Summary
ここで説明されているプロトコルは、超腸サイトにコロンから移住免疫細胞を特定する新生児マウスの photolabeling アプローチを採用しています。この戦略は、初期の生活におけるホスト マイクロバイ相互作用の研究に有用になります。
Abstract
腸内細菌群集は、人生の早い段階で確立され、免疫細胞の発生と機能に影響を与えます。新生児の細菌は抗生物質の使用と自己免疫疾患および炎症性疾患への感受性に影響を与える食事を含む多数の外部の影響を受けやすいです。炎症性腸疾患 (IBD) などの疾患は、腸の免疫細胞の大量流入によって特徴付けられます。ただし、免疫細胞、細菌叢によって調節が超腸内サイトでの免疫反応に影響を与える腸から移住また。したがって、識別し、遠位のサイトに腸から微生物のメッセージを運ぶことができる細胞を分類する必要があります。ここでは、新生児マウス体内移行後余分な腸のサイトで彼らを識別するための大腸のラベル セルに手法について述べる。
Introduction
哺乳類の消化管では、ホスト1との共生関係にある細菌の種の数百を隠し持っています。ローカルの環境で現在の免疫細胞は、これらの微生物との共存を適用し、病原体の侵入に対する保護バリアを確立します。したがって、免疫細胞と微生物相の双方向相互作用は免疫系を教育し、病原体に免疫反応性のしきい値を設定します共生コミュニティを確立する重要です。免疫恒常性を乱す、1 型糖尿病、IBD の2,3などの免疫介在性疾患につながる消化管の炎症を抑制する規制の回路を混乱する微生物の組成、または dysbiosis、することができます変更.
期間中に腸内微生物群集は同時に免疫システムを確立し始めるユニークな発達ウィンドウ出産後すぐには、4を成熟します。生後の微生物叢は自然群集組成とよく5の変化と、安定しません。明確な解剖学的の場所に - 腸粘膜および腸の上皮6微生物叢と相互作用する免疫細胞が存在します。(これは樹状細胞、単球、マクロファージを含める) 骨髄細胞、リンパ球 (T 細胞、B 細胞、自然免疫リンパ球様細胞など) を含む腸の免疫細胞の様々 なタイプがあります。これらの細胞、造血細胞とも呼ばれる腸粘膜バリアーを維持し、恒常性を維持する機能の多数を実行します。
腸のサイトで彼らの規制機能に加え粘膜の免疫細胞はまた全身性免疫7,8,9を規制する超腸サイト宛ての微生物を運ぶかもしれない。成長の研究関心のある分野で、その機能を調査するために腸管組織から移行免疫細胞を特定する方法の必要性を強調します。ここで報告されるプロトコルは、ラベル セルの光変換蛍光蛋白質を利用市販マウス モデルを利用しています。ファム摘出マウスは遍在が不可逆的紫外線 (UV) 光10赤蛍光活性化に切り替えられる緑の蛍光 Dendra2 蛋白質を表現します。新生仔マウスの大腸に 405 nm の光を提供する繊維光学カニューレを用いて、脾臓の生まれか、コロンを通過 photoconverted 造血細胞を見つけることができますを示す.
