin ve buz üzerinde yerleştirin.
- Fare ile inhale isoflurane uygun anestezi atma işlemini kullanarak aşırı dozda ötenazi (yaklaşık 3 dk Riziko > % 4 isoflurane Oda hava veya %100 O2). Sonra belirgin nefes kesilmesi ve refleks hareketi, derin ağrı yokluğu sıkıca bir arka pençe pinching tarafından doğrulayın (forseps kullanarak önerilir). Ötenazi ile cerrahi makas ya da yeni bir usturanın kullanarak bir işten çıkarma emin olun.
Not: Servikal yerinden çıkması boyutu ve hayvan yaş nedeniyle bu adım için tavsiye edilmez. Bu yöntemler üzerinde ötenazi 2013 travma yönergeleri ile tutarlı olduğundan ve MGH IACUC tarafından onaylandı. - Karın açmak için temiz forseps ve makas kullanarak kolon hasat. Bağırsak kolon ortaya çıkarmak için fare karın 1 tarafına yansıtır. İlk o (doğru anüs) sadece distal transecting tarafından tüm kolon kaldırmak çekum için. Sonra iki nokta üst üste forseps ile sıkıca açgözlü iken, makas üretra Rectuma kesmek için kullanın. Anüs mümkün olduğunca yakın olarak kolon kesme. Dalak Kolonu çıkardıktan sonra hasat (bkz: 4.1-4.2 aşağıdaki adımlar).
Not: photoconversion iletişim kuralı yalnızca ~ % 25 yenidoğan'ın kolon (fiber optik kanül 5 mm) hedefleyen iken, tüm kolon hücre yalıtım modunda yardım için hasat edilir. - İki nokta üst üste iki nokta üst üste ve kuru kağıt havlu üzerine içeriğini itmek için forseps kullanarak temizleyin. Doku ince bir kültür yemek kapağında bir hamur içine iki nokta üst üste doğrayın ve bu hamur hücre süzgeç Petri kabına aktarmak için jilet kullanarak lunaparkçı.
- Temiz 8 mm uzun manyetik heyecan çubuğu için süzgeç ekleme ve çanak 9-pozisyon manyetik karıştırıcı tabağa yerleştirin. Manyetik heyecan bar hızını ayarlamak için 800 devir/dakika ve oda sıcaklığında 5 min için hücreleri kuluçkaya. Arabellek atın ve 10 mL HBSS/CS (HBSS; 3.1.1. adımda yapılan ve buz üzerinde depolanan % 5 CS arabellek) kullanarak yıkama yineleyin. Arabellek yıkama sonunda atmak.
- Epitel hücreleri prewarmed epitel şerit arabellek (HBSS % 5 CS 1 mM DTT; 5 mM EDTA; 3.1.2 adımda yapılan ve 37 ° C su banyosu içinde depolanmış 15 mM HEPES [pH 7.2-7,5] arabellek) 10 mL ekleyerek hücre süzgeç ayırmak ve 30 dk içinde 3 için 800 rpm'de karıştırın 7 ° C inkübatör. İnkübasyon sonunda, epitel kesir bir temiz 15 mL tüp için zenginleştirilmiş arabellek aktarın.
Not: sağlam lamina propria hücrelerde hücre süzgeç sırasında bu adım11kalırken epitel ve ilişkili hücreleri (bağırsak epitel hücreleri ve bağırsak epitel lenfositler) arabelleği serbest.- Zenginleştirilmiş Bağırsak epitel kesir (IELs) vasıl 700 x g için oda sıcaklığında 5 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant atın ve hücre Pelet FACS arabellek 1 mL resuspend. Kullanılmak üzere adım 3,15 buzda saklayın.
- 2 hücre süzgeç içinde lamina propria kesir yıkama x HBSS/CS ile. Bunu yapmak için 10 mL HBSS/CS çözeltisi (HBSS; buz üzerinde depolanan adım 3.1.1 yapıldı % 5 CS arabellek) hücre süzgeç ekleyin ve 37 ° C kuluçka 5 min için 800 rpm'de karıştırın. Arabellek her yıkama sonra atın.
- Örnek 2 yıkama yıkama medya x. Yıkama medya (HBSS; % 1 CS; adım 3.1.3 ve oda sıcaklığında depolanmış 1 mM EDTA arabellek) 10 mL hücre süzgeç ekleyin ve 15 dakika 37 ° C kuluçka 800 rpm'de karıştırın. Arabellek her yıkama sonra atın.
- Yıkama medya kullandıktan sonra adım 3.14 kullanımda buzda saklayın.
- Örnek 2 yıkama x HBSS ile/CS. 10 mL HBSS/CS tampon (HBSS; buz üzerinde depolanan 3.1.1. adımda yapılan % 5 CS arabellek) hücre süzgeç ekleyin ve 37 ° C kuluçka 5 min için 800 rpm'de karıştırın. Arabellek her yıkama sonra atın.
- EDTA içermeyen yıkama arabellek dokusunda kuluçkaya. 10 mL EDTA içermeyen yıkama arabellek (HBSS; % 1 CS; 3.1.4. adımda yapılan ve oda sıcaklığında depolanmış 15 mM HEPES tampon) hücre süzgeç ekleyin ve karıştırma olmadan oda sıcaklığında 10 dakika plaka kuluçkaya. Bu adımın sonundaki arabellek atmak.
- Örnek 2 yıkama x HBSS/CS ile ve enzim çözüm hazırlamak. HBSS/CS (HBSS; % 5 CS arabellek buz üzerinde depolanan adım 3.1.1 yapılan) 10 mL ekleyin arabellek hücre süzgeç ve 10 dk 37 ° C kuluçka için 800 rpm'de karıştırın. Arabellek her yıkama sonra atın.
- Enzim çözüm hazırlamak (EDTA içermeyen yıkama arabellek; 0.1 mg/mL DNaz ben; 167 mg/mL collagenase) ikinci yıkama süresi boyunca: 9 mg eklemek DNaz ben ve 15 mg liyofilize collagenase 90 mL EDTA ücretsiz için arabellek yıkayın. Çözüm, oda sıcaklığında saklayın.
- Lamina propria lenfositler (LPLs) elde etmek için hücre süzgeç bulunan lamina propria kesir sindirmek. Enzim çözüm 10 mL ekleyin (EDTA ücretsiz yıkama arabellek; 0.1 mg/mL DNaz ben; 3.12.1 adımda yapılan ve oda sıcaklığında depolanan 167 mg/mL collagenase arabellek) hücre süzgeç için ve 45 dk 37 ° C kuluçka için 800 rpm'de karıştırın.
Not: LPLs sonra enzimatik sindirim çözüm içine salınır.- Hücreleri içeren enzim çözüm toplamak ve 50 mL konik tüp içine yeni bir hücre süzgeç aracılığıyla filtre.
- 20 mL soğuk yıkama medya (HBSS; % 1 CS; 1 mM EDTA made ın adım 3.1.3 ve saklı 3.9.1. adımda buzda arabellek) enzim çözüm collagenase faaliyetleri engellemek için filtre uygulanmış hücreleri ekleyin. Tüp vasıl 700 x g oda sıcaklığında 6 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak ve LPLs 1 mL FACS arabellek içeren pelet resuspend.
- IEL (Kimden adım 3.7.1) ve lipoprotein LİPAZ (Kimden adım 3.14) kesirler birleştirir ve onları floresan Birleşik antikorlar akış sitometrik çözümlemesi ile leke (bkz. Adım 5).
Not: bölme bilgi isterseniz IEL ve lipoprotein LİPAZ kesirler ayrı ayrı lekeli.
4. yalıtım lenfositleri dalak üzerinden
- Toplama tüp microcentrifuge tüp içine 500 µL FACS arabelleği ekleyerek hazırlayın. Onu buza saklayın.
- İki nokta üst üste (adım 3.4) kaldırma sonra bütün dalak hasat ve toplama tüpü yerleştirin. Doku buz üstünde depolar.
- Bir elektrik doku homogenizer kullanarak, dalak yaklaşık 1 dk. santrifüj microcentrifuge tüp içinde 300 x g [mikro santrifüj] oda sıcaklığında ve aspiratı süpernatant kapalı 5 min için de örnek lunaparkçı.
- Kırmızı kan hücre lizis 500 µL amonyum klorür potasyum (ACK) lizis arabelleği hücre ölümü tarafından ozmotik lizis başlatmak için örnek resuspending tarafından gerçekleştirin. Örnek 1-2 dk oda sıcaklığında kuluçkaya ve sonra FACS arabellek 725 µL içinde resuspend izin.