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Protocol
動物のすべてのプロシージャの承認機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) マサチューセッツ総合病院に準拠して行った。
注意: このプロトコルは、クラス 3 b レーザー (LG3) の使用を含みます。このレーザーを動作しているとき、LG3 レーザー安全ゴーグルを使用常にする必要があります。怪我のリスクを避けるために適切な訓練と安全のガイドラインに従わなければなりません。
1. デザインとレーザーのアセンブリ
- 光発光ダイオード (LED) を接続 (405 nm、19.3 mW、ファイバー結合型 1400 mA)、LED ドライバー経由で来る 4 ピン M8 コネクタ ケーブルに接続されている LED。慎重に接続を固定するネジを締めます。
- オプトジェネティクス パッチ ケーブルを LED に接続する前に、コネクタを保持に LED の開放ができるように光目に見える障害物がないです。必要に応じて任意の障害物を排除し、オプトジェネティクス パッチ ケーブルを開口部に挿入する穴に吹く。
- オプトジェネティクス パッチ ケーブル コネクタ スリーブの両端にカニューレを挿入することによってファイバー光カニューレに接続します。パッチ ケーブルにコネクタ スリーブの他の端を接続します。 接続をセキュリティ保護がない曲げたりカニューレで光ファイバーを破るように注意する十分な圧力を適用します。
注: 壊れやすい繊維ファイバー カニューレは、レーザーが使用されていないときに保護キャップで覆われて。 - LED ドライバーを 0 と電流 1.2 a. に設定で連続調整ノブと連続波 (CW) モードに設定します。
2. 大腸内のセルの光電
注: 雌雄マウスは出生後 1-2 日 intracolonic 405 nm の光にさらされたが 1 週齢の前に犠牲になった。
- コンセントへのアクセスと暗い場所を確保します。LED ドライバーをコンセントに差し込みます。
注: この手順を実行最小の白色光で周囲の光にマウスの長時間露出がセルの不要な光変換を引き起こす可能性があります。赤い光は、代替として使用されます。
注意: 次の手順は、麻酔動物の使用を含みます。麻酔薬の管理では、クラス II フードまたは別の適切な清掃システムを使用して行われます。麻酔薬の吸入は、めまい、眠気、またはも無意識のうちにあります。 - 100 %o2 [誘導] ボックスで 4-5% イソフルラン暴露によるマウスを麻酔します。(応答なし) 後肢をしっかりとつまんで適切な麻酔深度を確認します。約 2% イソフルランに鼻の円錐形によって麻酔を維持します。適切なフードや麻酔の清掃装置の使用によってハンドラー イソフルラン暴露を防ぐ。
- 首筋に 1 を使用して intracolonic 露出のため麻酔下マウスの位置手の人差し指と親指で軽くマウスの背面。マウスを裏返し、腹部を公開します。マウスは、そのピンクの色を失うことを開始した場合またはその呼吸速度が遅いを開始した場合は、グリップを緩めます。マウスの尾をリングと小さな指の間を固定します。
- もう片方の手には、カニューレから保護キャップを取り外します。維持しながらマウスの正中線に平行のカニューレの長軸そっと挿入肛門からファイバー光カニューレ コロン、光ファイバーのすべて 5 mm が、マウスの内部。
注: この手順を実行ゆっくりと大腸の壁に穴を開けるように注意。分揺らすとカニューレのねじれは、コロン進出を支援します。 - 安全ゴーグルをドンし、最大値 (すべての方法時計回り) に現在のレーザーを増やします。マウスの半透明の腹部を見ることによって紫外線の存在を確認します。
注: LG3 レーザー安全メガネは、視認性を大幅に減少します。ゴーグルを着用し、レーザーをオンに同僚 (身に着けている保護具) の支援を持っています。 - 公開 2 分約 1 mm のカニューレの撤回の合計のためのレーザ光にコロンすべての 30 s、光にさらされる内腔領域を最大化します。2 分の最後に、レーザーをオフにします。
- ゆっくりとマウスからカニューレを削除します。空暖かいケージ内麻酔から回復した後、マウスを家のケージに戻ります。
3. 腸管リンパ球の分離
- ハンクの平衡塩類ソリューション/子牛血清 (HBSS/CS) バッファーの 1 L、上皮ストリップ バッファーの 200 mL、500 mL 洗浄メディアのエチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 200 mL を準備-無料洗浄メディア。
注: 試薬ボリュームの 9 のサンプル サイズが計算されます。- CS の 50 mL を HBSS の 950 mL に追加して HBSS/CS のバッファー (HBSS; 5 %cs) をします。氷の上保管してください。
- 185 mL に CS、1 M DTT、0.5 M の EDTA の 2 mL、3 mL の 1 M HEPES バッファーの 200 μ L の 10 mL を追加して [HBSS; 5 %cs; 1 mM ジチオトレイトール (DTT); 5 mM EDTA; 15 mM 4-(2-Hydroxyethyl) ピペラジン-1-ethanesulfonic 酸 (HEPES) (pH 7.2 7.5)] 上皮ストリップ バッファーを準備します。HBSS。37 ° C の水浴中上皮ストリップ バッファーを配置します。
- HBSS 494 mL に CS の 5 mL と 0.5 M の EDTA の 1 mL を追加することによって洗浄メディア (HBSS; 1% CS 1 mM EDTA) を作る。室温で保管してください。
- HBSS 195 mL に 2 mL CS と 1 M HEPES 3 mL を追加して EDTA 無料洗浄メディア (HBSS; 1 %cs; 15 mM HEPES) を準備します。室温で保管してください。
- FACS バッファーを作る [リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 (pH = 7.2); 2 %cs] 490 mL の PBS に CS の 10 mL を追加しています。氷の上保管してください。
- 70 μ m セル ストレーナー 60 × 10 mm 培養皿の中に配置することによって組織のコレクション料理を準備します。皿に HBSS/CS バッファー (HBSS; 5 %cs バッファー 3.1.1 の手順で作った、氷に格納) の 10 mL を追加し、氷の上に置きます。
- 安楽死、マウスを介して吸入イソフルラン麻酔薬の適切な清掃を使用しての過剰摂取 (約 3 分の露出に > 4% イソフルラン部屋の空気または 100% O2)。呼吸の明白な停止後および動きを反射、後肢の足をしっかりとつまんで深い痛みの有無を確認します (推奨鉗子を使用して)。外科はさみのペアまたは新しいストレートかみそりを使用して斬首による安楽死を確認します。
注: 頚部転位はこのステップ サイズと動物の年齢のための推奨されません。これらのメソッドは、安楽死の 2013 AVMA のガイドラインと一致しているし、MGH IACUC によって承認されました。 - きれいな鉗子、はさみを使用して、腹部を開くコロンを収穫します。コロンを公開するマウスの腹部の 1 側に腸を反映してください。最初 transecting (肛門) に向けてのすぐ遠位のそれによって全体のコロンを削除盲腸に到達します。その後、しっかりと把握しながら鉗子、大腸は直腸に尿道を通って削減するはさみを使用します。できるだけ肛門に近くとしてコロンをカットします。コロンを削除した後、脾臓を収穫 (4.1 4.2 下記手順を参照)。
注: 光電プロトコルのみ新生児のコロン (繊維ファイバー カニューレの 5 mm) の ~ 25% をターゲットに中、全体のコロンは細胞単独で支援するために収穫されます。 - 大腸のうち、乾燥したペーパー タオルの上に内容をプッシュする鉗子を使用して、コロンをきれい。培養皿のカバーの貼り付けにみじん切りにコロン、ペトリ皿にセル ストレーナーにこのペーストを転送するかみそりの刃を使用して組織をホモジナイズしてください。
- こし器にきれいな 8 mm 長い電磁攪拌棒を追加し、9 位置磁気スターラー プレートに皿を置きます。電磁攪拌バー速度を 800 rpm にセット、室温で 5 分間細胞を孵化させなさい。バッファーを破棄し、HBSS/CS (、HBSS; 5 %cs バッファー 3.1.1 の手順で作った、氷に格納) の 10 mL を使用して洗浄を繰り返します。洗浄の最後にバッファーを破棄します。
- セル ストレーナーを 10 mL の prewarmed 上皮ストリップ バッファー (、HBSS; 5 %cs; 1 mM DTT; 5 mM EDTA; 3.1.2 のステップで行われた、37 ° C の水浴中に格納された 15 mM HEPES [pH 7.2 7.5] バッファー) を追加することによって上皮細胞を解離して、3 で 30 分間 800 rpm で攪拌7 ° C の定温器。孵化の最後に、きれいな 15 mL チューブにある上皮部分で濃縮バッファーを転送します。
注: 上皮と関連付けられている細胞 (小腸上皮細胞や腸管上皮リンパ球) に放出されるバッファー、そのまま粘膜の細胞がこのステップ11セル ストレーナーのまま。- 遠心分離機の部屋の温度で 5 分間 700 x g で豊かな腸上皮分数 (Iel)。上澄みを廃棄し、1 mL の FACS バッファーで細胞ペレットを再懸濁します。3.15 の手順で使用するため氷の上保管してください。
- セル ストレーナー 2 内粘膜の一部を洗って HBSS/CS と x。セル ストレーナーに HBSS/CS ソリューション (HBSS; 氷の上に格納されているステップ 3.1.1 で作られた 5 %cs バッファー) の 10 mL を追加し、37 ° C の定温器で 5 分間 800 rpm で攪拌します。各洗浄した後、バッファーを破棄します。