- 300 x g [mikro santrifüj] oda sıcaklığında ve aspiratı süpernatant kapalı 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi. Pelet FACS arabellek 500 µL içinde resuspend ve yeni microcentrifuge tüp içine 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre. Tüm örnek için yeni bir microcentrifuge tüp aktarmak ve floresan Birleşik antikorlar akış sitometrik çözümlemesi ile leke (bkz. Adım 5).
5. Dendra-r+ hücreleri kullanarak akış sitometresi tanımlaması
- 300 x g [mikro santrifüj] oda sıcaklığında ve aspiratı süpernatant kapalı 5 min için de IEL/LPL ve dalak örnekler santrifüj kapasitesi.
- Granül mix boyama antikor 100 µL içinde resuspend. Mix 1 µL fluorescently Birleşik anti-CD45 antikor FACS arabelleği örnek başına 100 µL ekleyerek boyama antikor hazırlayın.
Not: Deneme önce akış sitometresi için en uygun konsantrasyonu belirlemek için Doygunluk bağlama oluştuğu kullanılan antikor titre önemlidir. - Örnekleri (karanlık bir konumda) buz üzerinde 35 dk için kuluçkaya.
- Örnekleri FACS arabellek 300 µL içinde resuspend ve onları vasıl 300 x g [mikro santrifüj] için oda sıcaklığında 5 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant Aspire edin ve örnekleri FACS arabellek 325 µL içinde resuspend. Akış Sitometresi örneği analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir fiber optik kablo 405 nm ışık iki nokta üst üsteeksize 2 - gün eski PhAM farelerin teslim etmek için kullanıldı. Önceki deneyler, 30 s maruz kalma en az sitotoksisite (Şekil 1A) ile iki nokta üst üste hücre maksimal photoconversion vermek tespit edilmiştir. Bu nedenle, sıralı 30 s Etkilenmeler kolon farklı kesimlerinin iletişim kuralında tanımlandığı gibi yapılmıştır. Lazer pozlama, fareler hemen euthanized ve photoconversion hücrelerin tespit edildi. Tek hücreli hazırlıklar toplam kolon doku floresan Birleşik anti-CD45 antikor ile lekeli ve akış sitometrik çözümlemesi photoconversion algılamak için gerçekleştirildi. Din Dendra2-yeşil (Dendra-g) protein uyarma ve emisyon maxima 490 ve 553 nm'de sırasıyla vardır ve ise photoconverted Dendra2-kırmızı (Dendra-k) protein uyarma ve emisyon maxima 507 ve 573 nm'de FITC kanalda tespit edilebilir sırasıyla ve akış sitometresi PE kanal algılanabilir. Bir kez geri dönüşümsüz kırmızı şekliyle değiştirmiş, Dendra2 son derece photostable olduğunu ve uzun vadeli izleme uygulamalar için kullanışlıdır.
Hiçbir Dendra-r+ hücre unlasered fareler (Şekil 1B sol) tespit edildi. Ancak, farklı Dendra-r+ hücre popülasyonlarının CD45negatif ve CD45 405 nm ışık pozlama sonuçlandı+ hücre bölmeleri (Şekil 1B sağ). Kolon photoconversion Protokolü arka plan hücre ekstra bağırsak sitelerdeki etiketleme içinde oluştuysa, biz hasat dalağı yeni photoconverted fareler gelen belirlemek için (T = 0) ve Dendra-r+ akış sitometresi tarafından hücreleri için denetlesinler. Yok Dendra-r+ hücreleri CD45negatif veya CD45 tespit edildi+ hücre içi kolon lazer ışını photolabel hücreleri dalak için yeterli nüfuz etmedi düşündüren bölmeleri (Şekil 1C). Böylece, herhangi bir Dendra-r+ hücreleri dalak içinde zaman için belgili tanımlık göç izin sonra tespit (T = 3d, 5 d) kolon kökenli olduğu.
Resim 1 : Vivo kolon dokusunun photoconversion. 2 - gün eski PhAMeksize pups üzerinden kolonun hücreler 30 içi kolon 405 nm ışığa maruz kalan açıklandığı gibi s. Photoconversion ve hücreleri etiketleme işlemden hemen sonra belirlenmiştir (T = 0) tek hücreli hazırlıklar kolon doku ve dalak akışı sitometrik analizinde tarafından. (A) Bu temsilcisi akış sitometrik nokta Arsa CD45 ifade gösterir (x-ekseni) ve canlı ölü boya boyama (y-ekseni) iki nokta üst üste gelen tek hücreli müstahzarları kontrol ve lazer fare. B ve C panelleridir temsilcisi akış sitometrik nokta Arsa bindirmeleri ifade Dendra2-yeşil protein gösterir (Dendra2-g, yatay eksenli) ve Dendra2-kırmızı protein (Dendra2-r, dikey eksenli) denetim harfi içinde ve CD45 maruz+ (hematopoetik) ve CD45negatif (hematopoetik olmayan) hücreleri (B) iki nokta üst üste ve (C) dalak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Dalak göçmen hücrelerinde tanımlamak için tipik photoconversion deney verileri Şekil 2' de gösterilmiştir. İki nokta üst üste 2 - gün eski PhAMeksize fare hücrelerinde photoconversion Şekil 1de olduğu gibi gerçekleştirildi. Fareler maruz kaldıktan sonra 3 ile 5 gün ötenazi ve dalak Dendra-r+ hücrelerinde varlığı akış sitometresi tarafından belirlendi. Yok Dendra-r+ hücrelerde CD45negatif hücre alt, CD45negatif kan hücreleri öncelikle epitel görünümüyle tutarlı ve diğer yapısal hücreler bağırsak vardı. Bazı CD45+ hematopoetik hücrelerin ifade Dendra-r, onlar photoconverted kolon olmuştu ve dalak için göç düşündüren.
Resim 2 : CD45+ hematopoetik hücrelerin göç iki nokta üst üste dalak için. Yenidoğan (0 - 2 gün) PhAMeksize fareler 405 nm ışık photoconvert Dendra2 protein içi kolon poz tarafından maruz. Dendra2-yeşil protein ifadesi temsilcisi akış sitometresi araziler göster (Dendra2-g, yatay eksenli) ve Dendra2-kırmızı protein (Dendra2-r, dikey eksenli) CD45negatif ve CD45+ dalak hücreleri buluşuyor 5-gün-yaşlı farelerin ve maruz fareler 3 ve 5 gün analiz (T = 3d, 5 d) photoconversion sonra. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kimlik ve çalışabileceği ve bağırsaktaki microbiota etkilenmiştir hücrelerin karakterizasyonu önemlidir ve mukozal microenvironment bilgilerinden vücudun geri kalanına nasıl geçirilir anlayış kolaylaştıracaktır. Gut ile ilgili hücre geçiş çalışmak için bir yöntem yalıtımı gut ilişkili hücre tarafından evlat edinen bir transfer alıcı fareler onların doku-posta desenlerini belirlemek ve12,13işlev takip gerektirir. Aktarılan belirli hücre türleri izleniyor olabilir bu yaklaşım, çok sınırlıdır. Ayrıca, hücre dokuları ve arıtma işlemi yalıtım ortaya çıkan eserler vivo içinde göç süreci engelleyebilir. Daha yakın zamanlarda, bağırsak hücreleri Kaede fare kullanarak etiketlemek için bir endoskopik photoconversion Protokolü bildirilen14yaşındaydım. Bu çalışmada bir geniş lökositlerin gelen bağırsak ve yetişkin fareler kaçakçılığı bulundu.
Bizim rapor etiket hücrelere yeni doğan farelerin kolon yöntemi açıklanır ve dalak gibi ekstra bağırsak siteleri için kendi geçiş izlemek. PhAMeksize fare ubiquitously UV ışık tarafından geri dönüşümsüz onun etkinleştirme üzerine kırmızı floresans için açık bir photoconvertible yeşil flüoresan Dendra2 protein ifade eder. İki nokta üst üste yeni doğan farelerin maruz 405 nm ışık etiketli her iki CD45+ hematopoetik ve CD45negatif olmayan hematopoetik hücreler. CD45+Dendra2-kırmızı+ hücreleri hematopoetik hücrelerin ekstra bağırsak geçişini gösteren photoconversion sonra 3-5 gün içinde dalak algılandı.
Bu tahlil için hızı sınırlaması adım 405 nm ışığa maruz kolon alanı bölümüdür. Yeni doğan kolon kırılganlık ve dışkı, varlığı çok az da olsa bu erken yaşta eklenebilir fiber optik kanül uzunluğunu sınırlar. Önceki deneylerde daha uzun bir kanül başarıyla 5 mm den fazla eklenemedi. Yağlama maddeleri lazer ışını değişken ışık kırılma riski nedeniyle atlanma. Kanül dışa doğru hareket her 30 s yardım lazer ışığa maruz kolon alanı en üst düzeye çıkarmak. Önemlisi, bir kanül ile büyük bir NA değer (NA 0,5 =) üst üste ışık geniş bir koni oluşturmak için kullanılan.