- サンプル 2 を洗う洗浄メディアで x。セル ストレーナーを洗浄メディア (HBSS; 1% CS 3.1.3 の手順で、室温で格納された 1 mM EDTA バッファー) の 10 mL を追加し、37 ° C の定温器で 15 分間 800 rpm で攪拌します。各洗浄した後、バッファーを破棄します。
- 洗浄メディアを使用した後 3.14 の手順で使用するため氷の上保管してください。
- サンプル 2 を洗う HBSS x/CS. セル ストレーナーに HBSS/CS バッファー (HBSS; 氷の上に格納されている、手順 3.1.1 5% の CS のバッファー) の 10 mL を追加し、37 ° C の定温器で 5 分間 800 rpm で攪拌します。各洗浄した後、バッファーを破棄します。
- 洗浄バッファーの EDTA 無料のティッシュを孵化させなさい。セル ストレーナーに 10 mL の洗浄バッファーの EDTA 無料 (HBSS; 1% CS 3.1.4 の手順で、室温で格納された 15 mM HEPES バッファー) を追加し、プレート攪拌しなくても室温で 10 分間インキュベートします。このステップの終わりにバッファーを破棄します。
- サンプル 2 を洗う HBSS/CS と x と酵素液を準備します。HBSS/CS (HBSS; 5 %cs バッファー、氷の上に格納されている手順 3.1.1) 10 mL を追加セル ストレーナーをバッファーに格納し、37 ° C の定温器で 10 分間 800 rpm で攪拌します。各洗浄した後、バッファーを破棄します。
- 酵素液を準備 (EDTA 無料洗浄バッファー; 0.1 mg/mL DNase I; 167 mg/mL コラゲナーゼ) 2 番目の洗浄期間中: 9 mg を追加 DNase の私と 15 mg EDTA 無料 90 mL に凍結乾燥のコラゲナーゼの洗浄バッファー。室温でソリューションを保存します。
- 粘膜固有層リンパ球 (Lpl) を取得するセル ストレーナー内粘膜画分を消化します。酵素溶液 10 mL を追加 (EDTA 無料洗浄バッファー; 0.1 mg/mL DNase I; 167 mg/mL コラゲナーゼ バッファー 3.12.1 の手順で行い、常温保存) セル ストレーナーを 37 ° C の定温器で 45 分間 800 rpm で攪拌し、。
注: Lpl 酵素消化後にソリューションにリリースされます。- セルを含む酵素液を収集し、50 mL の円錐管に新しいセル ストレーナー フィルターを適用します。
- 酵素液でコラゲナーゼの活性をブロックするフィルターが適用されたセルに 20 mL (1 mM EDTA; 1 %cs、HBSS バッファー 3.1.3 の手順で作られ、ストアド手順 3.9.1 で氷の上) 冷たい洗浄メディアを追加します。室温で 6 分間 700 x g でチューブを遠心します。上澄みを廃棄し、1 mL の FACS バッファーで Lpl を含むペレットを再懸濁します。
- (ステップ 3.7.1) から IEL と LPL (ステップ 3.14) から分数を組み合わせるし、フローサイトメトリーによる解析のための抗体の蛍光標識と、それらを染色 (手順 5. を参照)。
注: IEL と LPL の分数は、区画情報が必要な場合別途染色する場合があります。
4. 脾臓リンパ球の分離
- 微量遠心チューブに FACS バッファーの 500 μ L を追加することによって、コレクションの管を準備します。氷の上保管してください。
- コロン (ステップ 3.4) を取り出したら、全体の脾臓を収穫し、コレクションの管にそれを置きます。氷の上のティッシュを格納します。
- 電気組織ホモジナイザーを使用して、300 x g [超小型遠心分離機] 部屋の温度や培養上清を吸引で 5 分間のサンプル約 1 分遠心遠心チューブに脾臓を均質化します。
- 赤血球細胞の換散を実行するには、浸透圧の溶解によって細胞死を開始するアンモニウム塩化カリウム (ACK) 換散バッファーの 500 μ L のサンプルを再します。サンプルは室温で 1-2 分間インキュベートし、FACS バッファーの 725 μ L で再停止しなさいそれを許可します。
- 300 × g [超小型遠心分離機] 部屋の温度や培養上清を吸引で 5 分間のサンプルを遠心します。500 μ L の FACS バッファーでペレットを再懸濁し、新しい微量遠心チューブに 40 μ m 携帯こし器を通ってそれをフィルターします。新しい微量遠心チューブにサンプル全体を転送し、フローサイトメトリー解析用蛍光色素標識された抗体で染色 (手順 5. を参照)。
5. Dendra r+細胞を用いたフローサイトメトリーの同定
- 300 x g [超小型遠心分離機] 部屋の温度や培養上清を吸引で 5 分間で、IEL/LPL と脾臓のサンプルを遠心します。
- ミックスを汚す抗体の 100 μ L にペレットを再懸濁します。FACS バッファー サンプルごとの 100 μ L に蛍光標識抗 CD45 抗体の 1 μ L を追加してミックスを汚す抗体を準備します。