Bu iletişim kuralı yenidoğan (0 - 2 gün) için standart PhAMeksize pups. İçerik ve yaş farelerin kolon uzunluğuyla değişimler göz önüne alındığında, teknik büyük pups kullanırken buna göre optimize edilmiş olması gerekir. Öncelikle, photoconversion ve fiber optik kanül yerleştirilmesi uzunluğu toplam süresi için değişiklikler gerekli olacaktır.
İki nokta üst üste hücrelerde göçmen davranışını anlamak için bu yaklaşım akış sitometrik çözümlemesi tarafından kolaylaştırılmıştır. Çok parametreli akış sitometresi daha ileri tanımlamak için kullanılan ve fenotip göçmen bağışıklık hücre türleri içinde CD45+ alt hücre. Dendra2-r+ hücreleri de FACS tarafından gen ifade profil oluşturma ve proteomik çözümlemeleri gibi aşağı akım uygulamalar için sıralanmış. Bu çalışmada kolon hematopoietik hücre alt kümeleri anlayış yönelik iken, yöntem beyin ve cilt dahil olmak üzere ek doku sitelerden hücresel geçiş çalışmaya adapte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Nitya Jain bir NIH/NIAID kariyer geçiş Ödülü 1K22AI116661-01 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser | |||
| Light Emitting Diode (LED) | THORLABS | M405FP1 | CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 |
| LED driver | THORLABS | LEDD1B | Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 |
| Optogenetics patch cable | THORLABS | M87L01 | 1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454 |
| Fiber optic cannula | Doric lenses | MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 | 5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036 |
| Power supply | THORLABS | KPS101 | Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 |
| LG3 laser safety goggles | THORLABS | LG3 | Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 |
| Red light | Electron Microscopy Sciences | 74327-10 | 15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences |
| Intestinal cell isolation | |||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3 |
| 1X HBSS | Gibco | 14025076 | Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 |
| Calf Serum | Hyclone AZM | 197696 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 |
| DTT | Sigma | 10197777001 | CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US |
| HEPES | Gibco | 15630080 | 1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 |
| Petri dish | Corning | 353004 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F |
| 70 micron cell strainer | Falcon | 352350 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712 |
| Micro magnetic stir bar | Fisherbrand | 1451364 | Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364 |
| Magnetic stir plate | Corning Laboratory Stirrers | 440826 | https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE |
| Collagenase | Roche | 5401020001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE |
| DNase I | Sigma | 10104159001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US |
| 1X PBS | Gibco | 20012-027 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 |
| Pipet aid | Thermo Scientific | 14387165 | https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357530 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357515 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 15 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339651 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339653 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| Single cell suspension | |||
| Eppendorf tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx |
| Tissue homogenizer | Kimble | K7495400000 | Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000 |
| Homogenizer tips | Kimble | 7495210590 | Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| Antibodies | |||
| BV786 anti-mouse CD45 | BD | 564225 | Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 |
| Live/Dead | Invitrogen | L34962 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962 |
| Other | |||
| Razor blades | VWR | 55411-050 | Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades |
References
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489, 231-241 (2012).
- Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes. Journal of Immunology. 198, 590-595 (2017).
- Mathis, D., Benoist, C. Microbiota and autoimmune disease: the hosted self. Cell Host Microbe. 10, 297-301 (2011).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46, 350-363 (2017).
- Jain, N., Walker, W. A. Diet and host-microbial crosstalk in postnatal intestinal immune homeostasis. Nature Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 12, 14-25 (2015).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews in Immunology. 14, 667-685 (2014).
- Macpherson, A. J., Uhr, T. Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria. Science. 303, 1662-1665 (2004).
- Mowat, A. M. Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens. Nature Reviews in Immunology. 3, 331-341 (2003).
- Diehl, G. E., et al. Microbiota restricts trafficking of bacteria to mesenteric lymph nodes by CX(3)CR1(hi) cells. Nature. 494 (3), 116-120 (2013).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50, 833-843 (2012).
- Conway, K. L., et al. ATG5 regulates plasma cell differentiation. Autophagy. 9, 528-537 (2013).
- Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii. Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).
- Guo, X., Muite, K., Wroblewska, J., Fu, Y. X. Purification and Adoptive Transfer of Group 3 Gut Innate Lymphoid Cells. Methods in Molecular Biology. 1422, 189-196 (2016).
- Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).