メモ: 彩度をバインドが発生する最適な濃度を決定するのに実験に先立ちフローサイトメトリー用使用抗体を滴定することが重要です。 - 35 分 (暗い場所) の氷のサンプルをインキュベートします。
- FACS バッファーの 300 μ L のサンプルを再懸濁します、室温で 5 分間 300 x g [超小型遠心分離機] でそれらを遠心分離機します。上清を吸引し、FACS バッファーの 325 μ L のサンプルを再懸濁します。流れの cytometer でサンプルを分析します。
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Representative Results
光ファイバー ケーブルを使用して 2 日間の古いファム切除マウスのコロンに 405 nm の光を配信しました。前の実験で 30 秒露出は最小限の細胞毒性 (図 1A)、結腸細胞の最大光電を与えるに決定しました。したがって、コロンのさまざまなセグメントの連続 30 秒露出は、プロトコルに従って行われました。レーザ露光後マウスすぐに安楽死させ、セルの光電が決定されました。合計結腸組織の単一セル準備が蛍光標識抗 CD45 抗体で染色した、光電検出、フローサイトメトリーによる解析を行った。未変換の Dendra2 グリーン (Dendra g) 蛋白質 490 と 553 nm 励起と放射の最大値は、それぞれ、photoconverted Dendra2 赤 (Dendra-r) 蛋白質は、507 と 573 nm 励起と放射のマキシマに対し FITC チャンネルで検出できます。それぞれ流れの cytometer の PE チャンネルで検出することがあります。その赤フォームに切り替えられる不可逆的、Dendra2 は非常にあると長期追跡アプリケーションに役立ちます。
Unlasered マウス (図 1B 左) Dendra r+細胞は検出されませんでした。ただし、405 nm 露光結果 CD45negと CD45 の両方で異なる Dendra r+細胞集団+細胞コンパートメント (右図 1B )。新しく photoconverted マウスから脾臓を収穫できた大腸光電プロトコルは、超腸のサイトでセルの背景に起因した場合を決定する (T = 0)、フローサイトメトリーによる細胞 Dendra r+のための検定します。CD45negの CD45 Dendra r+細胞が検出されなかった+細胞コンパートメント (図 1C) 内大腸レーザー ビーム、photolabel 脾臓細胞に十分浸透していないことを示唆します。したがって、移行のための時間を可能にした後、脾臓で検出された Dendra r+セル (T = 3 d、5 d) コロンから由来している必要があります。
図 1:生体内で結腸組織の光電。2 日間の古いファム摘出した子犬からコロンの細胞は 30 の内大腸の 405 nm の光にさらされた前述の s。光変換とセルのラベル付け処理の直後に決定した (T = 0)、大腸組織および脾臓の単一細胞製剤のフローサイトメトリーによる解析によって。この代表的なフローのフローサイトメトリーによるドット プロット (A) は、CD45 の式を示します (x-軸) と住んでいる死者染料の染色 (y-軸) コントロールと書込みマウスのコロンからの単一セルの準備で。BとCのパネルは、Dendra2 グリーン蛋白の発現を示す代表的なフロー フローサイトメトリーによるドット プロット オーバーレイ (Dendra2 g、水平軸) と Dendra2 赤タンパク質 (Dendra2-r、垂直軸) コントロール露出されていないのとCD45 を公開+ (造血) CD45ネガティブ(非造血) 細胞 (B) コロンと(C) 脾臓。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
渡り鳥脾臓細胞を識別するために典型的な光電実験からのデータは、図 2のとおりです。図 1のように 2 日間の古いファム切除マウスのコロンのセルの光電を行った。マウス暴露後 3 〜 5 日を安楽死させ、脾臓で Dendra r+細胞の存在は、フローサイトメトリーによって決定されました。ビュー CD45neg細胞は主に上皮性と一貫性のある CD45neg細胞サブセットでない Dendra r+細胞と腸の他の構造細胞があった。いくつか CD45+造血細胞表現 Dendra r、彼らはコロンで photoconverted をされていた、脾臓に移行を示唆しています。
図 2: CD45+造血細胞は脾臓にコロンから移行します。新生児 (日 0 - 2) ファム摘出マウスは、大腸内の露出によって photoconvert Dendra2 蛋白質に 405 nm の光にさらされました。代表的な流れの cytometry プロット表示 Dendra2 グリーン蛋白の発現 (Dendra2-g、水平軸) と Dendra2 赤タンパク質 (Dendra2-r、垂直軸) CD45ネガティブで CD45+非公開 5 日齢のマウスの脾細胞とマウスの 3 〜 5 日で分析を公開 (T = 3 d、5 d) 光変換後。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
同定と対話し、大腸の微生物叢によって影響を受ける細胞の解析は重要であり、体の残りの部分に粘膜の微小環境からの情報を中継する方法を理解していただく必要があります。腸関連細胞遊走を勉強するための 1 つのメソッドには、その組織ホーミング パターンを決定し、12,13を機能する受信者のマウスに養子の転送が続いて腸関連細胞の分離が必要です。このアプローチは、転送された特定の細胞型のみを追跡すること、限られました。さらに、組織および浄化プロセス、細胞の分離の結果の成果物は生体内で移住性プロセスを妨げる可能性があります。最近では、楓のマウスを用いた消化管細胞をラベルする内視鏡光電プロトコルは報告された14だったこの研究では、成体マウスの白血球、腸からの広範な売買をわかりました。
当社の報告書は新生仔マウスの大腸内のラベル セルに方法について説明し、脾臓などの余分な腸への移行を追跡します。ファム摘出マウスは遍在が不可逆的紫外線によってその活性化時に赤い蛍光性に切り替えられる蛍光グリーン蛍光 Dendra2 蛋白質を表現します。新生仔マウスのコロンの 405 nm の光への暴露のラベル両方 CD45+造血と CD45ネガティブ非造血細胞。CD45+Dendra2 赤+細胞、脾臓で造血細胞の余分な腸の移行を示す光変換後 3 〜 5 日が検出されました。
この試金の率制限ステップは、405 nm の光にさらされている大腸の領域の割合です。新生児のコロンの脆弱性と、便の存在とはいえこの初期の時代に最低限は挿入することができます繊維ファイバー カニューレの長さを制限します。前の実験で長いカニューレ挿入できませんでした正常に 5 mm 以上。 潤滑剤は、レーザ光の可変光の屈折の危険があるため避けた。カニューレの外側の動きすべての 30 s を助けたレーザー光にさらされる大腸領域を最大化します。重要なは、NA 値が大きいカニューレ (NA = 0.5) コロンの広い円錐状の光を生成に使用されました。
このプロトコルは、新生児 (日 0 - 2) 標準化されていますファム摘出した子犬。コンテンツとマウスの年齢とともに大腸の長さの変化を考えると、技術は古い子犬を使用する場合、それに応じて最適化する必要があります。主に、光変換および繊維光学のカニューレの挿入の長さの総計の持続時間の変更が必要になります。
コロンの細胞の回遊行動を理解することへのこのアプローチは、フローサイトメトリーによる解析によって促進されます。マルチパラ メーター フローサイトメトリーを識別するためにさらに使用可能性があります、内、CD45 表現型出稼ぎ免疫細胞型+セルのサブセット。Dendra2 r+細胞が遺伝子発現プロファイルやプロテオミクス解析などの下流の FACS でも並べ替えられます。本研究ではコロンの造血細胞サブセットの理解に向け、一方メソッドは、脳、皮膚など他の組織サイトから携帯電話の移行を検討する適応可能性があります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
ニーチャ ジャイナ教は、NIH/NIAID キャリア遷移賞 1K22AI116661-01 によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser | |||
| Light Emitting Diode (LED) | THORLABS | M405FP1 | CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 |
| LED driver | THORLABS | LEDD1B | Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 |
| Optogenetics patch cable | THORLABS | M87L01 | 1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454 |
| Fiber optic cannula | Doric lenses | MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 | 5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036 |
| Power supply | THORLABS | KPS101 | Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 |
| LG3 laser safety goggles | THORLABS | LG3 | Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 |
| Red light | Electron Microscopy Sciences | 74327-10 | 15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences |
| Intestinal cell isolation | |||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3 |
| 1X HBSS | Gibco | 14025076 | Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 |
| Calf Serum | Hyclone AZM | 197696 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 |
| DTT | Sigma | 10197777001 | CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US |
| HEPES | Gibco | 15630080 | 1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 |
| Petri dish | Corning | 353004 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F |
| 70 micron cell strainer | Falcon | 352350 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712 |
| Micro magnetic stir bar | Fisherbrand | 1451364 | Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364 |
| Magnetic stir plate | Corning Laboratory Stirrers | 440826 | https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE |
| Collagenase | Roche | 5401020001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE |
| DNase I | Sigma | 10104159001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US |
| 1X PBS | Gibco | 20012-027 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 |
| Pipet aid | Thermo Scientific | 14387165 | https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357530 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357515 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 15 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339651 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339653 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| Single cell suspension | |||
| Eppendorf tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx |
| Tissue homogenizer | Kimble | K7495400000 | Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000 |
| Homogenizer tips | Kimble | 7495210590 | Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| Antibodies | |||
| BV786 anti-mouse CD45 | BD | 564225 | Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 |
| Live/Dead | Invitrogen | L34962 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962 |
| Other | |||
| Razor blades | VWR | 55411-050 | Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades |
References
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